Proc Natl Acad Sci VS A. Apr 29, 2014; 111 (17): 6455-6460.
Online gepubliceerd Apr 15, 2014. doi: 10.1073 / pnas.1404323111
PMCID: PMC4036004
Neurowetenschap leerprogramma
Teruko Danjo,a Kenji Yoshimi,b Kazuo Funabiki,a Satoshi Yawata,a en Shigetada Nakanishia,1
Dit artikel is geweest geciteerd door andere artikelen in PMC.
Significantie
Dopamine (DA) -neuronen in het ventrale tegmentale gebied (VTA) reageren op aversieve stimuli meestal door transiënte silencing. Het blijft onduidelijk of deze reactie direct leidt tot aversieve reacties bij muizen die zich gedragen. We onderzochten deze vraag door DA-neuronen optogenetisch te controleren in de VTA en ontdekten dat de inactivatie van DA-neuronen resulteerde in aversieve respons en leren. De nucleus accumbens (NAc), de belangrijkste output-kernen van VTA DA-neuronen, werd geacht verantwoordelijk te zijn voor deze respons, dus we hebben onderzocht welke van de fundamentele routes in het NAc voor dit gedrag van cruciaal belang was door knockdown van D1- of D2-receptor te gebruiken, en ontdekte dat de D2-receptor-specifieke route cruciaal was voor dit gedrag.
Abstract
Dopamine (DA) -transmissie vanuit het ventrale tegmentale gebied (VTA) is van cruciaal belang voor het beheersen van zowel belonend als aversief gedrag. De transiënte silencing van DA-neuronen is een van de antwoorden op aversieve stimuli, maar de gevolgen en neurale mechanismen met betrekking tot aversieve reacties en leren zijn grotendeels ongrijpbaar gebleven. Hier, we rapporteren dat optogenetische inactivatie van VTA DA-neuronen DA-niveaus onmiddellijk neerwaarts reguleerde en opwaartse regulatie van de neurale activiteit in de nucleus accumbens induceerde (NAc) zoals geëvalueerd door Fos-expressie. Tzijn optogenetische onderdrukking van het DA-neuronvuren veroorzaakte onmiddellijk aversieve reacties op de eerder geprefereerde donkere kamer en leidde tot aversief leren in de richting van de optogenetisch geconditioneerde plaats. Belangrijk is dat deze afkeer van de plaats werd opgeheven door de dopamine D2-receptoren af te breken, maar niet door die van D1-receptoren in het NAc.. Silencing van DA-neuronen in de VTA was dus onmisbaar voor het induceren van aversieve responsen en het leren door middel van dopamine D2-receptoren in het NAc.
Het mesolimbische dopaminerge systeem speelt niet alleen een cruciale rol in een breed scala aan motivatie en leren (1-3), maar de disfunctie ervan is ook betrokken bij ernstige neuropsychiatrische stoornissen zoals geïllustreerd in de ziekte van Parkinson, schizofrenie en drugsverslaving. Dopamine (DA) neuronen in het ventrale tegmentale gebied (VTA) reageren op belonende stimuli door fasisch schieten, en de hoofdfunctie van dit schieten is theoretisch om te coderen voor "de beloningsvoorspellingsfout", het verschil in de waarde tussen de voorspelde beloning en de werkelijke beloning (4). In tegenstelling tot de respons op belonende stimuli, zijn hun reacties op aversieve stimuli verre van homoloog; dat wil zeggen, sommige DA neuronen worden geactiveerd als reactie op aversieve stimuli, terwijl de meeste anderen reageren door voorbijgaand hun aanvallen te onderdrukken. (5-9). Recente studies hebben zelfs aangetoond dat optogenetische activatie van GABAergic neuronen en resulterende inactivatie van DA-neuronen de beloningsconsumptie onderdrukken en een aversieve respons opwekken (10, 11). Het is echter grotendeels ongrijpbaar gebleven welke mechanismen in de neurale circuits essentieel zijn voor het verwerven van aversief leren na de inactivatie van DA-neuronen in de VTA en hoe gedragsreacties worden gecontroleerd in de richting van het onderdrukken van beloningsgebruik en het induceren van aversief gedrag.
