J Neurosci. 2006 May 10;26(19):5131-42.
Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ.
bron
Afdeling Psychiatrie, Centrum voor Basic Neuroscience, The University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Texas 75390-9070, VS.
Abstract
De transcriptiefactor DeltaFosB (ook aangeduid als FosB2 of FosB [korte vorm]) is een belangrijke bemiddelaar van de langetermijnplasticiteit die in de hersenen wordt geïnduceerd door chronische blootstelling aan verschillende soorten psychoactieve stimuli, waaronder drugs tegen misbruik, stress en elektroconvulsieve aanvallen. . Een ander kenmerk van DeltaFosB is dat het, eenmaal geïnduceerd, gedurende relatief lange perioden in de hersenen blijft bestaan zonder verdere stimulatie. De mechanismen die aan deze schijnbare stabiliteit ten grondslag liggen, zijn echter onbekend gebleven. Hier tonen we aan dat DeltaFosB een relatief stabiele transcriptiefactor is, met een halfwaardetijd van ongeveer 10 h in celculturen. Bovendien laten we zien dat DeltaFosB een fosfoproteïne in de hersenen is en dat fosforylatie van een sterk geconserveerde serine-residu (Ser27) in DeltaFosB het beschermt tegen proteasomale afbraak. We bieden verschillende bewijslijnen die suggereren dat deze fosforylering wordt gemedieerd door caseïnekinase 2. Deze bevindingen vormen het eerste bewijs dat DeltaFosB gefosforyleerd is en tonen aan dat fosforylatie bijdraagt aan de stabiliteit, wat de kern is van zijn vermogen om langdurige aanpassingen in de hersenen te bemiddelen.
Introductie
De transcriptiefactor ΔFosB, ook aangeduid als FosB2 of FosB [korte vorm], is een C-terminaal getrunceerde splicevariant van het directe vroege gen FosB (Dobrazanski et al., 1991; Nakabeppu en Nathans, 1991; Yen et al., 1991). Net als FosB van volledige lengte, heeft ΔFosB een DNA-bindend basisdomein en een leucineritssluiting waardoor het met Jun-eiwitten dimeriseert om activatorproteïne-1 (AP-1) transcriptiefactorcomplexen te vormen, die de expressie van veel genen reguleren (Morgan en Curran, 1995; Rylski en Kaczmarek, 2004). Ondanks het ontbreken van een deel van het transactivatiedomein dat wordt gevonden in de C-terminus van FosB, fungeert ΔFosB als zowel een krachtige transcriptionele activator als repressor in gekweekte cellen en in de hersenen (Dobrazanski et al., 1991; Nakabeppu en Nathans, 1991; Chen et al., 1997; McClung en Nestler, 2003; Kumar et al., 2005).
ΔFosB wordt geïnduceerd tot hoge niveaus op een regiospecifieke manier in de hersenen na chronische, maar niet acute, blootstelling aan een verscheidenheid aan psychoactieve stimuli, waaronder stress, bepaalde laesies, antipsychotica en antidepressiva, misbruikverslaafden en natuurlijke beloningen (Hope et al., 1994b; Hiroi en Graybiel, 1996; Moratalla et al., 1996; Bing et al., 1997; Mandelzys et al., 1997; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002; Andersson et al., 2003; Colby et al., 2003; Peakman et al., 2003; Perrotti et al., 2004; Zachariou et al., 2006). De inductie van ΔFosB is direct gerelateerd aan de functionele effecten van verschillende van deze stimuli op de hersenen. De persistentie van ΔFosB, zelfs in de afwezigheid van extra stimulatie, onderscheidt het van alle andere transcriptiefactoren van de Fos-familie, die snel worden geïnduceerd als reactie op acute stimuli, binnen enkele uren terugkeren naar basale niveaus en in het algemeen desensibilisatie vertonen na chronische stimulatie (Hope et al., 1992; Daunais et al., 1993; Persico et al., 1993; Hiroi en Graybiel, 1996; Perrotti et al., 2004). Dit maakt ΔFosB een aantrekkelijke kandidaat om enkele van de langdurige veranderingen in genexpressie die ten grondslag liggen aan de stabiele neuronale aanpassingen veroorzaakt door bepaalde chronische stimuli, te bemiddelen.
Omdat de verlengde aanwezigheid van ΔFosB optreedt bij afwezigheid van verdere inductie van het mRNA (Chen et al., 1995), speculeerden we dat, in tegenstelling tot FosB van volledige lengte en alle andere eiwitten van de Fos-familie, die intrinsiek onstabiel zijn, ΔFosB een ongebruikelijk stabiele transcriptiefactor kan zijn (Hope et al., 1994b; Chen et al., 1997; Nestler et al., 2001; McClung et al., 2004). Bovendien suggereerde immunoblotanalyse van acuut versus chronisch gestimuleerd hersenweefsel dat ΔFosB duidelijk verschuift Mr (moleculaire massa) van ~33 kDa in de acute toestand tot ~35-37 kDa tijdens chronische behandeling (Hope et al., 1994a; Chen et al., 1995). Omdat er geen bewijs is voor het bestaan van additionele mRNA's die voor deze verschillende isovormen zouden kunnen coderen, speculeerden we verder dat ΔFosB posttranslationeel is gemodificeerd en dat dit misschien bijdraagt aan zijn ongebruikelijke stabiliteit. Tot op heden zijn echter geen biochemische analyses van de omzet of posttranslationele modificaties van ΔFosB gerapporteerd. Het doel van de huidige studie was om te bepalen of ΔFosB een fosfoproteïne is en of fosforylering een rol speelt in de stabiliteit ervan.
Materialen en methoden
Zoogdiercellijnen en DNA-constructen.
PC12-cellen (Clontech, Mountainview, CA) werden gekweekt in DMEM met hoog glucose-gehalte dat l-glutamine (L-Gln) bevat en aangevuld met 5% foetaal runderserum (FBS), 10% paardenserum (beide van Invitrogen, Carlsbad, CA) , 100 U / ml penicilline en 100 μg / ml streptomycine (beide van Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). HeLa-cellen (American Type Culture Collection, Manassas, VA) werden gekweekt in DMEM met een hoog glucosegehalte dat L-Gin bevat en aangevuld met 10% FBS, penicilline en streptomycine. Beide cellijnen werden op 37 ° C gehouden in een vochtig 5% CO2 atmosfeer.
Voor de transiënte transfecties met DNA werden PC12- of HeLa-cellen gezaaid op platen met zes putjes (bekleed met collageen I voor PC12-cellen) om 90-100% confluentie de volgende dag te bereiken en werden vervolgens getransfecteerd met behulp van Lipofectamine 2000 (Invitrogen). In sommige experimenten (zie Fig. 1⇓⇓⇓⇓⇓-7), Werd AFB kortstondig tot expressie gebracht in PC12-cellen via infectie met recombinant herpes simplex-virus (HSV).
ΔFosB en FosB cDNA's werden verkregen van onze eigen pTetop-constructen (Chen et al., 1997) en gesubkloneerd in een pcDNA3.1-vector (Invitrogen). Deze pcDNA3.1-ΔFosB / FosB-constructen werden gebruikt voor expressie in zoogdiercellen en als een matrijs voor plaatsgerichte mutagenese. Recombinant HSV-ΔFosB werd bereid zoals eerder beschreven (Neve et al., 1997) en de voorbereiding had een titer van ~1 × 108 pfu / ml.
Pulse-chase-experimenten.
Ongeveer 24 h na infectie / transfectie werden cellen (PC12 of HeLa) in platen met zes putjes twee tot drie keer gewassen met 2 ml PBS en geïncubeerd bij 37 ° C voor ~1 h in 2 ml Cys / Met-vrij DMEM (Invitrogen) aangevuld met 5% gedialyseerd FBS (Hyclone, Logan, UT) om intracellulaire pools van Met en Cys te depleteren. Aan het einde van deze periode van "verhongering" werden geneesmiddelen (als cellen moesten worden behandeld) toegevoegd en cellen werden gelabeld (puls) met 12-25 μCi van 35S Protein Labelling Mix (PerkinElmer, Wellesley, MA) voor ~1 h bij 37 ° C om alle nieuw gesynthetiseerde eiwitten te labelen. Het radioactieve label werd vervolgens verwijderd door de cellen twee tot drie keer te wassen met 2 ml PBS, en de 35S-gelabelde eiwitten werden gevolgd (achtervolging) door het medium te vervangen door "koud" (niet-radioactief) medium aangevuld met 5% FBS en de cellen op verschillende tijdstippen te oogsten. Celbehandelingen werden gedurende de gehele jacht gehandhaafd. Alle figuren van deze experimenten vertonen vergelijkbare initiële hoeveelheden van de verschillende eiwitten om vergelijkingen van hun omzettingssnelheden te optimaliseren.
Dieren en chronische behandeling met elektroconvulsieve aanvallen.
Volwassen Sprague Dawley mannelijke ratten (200-300 g; Charles River Laboratories, Kingston, RI) werden eenmaal daags behandeld met elektroconvulsieve aanvallen (ECS) voor 7-9 d. ECS werd uitgevoerd zoals eerder beschreven (Hope et al., 1994a) met behulp van een Ugo Basile (Comerio VA, Italië) ECS-eenheid met de volgende instellingen: frequentie, 100-pulsen / s; pulseren met, 0.5 ms; schokduur, 1.0 s; en stroom, 75 mA. Sham-controledieren werden parallel behandeld door de oorclipelektroden zonder elektrische stroom aan te leggen.
32 P metabolische labeling.
Voor het labelen van hersenplakjes werden ratten onthoofd, de hersenen snel ontleed en 300 μm frontale corticale plakken werden bereid met een DSK-microslicer (Ted Pella, Redding, CA). De plakjes werden geïncubeerd in plastic buizen in 2 ml fosfaat-deficiënte kunstmatige CSF (ACSF) en op 30 ° C gehouden onder constant zacht borrelen met een O2/CO2 mengsel (Hemmings et al., 1989). De plakken (twee plakken per buis) werden gelabeld met 1.3 mCi voor 8-10 h in de aanwezigheid of afwezigheid van okadaïnezuur (100 ng / ml). Aan het einde van deze incubatie werden de plakken ten minste driemaal gespoeld met koude ACSF en vervolgens gehomogeniseerd door sonicatie in 250 pl koud radio-immunoprecipitatietest (RIPA) buffer [PBS, pH 7.4, 150 mm NaCl, 1% (v / v) ) Igepal, 0.5% (w / v) natriumdeoxycholaat, 0.1% (w / v) SDS, 1 mm EDTA] aangevuld vóór gebruik met SDS tot 0.6%, proteaseremmercocktail voor zoogdiercellen (gebruikt bij 5 μl / ml; Sigma-Aldrich), fosfataseremmercocktails I en II (gebruikt bij 1: 100; Sigma-Aldrich), 1 mm PMSF en 2% glycerol. Homogenaten werden daarna gekookt voor 15 min en geklaard door centrifugatie bij 15,000 x g voor 15 min. Eiwitconcentratie in de resulterende supernatanten werd beoordeeld met behulp van de BCA-eiwitbepaling (Pierce, Holmdel, NJ).
Voor de 32P-labeling van gekweekte cellen, ~24 h na infectie / transfectie, cellen werden twee- tot driemaal gewassen met fosfaatvrij medium en geïncubeerd in dit medium voor ~1 h. Na deze uithongerperiode, 0.2-0.3 mCi van 32PH3PO4 (PerkinElmer) werden aan elk putje toegevoegd en cellen werden gelabeld voor 4-12 h afhankelijk van het soort experiment (zie Figuren 1-7 voor specificaties). Cellen werden vervolgens driemaal gewassen met PBS en gelyseerd op ijs gedurende 15 min met 50 pl van gesupplementeerde RIPA-buffer. Lysaten werden verzameld door schrapen en werden 10 keer door een 25 ga-naald gevoerd om DNA te scheuren, gekookt voor 10 min en gecentrifugeerd bij 15,000 rpm voor 15-30 min bij 4 ° C. De geklaarde lysaten (supernatanten) werden overgebracht naar een nieuwe buis en een BCA-eiwitbepaling (Pierce) werd uitgevoerd. Alle figuren van deze experimenten tonen vergelijkbare hoeveelheden totale wild-type (WT) en S27A AFosB-eiwitten om vergelijkingen van hun relatieve fosforyleringsniveaus te optimaliseren.
Chemicaliën en celkweekbehandelingen.
