PSMC5, een 19S Proteasomal ATPase, regelt cocaïnewerking in de Nucleus Accumbens (2015)

PLoS One. 2015 mei 11; 10 (5): e0126710. doi: 10.1371 / journal.pone.0126710. eCollection 2015.

Ohnishi YH1, Ohnishi YN2, Nakamura T3, Ohno M4, Kennedy PJ5, Yasuyuki O6, Nishi A7, Nooit8, Tsuzuki T4, Nestler EJ5.

Abstract

ΔFosB is een stabiele transcriptiefactor die zich ophoopt in de nucleus accumbens (NAc), een belangrijk onderdeel van het beloningscircuit van de hersenen, als reactie op chronische blootstelling aan cocaïne of andere drugs. Hoewel bekend is dat ΔFosB heterodimeriseert met een Jun-familielid om een ​​actief transcriptiefactorcomplex te vormen, is er tot op heden geen open verkenning van andere mogelijke bindingspartners voor ΔFosB in de hersenen geweest. Hier identificeren we met behulp van gist twee-hybride assays PSMC5 - ook bekend als SUG1, een ATPase-bevattende subeenheid van het 19S proteasomale complex - als een nieuw interactief eiwit met ΔFosB. We verifiëren dergelijke interacties tussen endogene ΔFosB en PSMC5 in het NAc en demonstreren dat beide eiwitten ook complexen vormen met andere chromatine-regulerende eiwitten die zijn geassocieerd met genactivering. We gaan verder om aan te tonen dat chronische cocaïne de nucleaire, maar niet cytoplasmatische niveaus van PSMC5 in het NAc verhoogt en dat overexpressie van PSMC5 in dit hersengebied de locomotorische reacties op cocaïne bevordert. Samen beschrijven deze bevindingen een nieuw mechanisme dat bijdraagt ​​aan de acties van ΔFosB en, voor het eerst, PSMC5 impliceert in door cocaïne geïnduceerde moleculaire en gedragsplasticiteit.

Citation: Ohnishi YH, Ohnishi YN, Nakamura T, Ohno M, Kennedy PJ, Yasuyuki O, et al. (2015) PSMC5, een 19S Proteasomal ATPase, regelt cocaïnewerking in de Nucleus Accumbens. PLoS ONE 10 (5): e0126710. doi: 10.1371 / journal.pone.0126710

Academische editor: James Edgar McCutcheon, University of Leicester, VERENIGD KONINKRIJK

ontvangen: December 10, 2014; Aanvaard: April 7, 2015; Gepubliceerd: 11 mei 2015

Copyright: © 2015 Ohnishi et al. Dit is een open access-artikel dat wordt verspreid onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie in elk medium mogelijk maakt, op voorwaarde dat de originele auteur en bron worden gecrediteerd

Beschikbaarheid van data: Alle relevante gegevens staan ​​in de krant.

financiering: Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health, het National Institute on Drug Abuse, en door de Ishibashi Foundation en de Japan Society for the Promotion of Science (KAKENHI-nummers: 24591735, 26290064, 25116010). De financiers hadden geen rol in onderzoeksontwerp, gegevensverzameling en -analyse, besluit tot publicatie of voorbereiding van het manuscript.

Concurrerende belangen: De auteurs hebben verklaard dat er geen concurrerende belangen bestaan.

Introductie

ΔFosB, een afgekapt product van de FosB gen, behoort tot de Fos-familie van transcriptiefactoren, die ook c-Fos, FosB met de volledige lengte, Fra-1 en Fra-2 omvatten. ΔFosB, zoals andere Fos-eiwitten, heterodimeriseert met een Jun-familie-eiwit-c-Jun, JunB of JunD-om een ​​actief AP-1 (activator-eiwit-1) transcriptiefactorcomplex te vormen, dat de expressie van specifieke doelgenen induceert of onderdrukt [1,2].

Van ΔFosB is aangetoond dat het een sleutelrol speelt bij drugsverslaving [2]. Uniek bij de familie-eiwitten van de Fos, hoopt het op in nucleus accumbens (NAc) en andere beloningsgerelateerde hersenregio's na herhaalde toediening van geneesmiddelen vanwege de hoge mate van stabiliteit [3,4], die wordt gemedieerd door het ontbreken van C-terminale degron-domeinen en door fosforylatie door verschillende proteïnekinasen [5-7]. Een dergelijke inductie van AFosB in het NAc medieert verhoogde gedragsreacties op misbruiktegenmiddelen. Zo verhoogt overexpressie van ΔFosB in dit hersengebied van volwassen dieren, hetzij door het gebruik van virale vectoren of induceerbare bitransgene muizen, de gevoeligheid van een dier voor de locomotor-activerende en belonende effecten van cocaïne en opiaten, evenals de motivatie van een dier om zichzelf toe te dienen cocaïne [7-11]. Omgekeerd veroorzaakt overexpressie van dominante negatieve antagonisten van ΔFosB de tegenovergestelde gedragsfenotypes [10-12].

Wij en anderen hebben eerder bevestigd, door middel van gel shift assays, dat JunD en misschien andere jun-familie-eiwitten de belangrijkste bindingspartners van ΔFosB in de hersenen zijn in vivo [13-15]. Tot op heden is er echter geen onbevooroordeelde evaluatie van ΔFosB's bindende partners in de hersenen geweest. Hier hebben we gezocht naar nieuwe bindingspartners voor ΔFosB door gebruik te maken van een gist twee-hybride assay [16,17]. Uit onze gegevens bleek dat PSMC5, ook bekend als SUG1, een robuuste partner is van ΔFosB, zowel in vitro als in het NAc in vivo, waar het zich verbindt met ΔFosB als onderdeel van een door cocaïne geïnduceerd transcriptieactivatiecomplex, dat ook CBP bevat (CREB-bindend eiwit ) en p300-zowel histon-acetyltransferasen (HAT's) - als BRG1 (een remmende eiwit van chromatine). We laten zien dat chronische blootstelling aan cocaïne de nucleaire niveaus van PSMC5, een ATPase-bevattende subeenheid van het 19S proteasomale complex, verandert in het NAc en dat PSMC5 op zijn beurt de gedragsreacties op cocaïne controleert.