Uit geaccumuleerd bewijs is gebleken dat het motiverende en cognitieve leren als reactie op positieve en negatieve stimuli grotendeels wordt gereguleerd door de neurale circuits inclusief de basale ganglia (12), die een grote hoeveelheid van de dopaminerge projectie van de middenhersenen ontvangen. In het striatum worden twee fundamentele neurale circuits gevormd door gespecificeerde middelgrote spiny-neuronen (MSN's), die elk een ander type DA-receptor tot expressie brengen (13).
- Eén circuit is de directe route, bestaande uit de MSN's die direct naar de uitgangskernen van de basale ganglia, substantia nigra pars reticulata (SNr) projecteren en voornamelijk dopamine D1-receptoren (D1R's) tot expressie brengen.
- De andere is de indirecte route, bestaande uit de MSN's die indirect via de globus pallidus naar de SNr projecteren en voornamelijk dopamine D2-receptoren (D2R's) tot expressie brengen.
DA-signalen van de middenhersenen modelleren dynamisch deze twee parallelle paden op de tegenovergestelde manier via D1R's en D2R's, en deze modulatie zou het motiverend leren moeten vergemakkelijken (3, 14).
- Wat de belonende stimuli betreft, worden up-gereguleerde DA-niveaus die worden geïnduceerd door belonende signalen geacht de D1R's te activeren en dus voornamelijk de directe route in de nucleus accumbens (NAc) te vergemakkelijken.
- Aan de andere kant verlaagt de onderdrukking van DA-neuronvuren als reactie op aversieve stimuli DA-niveaus in het NAc; en deze reactie wordt verondersteld specifiek de signaaloverdracht in de indirecte route te bevorderen via geactiveerde D2R's.
Hoewel studies met behulp van de farmacologische strategieën en omkeerbare neurotransmitterende blokkering (RNB) methode dit reguleringsmechanisme in het NAc hebben ondersteund (15, 16), het is onbekend gebleven of de onderdrukking van DA-neuronstralen voldoende is om de activiteit van de indirecte route te bevorderen en vervolgens het vermijdingsgedrag te induceren. In deze studie hebben we dit probleem aangepakt door DA-neuronen selectief in de VTA te inactiveren door optogenetisch manipuleren van membraan-hyperpolariserende Arch-eiwitten (17) en demonstreerde expliciet dat de onderdrukking van DA-neuronen in de VTA vervolgens DA-niveaus in het NAc verlaagde en aversieve reactie en leren induceerde. Verder hebben we de mechanismen van de regulatie van deze reactie onderzocht en beschreven dat deze aversieve reactie specifiek werd gecontroleerd door D2R's in het NAc.
Resultaten
Optogenetische inactivatie van DA-neuronen blokkeert de voorkeur voor donkere kamers.
Voor het selectief inactiveren van ontstekingen van DA-neuronen, injecteerden we een Cre-induceerbaar adeno-geassocieerd viraal construct dat codeert voor Arch-eGFP [AAV-dubbel-floxed omgekeerd open leeskader (DIO) -Arch] (17) eenzijdig in de VTA van volwassen tyrosinehydroxylase (TH) -Cre-muizen (18) en wildtype (WT) nestgenoten en plaatste een optische vezel boven de VTA (Fig. S1 A en C). Twee weken na de operatie werd Arch-eGFP in de VTA beperkt gedetecteerd (Fig. S1B). We testten het hyperpolariserende effect van het Arch-eiwit door elektrofysiologische registratie en maten het effect van optische stimulatie van de VTA van TH-Cre-muizen geïnjecteerd met AAV-DIO-Arch. In vivo elektrofysiologische opnames van de VTA van geanesthetiseerde TH-Cre-muizen onthulden dat optische stimulatie van vermeende DA-neuronen hun ontste- kingen remde (Fig. S2), wat aangeeft dat de optische stimulatie de membraanpotentiaal van de Arch-expresserende DA-cellen voldoende gehyperpolariseerd heeft en dus hun spontaan afvuren remde.