Okadaïnezuur (OA; Sigma-Aldrich) werd opgelost in ethanol en gebruikt in een eindconcentratie van 100 ng / ml. 5,6-Dichloor-1-p-d-ribofuranosyl-benzimidazool (DRB; Biomol, Plymouth Meeting, PA) werd opgelost in dimethylsulfoxide (DMSO; Sigma-Aldrich) en gebruikt in celkweek in een eindconcentratie van 50 μm. Spermine (Sigma-Aldrich) werd opgelost in water en gebruikt in een eindconcentratie van 200 μm. Calphostin-C (Biomol) werd opgelost in DMSO en gebruikt bij 0.2 μm, terwijl forbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA; Promega, Madison, WI) werd opgelost in DMSO en werd gebruikt bij 0.1 μm. myristoylated-autocamtide-2-gerelateerd remmend peptide (m-AIP; Biomol) werd opgelost in water en gebruikt bij een eindconcentratie van 1 en 10 μm. De breed-spectrum proteïne kinase remmers H-7 en H-8 (Biomol) werden opgelost in water en gebruikt in een eindconcentratie van respectievelijk 150 en 200 μm. MG132 (Calbiochem, San Diego, CA) en epoxomicine (Peptides International, Louisville, KY) werden beide opgelost in DMSO en gebruikt in een eindconcentratie van respectievelijk 12.5 en 7.5 μm. In alle experimenten werd DMSO (vehiculum) aan cellen toegevoegd zoals noodzakelijk om een constante hoeveelheid DMSO over alle behandelingen te handhaven. Voor 32P-labelingexperimenten, de geneesmiddelen werden direct voor het label toegevoegd en gedurende de resterende periode van etikettering bewaard. Voor pulse-chase-experimenten werden drugs toegevoegd ten tijde van Cys / Met "uithongering", gedurende de etiketteerperiode, en vervolgens weer in het chase-medium toegevoegd. De proteasoomremmers werden tijdens de gehele chase elke 3-4 h verrijkt om te compenseren voor de snelle turnover van deze peptiden.
ΔFosB immunoprecipitatie, immunoblotting en autoradiografie.
Voor immuunprecipitaties werden lysaten 1: 5 met gewoon RIPA verdund om de SDS-concentratie terug te brengen tot 0.1% voordat wordt doorgegaan met immunoprecipitatie (IP). Om niet-specifieke binding te beperken, werden de lysaten eerst geklaard door immunoprecipitatie met niet-immuun IgG en eiwit G-Sepharose (Sigma-Aldrich) gedurende ten minste 4 h. ΔFosB werd vervolgens immuungeprecipiteerd uit de geklaarde lysaten met behulp van een polyklonaal geitenantilichaam dat een intern epitoop herkent dat aanwezig is in zowel FosB als ΔFosB (SC-48G; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) bij 0.5-1 μg IgG per 10 μg lysaat-eiwit (50-300 μg totaal eiwit) in een totaal volume van 0.5 ml. IP's werden voorzichtig gemengd bij 4 ° C op een rotor gedurende ten minste 8 h en vervolgens werd 15 μl proteïne G-Sepharose toegevoegd en IP's werden gemengd voor ten minste een andere 4 h. IP's werden gepelleteerd door te draaien bij 3000 × g voor 3-5 min bij 4 ° C, driemaal gewassen met 0.5 ml koudgewalste RIPA en twee keer met koude PBS met 0.1% Tween 20. IP's werden vervolgens opnieuw gesuspendeerd in 0.5 ml koude PBS, overgebracht, tot korrels gevormd in een nieuwe buis en immunologisch neergeslagen eiwitten werden vervolgens geëlueerd door de toevoeging van 15-25 μl van 2 x reducerende Laemmli-eiwitmonsterbuffer. Dit IP-protocol resulteerde in de specifieke en effectieve precipitatie van vrijwel alle ΔFosB in het lysaat. De geïmmunoprecipiteerde eiwitten werden onderworpen aan SDS-PAGE door het gehele IP te laden op een 12.5% Tris-HCl-Criterion-gel (Bio-Rad, Hercules, CA) en vervolgens overgebracht op PVDF of nitrocellulose. Na overdracht was het membraan aan de lucht gedroogd en 32P- en 35S-radioactief gemerkte eiwitbanden werden waargenomen door autoradiografie met behulp van Kodak (Rochester, NY) autoradiografische film, evenals door fosforimaging met behulp van een Storm (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) PhosphorImager. Totaal (niet-gefosforyleerd en gefosforyleerd) ΔFosB in cellysaten of hersenhomogenaten werd gedetecteerd door immunoblotting van ofwel het geïmmunoprecipiteerde eiwit (met behulp van hetzelfde membraan dat werd gebruikt om de 32P-gemerkt eiwit), of van gelijke hoeveelheden lysaat / homogenaat-eiwit onderworpen aan SDS-PAGE en overgebracht op PVDF of nitrocellulose. Het membraan werd eerst geblokkeerd door het te incuberen met 1% (w / v) magere melkpoeder (Bio-Rad) in PBS aangevuld met 0.1% (v / v) Tween 20 (Sigma) voor 1 h bij 25 ° C. Het membraan werd vervolgens gedurende de nacht onderworpen aan immunoblotting bij 4 ° C met ons eigen konijn anti-FosB polyklonaal antilichaam gegenereerd tegen aminozuren 1-16 van FosB / AFosB (gebruikt bij 1: 10,000). Na primaire incubatie werden de membranen vier keer gewassen voor 5 min met blokkerende buffer en vervolgens geïncubeerd bij 25 ° C gedurende ~1 h met een geit anti-konijnen IgG geconjugeerd met mierikswortelperoxidase (gebruikt bij 1: 5000 in blokkeerbuffer, van Vector Laboratories, Burlingame, CA). Membranen werden vervolgens drie keer gewassen voor 10 min met blokkeerbuffer en één keer voor 5 min met PBS. Totale ΔFosB-eiwitbanden werden zichtbaar gemaakt op Kodak MR-film door verbeterde chemiluminescentie (Pierce) en / of door detectie van fluorescentie met behulp van de ECL-Plus-reagentia (Amersham Biosciences) en de Storm PhosphorImager.
Overexpressie en zuivering van recombinant AFosB uit insectencellen.
ΔFosB werd tot overexpressie gebracht in Sf9-insectencellen als een N-terminaal hexa-His-gelabeld eiwit (N-His (6) ΔFosB) met behulp van het Bac-naar-Bac baculovirus-expressiesysteem (Invitrogen) en volgens de instructies van de fabrikant. In het kort werd het ΔFosB cDNA (resten 2-237) voorafgegaan door de affiniteit N-terminale tag MGHHHHHHAG gesubkloneerd in de pFASTBacTM1-vector, die werd gebruikt voor het genereren van recombinant baculovirus. Sf9-cellen werden geïnfecteerd met recombinant virus en N-His (6) AFosB werd gezuiverd uit cellysaten door verschillende chromatografische stappen waaronder affiniteitschromatografie met behulp van een nikkelkolom (Qiagen, Valencia, CA), anionenuitwisseling met behulp van een mono-Q-kolom (Amersham Biosciences) en grootte-uitsluiting met behulp van een gelfiltratiekolom (Amersham Biosciences).
In vitro fosforylatie-onderzoeken.
In vitro fosforyleringsreacties voor tijdsverloop en stoichiometrie-analyse werden uitgevoerd in een volume van 30 μl met 10 μm-substraat (N-His (6) ΔFosB of een positief controlesubstraat), 250 μm ATP en 1 μCi / μl [γ-32P] ATP, de buffer geleverd door de kinasefabrikant en een van de volgende kinasen: CK2 (20 ng / μl; Upstate, Charlottesville, VA), CaMKII (10 ng / μl; Upstate), PKC (1.6 ng / μl; Calbiochem) of p70S6K (2.5 mU / μl; Upstate). Tijdsverloopreacties werden uitgevoerd door het verwijderen van 5 pl-aliquots uit de reactieoplossing op de aangewezen tijdstippen en het toevoegen van een gelijk volume 4 x reducerende Laemmli-eiwitmonsterbuffer. Michaelis-Menten kinetische parameters voor de CK2-reactie werden bepaald onder empirisch gedefinieerde lineaire steady-state condities. Deze reacties werden uitgevoerd voor 15 min in een volume 10 μl met 2 ng / μl enzym, 250 μm ATP, 1 μCi / μl [γ-32P] ATP- en N-His (6) ΔFosB-concentraties van 2.5-30 μm. Alle reacties werden uitgevoerd bij 30 ° C in een waterbad. Na SDS-PAGE en kleuring van de gel met Bio-Safe Coomassie (Bio-Rad), werd de gel gedroogd en 32Opname van P-fosfaat werd beoordeeld door middel van fosforbeeldvormende analyse (zie hieronder, kwantificering van gegevens, berekeningen en statistieken).
Tweedimensionale fosfopeptidekaart en fosfoaminozuuranalyse.
Beide analyses werden uitgevoerd zoals beschreven door Ploegh en Dunn (2000). In het kort, droge gelfragmenten die bevatten 32P-gelabeld ΔFosB (ofwel van in vitro reacties of van immunoprecipitaten van metabolisch gemerkte cellen), werden uitgesneden, gerehydrateerd, gewassen en onderworpen aan tryptische digestie. Het supernatant dat de tryptische digestieproducten bevatte, werd gelyofiliseerd en het lyofilaat werd verschillende keren gewassen en geresuspendeerd in 10 μl elektroforesebuffer, pH 1.9. Monster (3 pl) werd op een dunne-laag-chromatografieplaat (TLC) van cellulose (Analtech, Newark, DE) gespot en in één dimensie gescheiden door elektroforese en de andere dimensie door oplopende TLC. De resulterende fosfopeptidekaarten werden gevisualiseerd door autoradiografie en fosforimaging. Voor fosfoaminozuuranalyse werd 2 pl van de tryptische digesties die opnieuw gesuspendeerd waren in elektroforesepooler verder gesplitst door HCl-hydrolyse bij 105 ° C gedurende 25 min in 3 m HCl onder een N2 atmosfeer. De reactie werd gestopt door een zesvoudige verdunning in water en het mengsel werd gelyofiliseerd. Het lyofilaat werd opnieuw gesuspendeerd in 5 μl elektroforesebuffer, pH 1.9 en op een cellulose-TLC-plaat aangebracht samen met fosfo-Ser, -Thr en -Tyr-standaarden. Elektroforese werd uitgevoerd over de helft van de lengte van de TLC-plaat met behulp van elektroforesebuffer, pH 1.9, en vervolgens werd de plaat overgebracht naar de pH 3.5-buffer en werd de elektroforese voltooid. De fosfoaminozuurstandaarden werden gevisualiseerd door de TLC-plaat te sproeien met een 1% (v / v) ninhydrine-oplossing in aceton, en de 32P-gelabelde aminozuurmonsters werden gevisualiseerd door zowel autoradiografie als fosforimaging.
door siRNA geïnduceerde CK2α knock-down.
We gebruikten een RNA-interferentiemethode om selectief de niveaus van CK2 te verlagen (Di Maira et al., 2005). PC12-cellen werden gezaaid op met collageen I beklede platen met zes putjes om ~ 70-80% confluentie de volgende dag te bereiken, wanneer ze tijdelijk werden getransfecteerd met 20 nm (eindconcentratie) van ofwel niet-doelgericht siRNA of siRNA gericht tegen het mRNA van de katalytische a-subeenheid van Rat CK2, met 5 pl van het transfectiemiddel SilentFectin (Bio-Rad) en volgens de instructies van de fabrikant. Bij benadering 24 h later werden cellen transiënt getransfecteerd met AFosB plasmide, zoals hierboven vermeld. Ongeveer 24 h later (~48 h na siRNA-transfectie) werden cellen onderworpen aan ofwel 32P metabole labeling of pulse-chase-analyse zoals hierboven beschreven. De volgende vier CK2α-siRNA's werden gebruikt met vergelijkbare resultaten: 5'P-CAAACUAUAAUCGUACAUCUU3 ', 5'P-UCAAUCAU-GACAUUAUGCGUU3', 5'P-UAGUCAUAUAAAUCUUCCGUU3 ', 5'P-AAAUCCCUG ACAUCAUAUUUU3' (Dharmacon, Lafayette, CO). Als een negatieve controle hebben we gebruikt Geluiddemper negatieve controle #3 siRNA van Ambion (Austin, TX). De mate van CK2 knock-down werd gevolgd door immunoblotten met behulp van een anti-CK2 polyklonaal antilichaam (catalogus # 06-873 van Upstate) gedurende de nacht bij een 1: 1000 verdunning. P-tubuline werd gebruikt als een ladingscontrole en gedetecteerd met een monoklonaal antilichaam (catalogus # 05-661 uit Upstate) gedurende de nacht bij een 1: 20,000-verdunning.
Plaatsgerichte mutagenese.
Mutatie van Ser27 naar Ala of naar Asp werd bereikt met behulp van een Quick Change Site-Directed Mutagenesis-kit (Stratagene, La Jolla, CA) en volgens de instructies van de fabrikant. Om de Ser27-mutaties in het muizen-FAsB-eiwit te introduceren, werden de volgende mutageneseprimers gebruikt. Ser27 naar Ala: (reverse primer) 5'GCCGAAGGAGTCCACCGAAGCCAGGTACTGAGACTCGGCGGAGGG3 '. Ser27 naar Asp (forward primer) 5'CCCTCCGCCGAGTCTCAGTACCTGGATTCGGTGGACTCCTTCGGC3 '. De gemuteerde basen zijn vetgedrukt en het Ser27-codon is cursief gedrukt.