Materiaal en Methoden

Gist twee-hybride screening

MaV203-gistcellen (Invitrogen Life Technologies) werden gecotransfecteerd met pDBLeu waardoor verschillende fragmenten van het ΔFosB-eiwit werden aangestuurd en een muizenhersenenbank werd gesubkloneerd in pPC86 (Invitrogen Life Technologies). Getransformeerde cellen werden gekweekt op SC-medium zonder leucine, tryptofaan en histidine en bevatten 10 mM van 3-aminotriazol. Binding tussen FosB-fragmenten en een kandidaat-partner induceert drie reportergenen (His3, Ura3 en LacZ), en de inductie maakt transformanten in staat om te overleven onder de gebruikte gekweekte omstandigheden. Positieve klonen werden opnieuw getest met verse pDBLeu-AFosB-fragmenten door retransformatietesten in MaV203-cellen.

Cel lijnen

Muis Neuro 2A neuroblastoomcellen (ATCC) werden gehandhaafd in Eagle's minimum essential medium (EMEM) (ATCC), aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) bij 37 ° C en 5% CO2. Rat 1A-cellen waren een geschenk van Yusaku Nakabeppu (Fukuoka, Japan) [18] en onderhouden in Dulbecco's MEM (DMEM) (Life Technologies), aangevuld met 10% FBS bij 37 ° C en 5% CO2. Transfectie van cellen met plasmide-DNA werd volbracht met behulp van Effectene (Qiagen) volgens de instructies van de fabrikant.

PSMC5 en ΔFosB constructies

Verschillende mutante vormen van PSMC5, elk FLAG-gemerkt aan hun N-terminus, werden gegenereerd voor gebruik bij immunoprecipitatie of virale gemedieerde experimenten voor genoverdracht. Deze omvatten: PSMC5-K196M, PSMC5-Δcoiled-coil domein (PSMC5-ΔCC, zonder aminozuren 27-68), PSMC5-NT (bestaande uit het N-terminale fragment van het eiwit, aminozuren 1-151) en PSMC5 -CT (bestaande uit het C-terminale fragment van het eiwit, 172-aminozuren) (zie Fig 1). We gebruikten ook N-terminale MYC-gelabelde vormen van wildtype ΔFosB evenals ΔFosB met een mutatie in het leucine-zip-domein (mutatie van aminozuren 182 tot 205 waarvan bekend is dat het heterodimerisatie met Jun-familie-eiwitten [6].

thumbnail
Fig 1. ΔFosB bindt in vitro aan PSMC5.

 

A. Schematische voorstelling van ΔFosB, ΔFosB-LZM waarin het leucineritssluitingdomein is gemuteerd om AFosB-heterodimerisatie met Jun-eiwitten te vernietigen, en Δ2ΔFosB die de eerste 78-aminozuren van de ΔFosB-N-terminus mist. B. Schematische voorstelling van PSMC5, PSMC5-NT die de eerste 151-aminozuren van PSMC5, PSMC5-CT omvat die de eerste 235-aminozuren van PSMC5 mist, en PSMC5-ΔCC die het coiled-coil-domein mist (aminozuren 28-68) . Het AAA-domein komt overeen met een motief, ATPases geassocieerd met diverse cellulaire activiteiten, aanwezig in veel ATPases. C. 2.4 μg pcDNA3.1-ΔFosB (rijstroken 1-4) of ΔFosB-LZM (baan 5) werd gecotransfecteerd met 2.4 μg FLAG-gelabelde PSMC5 of verschillende deletiemutanten in Neuro2a-cellen. Twee dagen na transfectie werden de cellen gelyseerd en onderworpen aan immunoprecipitatie met een anti-FLAG antilichaam en daarna Western blotted met anti-ΔFosB of anti-FLAG antilichaam. Merk op dat ΔFosB, maar niet ΔFosB-LZM, krachtig bindt aan PSMC5 of PSMC5-NT, maar niet aan PSMC5-CT of PSMC5-ΔCC. De in de figuur getoonde gegevens werden in drievoud gerepliceerd in elk van drie afzonderlijke experimenten.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g001

Dieren

Negen - tot 11-week-oude C57BL / 6J mannelijke muizen (The Jackson Laboratory) werden voor alle experimenten gebruikt. Dieren werden gehuisvest in een 12-h licht-donkercyclus met toegang tot voedsel en water ad libitum en waren 1 week vóór het experiment gewend. Twee cocaïnebehandelingsregimes werden gebruikt. Om de biochemische effecten van cocaïne te bestuderen, kregen dieren 7 dagelijkse doses cocaïne (20 mg / kg) of zoutoplossing en werden ze gedood door onthoofding 24 uur na de laatste injectie. Dit is een standaardprotocol waarvan is aangetoond dat het talloze moleculaire en cellulaire reacties op het medicijn produceert [7]. Om de invloed van PSMC5 in nucleus accumbens op gedragsreacties op cocaïne te bestuderen, gebruikten we een subdrempel dosis van het medicijn (7.5 mg / kg; zie Locomotor sensitisatie hieronder) op basis van de hypothese dat PSMC5, zoals ΔFosB, de gevoeligheid van een dier voor cocaïne [8]. Alle dierproeven werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee op de berg Sinaï.