Met behulp van deze muizen hebben we vervolgens onderzocht of de optische inactivatie van DA-neuronen in de VTA kan dienen als een aversief signaal voor gedragsleren. Muizen hebben een aangeboren neiging om de voorkeur te geven aan een donkere omgeving (19). We ontwierpen een gedragsapparaat waarin muizen vrij de donkere kamer konden verkennen en heldere ruimtes konden openen (Fig 1A). Na gewenning bleven de WT-muizen bij voorkeur in de donkere kamer, al dan niet met optische stimulatie in de donkere kamer (Fig. S1D), waarbij ervoor werd gezorgd dat de optische stimulatie zelf geen invloed had op hun gedrag in de donkere kamer. We hebben het gedragsexperiment van dieren gepland om het effect van optische inactivatie van DA-neuronen op hun gedrag te testen (Fig. S1E). Na gewenning en vóór de test werden muizen geconditioneerd door de DA-neuronen in de VTA optisch te stimuleren toen ze in de donkere kamer bleven. Zelfs tijdens de eerste 5 min van conditionering bleven de TH-Cre-muizen uit de eerder geprefereerde donkere kamer en vermeden achtereenvolgens de donkere kamer gedurende de conditionering (Fig 1B). De TH-Cre-muizen hebben hun vermijding tegen de donkere kamer niet omgekeerd, hoewel ze bij de nameting geen optische stimulatie ontvingen (Fig 1C). Deze gegevens geven aan dat hyperpolarisatie van DA-neuronen niet alleen voorbijgaand aversief gedrag induceerde, maar ook diende als een signaal voor aversief leren tegen de donkere kamer en ook aantonen dat de inactivatie van DA-neuronen een oorzakelijke rol speelde in zowel voorbijgaand aversief gedrag als langdurig aversief leren.
Optogenetische neerwaartse regulatie van DA-niveaus in het NAc.
We hebben vervolgens onderzocht of de inactivatie van DA-neuronen in de VTA de concentratie van DA in het belangrijkste richtgebied, het NAc, daadwerkelijk heeft gewijzigd. We maten DA-niveaus in het NAc door fast-scan cyclische voltammetrie (FSCV) in geanesthetiseerde TH-Cre-muizen die waren geïnjecteerd met AAV-DIO-Arch in hun VTA. DA-niveaus in het NAc werden onmiddellijk verhoogd door elektrische stimulering van de VTA en de opgewekte DA-afgifte werd significant verminderd door gelijktijdige optische stimulatie van de VTA (Fig. S3). Vervolgens hebben we getest of optische stimulatie van VTA het tonische DA-niveau in het NAc kon verlagen. In dezelfde experimentele instellingen hebben we waargenomen dat het DA-niveau in het NAc tijdelijk werd verlaagd door 20 s van optische stimulatie van de VTA (Fig 2), wat consistent is met de gerapporteerde FSCV-reactie tegen de aversieve stimuli (20). Deze gegevens tonen aan dat optische stimulatie van de VTA voldoende effectief was om de VTA DA-neuronen te inactiveren en het DA-niveau in de NAc tijdens het gedragsexperiment te verminderen.
Up-regulatie van Fos-genexpressie door optische inactivatie van DA-neuronen in de VTA.