Bio-informatica.
Potentiële fosforylatieplaatsen en kinasen voor AFosB werden doorzocht door de muizeneiwitsequentie in te dienen bij gespecialiseerde databases waaronder ProSite (http://www.expasy.org/prosite/), PredictProtein (Rost et al., 2004) en NetPhosK (Blom et al., 2004).
Gegevenskwantificering, berekeningen en statistieken.
De hoeveelheid eiwit aanwezig in de PVDF of nitrocellulosemembraan werd gekwantificeerd met behulp van een Storm PhosphorImager en de bijbehorende ImageQuant-software (Amersham Biosciences / Molecular Dynamics). In de celkweek en hersenplak fosforylatie studies, de waarden verkregen voor de 32Met P gemerkt eiwit werd vervolgens gedeeld door de waarden die werden verkregen voor totaal ABosB en uitgedrukt als een verhouding. In de in vitro fosforylatie-onderzoeken, de hoeveelheid 32P-gelabeld AFosB per mol AFosB (stoichiometrie) werd berekend zoals eerder beschreven (Sahin et al., 2004). Alle metingen werden uitgevoerd binnen het lineariteitsbereik van het gebruikte instrument. Kinetische parameters werden berekend met behulp van het Michaelis-Menten-model, waarbij V = VMax[S] / ([S]+KM) en VMax = k2[ETotaal]. De halfwaardetijd (t1/2) van ΔFosB en FosB werden geschat op basis van de puls-chase-grafieken (met behulp van de niet-lineaire regressie die het best bij de gegevenspunten paste) en komen overeen met het tijdstip waarop de hoeveelheid overblijvend eiwit 50% van het origineel is. In alle figuren zijn de weergegeven resultaten representatief voor ten minste twee tot drie onafhankelijke experimenten. In alle grafieken zijn de weergegeven gemiddelden gemiddelden ± SEM's (3 ≤ n ≤16). De statistische significantie van verschillen werd beoordeeld met behulp van een ongepaarde t test, gecorrigeerd voor meerdere vergelijkingen en de sterretjes geven aan p ≤ 0.05.
Resultaten
ΔFosB is een ongebruikelijk stabiele transcriptiefactor
Hoewel we eerder hebben gespeculeerd dat ΔFosB een relatief stabiele transcriptiefactor is (Nestler et al., 2001), is een directe analyse van het omzetprofiel van het eiwit tot op heden nog niet uitgevoerd. Om deze vraag aan te pakken, voerden we pulse-chase-experimenten uit met behulp van PC12-cellen, die op grote schaal werden gebruikt als een neuronachtige cellijn, waarin ΔFosB tijdelijk tot expressie werd gebracht via infectie met een recombinant herpes-simplexvirus (HSV-ΔFosB). Nieuw gesynthetiseerde eiwitten werden metabolisch gelabeld met 35S-Met / Cys en het afbraakpatroon van 35S-gelabeld AFosB (35S-AFosB) werd gevolgd door immunoprecipitatie ervan uit cellysaten verkregen op verschillende tijdstippen na verwijdering van de radioactief gemerkte aminozuren. Analyse van de immunoprecipitaten door SDS-PAGE en autoradiografie onthulde dat de halfwaardetijd van ΔFosB in PC12-cellen ~10 h (Fig 1). Deze bevindingen tonen aan dat de halfwaardetijd van ΔFosB hoger is dan die van de meeste induceerbare transcriptiefactoren (zie Discussie), inclusief FosB met de volledige lengte waarvan de halfwaardetijd in celkweek ~90 min (Dobrazanski et al., 1991; Carle et al. 2004). Bovendien is het vermeldenswaard dat de degradatie van ΔFosB niet past in een eerste-graads exponentiële vervalcurve, maar eerder in tweefasen, beginnend met een lagere afbraaksnelheid. Dit suggereert het bestaan van meer dan één ΔFosB-soort en / of meer dan één afbraakroute.
Bekijk grotere versie:
Figuur 1.
ΔFosB is een ongebruikelijk stabiele transcriptiefactor. De halfwaardetijd van ΔFosB is ~10 h in celcultuur. ΔFosB werd tot expressie gebracht in PC12-cellen door ofwel infectie met HSV-ΔFosB of transiënte transfectie met een FMos-bevattend plasmide, en cellen werden onderworpen aan puls-chase-experimenten zoals beschreven in Materialen en Methoden. Equivalente resultaten werden verkregen, ongeacht de methode die werd gebruikt om ABos tot overexpressie te brengen. De afbeelding toont het tijdsverloop (en representatief autoradiogram) van afbraak van ΔFosB. De geplotte gegevens zijn het gemiddelde ± SEM van ten minste 15 individuele gegevenspunten verkregen uit ten minste vijf onafhankelijke experimenten. Ter vergelijking is de gerapporteerde halfwaardetijd van FosB met de volledige lengte aangegeven.
ΔFosB is een fosfoproteïne in de hersenen
We hebben de hypothese geopperd dat posttranslationele modificatie van ΔFosB kan bijdragen aan de schijnbare stabiliteit. Omdat is aangetoond dat fosforylering de activiteit van transcriptiefactoren op vele manieren moduleert, inclusief hun stabiliteit (zie voor een overzicht Desterro et al., 2000; Whitmarsh en Davis, 2000), hebben we onderzocht of ΔFosB een fosfoproteïne is. Hiertoe werd ΔFosB-expressie geïnduceerd in de hersenen van de rat met behulp van chronische ECS, een behandeling waarvan bekend is dat deze hoge niveaus van ΔFosB induceert, met name in de frontale cortex (Hope et al., 1994a). Een dag na de laatste ECS-behandeling, toen de ΔFosB-waarden hoog bleven, werden dunne frontale corticale plakken bereid en metabolisch gelabeld met 32P-orthofosfaat. Een parallelle reeks plakjes was niet radioactief gelabeld en deze werden gebruikt om totale AFBB-niveaus te detecteren. Na immunoprecipitatie met een specifiek anti-FosB / AFosB-antilichaam en scheiding van de aan immuunprecipitatie onderworpen eiwitten door SDS-PAGE, gefosforyleerd 32P-gelabeld AFosB werd gedetecteerd door autoradiografie, terwijl totaal AFB werd gedetecteerd door immunoblotting. Deze analyse liet zien dat ΔFosB gefosforyleerd is in de hersenen, zoals blijkt uit een specifiek 32P-gelabelde band van ~35 kDa aanwezig in de chronisch behandelde hersensamples, maar is vrijwel niet waarneembaar in de schijnbehandeling-behandelde controles (Fig 2A). Dit is consistent met het feit dat, bij afwezigheid van chronische stimulatie, de basale niveaus van ΔFosB erg laag zijn. De specificiteit van de immunoprecipitatiereactie wordt geïllustreerd door het ontbreken van een signaal in het niet-immune IgG-precipitaat.
Bekijk grotere versie:
Figuur 2.
ΔFosB is een fosfoproteïne in de hersenen. A, ΔFosB wordt gefosforyleerd in de hersenen. Endogene AFosB werd in rattenhersenen geïnduceerd door chronische ECS-behandeling zoals beschreven in Materialen en Methoden. Frontale corticale plakjes werden metabolisch gelabeld met 32PH3PO4 voor enkele uren. Na homogenisatie van de plakjes werd AFosB aan immunoprecipitatie onderworpen en gefosforyleerd AFosB (32P-AFosB) werd gedetecteerd door autoradiografie (bovenste paneel). Totaal ΔFosB in niet-radioactieve immunoprecipitaten werd gedetecteerd door immunoblotting (onderste paneel). Als negatieve controles worden het immuunprecipitaat van een schijnbehandeld dier en niet-immuun IgG weergegeven. B, Kandidaat-fosforyleringsplaatsen en kinasen met overeenkomstige voorspellingsscores voor de muizen-FAosB-eiwitsequentie werden verkregen door bioinformatische analyse. De kandidaat-sites met de hogere voorspellingsscores worden gemarkeerd in de eiwitsequentie en weergegeven in de tabel. Het DNA-bindende (basis) domein en leucineritssluiting zijn vetgedrukt in de eiwitsequentie. C, D, ΔFosB-fosforylatie wordt verhoogd door de Ser / Thr-fosfataseremmer OA. C, 32P-ΔFosB-niveaus in immunoprecipitaten van frontale corticale plakken gemerkt in de afwezigheid (Ctr) of aanwezigheid van 100 ng / ml OA (grafiek en bovenste paneel) werden gedetecteerd door autoradiografie. Het onderste paneel toont het totale ΔFosB gedetecteerd in immunoprecipitaten van niet-gelabelde plakjes door immunoblotting. D, PC12-cellen werden geïnfecteerd met HSV-ΔFosB of HSV-LacZ (vector) en metabolisch gelabeld met 32PH3PO4 in afwezigheid (Ctr) of aanwezigheid van 100 ng / ml OA. 32P-ΔFosB-niveaus in immunoprecipitaten werden gedetecteerd door autoradiografie (grafiek, bovenste paneel). Het onderste paneel toont het totale ΔFosB gedetecteerd in cellysaten door immunoblotting.
Als een eerste stap naar het ophelderen van welke kinase (s) en plaats (en) betrokken zijn bij fosForylatie van FMosB onderwierpen we de aminozuursequentie aan verschillende bioinformatische analyses. Dit toonde aan dat, hoewel ΔFosB geen kandidaat-sites voor Tyr-fosforylatie bevat, het wel verschillende Ser / Thr-kinase-consensusplaatsen bevat, waaronder drie CaMKII-sites, drie CK2-sites en twee PKC-sites met zeer hoge voorspelling van fosforylatie (Fig 2B). Als, zoals voorspeld door bioinformatica, AFosB alleen gefosforyleerd is op Ser- of Thr-residuen, dan zou de fosforylatie ervan significant gemoduleerd moeten worden door de activiteit van Ser / Thr-fosfatasen. Om deze hypothese te testen, hebben we de frontale corticale plakjes gelabeld met 32P-orthofosfaat in de aanwezigheid of afwezigheid van OA, een Ser / Thr-proteïnefosfataseremmer. Zoals getoond in Figuur 2C, OA heeft een grote (~2.5-vouw) toename veroorzaakt 32P-ΔFosB. Het veroorzaakte ook een kleine toename van de totale ΔFosB-spiegels, wat consistent is met eerdere rapporten die de carcinogene effecten van OA koppelen aan het vermogen om verschillende directe vroege genen waaronder Fos-eiwitten te induceren (Miller et al., 1998; Choe et al., 2004). Het netto resultaat is een significante algemene toename (~60%) in gefosforyleerde ΔFosB-niveaus.
Vervolgens onderzochten we of, in PC12-cellen, die vatbaarder zijn voor experimentele manipulatie, ΔFosB een fosforyleringspatroon vertoonde dat vergelijkbaar was met dat wat in de hersenen werd waargenomen. We hebben ΔFosB in PC12-cellen tot expressie gebracht via infectie met HSV-ΔFosB en metabolisch gelabeld met de cellen met 32P-orthofosfaat in aanwezigheid of afwezigheid van OA. De succesvolle expressie en immunoprecipitatie van het eiwit van met HSV-ΔFosB geïnfecteerde cellen wordt getoond door de aanwezigheid zowel in de immunoblot (Fig 2D, onderste paneel) en de autoradiografie (bovenste paneel) van een ~ 35 kDa-band, afwezig in de met vector geïnfecteerde cellen. Zoals waargenomen in de hersenen, veroorzaakte OA een kleine toename van het totale ΔFosB-gehalte, maar een veel hogere (ongeveer tweevoudige) toename in 32P-ΔFosB, resulterend in een significante (~50%) netto toename van fosforylatie van ΔFosB. Verder resulteerde de behandeling van PC12-cellen met een Tyr-fosfataseremmer, consistent met de bioinformatische voorspellingen, niet in significante veranderingen in 32P-ΔFosB-niveaus (gegevens niet getoond). Samen onthulden deze bevindingen dat ΔFosB gefosforyleerd is op Ser- en / of Thr-residuen in hersenen en in PC12-cellen en bevestigd dat dit laatste een goed celkweeksysteem is waarin de fosforylatie- en afbraakprofielen van ΔFosB verder bestudeerd worden.