Immunoprecipitatie en Western blotting

Neuro 2A-cellen werden getransfecteerd met wildtype of mutante vormen van PSMC5. Twee dagen na transfectie werden cellen gewassen in PBS, gelyseerd in RIPA-buffer (50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0.25% natriumdeoxycholaat, 10 mM natriumbutyraat, proteaseremmercocktail) . Lysaten werden gesplitst en geïncubeerd met ofwel niet-immune IgG (Sigma) of anti-FLAG antilichamen (Sigma) voor 3 uur bij 4 ° C. Immunoprecipitatie werd uitgevoerd met Protein G-parels (Invitrogen) zoals beschreven [19]. Kort samengevat werden immuungeprecipiteerde eiwitten onderworpen aan SDS-PAGE en geanalyseerd door Western blotting met behulp van anti-FosB / AFosB antilichaam (Cell Signaling Technology) op basis van gepubliceerde protocollen [7]. Voor in vivo eiwitbindingstests, gebruikten we gezuiverde nucleaire fracties van uit de pons ontleed NAc van muizen na chronische cocaïnebehandeling (20 mg / kg IP dagelijks gedurende 7 dagen, met muizen gebruikten 24 uur na de laatste injectie). Co-immunoprecipitatie uit kernfracties werd uitgevoerd met behulp van de Nuclear Complex Co-IP-kit (actief motief) volgens de instructies van de fabrikant. De volgende antilichamen werden gebruikt: MYC of ß-actine, Cell Signaling Technology (Danvers, MA), PSMC5 en histone H3, Abcam (Cambridge, MA), CBP, p300 en BRG1, Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), en FLAG M2, Sigma.

immunohistochemie

Immunohistochemie werd uitgevoerd volgens gepubliceerde procedures [20]. Muizen werden geanesthetiseerd en intracardiaal geperfuseerd met 4% paraformaldehyde in PBS. Hersenen werden cryobeschermd met 30% sucrose en daarna bevroren en bewaard bij -80 ° C tot gebruik. Coronale coupes (40 μm) werden gesneden op een cryostaat en verwerkt voor immunohistochemie. Vrij-zwevende secties werden vooraf geïncubeerd in een blokkeerbuffer die 0.3% Triton en 3% normaal ezelserum bevatte. ΔFosB werd gedetecteerd met behulp van een polyklonaal geit-antilichaam opgewekt tegen het N-terminale gedeelte van het eiwit (1 / 1000 Santa Cruz Biotechnology). PSMC5 werd gedetecteerd met behulp van een polyklonaal konijnenantilichaam (1 / 100 Abcam, Cambridge, MA). Beelden werden genomen met een confocale microscoop (60x vergroting; Zeiss).

Sensibilisatie van de locomotoriek

Alle muizen kregen dagelijks IP-injecties met zoutoplossing gedurende 3-dagen om ze te wennen aan de stress van de injecties. De volgende dag werden muizen IP met zoutoplossing of een subdrempelige dosis cocaïne (7.5 mg / kg, zie onder Dieren hierboven) geïnjecteerd en onmiddellijk in nieuwe locomotorboxen geplaatst. De locomotorische activiteit van de muizen werd geregistreerd met behulp van een fotobundelsysteem als ambulante bundelonderbrekingen voor 30 min. Deze behandelingen werden dagelijks herhaald gedurende 3-dagen.

Virale gemedieerde genoverdracht

We gebruikten uitgebreid gepubliceerde methoden voor virale gemedieerde genoverdracht [7,8,11,19]. In het kort werden expressieplasmiden voor PSMC5 of voor verscheidene van zijn mutanten (zie bovenstaande PSMC5- en AFosB-constructen) gesubkloneerd in het bicistronische p1005 (+) HSV-plasmide dat GFP tot expressie bracht onder de controle van de CMV-promoter en PSMC5 of zijn mutanten onder die van de IE4 / 5-promotor. Onder ketamine (100 mg / kg) / xylazine (10 mg / kg) anesthesie werden muizen gepositioneerd in een stereotaxisch instrument met kleine dieren en werd het schedeloppervlak blootgelegd. Er werden injectiespuiten met drieëndertig gauge gebruikt om 0.5 μl van een HSV-vector bilateraal in de NAc te infunderen onder een 10 ° hoek (AP + 1.6; ML + 1.5; DV -4.4) met een snelheid van 0.1 μl / min. Dieren die HSV-injecties ontvingen, mochten na 2-dagen na de operatie vóór het experimenteren herstellen.

Statistieken

ANOVA's en t-tests van studenten werden gebruikt, gecorrigeerd voor meerdere vergelijkingen, met significantie vastgesteld op p <0.05.

Resultaten

PSMC5: nieuwe bindingspartner van ΔFosB

We voerden voorlopige experimenten uit om een ​​geschikt fragment van AFosB te identificeren dat diende als aas in een twee-hybride gisttest zonder het systeem autoactief te maken. Door Holo-ΔFosB geïnduceerde reportergenactiviteit op zichzelf, evenals het N-terminale 1-78-aminozuurfragment van het eiwit. Een N-terminaal afgekapt AFFB (Fig 1A), genaamd Δ2ΔFosB, dat de eerste 78-aminozuren van het eiwit mist, had dit effect niet. Daarom hebben we Δ2ΔFosB als lokaasproteïne gebruikt.

Om te screenen voor potentiële bindingspartners, gebruikten we een bibliotheek van muishersenen die werd gesubkloneerd in pPC86. We identificeerden 11-kandidaten voor bindende partners. Hoewel deze eiwitten de bekende heterodimerisatiepartners van FosB waren, waren c-Jun en JunD (Tabel 1), de meest voorkomende kandidaat verreweg PSMC5. Hoewel verrassend, was dit een interessante bevinding, omdat PSMC5 jaren geleden in een enkel rapport werd getoond om in vitro te binden aan c-Fos [21]. Er zijn echter geen eerdere meldingen van PSMC5-betrokkenheid bij cocaïnewerking. Desalniettemin, vanwege de sterkte van het PSMC5-signaal in de twee-hybride gisttest, zijn we begonnen om mogelijke ΔFosB-PSMC5-interacties verder te bestuderen.

thumbnail
Tabel 1. Resultaten van gist twee-hybride screening met Δ2ΔFosB.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.t001

Ten eerste hebben we, om de fysieke interactie tussen ΔFosB en PSMC5 te bevestigen, in vitro co-immunoprecipitatie-experimenten uitgevoerd. We hebben FLAG-tagged PSMC5 gevonden (Fig 1B), getransfecteerd in Neuro 2A-cellen, effectief afgebroken ΔFosB (Fig 1C). Ten tweede hebben we voor het identificeren van het gebied in PSMC5 dat verantwoordelijk is voor de binding ervan aan ΔFosB, meerdere FLAG-gelabelde PSMC5-mutanten gegenereerd (Fig 1B) en herhaalde het co-immunoprecipitatie-experiment. ΔFosB werd effectief naar beneden getrokken met de N-terminale 151-aminozuren van PSMC5 (PSMC5-NT), maar niet met het C-terminale 172-aminozuurfragment van het eiwit (PSMC5-CT) (Fig 1C). PSMC5 zonder het coiled coil-domein (PSMC5-ΔCC) was ook niet effectief bij het neerslaan van ΔFosB. Deze bevindingen suggereren dat PSMC5 ΔFosB bindt via zijn coiled-coil domein (aminozuren 27-68). Bovendien precipiteerde PSM-gelabeld PSMC5 geen mutante vorm van ΔFosB met een gemuteerd leucineritssluitingdomein (ΔFosB-LZM) (Fig 1C), wat aangeeft dat ΔFosB ofwel PSMC5 bindt via dit domein ofwel, meer waarschijnlijk, dat ΔFosB heterodimerisatie vereist is voor PSMC5-binding.