De gedragsverandering veroorzaakt door geconditioneerde inactivatie van DA-neuronen in de VTA suggereerde dat optische stimulatie rechtstreeks de neurale activiteit veranderde en resulteerde in de verschuiving van gedragsprestaties. Dus hebben we vervolgens de regio's waarin de neurale activiteit verhoogd was door de geconditioneerde inactivatie van DA-neuronen onderzocht door de expressie van Fos, een onmiddellijk vroeg gen, te onderzoeken. Kort nadat de conditionering werd uitgevoerd in de donkere kamerproef, werden muizen snel verwerkt om de hoeveelheid Fos-expressie te bepalen door middel van kwantitatieve in situ hybridisatieanalyse (Fig 3 en Fig. S4). Het NAc, het gebied dat een grote hoeveelheid dopaminerge projecties van de VTA ontvangt, vertoonde een significant verhoogde hoeveelheid Fos-expressie in de TH-Cre-muizen (Fig 3). Deze opwaartse regulatie werd ook gedetecteerd in de contralaterale zijde van optische stimulatie, die vermoedelijk werd veroorzaakt door een kleine hoeveelheid virusinfectie aan die zijde. De opwaartse regulatie was echter aan de ipsilaterale zijde veel hoger dan aan de contralaterale kant van optische stimulatie, wat suggereert dat optische inactivatie van DA-neuronen de neurale activiteit van het NAc rechtstreeks omhoog regelde. De verhoogde Fos-expressie werd ook waargenomen in andere hersenregio's, waaronder het septum, periventriculaire regio's van het striatum, basolaterale amygdala (BLA) en laterale hypothalamus, maar niet in de laterale habenula of mediale prefrontale cortex (mPFC; Fig. S4). Deze resultaten geven aan dat de gebieden geactiveerd door optische inactivatie van DA-neuronen niet waren beperkt tot de directe doelwitgebieden van VTA DA-neuronen, maar eerder de gebieden omvatten die indirect geactiveerd konden worden op een neurale circuitafhankelijke manier. Deze waarneming suggereert dat optische inactivatie van DA-neuronen de gehele neuronale activiteit in het circuit veranderde en niet alleen een afkeerreactie kon oproepen, maar ook verschillende andere hersenfuncties, zoals angst, angst en stressreacties (21).
DA-signalering via D2R is van cruciaal belang voor optogenetisch geïnduceerde geconditioneerde plaats-aversie.
De meerderheid van de dopaminerge signalen van de VTA worden doorgegeven aan de MSN's in de NAc tot DA-receptoren, D1R en D2R. D1R wordt bijna uitsluitend tot expressie gebracht in de stof P (gecodeerd door het Tac1-gen) dat MSN's tot expressie brengt, en D2R komt voornamelijk tot expressie in de enkefaline (gecodeerd door Penk-gen) tot expressie brengende MSN's; elk type MSN vormt de directe en indirecte routes, respectievelijk, in het NAc (3). Omdat de affiniteit voor DA veel hoger is voor de D2R (nM-volgorde) dan voor de D1R (μM-volgorde) (22, 23), wordt aangenomen dat een verlaging van DA-niveaus resulteert in de inactivatie van Gi-gekoppelde D2R maar geen merkbaar effect op de D1R (3, 24), waardoor de neurale activiteit specifiek in de indirecte route wordt opgewaardeerd. Bovendien werd de Fos-activering prominenter waargenomen in Penk- of Drd2 (D2R) tot expressie brengende cellen dan in de cellen TacxNUMX- of Drd1a (D1R) -expressie (Fig. S5). Gebaseerd op deze waarnemingen, hebben we de hypothese dat DA-signalering via D2R een belangrijke rol zou kunnen spelen in de waargenomen aversieve conditionering.
Om deze hypothese te testen, hebben we de driekamer geconditioneerde place aversion (CPA) test uitgevoerd (Fig. S6). We hebben een gedragsapparaat gemaakt met twee kamers met vrijwel identieke omstandigheden en één kleine gang. Deze onbevooroordeelde omgevingsconditie in de CPA-test stelde ons in staat verder te onderzoeken of de inactivatie van VTA DA-neuronen in staat is tot het induceren van aversieve reactie en leren, naast het blokkeren van de voorkeur van de donkere kamer. Wanneer dieren vrij door het hele apparaat konden bewegen, bleven de meeste in twee kamers zonder enig kenmerkend verschil in gedrag bij de pretest. De optische conditionering werd vervolgens uitgevoerd door optische stimulatie te koppelen met één vaste kamer. Zelfs wanneer een van de kamers werd gebruikt voor de conditionering, vermeden de TH-Cre-muizen langdurig en significant voorkomen dat ze in de optisch geconditioneerde kamer verbleven tijdens de conditionering en tijdens de posttest (Fig. S6 B-E). Statistische analyse bevestigde een significante vermindering van de verblijftijd van de TH-Cre-muizen in de optisch geconditioneerde kamer in de posttest vergeleken met de verblijftijd voor de WT-muizen (Fig. S6F).