CK2 maar niet PKC of CaMKII fosforyleert ΔFosB in vitro
Zoals hierboven beschreven onthulde analyse van AFosB-aminozuursequentie hoge voorspellingsscores voor CK2-, PKC- en CaMKII-fosforyleringsplaatsen. Om te bepalen welke van deze kinasen ABosB kunnen fosforyleren, hebben we een reeks uitgevoerd in vitro fosforyleringsreacties met behulp van gezuiverde kinasen en gezuiverd recombinant AFosB. Zoals getoond in Figuur 3Avan de drie kandidaat-kinasen, alleen CK2 gefosforyleerde AFosB op een significante manier. Bovendien werden verschillende andere kinasen getest (bijvoorbeeld GSK3 en p70S6K) maar faalde niet om ΔFosB significant te fosforyleren (gegevens niet getoond). Bijkomende karakterisering van de CK2-reactie door tijdsverloopanalyse bracht aan het licht dat dit kinase de opname van ~0.5 mol fosfaat per mol ABFB kan katalyseren (Fig 3B). Het feit dat CK2 ΔFosB kan fosforyleren in vitro tot een aanzienlijke stoichiometrie (~50%) is suggestief voor een fysiologisch relevante reactie. Vervolgens hebben we de kinetiek van deze reactie bestudeerd door CK2 te incuberen in de aanwezigheid van toenemende hoeveelheden gezuiverd ΔFosB en we hebben vastgesteld dat CK2 ΔFosB fosforyleert met een Vmax van 5.8 pmol · min-1 · Μg-1 van enzym, a KM van 18.4 μm, en a khoe van 0.2 / s (Fig 3C). De waarden verkregen voor deze kinetische parameters ondersteunen verder de fysiologische relevantie van deze reactie. Bijvoorbeeld, de KM van CK2 voor DARPP32, een van de bekendste substraten, is 3.4 μm, en de khoe is ~0.3 / s (Girault et al., 1989); de KM voor ATP-reeksen van ~10-40 μm (Cochet et al., 1983; Silva-Neto et al., 2002), en die voor caseïne varieert van ~10-50 μm (Meggio et al., 1977; Pyerin et al., 1987). Samen geven deze gegevens aan dat ΔFosB een bonafide substraat is voor CK2 in vitro.
Bekijk grotere versie:
Figuur 3.
CK2 maar niet PKC of CaMKII fosforyleert ΔFosB in vitro. De autoradiograaf (bovenste paneel) toont het gefosforyleerde product en de met Coomassie gekleurde gel (onderste paneel) toont het totale ΔFosB dat aanwezig is in de reactie. A, Gezuiverd recombinant AFosB werd onderworpen aan in vitro fosforylatie door verschillende kandidaat-kinasen (waarvan er drie worden getoond). B, Tijdsverloop en stoichiometrische analyses geven aan dat CK2 ΔFosB kan fosforyleren in vitro met een stoichiometrie van ~50%. C, Kinetische analyse van de CK2-reactie onthulde dat AFosB een bonafide is in vitro substraat. De linearisatie van de reactie wordt getoond in een dubbele reciproke grafiek (onder), maar de kinetische parameters werden afgeleid van de Michaelis-Menten-curve (boven).
CK2 moduleert de fosforylatie en stabiliteit van ΔFosB in intacte cellen
Om de fysiologische relevantie van CK2-gemedieerde fosforylatie van ΔFosB te bepalen, hebben we vergelijkende fosfopeptidekartering uitgevoerd met behulp van in vitro gefosforyleerd en PC12-cel-gefosforyleerd AFosB. Na SDS-PAGE en gel-elutie van 32P-ΔFosB (uit de in vitro reacties of van het immunoprecipitaat van 32P-gelabelde cellen), het eiwit werd gedigereerd met trypsine en de resulterende fosfopeptiden werden onderworpen aan tweedimensionale scheiding. Deze analyse onthulde dat het belangrijkste fosfopeptide van de CK2-reactie gemigreerd met één van de twee belangrijkste fosfopeptiden uit ΔFosB gefosforyleerd in PC12-cellen (Fig 4A), terwijl de fosfopeptiden die resulteerden uit de PKC- of CaMKII-reactie (gegevens niet getoond) dat niet deden. Er was een tweede ΔFosB-fosfopeptide aanwezig in de kaart van PC12-cellen, maar vanwege het onvermogen van een van de kinasen hebben we getest om een vergelijkbaar fosfopeptide te genereren in vitro, we weten momenteel niet of dit tweede fosfopeptide een fosforylatieplaats anders dan het andere fosfopeptide bevat of dat het een duidelijk tryptisch peptide vertegenwoordigt dat dezelfde fosforyleringsplaats bevat.
Bekijk grotere versie:
Figuur 4.
CK2 moduleert de fosforylatie en stabiliteit van ΔFosB in intacte cellen. A, CK2 maar niet PKC lijkt ΔFosB in cellen te fosforyleren. Tweedimensionale fosfopeptidekaarten van ΔFosB gefosforyleerd door CK2 of PKC in vitro of door intacte PC12-cellen. De pijlen tonen de comigratie van het CK2-gefosforyleerde peptide maar niet de PKC-gefosforyleerde peptide met één van de AF fosfopeptiden verkregen uit PC12-cellen. B, ΔFosB-fosforylering in PC12-cellen wordt verhoogd door cellen te behandelen met de krachtige CK2-activator-spermine (SP) en verlaagd door behandeling met de CK2-remmer DRB. In tegenstelling hiermee werd fosForylatie van FMosB in PC12-cellen niet beïnvloed door behandeling met ofwel een PKC-activator (PMA) of de PKC-specifieke remmer calphostin-C (Calph). Een representatief autoradiogram (bovenpaneel) en immunoblot (onderpaneel) worden getoond. C-F, Effect van CK2-activiteit op ΔFosB-stabiliteit. De figuren tonen het tijdsverloop (en representatief autoradiogram) van afbraak van AFosB. PC12-cellen die AFOB passeren, werden onderworpen aan puls-chase-experimenten uitgevoerd in de afwezigheid of aanwezigheid van de CK2-remmer DRB (C), het CK2-activatorsperma (D), of de breed-spectrum kinase remmer H-8 (E), die werd gebruikt om te controleren op de niet-specifieke effecten van DRB. F, Effect van het omverwerpen van de katalytische subeenheid van CK2 op ΔFosB-stabiliteit. PC12-cellen werden getransfecteerd met hetzij een niet-doelgerichte siRNA (Ctr) of siRNA-richtende rat CK2a en 24 h later getransfecteerd met een AFFB-plasmide. Het bovenste paneel toont immunoblots van lysaten van volledige cellen die het effect van het CK2-siRNA op de CK2- en ΔFosB-eiwitniveaus laten zien. De overeenkomstige immunoblot voor P-tubuline wordt getoond als een ladingscontrole.
Om de fysiologische relevantie van CK2 als een ΔFosB-kinase verder aan te pakken, behandelden we ΔFosB-expresserende PC12-cellen met twee geneesmiddelen die CK2-activiteit moduleren. Zoals getoond in Figuur 4B, ΔFosB-fosforylering was verminderd door behandeling van PC12-cellen met de cel-permeabele CK2-remmer DRB (Meggio et al., 1990; Szyszka et al., 1995), en verhoogd door behandeling met het polyamine-spermine, waarvan bekend is dat het een krachtige CK2-activator is (Cochet en Chambaz, 1983; Meggio et al., 1983). In tegenstelling hiermee, behandeling van PC12-cellen met de PKC-remmer calphostin-C (Kobayashi et al., 1989; Tamaoki et al., 1990) of de PKC-activator PMA (Schmidt en Hecker, 1975; Beh et al., 1989) resulteerde niet in significante veranderingen in fosForylering van ΔFosB. In het geval van PMA neemt de lichte (en niet-significante) toename toe 32P-ΔFosB kan worden verklaard door een toename van het totale ΔFosB-gehalte veroorzaakt door dit geneesmiddel; er is zelfs gerapporteerd dat forbolesters expressie van verschillende Fos-familie-eiwitten induceren, waaronder FosB (Yoza et al., 1992; Suh et al., 2004). Verder, de behandeling van cellen met de specifieke cel-permeabele CaMKII-remmer m-AIP (Ishida en Fujisawa, 1995; Stevens et al., 1999) resulteerde ook niet in verminderde fosForylatie van ΔFosB (gegevens niet getoond). Samen zijn deze resultaten consistent met onze in vitro bevindingen en geven aan dat in intacte cellen ΔFosB waarschijnlijk is gefosforyleerd door CK2 maar niet door PKC of CaMKII. Het feit dat remming van CK2 niet volledig fosforylering van fosforyl fosforylering voorkomt, geeft het bestaan van extra fosforylatieplaatsen in het eiwit aan.
Vervolgens hebben we onderzocht of CK2 een rol speelt in de turnover van ΔFosB en daarmee in de stabiliteit. Hiertoe hebben we puls-chase-experimenten uitgevoerd met ΔFosB tot expressie brengende PC12-cellen die zijn behandeld met de CK2-remmer of de CK2-activator die in de fosforylatie-studie is gebruikt. Zoals getoond in Figuur 4C, behandeling van cellen met de CK2-remmer DRB had een significant effect op de omzetsnelheid van ΔFosB, wat blijkt uit de verandering in vorm van de degradatiekromme, van bifasisch naar een curve die dichterbij die van een exponentieel verval ligt. Omgekeerd veroorzaakte de aanwezigheid van het CK2-activatorsperma een significante afname van de afbraaksnelheid van ΔFosB, wat leidde tot de accumulatie van het eiwit gedurende de eerste uren van de jacht (Fig 4D).
Zoals het geval is met veel kinase-activatoren en -remmers, kunnen spermine en DRB metabole effecten hebben buiten de modulatie van CK2-activiteit. Het is zelfs aangetoond dat DRB het met transcriptie factor IIH (TFIIH) geassocieerde kinase remt (Yankulov et al., 1995), wat resulteert in remming van RNA-polymerase II-gemedieerde transcriptie. Omdat dit effect mogelijk de stabiliteit van ΔFosB zou kunnen beïnvloeden, analyseerden we het effect van de breedspectrumkinase-inhibitor H-8 (Hidaka en Kobayashi, 1992) op ΔFosB-turnover bij een concentratie (200 μm) waarvan bekend is dat het TFIIH-geassocieerd kinase maar niet CK2 remt (Yankulov et al., 1995). Zoals getoond in Figuur 4E, behandeling met H-8 had geen invloed op de omloopsnelheid van ΔFosB. Vergelijkbare resultaten werden verkregen met H-7, een andere breed-spectrum kinase-remmer, gebruikt in een concentratie die TFIIH-geassocieerd kinase remt maar niet CK2 (gegevens niet getoond). Deze gegevens ondersteunen verder de interpretatie dat de vermindering van de stabiliteit van ΔFosB veroorzaakt door DRB hoogstwaarschijnlijk kan worden toegeschreven aan de remming van CK2.
Om de rol van CK2 in de omzet van ΔFosB verder vast te stellen, onderzochten we de gevolgen van het uitschakelen van CK2 via siRNA. We hebben deze experimenten uitgevoerd met behulp van PC12-cellen die eerst werden getransfecteerd met controle (niet-doelgericht) siRNA of een siRNA die het mRNA van de katalytische subeenheid van CK2 van de rat (CK2α) en 24 h later getransfecteerd met ΔFosB target. Zoals getoond in Figuur 4Ftransfectie met het CK2α-siRNA heeft op efficiënte en specifieke wijze CK2a-eiwitniveaus vernietigd zonder de AFosB-niveaus (bovenste paneel) te beïnvloeden. Pulse-chase-analyse bracht aan het licht dat het uitschakelen van CK2 resulteerde in een significante toename van de omzet van ΔFosB, zoals blijkt uit de snellere afbraak van het eiwit. Het feit dat het remmen van CK2-activiteit (via DRB-behandeling of siRNA) de omzet van ΔFosB verhoogt en resulteert in het verdwijnen van de component met trage snelheid van de bifasische curve, terwijl CK2-activering de langzame fase van de curve verbetert, sterke ondersteuning biedt voor het idee dat CK2 een rol speelt bij het reguleren van ΔFosB-stabiliteit.
CK2 fosforyleert ΔFosB op Ser27
Om te beginnen met het identificeren van de site (s) op ΔFosB gefosforyleerd door CK2, voerden we fosfo-aminozuuranalyse uit van recombinant ΔFosB gefosforyleerd door CK2 in vitro en van ΔFosB gefosforyleerd in PC12-cellen. Uit deze experimenten bleek dat in beide gevallen het enige gedetecteerde fosfo-aminozuur fosfo-ser was (Fig 5A). Deze bevinding, samen met de stoichiometrie verkregen voor de CK2 in vitro fosforyleringsreactie (~50%) (Fig 3B) en de aanwezigheid van slechts één significante plek op de CK2-fosfopeptidekaart (Fig 4A), suggereert dat CK2-fosforylering van AFosB waarschijnlijk beperkt is tot een enkele serineresidu. Deze conclusie is consistent met de analyse van de fosforylatieconsensuspositie (Fig 2B), die slechts één kandidaatserine voorspelde, namelijk Ser27, voor CK2. Taxonomische analyse onthulde dat Ser27 sterk geconserveerd is door evolutie onder familieleden van Fos (Fig 5B), wat suggereert dat het een belangrijke fysiologische functie kan hebben.
Bekijk grotere versie:
Figuur 5.