PSMC5-ΔFosB-binding in NAc na chronische toediening van cocaïne

Op basis van deze bevindingen in vitro, hebben we onderzocht of PSMC5-niveaus in het NAc zijn veranderd als reactie op chronische cocaïnebeheersing. We vonden door subcellulaire fractionering en Western-blotting dat chronische cocaïne de nucleaire niveaus van PSMC5 in dit hersengebied verhoogt zonder een verandering in cytoplasmatische niveaus (Fig 2A). Dit effect werd niet waargenomen na enkelvoudige doses cocaïne (gegevens niet getoond). We onderzochten vervolgens de lokalisatie van PSMC5 en ΔFosB in NAc door confocale immunofluorescentiemicroscopie. We analyseerden muizen 24 uur na de laatste herhaalde dosis cocaïne, een tijdstip waarop ΔFosB de enige detecteerbare is FosB genproduct (zie Nestler 2008). We vonden sterke PSMC5 immunoreactiviteit in het NAc, inclusief een sterk nucleair signaal. ~ 85% van ΔFosB + kernen samen gekleurd voor PSMC5 (Fig 2B). Daarnaast voerden we co-immunoprecipitatie-experimenten uit met NAc-extracten en ontdekten dat, na een chronische behandeling met cocaïne, AFosB effectief werd afgebroken door een anti-PSMC5-antilichaam (Fig 2C). In tegenstelling toonde analyse van geneesmiddel-naïeve NAc (na herhaalde zoutoplossing injecties) geen detecteerbaar AFosB pull-down (gegevens niet getoond). Deze gegevens komen overeen met onze bevindingen in celkweek en bevestigen dat ΔFosB en PSMC5 in vivo interactief zijn in het NAc.

thumbnail
Fig 2. PSMC5-regeling in muis NAc.

 

A. Western blotting van nucleaire en cytosolische fracties van NAc van muizen die dagelijks werden behandeld met zoutoplossing of cocaïne (20 mg / kg) gedurende 7 dagen, waarbij dieren 24 uur na de laatste injectie werden geanalyseerd. Cocaïne verhoogt de nucleaire maar niet de cytosolische niveaus van PSMC5. Histon H3 en ß-actine, die niet werden beïnvloed door cocaïne, werden gebruikt als laadcontroles. Gegevens zijn gemiddelde ± SEM (n = 8-10 / groep, * p <0.05). B.Co-lokalisatie van endogeen PSMC5 (groen) en ΔFosB (blauw) in NAc van muizen die chronisch werden behandeld met cocaïne zoals in AC Nucleaire lysaten van muis NAc na chronische cocaïnebehandeling werden onderworpen aan immunoprecipitatie met anti-PSMC5-antilichaam of muis-IgG als controle , en vervolgens Western-blotting met anti-FosB / ΔFosB-antilichaam. De figuur toont PSMC5-ΔFosB-interacties in het NAc in vivo. Gegevens in B en C werden in drievoud gerepliceerd in elk van de drie afzonderlijke experimenten.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g002

PSMC5 verbetert ΔFosB-expressie in vitro

Omdat PSMC5 een bekend lid is van het proteasoomcomplex, hebben we getest of het ΔFosB-niveaus reguleert met behulp van Rat 1A-cellen. PSMC5-overexpressie had geen effect op de basale niveaus van ΔFosB, maar veroorzaakte een kleine maar significante verhoging van ΔFosB-inductie na serumstimulatie van de cellen (Fig 3A). Een vergelijkbare trend werd waargenomen voor FosB van volledige lengte, maar het effect bereikte geen statistische significantie. Omgekeerd, de suppressie van endogene PSMC5-expressie in Rat 1A-cellen, bereikt door gebruik van siRNA's die PSMC5 targeten, had geen invloed op de basale ΔFosB-niveaus, maar remde ΔFosB-inductie door serumstimulatie (Fig 3B). Vergelijkbare effecten werden gezien voor FosB van volledige lengte. Deze gegevens suggereren dat PSMC5 de proteasomale afbraak van ΔFosB niet bevordert, zoals verwacht kan worden als een kern-subeenheid van het proteasoom, maar in plaats daarvan nodig is voor maximale accumulatie van FosB genproducten in vitro, misschien door de eiwitten te stabiliseren.

thumbnail
Fig 3. PSMC5-regulatie van FosB / ΔFosB-expressie in Rat 1A-cellen.

 

A. Rat 1A-cellen werden getransfecteerd met 4 ug PSMC5 of controle-DNA. Overexpressie van PSMC5 had geen effect op basale expressieniveaus van FosB- of ΔFosB-eiwit zoals bepaald door Western blotting, maar produceerde een kleine maar significante toename in de inductie van ΔFosB door serumstimulatie (F (2,21, 9.75) = 0.001, 1, p = 5, 5). B. Ratten 1A-cellen werden getransfecteerd met 23 pmol van een van de twee siRNA's of gecodeerd RNA (controle). Beide siRNA's verlaagden effectief PSMC5-eiwitniveaus in vergelijking met controlecondities (siRNA # 2, 18 ± 6% van de controle; siRNA # 0.05, 4 ± 5%; p <2,6; n = 20.99). PSMC0.002-knockdown had geen effect op basale niveaus van FosB of ΔFosB, maar verzwakte de inductie van zowel FosB als ΔFosB door serumstimulatie (FosB: F (2,6) = 22.83, p = 0.002; ΔFosB: F (XNUMX) = XNUMX , p = XNUMX).