We hebben vervolgens gepoogd DA-receptor-subtypen die betrokken zijn bij dit aversieve gedrag te specificeren door specifiek elk van de DA-receptoren in het NAc te onderdrukken (Fig 4 en Fig. S7). We ontwierpen en valideerden lentivirale vectoren met kort haarspeld-RNA (shRNA) specifiek voor elke DA-receptor met constitutieve expressie van mCherry. Drie weken na het injecteren van het lentivirus in het NAc, werd robuuste expressie van mCherry gelokaliseerd in het NAc (Fig 4B). De effectieve knockdown van mRNA-expressie van elke receptor werd bevestigd door kwantitatieve real-time PCR-analyse (Fig. S7A). Het meten van eiwitniveaus door Western blotting onthulde ook dat injectie van elk van de lentivirussen selectief zijn doeleiwitproduct verminderde zonder de expressie van het andere subtype van DA-receptor te beïnvloeden (Fig 4C en Fig. S7 B-G). De shD1R- en shD2R tot expressie brengende lentivirussen verminderden hun doeleiwitniveau respectievelijk tot 46.2 ± 1.1% en 38.4 ± 4.9%, vergeleken met het niveau voor het controlevirus (Fig 4C). Deze resultaten bevestigden dat de lentivirale vectoren die shRNA specifiek voor D1R en D2R tot expressie brengen selectief en voldoende hun doel-RNA's onderdrukten en de hoeveelheid van de respectieve eiwitproducten neerwaarts reguleerden. We bevestigden ook dat de door virus gemedieerde expressie van mCherry niet werd gedetecteerd in de VTA, met uitsluiting van de mogelijkheid dat het lentivirus-gemedieerde shRNA de VTA rechtstreeks beïnvloedde.
Met behulp van deze lentivirussen die shRNA bevatten, hebben we getest welk type DA-receptor verantwoordelijk was voor het aversieve gedrag geïnduceerd door optogenetische inactivatie van DA-neuronen. We injecteerden shRNA-bevattend lentivirus of controle lentivirus in het bilaterale NAc samen met AAV-DIO-Arch in de linker VTA van de TH-Cre-muizen. De optische vezel werd ook ingebracht boven de VTA (Fig 4A). Toen de driekamer-CPA-test drie weken na de operatie werd uitgevoerd, toonden de TH-Cre-muizen die waren geïnjecteerd met lenti: shD1R-mCherry nog steeds een expliciete CPA tegen de met optische stimulatie gepaard gaande kamer, vergelijkbaar met die van de TH-Cre-muizen die waren geïnjecteerd met de controle lentivirus (lenti: mCherry). In tegenstelling hiermee lieten de TH-Cre-muizen geïnjecteerd met lenti: shD2R-mCherry geen duidelijke CPA tijdens conditionering zien (Fig 4D). Het exclusieve leerachterstand van de TH-Cre-muizen geïnjecteerd met lenti: shD2R-mCherry werd verder onderbouwd door analyse van aversief leren bij de posttest (Fig 4E). Deze resultaten tonen aan dat het aversieve gedrag van de plaats geconditioneerd door DA-neuroninactivatie specifiek werd opgeroepen via D2R, en niet via D1R, in het NAc.