CK2 Fosforylaat ΔFosB op Ser27. A, Fosfoaminozuuranalyse van CK2-gefosforyleerd (in vitro) en PC12 cel-gefosforyleerde AFFB dat toont dat in beide gevallen het belangrijkste gefosforyleerde residu serine is. B, Cross-species-analyse van de aminozuursequentie van FosB / ΔFosB onthulde een hoog behoud van Ser27 bij Fos-familieleden van mens tot zebravis (donkere highlight). Het zure residu op positie + 3, dat vereist is voor de CK2-consensussite, is echter niet geconserveerd (lichte highlight). CHeLa-cellen werden transiënt getransfecteerd met ofwel wildtype AFosB (WT) of AFosB bevattende een puntmutatie om Ser27 te vervangen door Ala (S27A). Cellen werden metabolisch gelabeld met 32PH3PO4 en behandeld met vehikel of met spermine (SP) om CK2 te activeren. Een representatief autoradiogram (bovenste paneel) en immunoblot (onderste paneel) van de verkregen AFosB-immuunprecipitaten worden getoond. Het immunoprecipitaat van schijn-getransfecteerde cellen (vector) wordt getoond.
Om te bepalen of Ser27 is gefosforyleerd in ΔFosB, hebben we dit residu gemuteerd naar Ala en de consequenties voor de fosforyleringsstatus van het eiwit geanalyseerd. Hiertoe gebruikten we HeLa-cellen (die met hogere efficiëntie kunnen worden getransfecteerd) om tijdelijk WT- of S27A-mutant AFosB tot expressie te brengen. Ongeveer 24 h na transfectie werden de cellen metabolisch gelabeld met 32P-orthofosfaat en volledige cellysaten werden bereid. Na immunoprecipitatie en SDS-PAGE, 32P-AFosB werd gedetecteerd door autoradiografie en totaal AFosB door immunoblotting. Zoals getoond in Figuur 5C (onderste paneel), werd ΔFosB niet gedetecteerd in de vector-getransfecteerde cellen, terwijl cellen die zijn getransfecteerd met WT of S27A mutant ΔFosB met succes het eiwit tot expressie brachten. We ontdekten dat de S27A-mutatie een significante (~30%) vermindering veroorzaakte in 32P-ΔFosB-niveaus (Fig 5C, bovenste paneel en grafiek), hetgeen aangeeft dat in levende cellen AFFB gefosforyleerd is op Ser27. In een poging om vast te stellen of in cellen Ser27 inderdaad door CK2 gefosforyleerd is, vergeleken we het vermogen van het CK2-activator-spermine om de fosforylatie van WT en S27A AFosB te moduleren. Zoals we eerder in PC12-cellen (Fig 4B), behandeling van HeLa-cellen met spermine verhoogde de fosforylering van het WT-eiwit significant. Het feit dat dit effect significant werd verminderd door de S27A-mutatie (Fig 5C) ondersteunt de interpretatie dat Ser27 in ΔFosB een fysiologisch substraat is voor CK2.
Fosforylering van Ser27 reguleert de stabiliteit van ΔFosB
Nadat vastgesteld is dat de stabiliteit van ΔFosB afneemt wanneer CK2 wordt geremd en versterkt wanneer CK2 is geactiveerd (Fig 4) en dat CK2 ΔFosB fosforyleert op Ser27 (Fig 5), voorspelden we dat het voorkomen van fosforylatie van deze site het eiwit zou destabiliseren. Pulse-chase-experimenten uitgevoerd met HeLa-cellen die tijdelijk WT- of S27A-mutant AFosB tot expressie brachten, onthulden dat, zoals voorspeld, de S27A-mutatie resulteerde in een significante toename van de afbraaksnelheid van ΔFosB en een gelijktijdige afname van de halfwaardetijd van het eiwit (Fig 6A). Vervolgens onderzochten we of dit regulerende mechanisme ook voorkomt in de meer neuronachtige PC12-cellijn. Uit deze experimenten bleek dat, zoals we in HeLa-cellen hadden waargenomen, de S27A-puntmutatie een dramatische afname van de halfwaardetijd van ΔFosB in PC12-cellen veroorzaakt (van ~11 tot ~4 h) (Fig 6B). Het feit dat deze destabilisatie vergelijkbaar is met die veroorzaakt door CK2-remming of knock-down (Fig 4) biedt verdere ondersteuning voor het idee dat CK2-gemedieerde fosforylering van Ser27 de stabiliteit van ΔFosB reguleert. Aanvullend bewijs voor de regulerende rol van Ser27-fosforylering op AFFosB-eiwitomzetting werd verkregen met behulp van een fosfomimetische Ser27 tot Asp-mutatie (S27D). De S27D-mutatie wordt als fosfomimetisch beschouwd, omdat het een grote negatief geladen (carboxyl) groep op aminozuur 27 plaatst en daardoor gedeeltelijk de fosforylatie van Ser27 nabootst. Zoals getoond in Figuur 6Cde S27D-mutatie veroorzaakte het tegenovergestelde effect van de S27A-mutatie en resulteerde in een eiwit dat aanzienlijk stabieler was dan het WT-eiwit. Vergelijkbaar met het effect dat wordt verkregen na activering van CK2 (Fig 4D), resulteerde de S27D-mutatie in de accumulatie en dus in verhoogde ΔFosB-niveaus tijdens de eerste uren van de achtervolging.
Bekijk grotere versie:
Figuur 6.
Fosforylatie van Ser27 reguleert de stabiliteit van ΔFosB. A, C, Pulse-chase-analyse die het effect van Ser27-fosforylatie op de omzettingssnelheid van ΔFosB laat zien. Het afbraakprofiel en de geschatte halfwaardetijden van wild-type ΔFosB (WT), de Ser27 naar Ala-mutant (S27A) en de fosfomimetische Ser27 naar Asp-mutant (S27D) worden getoond. Dezelfde bevindingen werden verkregen in HeLa-cellen (A) en PC12-cellen (B, C).
Ser27-fosforylatie stabiliseert AFosB door de proteasomale afbraak ervan te voorkomen
Om te beginnen met het ophelderen van het mechanisme waardoor fosforylatie van Ser27 ΔFosB stabiliseert, onderzochten we het vermogen van de proteasoomremmers MG132 (Palombella et al., 1994; Tsubuki et al., 1996) en epoxomicine (Hanada et al., 1992; Kim et al., 1999) om de afbraaksnelheid van WT en S27A mutant ΔFosB te moduleren. Pulse-chase-experimenten werden uitgevoerd met behulp van PC12-cellen die waren geïnfecteerd met een recombinant HSV dat WT of S27A AFBB tot expressie bracht en werden behandeld met ofwel DMSO of één van de twee proteasoomremmers. Deze experimenten onthulden dat hoewel de degradatiesnelheid van het WT-eiwit relatief ongevoelig is voor de aanwezigheid van een van de twee proteasoomremmers (Fig 7A), dat van de S27A-mutant gevoelig is voor deze geneesmiddelen (Fig 7B). Dit geeft aan dat, in tegenstelling tot het WT-eiwit, de S27A-mutant een doelwit is van proteasomale afbraak. Inderdaad heeft de behandeling van cellen met MG132 of epoxomicine het effect van de S27A-mutatie op de afbraaksnelheid van ΔFosB volledig omgekeerd, wat blijkt uit een toename van de halfwaardetijd van de S27A-mutant van ~4 tot ~9 h voor MG132 en tot ~ 12 h voor epoxomicine (Fig 7B). Samen geven deze bevindingen aan dat fosforylatie van ΔFosB op Ser27 het eiwit beschermt tegen proteasomale afbraak en daarom essentieel is voor zijn ongewone stabiliteit.
Bekijk grotere versie:
Figuur 7.
Fosforylering van Ser27 stabiliseert AFosB door de proteasomale afbraak ervan te voorkomen. A, B, Pulse-chase-analyse met HSV-geïnfecteerde PC12-cellen die het afbraakprofiel en de geschatte halfwaardetijden van wild-type ΔFosB tonen (A) of S27A ΔFosB (B) in de afwezigheid of aanwezigheid van een van de twee proteasoomremmers [MG132 en epoxomicine (Epoxo)]. Merk op dat geen van beide geneesmiddelen een significant effect heeft op de turnover van wild-type ΔFosB, terwijl de behandeling van cellen met een proteasoomremmer resulteerde in de stabilisatie van S27A ΔFosB. C, Een model voor de rol van Ser27-fosforylatie in het vermogen van ΔFosB om plasticiteit op lange termijn voor de hersenen te bewerkstelligen. Eenmaal geïnduceerd, wordt een deel van ΔFosB gestabiliseerd in de hersenen door de CK2-gemedieerde fosforylatie van S27. Dit resulteert in zijn accumulatie, wat op zijn beurt resulteert in langdurige veranderingen in genexpressie. Deze stabiele veranderingen in genexpressie dragen bij aan stabiele gedragsaanpassingen. Omgekeerd resulteert de defosforylering van S27 door de Ser / Thr-fosfatasen PP1 en / of PP2A in destabilisatie van het eiwit en de verwerking ervan door de proteasomale machinerie.
Discussie
In de huidige studie laten we zien dat ΔFosB een halfwaardetijd heeft van ~10 h in celkweek, waardoor het stabiel is in vergelijking met FOSB met de volledige lengte en de meeste andere induceerbare transcriptiefactoren, waarvan de halfwaardetijden in celcultuur zo kort kunnen zijn als een paar minuten en overschrijd zelden 3 h (Hann en Eisenman, 1984; Dobrazanski et al., 1991; Roberts en Whitelaw, 1999; Ferrara et al., 2003; Hirata et al., 2004). Bovendien zien we dat ΔFosB gefosforyleerd is in de hersenen en dat de fosforylatie ervan gevoelig is voor de PP1 / PP2A-remmer okadaïnezuur. Onze celkweekstudies tonen aan dat de stabiliteit van ΔFosB wordt gemoduleerd door CK2, met een hogere CK2-activiteit die het eiwit stabiliseert. Ten slotte suggereren onze bevindingen dat CK2 ΔFosB fosforyleert op een sterk geconserveerd N-terminus-serine (S27) en aantoont dat fosforylatie van S27 ΔFosB beschermt tegen proteasomale afbraak. We stellen daarom een model voor waarbij fosforylering van ΔFosB op S27 door CK2 een kritisch regulerend mechanisme is voor de omzet van ΔFosB (Fig 7C). Een dergelijke door fosforylatie gemedieerde stabilisatie van AFosB is functioneel belangrijk, omdat is aangetoond dat verhoogde niveaus van AFosB in bepaalde hersengebieden direct vele neuronale genen reguleren in vivo en om krachtige gedragseffecten uit te oefenen in diermodellen van verschillende neuropsychiatrische stoornissen (zie Inleiding).
Hoewel fosforylatie een snelle en omkeerbare manier is om de transcriptionele activiteit van bepaalde transcriptiefactoren, zoals CREB (cAMP-responselement-bindend eiwit) (Bohmann, 1990), het moduleren van de afbraak van transcriptiefactoren zorgt voor een nog krachtigere (minder gemakkelijk omkeerbare) vorm van regulering (Desterro et al., 2000). Transcriptiefactoren waarvan de functionele activiteit wordt gereguleerd op het niveau van hun afbraak omvatten NFκB (Desterro et al., 2000), c-Myc (Sears et al., 1999) en c-Fos (Ferrara et al., 2003), onder andere. In veel gevallen is fosforylatie een belangrijke regulator van de stabiliteit van een transcriptiefactor, zoals is aangetoond voor c-Fos (Okazaki en Sagata, 1995; Tsurumi et al., 1995), Fos-gerelateerd antigen-1 (Fra-1) (Vial en Marshall, 2003), Fra-2 (Manabe et al., 2001), c-Jun (Fuchs et al., 1996), JunB (Fuchs et al., 1997), ATF2 (Fuchs et al., 2000) en p53 (Buschmann et al., 2001). Onze studies voegen aldus ΔFosB toe aan deze lijst van transcriptiefactoren waarvan de functionele activiteit wordt gereguleerd door zijn gefosforyleerde afhankelijke stabiliteit.
CK2 is een alomtegenwoordige en constitutief actieve Ser / Thr-kinase die tot nu toe> 300 vermeende substraten heeft geïdentificeerd en die betrokken is bij meerdere biologische processen, waaronder celdood en overleving (Litchfield, 2003; Unger et al., 2004), cellulaire stressreacties (Yanagawa et al., 1997; Kato et al., 2003), en DNA-reparatie en chromatine-hermodellering (Barz et al., 2003; Krohn et al., 2003). Meer dan een derde van de vermoedelijke substraten van CK2 zijn eiwitten die betrokken zijn bij de regulatie van genexpressie (Meggio en Pinna, 2003). Het is zelfs aangetoond dat CK2 een prominente nucleaire kinase is (Krek et al., 1992) (voor een overzicht, zie Yu et al., 2001) en om te interageren met de bZIP-domeinen van verschillende transcriptiefactoren (Yamaguchi et al., 1998). Van CK2-gemedieerde fosforylering is ook aangetoond dat het de degradatie (ofwel het verhoogt of verlaagt) van veel eiwitten modificeert, waaronder IkB (Schwarz et al., 1996), PTEN (Torres en Pulido, 2001), lensconnexine (Yin et al., 2000), chromatine-geassocieerd eiwit HMG1 (Wisniewski et al., 1999) en verschillende transcriptiefactoren zoals HMGB (Stemmer et al., 2002), Myf-5 (Winter et al., 1997) en c-Myc (Channavajhala en Seldin, 2002). CK2 komt het meest voor in hersenen (Alcazar et al., 1988; Girault et al., 1990), en zijn activiteit is betrokken bij vele aspecten van de hersenfunctie, waaronder neuronale overleving (Boehning et al., 2003), differentiatie (Nuthall et al., 2004), ionkanaalfunctie (Jones en Yakel, 2003; Bildl et al., 2004) en langetermijnpotentiëring en neuronale plasticiteit (Diaz-Nido et al., 1992; Lieberman en Mody, 1999; Reikhardt et al., 2003).