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g003

ΔFosB en PSMC5 vormen complexen met CBP, p300 en BRG1 in NAc

Om de transcriptionele mechanismen waardoor PSMC5 de AFosB-functie zou kunnen beïnvloeden beter te begrijpen, onderzochten we mogelijke bijkomende bindingspartners voor de twee eiwitten in het NAc onder chronische met cocaïne behandelde aandoeningen. Er is één rapport dat PSMC5 aan CBP-a HAT bindt en histon H3-acetylatie verhoogt bij de proximale MHC-II-promotor in HeLa-cellen [22]. Bovendien verminderden muizen met een tekort aan CBP-weergave de gedragsgevoeligheid voor cocaïne evenals verminderde histonacetylering bij de FosB promotor [23]. We hebben dus getest of PSMC5 zou kunnen binden met ΔFosB als onderdeel van complexen die ook CBP en mogelijk andere transcriptieactivatoren bevatten.

We hebben eerst aangetoond dat ΔFosB effectief zowel CBP als p300, een verwante HAT, in Neuro2A-cellen (Fig 4A). Daarentegen vertoonde de leucineritsmutante vorm van AFosB, zoals verwacht, deze activiteit niet. Evenzo trok PSMC5 effectief CBP en p300 (Fig 4B). Interessant is dat dit effect ook werd waargenomen voor PSMC5-ΔCC, dat ΔFosB niet naar beneden trok, wat aangeeft dat PSMC5 interageert met CBP en p300 via andere domeinen van het eiwit en onafhankelijk van zijn binding aan ΔFosB.

thumbnail
Fig 4. ΔFosB en PSMC5 interageren met in vitro en in vivo interactie met CBP, p300 en BRG1.

 

A. Neuro2A-cellen werden getransfecteerd met 2.4 μg MYC-gelabeld AFosB of MYC-gelabeld AFosB-LZM. Celextracten werden geïmmunoprecipiteerd met anti-CBP of anti-p300-antilichaam en precipitaten werden Western geblot met hetzelfde antilichaam of met anti-MYC-antilichaam. Zowel CBP als p300 werken samen met ΔFosB en dergelijke interacties vereisen een intacte leucineritssluiting. B. Neuro2A-cellen werden getransfecteerd met 2.4 μg FLAG-gelabeld PSMC5 of FLAG-gelabeld PSMC5-ΔCC. Celextracten werden geïmmunoprecipiteerd met anti-CBP of anti-p300-antilichaam en precipitaten werden Western blotted met hetzelfde antilichaam of met anti-FLAG-antilichaam. Zowel CBP als p300 werken samen met PSMC5 en dergelijke interacties vereisen geen CC-domein. C. Nucleaire lysaten van muizen-NAc na chronische cocaïnebehandeling werden onderworpen aan immunoprecipitatie met anti-CBP of anti-p300-antilichaam. Daaropvolgende Western-blotting van resulterende precipitaten met anti-FosB / AFosB-antilichaam toonde endogene interacties tussen AFosB en CBP / p300. D. Hoeveelheden van dezelfde nucleaire lysaten werden onderworpen aan immunoprecipitatie met anti-BRG1 of anti-PSMC5-antilichaam, gevolgd door Western blotting van precipitaten met anti-FosB / AFosB of anti-BRG1-antilichaam. De resultaten laten endogene interacties zien tussen ΔFosB en BRG1, en BRG1 en PSMC5. E. Schematische illustratie van complex voor transcriptieactivatie samengesteld uit ΔFosB: JunD heterodimers die interageren met CBP / p300, BRG1 en PSMC5.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g004

Om te bevestigen dat deze interacties ook in vivo voorkomen, hebben we chronisch cocaïne toegediend om ΔFosB- en nucleaire PSMC5-niveaus te induceren, vervolgens immunologisch neergeslagen NAc-extracten met anti-CBP- of anti-p300-antilichamen. Consistent met onze celkweekgegevens, immunoprecipitatie van CBP of van p300 effectief afgebroken ΔFosB (Fig 4C). We hebben getest of BRG1, een kernsubeenheid van het SWI-SNF chromatine remodelleringscomplex, ook kan binden aan ΔFosB en PSMC5, op basis van onze eerdere bevinding dat BRG1 wordt gerekruteerd voor bepaalde ΔFosB-doelgenen in overleg met hun activering in NAc na chronische cocaïne [24]. We vonden dat immunoprecipitatie van BRG1 ΔFosB naar beneden trok in NAc-extracten en dat immunoprecipitatie van PSMC5 eveneens endogeen BRG1 coprecipiteerde (Fig 4D). Al deze resultaten suggereren dat ΔFosB-PSMC5 complexen vormt in NAc die ook CBP / p300 en BRG1 (Fig 4E).

PSMC5-overexpressie verhoogt de motorische responsen op cocaïne

De prominente binding van PSMC5 met ΔFosB in NAc zette ons ertoe aan om te onderzoeken of het verhogen van PSMC5-niveaus in dit hersengebied gedragsreacties op cocaïne reguleert. We hebben een Herpes Simplex Virus (HSV) -vector gegenereerd die ofwel wildtype PSMC5 ofwel een van zijn mutanten tot overexpressie brengt en de vectoren in NAc in vivo valideert (Fig 5A). Viraal gemedieerde expressie van PSMC5 overheerst in de celkern (Fig 5B). Muizen die wildtype PSMC5 tot overexpressie brachten vertoonden geen veranderde reacties op aanvankelijke doses cocaïne, maar vertoonden verhoogde locomotoractivatie in reactie op herhaalde cocaïnedoses vergeleken met GFP tot expressie brengende controlemuizen. Daarentegen vertoonden muizen die een mutante vorm van PSMC5 tot overexpressie brengen die zijn coiled-coil domein (PSMC5-ΔCC) niet vertoont dit effect (Fig 5B). Interessant is dat overexpressie van PSMC5-K196M, dat de ATPase-activiteit van het wildtype-eiwit mist, ook de locomotorische respons van cocaïne versterkte.

thumbnail
Fig 5. PSMC5-overexpressie in NAc verhoogt de motorische responsen op cocaïne.