Discussie
In het striatum hebben studies aangetoond dat activering van de Gs-gekoppeld D1R vergemakkelijkt het vuren, terwijl activering van de Gi-gekoppeld D2R resulteert in onderdrukte schietefficiëntie (25). AcOp basis van de specificiteit van de DA-receptorexpressie activeren fasische afvuuracties van DA-neuronen hoofdzakelijk de directe route via D1R, terwijl een voorbijgaande afname van DA-neuronvuren voornamelijk de indirecte route-competentie bevordert via D2R (3, 26). Op basis van dit regulatiemechanisme is voorgesteld dat silencing van DA-neuronen in reactie op aversieve stimuli voornamelijk via de indirecte route wordt verwerkt en resulteert in aversief gedrag (3). Recente studies hebben aangetoond dat blokkering van de synaptische overdracht van de indirecte route de verkrijging van aversief gedrag veroorzaakt door een elektrische schok (15) en dat deze verslechtering wordt veroorzaakt door de remming van door D2R gemedieerde signaaloverdracht (16). IkBovendien verhoogt de optogenetische opwaartse regulatie van D2R tot expressie brengende MSN's in de indirecte route gedragsvermijding (27). Omdat DA-neuronen zowel versterkte als onderdrukte ontstekingen vertonen in reactie op aversieve stimuli en omdat andere schokgerelateerde sensorische informatie tegelijkertijd in de hersenen wordt verwerkt, moet nog worden opgehelderd of silencing van DA-neuronen direct aversieve reactie en leren kan veroorzaken, en of deze reactie gereguleerd wordt door D2R tot expressie brengende MSN's in de indirecte route.
In deze studie gebruikten we optogenetische controle van DA-neuronvuren in de twee gedragstests: de voorkeurstest in de donkere kamer en de driekamers CPA-test. Onze optogenetische manipulatie toonde efficiënte onderdrukking van DA-neuronvuur in de VTA en neerwaartse regulatie van DA-niveaus in het NAc. Onze precieze optogenetische inactivatie van DA-neuronvuren alleen gedurende de periode dat de dieren in de geconditioneerde kamer bleven, leidde expliciet tot een afkeerreactie en leren, wat aantoont dat voorbijgaande DA-silencing direct passief vermijdingsgedrag veroorzaakte. Verder heeft dit onderzoek duidelijk gemaakt dat de door D2R gemedieerde signaalverwerking een sleuteldeterminant is voor de inductie van deze aversieve reactie en het leren.
Hoewel onze gegevens aantoonden dat D1R geen effect had in de gedragsexperimenten om de CPA op te roepen, hebben verschillende onderzoeken gedocumenteerd dat fasisch afvuren van DA-neuronen nodig is voor angstresponsen en aversief leren (28, 29). Dit verschil is te wijten aan de experimentele instelling; dat wil zeggen dat onze optogene benadering de mogelijkheid uitsluitte van signalering door geactiveerde DA-neuronen om aversief gedrag op te wekken, wat aangeeft dat inactiverende DA-neuronen voldoende waren om aversief gedrag en leren te veroorzaken. De functie en signaalverwerking van het geactiveerde DA-vuur dat door aversieve stimuli wordt opgeroepen, zou verschillende bijdragen aan aversiegedrag hebben van degenen die hier worden bestudeerd en moet in de toekomst worden verduidelijkt.
DA neuronen projecteren ook naar verschillende andere regio's, waaronder de mPFC, amygdala en hippocampus. Een recente studie wees dat aan optogenetische activering van laterale habenula-neuronen die naar DA-neuronen in de VTA projecteren, zijn in staat om aversief gedrag te induceren, en deze DA-neuronen zijn hoofdzakelijk en specifiek gericht op de mPFC (30), hoewel hun optogenetische conditionering anders was dan in onze huidige studie, omdat hun optogenetische stimulatie gedurende een hele conditioneringssessie werd verlengd. Omdat gemeld is dat de dopaminerge input van de mPFC niet alleen wordt geactiveerd door aversieve stimuli, maar ook door chronische stress (31, 32), is het mogelijk dat hun continue activering van mPFC-projecterende DA-neuronen wordt waargenomen als signalen uit een zeer stressvolle omgeving; en als gevolg van de accumulatie van stressvolle conditionering, zouden de dieren een aversief gedrag vertonen in de geconditioneerde kamer. Daarentegen remden we afvuren van DA-neuronen alleen terwijl de dieren in de geconditioneerde kamer bleven. De resultaten van onze gedragsexperimenten met timing-gematchte conditionering gaven aan dat een plotselinge onderdrukking van het DA-signaal zou worden waargenomen als een plotselinge aversieve input, wat resulteerde in hun snelle aversieve respons.