Ondanks dit groeiende bewijs voor de rol van CK2 in de regulatie van de neuronale functie, is er weinig bekend over wat de activiteit ervan bestuurt. CK2 wordt verondersteld constitutief actief te zijn, met regulatie van het vermogen ervan om specifieke substraten te fosforyleren, voornamelijk afhankelijk van veranderingen in de intracellulaire lokalisatie (bijv. Cytosol versus nucleus) (Ahmed en Tawfic, 1994; Yu et al., 1999). Deze informatie werpt een belangrijke vraag op over welke signalen nodig zijn om ΔFosB-accumulatie in hersenen na chronische stimulatie te induceren (Fig 7C). Een vereiste is herhaalde activering van de FosB gen en inductie van ΔFosB mRNA (Chen et al., 1995). Onze gegevens geven aan dat CK2-fosforylatie van ΔFosB van cruciaal belang is voor de stabiliteit ervan, wat suggereert dat een tweede signaal nodig kan zijn voor de langetermijneffecten van ΔFosB op genexpressie, namelijk een signaal dat de fosforylatie van eiwitten door CK2 stimuleert. Dit zou de activering van CK2 kunnen inhouden door een onbekend mechanisme of de translocatie naar de kern. Als alternatief kan CK2-fosforylatie van AFosB constitutief zijn, zodanig dat als AFosB-eiwit in reactie op elke stimulus wordt getransleerd, een deel ervan wordt gefosforyleerd en daardoor wordt gestabiliseerd, zodat het bij herhaalde stimulatie accumuleert tot hoge niveaus in aangetaste neuronen.
Onze bevindingen tonen aan dat CK2 en S27 waarschijnlijk niet de enige kinase en plaats zijn die verantwoordelijk is voor fosforylatie van ΔFosB, omdat noch de remming van CK2 noch de S27A-mutatie AFosB-fosforylering volledig kon voorkomen. Op dezelfde manier betoogt het feit dat de S27A-mutatie resulteert in een 30% reductie in fosfo-ΔFosB, dat S27 een belangrijke fosforylatieplaats op het eiwit is. We onderzoeken desondanks andere hypothetische kinases en fosforylatiesites op ΔFosB. Uiteindelijk zal het ook belangrijk zijn om de fosforylatie van S27 en eventuele andere fosforylatiesites in ΔFosB in de hersenen te analyseren in vivo na verschillende soorten chronische stimulatie, bijvoorbeeld door het gebruik van massaspectrometrie of fosfospecifieke antilichamen.
Zoals hierboven vermeld, is S27 in ΔFosB sterk geconserveerd doorheen de evolutie en onder andere Fos-familie-eiwitten. De consensussite voor CK2 is echter niet: zoals weergegeven in Figuur 5B, alleen FosB / ΔFosB (en de xenoloog van de zebravis), maar niet c-Fos of Fra-2, hebben een zure rest op + 3, een belangrijke determinant van CK2-fosforylatie (Marin et al., 1986; Meggio et al., 1994). Het ontbreken van CK2-fosforylatie op S27 kan dus verklaren waarom andere Fos-familie-eiwitten niet zo stabiel zijn als ΔFosB. Dit verklaart echter niet waarom FosB van volledige lengte, dat dezelfde CK2-consensussite heeft als ΔFosB, niet op vergelijkbare wijze is gestabiliseerd. We weten niet of FosB van volledige lengte gefosforyleerd is door CK2 op dit geconserveerde residu. De enige rapporten van FosB (Skinner et al., 1997) en c-Fos (Okazaki en Sagata, 1995; Chen et al., 1996) fosforylatie beschrijft plaatsen in het C-terminale gebied van deze eiwitten, die afwezig is in ΔFosB. De potentiële fosforylatie van FosB en andere Fos-familie-eiwitten van volledige lengte door CK2 vereist direct onderzoek. Echter, zelfs als ze gefosforyleerd zijn, is bekend dat de andere Fos-familie-eiwitten motieven bevatten op hun C-termini die gericht zijn op de eiwitten voor snelle afbraak (Papavassiliou et al., 1992; Jariel-Encontre et al., 1997; Acquaviva et al., 2002). Er is bijvoorbeeld aangetoond dat een stuk ~ 21-residuen dat aanwezig is in het C-uiteinde van alle Fos-familie-eiwitten, maar afwezig is in ΔFosB, fungeert als een destabiliserend domein voor c-Fos (Acquaviva et al., 2001). We hebben vastgesteld dat hoewel deze sequentie FOSB van volledige lengte op dezelfde manier destabiliseert (Carle et al., 2004), de afwezigheid van dit domein in ΔFosB houdt niet volledig rekening met de stabilisatie ervan. Integendeel, de combinatie van de afwezigheid van dit C-terminusdomein en Ser27-fosforylatie lijkt volledig rekening te houden met het ongeveer vijfvoudige verschil in stabiliteit tussen ΔFosB en FosB.
Hoewel de afbraak van Fos-familie-eiwitten complex is en niet volledig wordt begrepen, lijkt proteasomale afbraak de belangrijkste route te zijn (Salvat et al., 1999; Acquaviva et al., 2002; Ferrara et al., 2003). Hier gepresenteerde gegevens, waarin proteasomale remmers de snelheid van AFosB-degradatie niet significant wijzigen, beweren dat, in tegenstelling tot andere Fos-familie-eiwitten, AFosB het 26S-proteasoom ontwijkt en dit speelt een centrale rol bij de stabilisatie ervan. We stellen daarom een schema voor waarbij de verhoogde stabiliteit van ΔFosB te wijten is aan de combinatie van twee hoofdfactoren: (1) de afwezigheid van een C-terminaal destabiliserend domein en (2) de fosforylatie van S27 door CK2.
Samenvattend verschaft de onderhavige studie mechanistisch inzicht waarom ΔFosB, een product van het onmiddellijke vroege gen FosBis, in tegenstelling tot alle andere familieleden van Fos, een relatief langlevende proteïne. Hoewel wordt aangenomen dat andere Fos-familie-eiwitten snelle maar voorbijgaande stimulus-transcriptiekoppeling (Morgan en Curran, 1995), de relatieve stabiliteit van ΔFosB verleent het het vermogen om langdurigere transcriptieveranderingen veroorzaakt door chronische stimulatie te mediëren. Dit ondersteunt de opvatting dat ΔFosB functioneert als een duurzame moleculaire switch in de hersenen, waarbij acute reacties geleidelijk worden omgezet in chronische aanpassingen. Identificatie van Ser27-fosforylering als een centraal mechanisme voor de stabiliteit van ΔFosB opent nieuwe wegen voor de ontwikkeling van middelen om de functie van ΔFosB te reguleren en daardoor de langetermijneffecten op neurale en gedragspolysticiteit te moduleren.
voetnoten
- November 21, 2005 ontvangen.
- Herziening ontvangen februari 21, 2006.
- Geaccepteerd in april 2, 2006.
- Dit werk werd ondersteund door een Nationale Alliantie voor Onderzoek naar Schizofrenie en Depressie Young Investigator Award voor PGU, een National Institute on Drug Abuse (NIDA) National Research Service Award voor PGU en subsidies van het National Institute of Mental Health en NIDA aan EJN We dank Dr. James Bibb voor zijn hulp bij de in vitro fosforyleringsassays, Dr. Ming-Hu Han voor zijn hulp bij de bereiding van hersenschijfjes die worden gebruikt voor metabole labeling, en Dr. Rachael Neve voor haar hulp bij het verpakken van de recombinante HSV's.
- Het huidige adres van G. Rudenko: Life Sciences Institute and Department of Pharmacology, University of Michigan, 210 Washtenaw Avenue # 3163A, Ann Arbor, MI 48109-2216.
- Correspondentie moet worden gericht aan Eric J. Nestler, 5323 Harry Hines Boulevard, Dallas, TX 75390-9070. E-mail: [e-mail beveiligd]
Referenties
Acquaviva C, Brockly F, Ferrara P, Bossis G, Salvat C, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2001) Identificatie van een C-terminaal tripeptide-motief dat betrokken is bij de controle van snelle proteasomale afbraak van c-Fos-proto-oncoproteïne tijdens de G (0) -to-S-faseovergang. Oncogene 20:7563-7572.
Acquaviva C, Bossis G, Ferrara P, Brockly F, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2002) Meerdere afbraakroutes voor Fos-familie-eiwitten. Ann NY Acad Sci 973:426-434.
Ahmed K, Tawfic S (1994) Mechanisme van intracellulaire regulatie van proteïnekinase CK2: rol van stimulus-gemedieerde sub-nucleaire associatie. Cell Mol Biol Res 40:539-545.
Alcazar A, Martin E, Lopez-Fando J, Salinas M (1988) Een verbeterde zuiveringsprocedure en eigenschappen van caseïnekinase II uit de hersenen. Neurochem Res 13:829-836.
Andersson M, Westin JE, Cenci MA (2003) Tijdsverloop van striatale DeltaFosB-achtige immunoreactiviteit en mRNA-niveaus van prodynorfine na stopzetting van de behandeling met chronische dopaminomimetica. Eur J Neurosci 17:661-666.
Barz T, Ackermann K, Dubois G, Eils R, Pyerin W (2003) Genoom-brede expressieschermen geven een globale rol aan voor eiwitkinase CK2 in chromatine-hermodellering. J Cell Sci 116:1563-1577.
Abstract / GRATIS volledige tekst
Beh I, Schmidt R, Hecker E (1989) Twee isozymen van PKC die in HL-60-cellen worden gevonden, vertonen een verschil in activering door de forbolester TPA. FEBS Lett 249:264-266.
Bildl W, Strassmaier T, Thurm H, Andersen J, Eble S, Oliver D, Knipper M, Mann M, Schulte U, Adelman JP, Fakler B (2004) Eiwitkinase CK2 is samengevoegd met kleine geleiding Ca (2 +) - geactiveerde K + -kanalen en reguleert de kanaalpoort. Neuron 43:847-858.
Bing G, Wang W, Qi Q, Feng Z, Hudson P, Jin L, Zhang W, Bing R, Hong JS (1997) Langdurige expressie van Fos-gerelateerd antigeen en transiënte expressie van delta FosB geassocieerd met toevallen in de hippocampus en het striatum van de rat. J Neurochem 68:272-279.
Blom N, Sicheritz-Ponten T, Gupta R, Gammeltoft S, Brunak S (2004) Voorspelling van post-translationele glycosylatie en fosforylering van eiwitten uit de aminozuursequentie. proteomics 4:1633-1649.
Boehning D, Moon C, Sharma S, Hurt KJ, Hester LD, Ronnett GV, Shugar D, Snyder SH (2003) Koolmonoxide neurotransmissie geactiveerd door CK2-fosforylatie van Heem-oxygenase-2. Neuron 40:129-137.
Bohmann D (1990) Transcriptiefactorfosforylatie: een verband tussen signaaltransductie en de regulatie van genexpressie. Kankercellen 2:337-344.
Buschmann T, Potapova O, Bar-Shira A, Ivanov VN, Fuchs SY, Henderson S, Fried VA, Minamoto T, Alarcon-Vargas D, Pincus MR, Gaarde WA, Holbrook NJ, Shiloh Y, Ronai Z (2001) Jun NH2-terminale kinasefosforylering van p53 op Thr-81 is belangrijk voor p53-stabilisatie en transcriptionele activiteiten als reactie op stress. Mol Cell Biol 21:2743-2754.
Abstract / GRATIS volledige tekst
Carle TL, Ulery PG, Nestler EJ (2004) De afwezigheid van een geconserveerd C-terminaal domein van de Fos-familie draagt bij aan de unieke stabiliteit van deltaFosB. Soc Neurosci Abstr 30: 692.2.
Channavajhala P, Seldin DC (2002) Functionele interactie van proteïnekinase CK2 en c-Myc bij lymfomagenese. Oncogene 21:5280-5288.
Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, Hope BT, Nestler EJ (1995) Regulatie van delta FosB en FosB-achtige eiwitten door elektroconvulsieve aanvallen en cocaïnebehandelingen. Mol Pharmacol 48:880-889.