 

A. Representatieve HSV-gemedieerde transgenexpressie in mediale NAc. AC, voorste commissuur. NAc-kern- en shell-subregio's worden op de afbeelding vermeld. B. Representatieve sterkere vergrotingen (60x) van immunohistochemische kleuring van PSMC5 in NAc-neuronen na HSV-PSMC5-injectie, wat aantoont dat het eiwit overwegend nucleair is, zoals gemarkeerd door DAPI-kleuring. C. Muizen ontvingen bilaterale HSV-injecties in NAc, gevolgd door dagelijkse IP-injecties van subdrempeldoses cocaïne (7.5 mg / kg). Motorische reacties worden getoond als reactie op de eerste en laatste van 3 dagelijkse doses van het medicijn. Overexpressie van PSMC5 of PSMC5-K196M verhoogt de locomotorische reacties op herhaalde cocaïne, een effect dat niet werd waargenomen bij PSMC5-ΔCC. Er was geen significant effect van de transgenen op de locomotorische reacties op initiële doses cocaïne. ANOVA F (3,125) = 4.163, * p <0.05 volgens de posthoc-test van Dunnett.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g005

Discussie

De resultaten van de huidige studie onthullen een nieuw mechanisme waarmee ΔFosB de effecten op de hersenen medieert en een nieuw mechanisme dat betrokken is bij cocaïnewerking. Door gebruik te maken van een onbevooroordeelde benadering, een twee-hybride gisttest, identificeerden we PSMC5 als een nieuwe bindingspartner voor ΔFosB. We valideerden deze bevinding zowel in gekweekte cellen in vitro en in het NAc in vivo door het aantonen van robuuste PSMC5-ΔFosB-binding. Belangrijk is dat nucleaire niveaus van PSMC5 worden geïnduceerd in NAc door chronische toediening van cocaïne. We hebben verder aangetoond dat binding van PSMC5-ΔFosB plaatsvindt in combinatie met verschillende andere transcriptie-activator-eiwitten, namelijk CBP en p300 (twee HAT's) en BRG1 (een hoofdbestanddeel van SWI-SNF-chromatine-remodellerende complexen). Samen ondersteunen onze bevindingen de hypothese dat PSMC5 deel uitmaakt van het transcriptionele activatiecomplex dat wordt gerekruteerd voor ten minste bepaalde ΔFosB-geïnduceerde genen tijdens een cursus van chronische cocaïneadministratie (Fig 4E). Consistent met deze hypothese is de extra bevinding dat overexpressie van PSMC5 in NAc, zoals de overexpressie van ΔFosB zelf, gedragsreacties tegen cocaïne bevordert. Het zou interessant zijn in toekomstige studies om deze in vivo observaties te volgen met karakterisering van PSMC5-ΔFosB-HAT-BRG1 interacties met behulp van in vitro reportertests.

De betrokkenheid van PSMC5 bij cocaïnewerking is volledig nieuw. Aanvankelijk geïdentificeerd als een lid van een grote familie van ATPasen die het proteasoom omvatten, is PSMC5 door de jaren heen getoond om te interageren met verschillende transcriptiefactoren, waaronder c-Fos, p53, nucleaire hormoonreceptoren en bestanddelen van het basale transcriptiecomplex [25], echter zijn er in de loop van de jaren weinig functionele onderzoeken uitgevoerd [26]. De beste gevestigde actie is om de activiteit van MYC-transcriptiefactoren in gekweekte cellen te bevorderen [27]. De implicatie van PSMC5 in transcriptionele mechanismen heeft een mogelijke rol voor de ubiquitinerings-proteasomale activiteit in de regulatie van gentranscriptie gesuggereerd, maar de betrokkenheid van PSMC5 bij dergelijke regulering blijft tot op heden vrijwel onbeproefd [28,29].

Er is zeer weinig bekend over de PSMC5-functie in de hersenen. Een eerdere studie toonde wijdverspreide expressie van PSMC5-mRNA aan in de hersenen [30], maar de functionele activiteit ervan is nog niet bestudeerd. Onze bevindingen leiden nu tot verder onderzoek van dit interessante eiwit om de rol ervan in het reguleren van gentranscriptie en de relatie met ubiquitinatie-proteasomale functie in de hersenen beter te begrijpen. De binding van PSMC5 aan ΔFosB wordt gemedieerd door het coiled-coil-domein van PSMC5. Bovendien vereist het vermogen van PSMC5 om locomotorische responsen op cocaïne te bevorderen, terwijl het coiled-coil-domein vereist is, geen ATPase-activiteit die intrinsiek is voor het eiwit. Deze resultaten verhogen de mogelijkheid dat, althans in ons systeem, de hoofdactiviteit van PSMC5 kan worden gemedieerd door zijn binding aan ΔFosB en andere transcriptionele regulatorische eiwitten en niet door zijn proteasomaal gerelateerde activiteit op zich. Verder werk is nodig om deze en alternatieve mogelijkheden direct te testen. De hypothese dat door virussen veroorzaakte overexpressie van PSMC5 de locomotorische responsen op cocaïne verhoogde via interacties met ΔFosB is aannemelijk, ondanks het gebruik van een 3 dag-cocaïne behandelingsregime, omdat bekend is dat aanzienlijke waarden van ΔFosB zich in dit brein ophopen binnen dit tijdsbestek [3].

De huidige bevindingen onderbouwen verder het nut van het gebruik van onbevooroordeelde, open experimentele benaderingen bij het bestuderen van de moleculaire basis van hersenregulatie. Onze aanvankelijke aandacht voor PSMC5 was uitsluitend gebaseerd op de prominente binding ervan aan ΔFosB in een twee-hybride gisttest, maar het lijkt een belangrijk onderdeel te zijn van transcriptionele veranderingen die in NAc worden gerecruteerd door herhaalde toediening van cocaïne. Een beter begrip van de gedetailleerde mechanismen waardoor nucleaire niveaus van PSMC5 worden geïnduceerd door cocaïne en, op zijn beurt, waarmee PSMC5 vervolgens bijdraagt ​​aan door cocaïne geïnduceerde transcriptionele activatiecomplexen, zijn de focus van de huidige onderzoeken. Ondertussen onthulde onze twee-hybride-test van gist verschillende bijkomende vermoedelijke bindingspartners van ΔFosB (Tabel 1) die nu ook direct onderzoek rechtvaardigen in cocaïnemodellen. Samen draagt ​​dit werk bij aan een toenemend inzicht in de complexe moleculaire mechanismen waardoor cocaïne-alterers NAc werken.