DA neuronen projecteren ook naar de amygdala, de regio die grotendeels bijdraagt aan de angstrespons. Inderdaad, de DA-signalering naar de amygdala is betrokken bij de angstrespons en het verwerven van angstgeheugen (33, 34). In onze studie identificeerde het labelen van DA-neuronen in de VTA een set DA-neuronen die naar de BLA projecteerden, maar de omvang van deze projecties was veel lager dan die naar het NAc projecteerde. Hoewel we een subtiel effect van door amygdala geprojecteerde DA-signalering op ons waargenomen aversiegedrag niet konden uitsluiten, zou het belangrijkste effect van onze optogenetische inactivatie van DA-neuronen op het NAc moeten zijn, omdat onze experimenten met specifieke knockdown van de D2R in het NAc drastisch afnamen het aversieve gedrag. Toekomstige onderzoeken naar doelspecifieke DA-signalering zijn nodig om de effecten van circuit-brede modificatie van DA-neuronen op de aversieve stimuli en angstconditionering op te helderen.
Materialen en methoden
Onderwerpen.
Tyrosine hydroxylase: IRES-Cre (TH-Cre) knock-in muizen (EM: 00254) (18) verkregen uit het European Mouse Mutant Archive. Alle proefdieren werden voor meer dan 57-generaties teruggekruist naar de C6BL / 10J-stam. Muizen werden gepaard met de C57BL / 6J WT-muizen en gehuisvest met een standaard 12-h licht / 12-h donkere cyclus en kregen ad libitum voedsel en water. Cre+ en Cre- muizen uit dezelfde nesten (3-6 mo van leeftijd) werden voor de experimenten gebruikt. Alle dierproeven werden goedgekeurd door de dierencommissie van Osaka Bioscience Institute volgens de richtlijnen van dierproeven.
Gedragstesten.
Tijdens alle gedragstests werden muizen verbonden met een optische vezel en toegestaan om zich rond het gehele apparaat te bewegen. De beweging van muizen werd gemonitord zodat ze zonder obstakels konden bewegen, zelfs als ze waren verbonden met een optische vezel op hun kop. De positie van een muis werd gedetecteerd door een videocamera die boven het gedragsapparaat was opgehangen en werd geanalyseerd door een op maat gemaakt programma met Labview-software.
Testvoorkeur donkere kamer.
Het op maat gemaakte gedragsapparaat dat in de test werd gebruikt, bestond uit een donkere kamer (15 × 9.5 cm) en een heldere open ruimte (15 × 11 cm). De donkere kamer had muren, een vloer en een dak, die allemaal in het zwart waren gekleurd en een ingang (4.5 cm lang) hadden naar de open heldere ruimte. De open heldere ruimte had de vorm van een ellips en had een metalen roostervloer en heldere muren zonder dak. Vóór de test werden alle muizen gewend voor 10 min in het apparaat. De test bestond uit drie sessies: aan het begin van de dag 1 (pretest: 5 min.) Mochten muizen het hele apparaat verkennen. Vanaf de late helft van de dag 1 tot dag 4 (conditionering: 35 min. In totaal) kregen muizen optische stimulatie toen ze in de donkere kamer bleven. Op dag 5 werd de donker-kamervoorkeur getest zonder optische stimulatie (posttest: 5 min; Fig. S1E).
Driekamers CPA-test.
Het op maat gemaakte driekamer geconditioneerde plaatsvoorkeur / CPA-apparaat dat in de test werd gebruikt, bestond uit twee kamers (10 × 17 cm) en een verbindingsgang. De test bestond uit drie sessies. Dag 1 (pretest: 15 min.): Muizen mochten vrij het hele apparaat verkennen. Muizen die 1.5 langer in de ene kamer bleven dan in de andere, werden uitgesloten van de test. Dagen 2 en 3 (conditio nering: 15 min. Elk): Muizen ontvingen optische stimulatie wanneer ze in de licht-gepaarde kamer bleven. De selectie van de licht-gepaarde kamer werd gecompenseerd. Dag 4 (nameting: 15 min): de test werd uitgevoerd onder dezelfde omstandigheden als in de pretest (Fig. S6A).