Chen J, Kelz MB, Hope BT, Nakabeppu Y, Nestler EJ (1997) Chronische Fos-gerelateerde antigenen: stabiele varianten van ΔFosB geïnduceerd in hersenen door chronische behandelingen. J Neurosci 17:4933-4941.
Abstract / GRATIS volledige tekst
Chen RH, Juo PC, Curran T, Blenis J (1996) Fosforylering van c-Fos aan de C-terminus verbetert de transformerende activiteit ervan. Oncogene 12:1493-1502.
Choe ES, Parelkar NK, Kim JY, Cho HW, Kang HS, Mao L, Wang JQ (2004) De proteïnefosfatase 1 / 2A-remmer okadaïnezuur verhoogt CREB en Elk-1-fosforylering en c-fos-expressie in het rattenstriatum in vivo. J Neurochem 89:383-390.
Cochet C, Chambaz EM (1983) Polyamine-gemedieerde eiwitfosforyleringen: een mogelijk doelwit voor intracellulaire polyamine-actie. Mol Cell Endocrinol 30:247-266.
Cochet C, Feige JJ, Chambaz EM (1983) Katalytische en moleculaire eigenschappen van een zeer gezuiverd caseïne-kinase van het G-type uit longweefsel van runderen. Biochim Biophys Acta 743:1-12.
Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW (2003) Striatale celtypespecifieke overexpressie van DeltaFosB verhoogt de stimulans voor cocaïne. J Neurosci 23:2488-2493.
Abstract / GRATIS volledige tekst
Daunais JB, Roberts DC, McGinty JF (1993) Cocaïne zelftoediening verhoogt preprodynorfine, maar niet c-fos, mRNA in rattenstriatum. NeuroReport 4:543-546.
Desterro JM, Rodriguez MS, Hay RT (2000) Regulatie van transcriptiefactoren door eiwitafbraak. Cell Mol Life Sci 57:1207-1219.
Diaz-Nido J, Armas-Portela R, Avila J (1992) Toename van cytoplasmatische caseïnekinase II-type activiteit vergezelt neurietuitgroei na remming van DNA-synthese in NIA-103-neuroblastomacellen. J Neurochem 58:1820-1828.
Di Maira G, Salvi M, Arrigoni G, Marin O, Sarno S, Brustolon F, Pinna LA, Ruzzene M (2005) Eiwitkinase CK2 fosforyleert en reguleert Akt / PKB. Celdood verschilt 12:668-677.
Dobrazanski P, Noguchi T, Kovary K, Rizzo CA, Lazo PS, Bravo R (1991) Beide producten van het fosB-gen, FosB en de korte vorm ervan, FosB / SF, zijn transcriptieactivatoren in fibroblasten. Mol Cell Biol 11:5470-5478.
Abstract / GRATIS volledige tekst
Ferrara P, Andermarcher E, Bossis G, Acquaviva C, Brockly F, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2003) De structurele determinanten die verantwoordelijk zijn voor de proteasomale afbraak van c-Fos-eiwit verschillen volgens de omstandigheden van expressie. Oncogene 22:1461-1474.
Fuchs SY, Dolan L, Davis RJ, Ronai Z (1996) Fosforylatie-afhankelijke targeting van c-Jun ubiquitination door Jun N-kinase. Oncogene 13:1531-1535.
Fuchs SY, Xie B, Adler V, Fried VA, Davis RJ, Ronai Z (1997) c-Jun NH2-terminale kinasen richten zich op de ubiquitinering van hun geassocieerde transcriptiefactoren. J Biol Chem 272:32163-32168.
Abstract / GRATIS volledige tekst
Fuchs SY, Tappin I, Ronai Z (2000) Stabiliteit van de ATF2-transcriptiefactor wordt gereguleerd door fosforylatie en defosforylering. J Biol Chem 275:12560-12564.
Abstract / GRATIS volledige tekst
Girault JA, Hemmings HC Jr, Williams KR, Nairn AC, Greengard P (1989) Fosforylatie van DARPP-32, een dopamine- en cAMP-gereguleerd fosfoproteïne, door caseïnekinase II. J Biol Chem 264:21748-21759.
Abstract / GRATIS volledige tekst
Girault JA, Hemmings HC Jr, Zorn SH, Gustafson EL, Greengard P (1990) Karakterisering in zoogdierlijke hersenen van een DARPP-32 serinekinase identiek aan caseïnekinase II. J Neurochem 55:1772-1783.
Hanada M, Sugawara K, Kaneta K, Toda S, Nishiyama Y, Tomita K, Yamamoto H, Konishi M, Oki T (1992) Epoxomicine, een nieuw antitumormiddel van microbiële oorsprong. J Antibiot (Tokyo) 45:1746-1752.
Hann SR, Eisenman RN (1984) Eiwitten gecodeerd door het humane c-myc-oncogen: differentiële expressie in neoplastische cellen. Mol Cell Biol 4:2486-2497.
Abstract / GRATIS volledige tekst
Hemmings HC Jr, Girault JA, Williams KR, LoPresti MB, Greengard P (1989) ARPP-21, een cyclisch door AMP gereguleerd fosfoproteïne (Mr = 21,000) dat is verrijkt in met dopamine geïnnerveerde hersengebieden. Aminozuursequentie van de plaats gefosforyleerd door cyclisch AMP in intacte cellen en kinetische studies van zijn fosforylatie in vitro. J Biol Chem 264:7726-7733.
Hidaka H, Kobayashi R (1992) Farmacologie van proteïnekinaseremmers. Annu Rev Pharmacol Toxicol 32:377-397.
Hirata H, Bessho Y, Kokubu H, Masamizu Y, Yamada S, Lewis J, Kageyama R (2004) Instabiliteit van Hes7-eiwit is cruciaal voor de somietsegmentatieklok. Nat Genet 36:750-754.
Hiroi N, Graybiel AM (1996) Atypische en typische neuroleptische behandelingen induceren verschillende programma's van transcriptiefactorexpressie in het striatum. J Comp Neurol 374:70-83.
Hope B, Kosofsky B, Hyman SE, Nestler EJ (1992) Regulatie van directe vroege genexpressie en AP-1-binding in de rattenucleus accumbens door chronische cocaïne. Proc Natl Acad Sci USA 89:5764-5768.
Abstract / GRATIS volledige tekst
Hope BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ (1994a) Chronische behandeling met elektroconvulsieve aanvallen (ECS) resulteert in de expressie van een langdurig AP-1-complex in hersenen met veranderde samenstelling en kenmerken. J Neurosci 14:4318-4328.
Hope BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ (1994b) Inductie van een langdurig AP-1-complex dat bestaat uit veranderde Fos-achtige eiwitten in de hersenen door chronische cocaïne en andere chronische behandelingen. Neuron 13:1235-1244.
Ishida A, Fujisawa H (1995) Stabilisatie van calmoduline-afhankelijk proteïne kinase II door het auto-remmende domein. J Biol Chem 270:2163-2170.
Abstract / GRATIS volledige tekst
Jariel-Encontre I, Salvat C, Steff AM, Pariat M, Acquaviva C, Furstoss O, Piechaczyk M (1997) Complexe mechanismen voor afbraak van c-fos en c-jun. Mol Biol Rep 24:51-56.
Jones S, Yakel JL (2003) Caseïnekinase ii (proteïnekinase ck2) reguleert de serotonine 5-ht (3) -receptorkanaalfunctie in ng108-15-cellen. Neurowetenschap leerprogramma 119:629-634.
Kato T Jr, Delhase M, Hoffmann A, Karin M (2003) CK2 is een C-terminale IkappaB-kinase die verantwoordelijk is voor NF-kappaB-activering tijdens de UV-reactie. Mol Cell 12:829-839.
Kelz MB, Chen J, Carlezon WA Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ (1999) Expressie van de transcriptiefactor deltaFosB in de hersenen regelt de gevoeligheid voor cocaïne. NATUUR 401:272-276.
Kim KB, Myung J, Sin N, Crews CM (1999) Proteasoomremming door de natuurlijke producten epoxomicine en dihydroeponemycine: inzicht in specificiteit en potentie. Bioorg Med Chem Lett 9:3335-3340.
Kobayashi E, Nakano H, Morimoto M, Tamaoki T (1989) Calphostin C (UCN-1028C), een nieuwe microbiële verbinding, is een zeer krachtige en specifieke remmer van proteïnekinase C. Biochem Biophys Res Commun 159:548-553.
Krek W, Maridor G, Nigg EA (1992) Caseïnekinase II is een overwegend nucleair enzym. J Cell Biol 116:43-55.
Abstract / GRATIS volledige tekst
Krohn NM, Stemmer C, Fojan P, Grimm R, Grasser KD (2003) Eiwitkinase CK2 fosforyleert het SSRP1-eiwit met hoog mobiliteits-groepsdomein, waardoor de herkenning van door UV beschadigd DNA wordt geïnduceerd. J Biol Chem 278:12710-12715.
Abstract / GRATIS volledige tekst
Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DEH, Truong HT, Russo SJ, LaPlant Q, Whistler K, Neve RL, Self DW, Nestler EJ (2005) Chromatine-hermodellering is een sleutelmechanisme dat ten grondslag ligt aan door cocaïne geïnduceerde plasticiteit in striatum. Neuron 48:303-314.
Lieberman DN, Mody I (1999) Caseïnekinase II reguleert NMDA-kanaalfunctie in hippocampale neuronen. Nat Neurosci 2:125-132.
Litchfield DW (2003) Protein kinase CK2: structuur, regulatie en rol in cellulaire beslissingen van leven en dood. Biochem J 369:1-15.
Manabe T, Kuramoto N, Nakamichi N, Aramachi K, Baba K, Hirai T, Yoneyama M, Yoneda Y (2001) Afbraak van c-Fos-eiwit tot expressie gebracht door N-methyl-d-asparaginezuur in kernfracties van muriene hippocampus. Brain Res 905:34-43.
Mandelzys A, Gruda MA, Bravo R, Morgan JI (1997) Afwezigheid van een aanhoudend verhoogd 37 kDa fos-gerelateerd antigeen en AP-1-achtige DNA-bindende activiteit in de hersenen van met kaininezuur behandelde fosB-nulmuizen. J Neurosci 17:5407-5415.
Abstract / GRATIS volledige tekst
Marin O, Meggio F, Marchiori F, Borin G, Pinna LA (1986) Locatiespecificiteit van caseïnekinase-2 (TS) uit cytosol van rattenlever. Een onderzoek met modelspeptide-substraten. Eur J Biochem 160:239-244.
McClung CA, Nestler EJ (2003) Regulatie van genexpressie en cocaïnebeloning door CREB en DeltaFosB. Nat Neurosci 6:1208-1215.
McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ (2004) DeltaFosB: een moleculaire switch voor langdurige aanpassing in de hersenen. Brain Res Mol Brain Res 132:146-154.
Meggio F, Pinna LA (2003) Eénduizend-en-één substraten van proteïnekinase CK2? FASEB J 17:349-368.
Abstract / GRATIS volledige tekst
Meggio F, Donella-Deana A, Pinna LA, Moret V (1977) Fosforylering van caseïnefracties door 'fosvitinekinase' van de rattenlever. FEBS Lett 75:192-196.
Meggio F, Brunati AM, Pinna LA (1983) Autofosforylering van type 2-caseïnekinase TS op zowel zijn alfa- als bèta-subeenheden. Invloed van verschillende effectoren. FEBS Lett 160:203-208.
Meggio F, Shugar D, Pinna LA (1990) Ribofuranosyl-benzimidazolderivaten als remmers van caseïnekinase-2 en caseïnekinase-1. Eur J Biochem 187:89-94.
Meggio F, Marin O, Pinna LA (1994) Substraatspecificiteit van proteïnekinase CK2. Cell Mol Biol Res 40:401-409.
Miller C, Zhang M, He Y, Zhao J, Pelletier JP, Martel-Pelletier J, Di Battista JA (1998) Transcriptionele inductie van cyclooxygenase-2-gen door okadaic acid-remming van fosfataseactiviteit in menselijke chondrocyten: co-stimulatie van AP-1 en CRE-nucleaire bindende eiwitten. J Cell Biochem 69:392-413.
Moratalla R, Elibol B, Vallejo M, Graybiel AM (1996) Veranderingen op netwerkniveau in de expressie van induceerbare Fos-Jun-eiwitten in het striatum tijdens chronische cocaïnebehandeling en -ontwenning. Neuron 17:147-156.
Morgan JI, Curran T (1995) Onmiddellijke vroege genen: tien jaar later. Trends Neurosci 18:66-67.
Nakabeppu Y, Nathans D (1991) Een van nature voorkomende ingekorte vorm van FosB die de transcriptionele activiteit van Fos / Jun remt. Cel 64:751-759.
Nestler EJ, Barrot M, Self DW (2001) Delta FosB: een aanhoudende moleculaire switch voor verslaving. Proc Natl Acad Sci USA 98:11042-11046.