Dankwoord

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het National Institute on Drug Abuse, en door de Ishibashi Foundation en de Japan Society for the Promotion of Science (KAKENHI-nummers: 24591735, 26290064, 25116010).

Bijdragen van auteurs

Bedacht en ontwierp de experimenten: YHO YNO EJN. Voer de experimenten uit: YHO YNO PJK RN. Analyse van de gegevens: YHO YNO EJN. Bijgedragen reagentia / materialen / analyse-instrumenten: TN MO OY AN RN TT. Schreef de krant: YHO EJN.

Referenties

  1. 1. Morgan JI, Curran T (1995) Onmiddellijke vroege genen: tien jaar later. Trends Neurosci 18: 66-67. pmid: 7537412 doi: 10.1016 / 0166-2236 (95) 80022-t
  2. 2. Nestler EJ (2008) Transcriptionele verslavingsmechanismen: rol van deltaFosB. Philos Trans R Soc London B Biol Sci 363: 3245-3255. doi: 10.1098 / rstb.2008.0067. PMID: 18640924
  3. Bekijk artikel
  4. PubMed / NCBI
  5. Google Scholar
  6. Bekijk artikel
  7. PubMed / NCBI
  8. Google Scholar
  9. Bekijk artikel
  10. PubMed / NCBI
  11. Google Scholar
  12. Bekijk artikel
  13. PubMed / NCBI
  14. Google Scholar
  15. Bekijk artikel
  16. PubMed / NCBI
  17. Google Scholar
  18. Bekijk artikel
  19. PubMed / NCBI
  20. Google Scholar
  21. Bekijk artikel
  22. PubMed / NCBI
  23. Google Scholar
  24. Bekijk artikel
  25. PubMed / NCBI
  26. Google Scholar
  27. Bekijk artikel
  28. PubMed / NCBI
  29. Google Scholar
  30. Bekijk artikel
  31. PubMed / NCBI
  32. Google Scholar
  33. Bekijk artikel
  34. PubMed / NCBI
  35. Google Scholar
  36. Bekijk artikel
  37. PubMed / NCBI
  38. Google Scholar
  39. Bekijk artikel
  40. PubMed / NCBI
  41. Google Scholar
  42. Bekijk artikel
  43. PubMed / NCBI
  44. Google Scholar
  45. Bekijk artikel
  46. PubMed / NCBI
  47. Google Scholar
  48. Bekijk artikel
  49. PubMed / NCBI
  50. Google Scholar
  51. Bekijk artikel
  52. PubMed / NCBI
  53. Google Scholar
  54. Bekijk artikel
  55. PubMed / NCBI
  56. Google Scholar
  57. Bekijk artikel
  58. PubMed / NCBI
  59. Google Scholar
  60. Bekijk artikel
  61. PubMed / NCBI
  62. Google Scholar
  63. Bekijk artikel
  64. PubMed / NCBI
  65. Google Scholar
  66. Bekijk artikel
  67. PubMed / NCBI
  68. Google Scholar
  69. Bekijk artikel
  70. PubMed / NCBI
  71. Google Scholar
  72. Bekijk artikel
  73. PubMed / NCBI
  74. Google Scholar
  75. Bekijk artikel
  76. PubMed / NCBI
  77. Google Scholar
  78. Bekijk artikel
  79. PubMed / NCBI
  80. Google Scholar
  81. Bekijk artikel
  82. PubMed / NCBI
  83. Google Scholar
  84. Bekijk artikel
  85. PubMed / NCBI
  86. Google Scholar
  87. Bekijk artikel
  88. PubMed / NCBI
  89. Google Scholar
  90. 3. Hope BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, et al. (1994) Inductie van een langdurig AP-1-complex dat bestaat uit veranderde Fos-achtige eiwitten in de hersenen door chronische cocaïne en andere chronische behandelingen. Neuron 13: 1235-1244. pmid: 7946359 doi: 10.1016 / 0896-6273 (94) 90061-2
  91. 4. Hiroi N, Brown J, Haile C, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ (1997) FosB-mutante muizen: verlies van chronische cocaïne-inductie van Fos-gerelateerde eiwitten en verhoogde gevoeligheid voor de psychomotorische en belonende effecten van cocaïne. Proc Natl Acad Sci USA 94: 10397-10402. pmid: 9294222 doi: 10.1073 / pnas.94.19.10397
  92. 5. Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ (2006) Regulering van ΔFosB-stabiliteit door fosforylatie. J Neurosci 26: 5131-5142. pmid: 16687504 doi: 10.1523 / jneurosci.4970-05.2006
  93. 6. Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A, et al. (2007) Afwezigheid van geconserveerd C-terminaal degron-domein draagt ​​bij aan de unieke stabiliteit van ΔFosB. Eur J Neurosci 25: 3009-3019. PMID: 17561814
  94. 7. Robison AJ, Vialou V, Mazei-Robison M, Feng J, Kourrich S, Collins M, et al. (2013) Gedrags- en structurele reacties op chronische cocaïne vereisen een feed-forward-lus waarbij ΔFosB en CaMKII in de nucleus accumbens-schaal betrokken zijn. J Neurosci 33: 4295-4307 doi: 10.1523 / JNEUROSCI.5192-12.2013. PMID: 23467346
  95. 8. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, et al. (1999) Expressie van de transcriptiefactor ΔFosB in de hersenen regelt de gevoeligheid voor cocaïne. Natuur 401: 272-276. PMID: 10499584
  96. 9. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW (2003) ΔFosB verbetert de incentive voor cocaïne. J Neurosci 23: 2488-2493. PMID: 12657709
  97. 10. McClung CA, Nestler EJ (2003) Regulering van genexpressie en cocaïnebeloning door CREB en DFosB. Nat Neurosci 11: 1208-1215. pmid: 14566342 doi: 10.1038 / nn1143