In de conditioneringssessie werd de optische stimulatie gestopt voor 30 s wanneer de muizen continu bleven boven 30 s in de donkere kamer of de licht-gepaarde kamer om oververhitting te voorkomen. Het laservermogen werd gecontroleerd op ongeveer 5 mW aan het uiteinde van de optische vezel bij alle gedragstests.
In vivo Fast-Scan Cyclische Voltammetrie.
FSCV-experimenten werden uitgevoerd met behulp van de methode beschreven in eerdere studies (35-37). Muizen werden geanesthetiseerd met een ketamine / xylazine-mengsel zoals beschreven in SI-materialen en -methoden en geplaatst in een stereotaxisch frame. Een optische vezel die wordt gebruikt voor het stimuleren van DA-neuronen die de HA tot expressie brengen was dicht bij de stimulatie-elektrode geplaatst. De stimulerende optrode werd vervolgens in de VTA geplaatst (van bregma: anterior-posterior, -3.2 mm; lateral, 0.5 mm; and dorsal-ventral, 3.5 mm) en verlaagd met 0.25-mm intervallen. Een koolstofvezel-micro-elektrode (lengte 300 μm) voor voltametrische registratie werd verlaagd naar de NAc (van bregma: anterior-posterior, 1.0 mm; laterale; 1.0 mm; en dorsale ventrale; 3.5 mm). Voltametrische metingen werden elke 100 ms gemaakt door een driehoeksgolfvorm (-0.4 V tot + 1.3 V tot -0.4 V versus Ag / AgCl, bij 400 V / s) toe te passen op de koolstofvezel-micro-elektrode. Een op maat gemaakte potentiostaat werd gebruikt voor golfvormisolatie en stroomversterking. DA-afgifte werd opgeroepen door elektrische stimulatie van DA-neuronen door gebruik te maken van 24-pulsstimulatie (100 μA, 5 ms-duur, 30 Hz). Een optische stimulatie van DA-neuronen (532 nm, ~5 mW vermogen aan de vezeltip) werd toegepast voor het starten van 10 s 5 s voor het begin van een elektrische stimulatie. Koolstofvezel micro-elektroden werden gekalibreerd in een oplossing met bekende concentraties DA (0.2 μM, 0.5 μM en 1.0 μM). Alle voltammetrie data werden geanalyseerd door op maat gemaakte programma's met behulp van Labview en Matlab software. Vermindering van DA-niveaus door optische stimulatie werd opgelost met principale componentenanalyse, door gebruik te maken van de sjabloon-DA-golfvormen verkregen uit elektrische VTA-stimulaties om dopaminesignalen te scheiden (35, 36).
Statistische analyse.
Statistische analyse werd uitgevoerd met GraphPad PRISM 5.0 (GraphPad Software). Gegevens werden geanalyseerd met herhaalde metingen ANOVA (Fig. 1B, , 4D,4D en Fig. S6 D en E) of one-way ANOVA (Fig. 1C, , 3D,3D, 4 C en E en Fig. S4 K-M, S6F en S7A) en post-hocanalyses werden gedaan met behulp van de Bonferroni-test. Alle markeringen / kolommen en staven vertegenwoordigden respectievelijk het gemiddelde en ± SEM.
Andere experimentele procedures waaronder voorbereiding en injectie van virussen, elektrofysiologische registratie en immunohistochemische en mRNA-analyse worden in detail beschreven in SI-materialen en -methoden.
Dankwoord
We danken E. Boyden voor het Arch-construct, R. Matsui voor technisch advies over de productie en zuivering van lentivirussen, en Y. Hayashi voor technisch advies bij het programmeren van data-analyse. Dit werk werd ondersteund door Research Grants-in-Aid 22220005 (naar SN), 23120011 (naar SY en SN), 24700339 (naar TD) en 25871080 (naar SY) van het ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie van Japan en een subsidie van Takeda Science Foundation (aan SN).
voetnoten
De auteurs verklaren geen belangenconflict.
Dit artikel bevat ondersteunende informatie online op www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1404323111/-/DCSupplemental.
Referenties
;