Abstract / GRATIS volledige tekst
Neve RL, Howe JR, Hong S, Kalb RG (1997) Introductie van de glutamaatreceptorsubeenheid 1 in motorneuronen in vitro en in vivo met behulp van een recombinant herpes-simplex-virus. Neurowetenschap leerprogramma 79:435-447.
Nuthall HN, Joachim K, Stifani S (2004) Fosforylatie van serine 239 van Groucho / TLE1 door proteïnekinase CK2 is belangrijk voor de remming van neuronale differentiatie. Mol Cell Biol 24:8395-8407.
Abstract / GRATIS volledige tekst
Okazaki K, Sagata N (1995) De Mos / MAP-kinase-route stabiliseert c-Fos door fosforylatie en verhoogt de transformerende activiteit ervan in NIH 3T3-cellen. EMBO J 14:5048-5059.
Palombella VJ, Rando OJ, Goldberg AL, Maniatis T (1994) De ubiquitine-proteasoomroute is vereist voor het verwerken van het NF-kappa B1-precursoreiwit en de activering van NF-kappa B. Cel 78:773-785.
Papavassiliou AG, Treier M, Chavrier C, Bohmann D (1992) Gerichte afbraak van c-Fos, maar niet van v-Fos, door een fosforylatie-afhankelijk signaal op c-Jun. Wetenschap 258:1941-1944.
Abstract / GRATIS volledige tekst
Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E (2003) Induceerbare, hersenregio-specifieke expressie van een dominante negatieve mutant van c-Jun in transgene muizen verlaagt de gevoeligheid voor cocaïne. Brain Res 970:73-86.
Perrotti LI, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ (2004) Inductie van DeltaFosB in beloningsgerelateerde hersenstructuren na chronische stress. J Neurosci 24:10594-10602.
Abstract / GRATIS volledige tekst
Persico AM, Schindler CW, O'Hara BF, Brannock MT, Uhl GR (1993) Hersentranscriptiefactorexpressie: effecten van acute en chronische amfetamine en injectiestress. Brain Res Mol Brain Res 20:91-100.
Ploegh HL, Dunn BM (2000) Post-translationele modificatie: fosforylering en fosfatasen. In: Huidige protocollen in eiwitwetenschap (Dunn BM, ed.) Pp. 13.01-13.02. New York: Wiley and Sons.
Pyerin W, Burow E, Michaely K, Kubler D, Kinzel V (1987) Katalytische en moleculaire eigenschappen van sterk gezuiverd phosvitine / caseïnekinase type II uit menselijke epitheelcellen in kweek (HeLa) en relatie tot ecto-proteïnekinase. Biol Chem Hoppe Seyler 368:215-227.
Reikhardt BA, Kulikova OG, Borisova GY, Aleksandrova IY, Sapronov NS (2003) Status van het "protein kinase CK2-HMG14" -systeem bij leeftijdsgerelateerde amnesie bij ratten. Neurosci Behav Physiol 33:799-804.
Roberts BJ, Whitelaw ML (1999) Degradatie van de dioxinereceptor voor basische helix-lus-helix / Per-ARNT-Sim-homologie via de ubiquitine / proteasoomroute. J Biol Chem 274:36351-36356.
Abstract / GRATIS volledige tekst
Rost B, Yachdav G, Liu J (2004) De PredictProtein-server. Nucleic Acids Res 32:W321-W326.
Abstract / GRATIS volledige tekst
Rylski M, Kaczmarek L (2004) Ap-1 doelen in de hersenen. Front Biosci 9:8-23.
Sahin B, Kansy JW, Nairn AC, Spychala J, Ealick SE, Fienberg AA, Greene RW, Bibb JA (2004) Moleculaire karakterisatie van recombinant muizen-adenosinekinase en evaluatie als doelwit voor eiwitfosforylering. Eur J Biochem 271:3547-3555.
Salvat C, Aquaviva C, Jariel-Encontre I, Ferrara P, Pariat M, Steff AM, Carillo S, Piechaczyk M (1999) Zijn er in vivo meerdere proteolytische routes die bijdragen tot de afbraak van c-Fos, c-Jun en p53-proteïne? Mol Biol Rep 26:45-51.
Schmidt R, Hecker E (1975) Autoxidatie van forbolesters onder normale opslagomstandigheden. Cancer Res 35:1375-1377.
Schwarz EM, Van Antwerp D, Verma IM (1996) Constitutieve fosforylatie van IkappaBalpha door caseïnekinase II treedt bij voorkeur op bij serine 293: vereiste voor afbraak van vrije IkappaBalpha. Mol Cell Biol 16:3554-3559.
Abstract / GRATIS volledige tekst
Sears R, Leone G, DeGregori J, Nevins JR (1999) Ras verbetert de stabiliteit van het Myc-eiwit. Mol Cell 3:169-179.
Silva-Neto MA, Fialho E, Paes MC, Oliveira PL, Masuda H (2002) Cyclische nucleotide-onafhankelijke fosforylatie van vitelline door caseïnekinase II, gezuiverd uit Rhodnius prolixus-oöcyten. Insect Biochem Mol Biol 32:847-857.
Skinner M, Qu S, Moore C, Wisdom R (1997) Transcriptionele activering en transformatie door FosB-eiwit vereisen fosforylatie van het carboxyl-terminale activeringsdomein. Mol Cell Biol 17:2372-2380.
Abstract / GRATIS volledige tekst
Stemmer C, Schwander A, Bauw G, Fojan P, Grasser KD (2002) Eiwitkinase CK2 fosforyleert op verschillende manieren maïs-chromosomale groepen van hoge mobiliteit uit groep B (HMGB) die hun stabiliteit en DNA-interacties moduleren. J Biol Chem 277:1092-1098.
Abstract / GRATIS volledige tekst
Stevens I, Derua R, Rondelez E, Waelkens E, Merlevede W, Goris J (1999) Identificatie van cyk, een cycline B2-kinase, als een nieuw calcium / calmoduline-afhankelijk eiwitkinase II en zijn rol tijdens rijping van Xenopus laevis-oocyten. Exp Cell Res 252:303-318.
Suh HW, Choi SS, Lee JK, Lee HK, Han EJ, Lee J (2004) Regulatie van c-fos en c-jun genexpressie door lipopolysaccharide en cytokines in primaire gekweekte astrocyten: effect van PKA- en PKC-routes. Arch Pharm Res 27:396-401.
Szyszka R, Boguszewska A, Grankowski N, Ballesta JP (1995) Differentiële fosforylering van ribosomale zure eiwitten uit gistcellen door twee endogene eiwitkinasen: caseïnekinase-2 en 60S-kinase. Acta Biochim Pol 42:357-362.
Tamaoki T, Takahashi I, Kobayashi E, Nakano H, Akinaga S, Suzuki K (1990) Calphostin (UCN1028) en calphostin gerelateerde verbindingen, een nieuwe klasse van specifieke en krachtige remmers van proteïne kinase C. Adv Second Messenger Phosphoprotein Res 24:497-501.
Torres J, Pulido R (2001) De tumoronderdrukker PTEN wordt gefosforyleerd door het proteïnekinase CK2 aan zijn C-uiteinde. Implicaties voor PTEN-stabiliteit voor proteasoom-gemedieerde afbraak. J Biol Chem 276:993-998.
Abstract / GRATIS volledige tekst
Tsubuki S, Saito Y, Tomioka M, Ito H, Kawashima S (1996) Differentiële remming van calpaïne- en proteasoomactiviteiten door peptidylaldehyden van di-leucine en tri-leucine. J Biochem (Tokyo) 119:572-576.
Abstract / GRATIS volledige tekst
Tsurumi C, Ishida N, Tamura T, Kakizuka A, Nishida E, Okumura E, Kishimoto T, Inagaki M, Okazaki K, Sagata N (1995) Degradatie van c-Fos door het 26S-proteasoom wordt versneld door c-Jun en meerdere eiwitkinasen. Mol Cell Biol 15:5682-5687.
Abstract / GRATIS volledige tekst
Unger GM, Davis AT, Slaton JW, Ahmed K (2004) Eiwitkinase CK2 als regulator van celoverleving: implicaties voor kankertherapie. Curr Cancer Drug Targets 4:77-84.
Flacon E, Marshall CJ (2003) Verhoogde ERK-MAP-kinaseactiviteit beschermt het FOS-familielid FRA-1 tegen proteasomale afbraak in coloncarcinoomcellen. J Cell Sci 116:4957-4963.
Abstract / GRATIS volledige tekst
Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S (2002) ΔFosB regelt het draaiende wiel. J Neurosci 22:8133-8138.
Abstract / GRATIS volledige tekst
Whitmarsh AJ, Davis RJ (2000) Regulatie van transcriptiefactorfunctie door fosforylatie. Cell Mol Life Sci 57:1172-1183.
Winter B, Kautzner I, Issinger OG, Arnold HH (1997) Twee vermeende eiwitkinase CK2-fosforylatiesites zijn belangrijk voor Myf-5-activiteit. Biol Chem 378:1445-1456.
Wisniewski JR, Szewczuk Z, Petry I, Schwanbeck R, Renner U (1999) Constitutieve fosforylering van de zure staarten van de 1-eiwitten met hoge mobiliteit door caseïnekinase II verandert hun conformatie, stabiliteit en DNA-bindingsspecificiteit. J Biol Chem 274:20116-20122.
Abstract / GRATIS volledige tekst
Yamaguchi Y, Wada T, Suzuki F, Takagi T, Hasegawa J, Handa H (1998) Caseïnekinase II interageert met de bZIP-domeinen van verschillende transcriptiefactoren. Nucleic Acids Res 26:3854-3861.
Abstract / GRATIS volledige tekst
Yanagawa T, Yuki K, Yoshida H, Bannai S, Ishii T (1997) Fosforylering van A170 stresseiwit door caseïnekinase II-achtige activiteit in macrofagen. Biochem Biophys Res Commun 241:157-163.
Yankulov K, Yamashita K, Roy R, Egly JM, Bentley DL (1995) De transcriptionele verlengingsremmer 5,6-dichloro-1-beta-d-ribofuranosylbenzimidazol remt transcriptie-factor IIH-geassocieerd eiwitkinase. J Biol Chem 270:23922-23925.
Abstract / GRATIS volledige tekst
Yen J, Wisdom RM, Tratner I, Verma IM (1991) Een alternatieve gesplitste vorm van FosB is een negatieve regulator van transcriptionele activering en transformatie door Fos-eiwitten. Proc Natl Acad Sci USA 88:5077-5081.
Abstract / GRATIS volledige tekst
Yin X, Jedrzejewski PT, Jiang JX (2000) Caseïnekinase II fosforyleert lensconnexine 45.6 en is betrokken bij de afbraak ervan. J Biol Chem 275:6850-6856.
Abstract / GRATIS volledige tekst
Yoza BK, Brooks JW, Mizel SB (1992) Inductie van AP-1 transcriptiefactor componenten tijdens T-cel activering door interleukine 1 en forbol esters. Celgroei verschilt 3:677-684.
Yu S, Wang H, Davis A, Ahmed K (2001) Gevolgen van CK2-signalering voor de nucleaire matrix. Mol Cell Biochem 227:67-71.
Yu S, Davis AT, Guo C, Green JE, Ahmed K (1999) Differentiële targeting van proteïnekinase CK2 naar de nucleaire matrix na tijdelijke overexpressie van zijn subeenheden. J Cell Biochem 74:127-134.
Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton O, Sim-Selley LJ, DiLeone RJ, Kumar A, Nestler EJ (2006) ΔFosB: een essentiële rol voor ΔFosB in de nucleus accumbens in morfineactie. Nat Neurosci 9:205-211.
Artikelen die dit artikel citeren
- Gedrags- en structurele reacties op chronische cocaïne vereisen een feedforward-lus met betrekking tot {Delta} FosB- en calcium / calmodulineafhankelijke proteïnekinase II in de Nucleus Accumbens Shell Journal of Neuroscience, 6 maart 2013, 33(10):4295-4307
- Striatale overexpressie van {Delta} FosB reproduceert chronische door levodopa geïnduceerde onvrijwillige bewegingen Journal of Neuroscience, 26 mei 2010, 30(21):7335-7343
- Abstract
- Volledige tekst
- Volledige tekst (PDF)
- Abstract
- Volledige tekst
- Volledige tekst (PDF)
- Abstract
- Volledige tekst
- Volledige tekst (PDF)
- Abstract
- Volledige tekst
- Volledige tekst (PDF)
- Transcriptionele verslavingsmechanismen: rol van {Delta} FosB Philosophical Transactions van de Royal Society B: Biological Sciences, 12 oktober 2008, 363(1507):3245-3255
- Blijvende kwetsbaarheid voor herstel van methamfetamine-zoekgedrag in gliale cellijn-afgeleide neurotrofische factor mutante muizen Het FASEB-dagboek, 1 juli 2007, 21(9):1994-2004
- De activatorproteïne-1 transcriptiefactor in respiratoire epitheelcarcinogenese Moleculair kankeronderzoek, 1 februari 2007, 5(2):109-120
;