  98. 11. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, et al. (2006) ΔFosB: een essentiële rol voor ΔFosB in de nucleus accumbens in morfineactie. Nature Neurosci 9: 205-211. pmid: 16415864 doi: 10.1038 / nn1636
  99. 12. Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, et al. (2003) Induceerbare, hersenregio-specifieke expressie van een dominante negatieve mutant van c-Jun in transgene muizen verlaagt de gevoeligheid voor cocaïne. Brain Res 970: 73-86. pmid: 12706249 doi: 10.1016 / s0006-8993 (03) 02230-3
  100. 13. Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, et al. (1995) Regulatie van delta FosB en FosB-achtige eiwitten door elektroconvulsieve aanvallen en cocaïnebehandelingen. Mol Pharmacol 48: 880-889. PMID: 7476919
  101. 14. Hiroi N, Marek GJ, Brown J, Ye H, Saudou F, Vaidya VA, et al. (1998) Essentiële rol van het fosB-gen in moleculaire, cellulaire en gedragsmatige acties van elektroconvulsieve aanvallen. J Neurosci 18: 6952-6962. PMID: 9712664
  102. 15. Perez-Otano I, Mandelzys A, Morgan JI (1998) MPTP Parkinsonisme gaat gepaard met persistente expressie van een D-FosB-achtig eiwit in dopaminerge routes. Mol Brain Res 53: 41-52. pmid: 9473580 doi: 10.1016 / s0169-328x (97) 00269-6
  103. 16. Ma J, Ptashne M (1988) Een eukaryote transcriptionele remmer converteren in een activator. Cel 55: 443-446. pmid: 3180218 doi: 10.1016 / 0092-8674 (88) 90030-x
  104. 17. Chien CT, Bartel PL, Sternglanz R, Fields S (1991) Het twee-hybride systeem: een methode voor het identificeren en klonen van genen voor eiwitten die interageren met een eiwit van belang. Proc Natl Acad Sci USA 88: 9578-9582. pmid: 1946372 doi: 10.1073 / pnas.88.21.9578
  105. 18. Nakabeppu Y 1, Oda S, Sekiguchi M (1993) Proliferatieve activering van rustende Rat-1A-cellen door delta FosB. Mol Cell Biol 13: 4157-4166. PMID: 8321220
  106. 19. Scobie KN, Damez-Werno D, Sun H, Shao N, Gancarz A, Panganiban CH, et al. (2014) Essentiële rol van poly (ADP-ribosyl) atie bij cocaïnewerking. Proc Natl Acad Sci USA 111: 2005-2010. doi: 10.1073 / pnas.1319703111. PMID: 24449909
  107. 20. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, et al. (2008) Verschillende patronen van ΔFosB-inductie in de hersenen door misbruik door drugs. Synapse 62: 358-369. doi: 10.1002 / syn.20500. PMID: 18293355
  108. 21. Wang WL, Chevray PM, Nathans D (1996) Mammalian Sug1 en c-Fos in het nucleaire 26S-proteasoom. Proc Natl Acad Sci USA 93: 8236-8240. pmid: 8710853 doi: 10.1073 / pnas.93.16.8236
  109. 22. Koues OI 1, Dudley RK, Truax AD, Gerhardt D, Bhat KP, McNeal S, et al. (2008) Regulering van acetylatie bij de major histocompatibility complex klasse II proximale promotor door de 19S proteasomale ATPase Sug1. Mol Cell Biol 28: 5837-5850. doi: 10.1128 / MCB.00535-08. PMID: 18662994
  110. 23. Levine AA, Guan Z, Barco A, Xu S, Kandel ER, Schwartz JH (2005) CREB-bindend eiwit regelt de reactie op cocaïne door histonen te acetyleren op de fosB-promotor in het striatum van de muis. Proc Natl Acad Sci USA 102: 19186-19191. pmid: 16380431 doi: 10.1073 / pnas.0509735102
  111. 24. Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DEH, Truong HT, et al. (2005) Chromatine hermodellering is een sleutelmechanisme dat ten grondslag ligt aan door cocaïne geïnduceerde plasticiteit in striatum. Neuron 48: 303-314. pmid: 16242410 doi: 10.1016 / j.neuron.2005.09.023
  112. 25. St-Arnaud R (1999) Dubbele functies voor transcriptionele regulatoren: mythe of realiteit. J Cell Biochem Suppl 32/33: 32-40. doi: 10.1002 / (sici) 1097-4644 (1999) 75: 32+ <32 :: aid-jcb5> 3.0.co; 2-x
  113. 26. Ferrell K, Wilkinson CRM, Dubiel W, Gordon C (2000) Regulatory subunit-interacties van het 26S-proteasoom, een complex probleem. Trends Biochem Sci 25: 83-88. pmid: 10664589 doi: 10.1016 / s0968-0004 (99) 01529-7
  114. 27. von der Lehr N, Johansson S, Larson LG (2003) Implicatie van het ubiquitine / proteasoomsysteem in myc-gereguleerde transcriptie. Celcyclus 2-5: 403-407. doi: 10.4161 / cc.2.5.484
  115. 28. Geng FQ, Wenzel S, Tansey WP (2012) Ubiquitine en proteasomen in transcriptie. Annu Rev Biochem 81: 177-201. doi: 10.1146 / annurev-biochem-052110-120012. PMID: 22404630
  116. 29. Collins GA, Tansey WP (2006) Het proteasoom: een hulpprogramma voor transcriptie? Curr Op Genet Dev 16: 197-202. PMID: 16503126
  117. 30. Sun DH, Swaffield JC, Johnston SA, Milligan CE, Zoeller RT, Schwartz LM (1997) Identificatie van een fylogenetisch geconserveerd Sug1 CAD-familielid dat differentieel tot expressie wordt gebracht in het zenuwstelsel van de muis. Dev Neurobiol 33: 877-890. doi: 10.1002 / (sici) 1097-4695 (199712) 33: 7 <877 :: aid-neu2> 3.0.co; 2-5