Optogenetica onthult een rol voor accumulaire middelgrote stekelige neuronen die dopamine D2-receptoren tot expressie brengen in door cocaïne geïnduceerde gedragssensibilisatie (2014)

Ga naar:

Abstract

Langdurige, door drugs geïnduceerde aanpassingen binnen de nucleus accumbens (NAc) zijn voorgesteld om bij te dragen aan door drugs gemedieerd verslavend gedrag. Hier hebben we een optogenetische benadering gebruikt om de rol te onderzoeken van NAc medium stekelige neuronen (MSN's) die dopamine D2-receptoren (D2R's) tot expressie brengen in door cocaïne geïnduceerde gedragssensibilisatie. Adeno-geassocieerde virale vectoren die coderen voor kanaalrhodopsine-2 (ChR2) werden afgeleverd in het NAc van D2R-Cre-transgene muizen. Hierdoor konden we D2R-MSN's in NAc selectief fotostimuleren. D2R-MSN's vormen lokale remmende circuits, omdat fotostimulatie van D2R-MSN remmende postsynaptische stromen (IPSC's) in naburige MSN's veroorzaakte. Fotostimulatie van NAc D2R-MSN in vivo beïnvloedde noch de initiatie noch de expressie van door cocaïne geïnduceerde gedragssensibilisatie. Fotostimulering tijdens de periode van het stoppen van het geneesmiddel verzwakte echter de expressie van door cocaïne geïnduceerde gedragssensibilisatie. Deze resultaten tonen aan dat D2R-MSN's van NAc een sleutelrol spelen bij door ontwenning geïnduceerde plasticiteit en kunnen bijdragen aan terugval na stopzetting van drugsmisbruik.

sleutelwoorden: optogenetica, middellange stekelige neuronen, dopamine D2-receptoren, cocaïne, drugsverslaving

Introductie

Dopamine (DA) -signalering is geassocieerd met beloningsverwachtingen en doelgericht gedrag (Wise, 2004; Ga naar en gratie, 2005; Berridge, 2007). Een van de bekende pathologieën van dopaminerge aandoeningen is drugsverslaving (Robinson en Berridge, 1993, 2003). Na herhaalde blootstelling aan verslavende stoffen treden adaptieve veranderingen op op moleculair en cellulair niveau in de DA-mesolimbische route; deze kunnen leiden tot drugsverslaving, een chronische, recidiverende aandoening waarbij compulsief gedrag ten aanzien van het opzoeken van drugs en drugsgebruik ondanks hun ernstige negatieve gevolgen aanhoudt (Thomas et al., 2008; Baik, 2013). Karakterisering van de modificaties die plaatsvinden in het mesolimbische dopaminerge systeem is dus de sleutel tot begrip van drugsverslaving.

Dopamine D1-receptoren (D1R) en D2-receptoren (D2R) komen sterk tot uiting in de medium stekelige neuronen (MSN's) van het striatum. Er is gesuggereerd dat langdurige medicijngeïnduceerde aanpassingen in het ventrale striatum, beter bekend als de nucleus accumbens (NAc), bijdragen tot de ontwikkeling van verslaving evenals drugszoekende en terugvalgedrag (Lobo en Nestler, 2011; Smith et al., 2013). Dopaminerge cellichamen van het ventrale tegmentale gebied meestal innervate het NAc. Over 95% van de cellen in het NAc zijn MSN's, die exciterende ingangen ontvangen van vier belangrijke hersenregio's: de prefrontale cortex, het ventrale submiculum van de hippocampus, de basolaterale amygdala en de thalamus (Sesack en Grace, 2010; Lüscher en Malenka, 2011). MSN's binnen het NAc kunnen worden onderverdeeld in twee grote subpopulaties: directe pathway-MSN's die D1R's tot expressie brengen en rechtstreeks naar DA-gebieden van de middenhersenen projecteren, en indirecte pathway-MSN's die D2R's tot expressie brengen en projecteren naar het ventrale pallidum (Kreitzer en Malenka, 2008; Sesack en Grace, 2010; Lüscher en Malenka, 2011; Smith et al., 2013). Omdat MSN GABAergic is, zal activering van MSN's neuronen hun stroomafwaartse targets die ook GABAergic zijn (Chevalier en Deniau, 1990). Daarom zal activering van D1R-MSN's de DA-neuronen van de middenvelder prikkelen, wat vervolgens bijdraagt ​​tot de regulatie van beloningsgerelateerd gedrag (Lüscher en Malenka, 2011; Bocklisch et al., 2013).

Recente studies met genetisch gemanipuleerde muizen die Cre-recombinase tot expressie brengen op een specifieke manier van het celtype hebben verschillende rollen onthuld voor D1R-MSN's en D2R-MSN's in cocaïneverslaving. Dergelijke muizen maken genetische targeting mogelijk van specifieke toxines, optogenetische probes of DREADD (designerreceptoren die uitsluitend worden geactiveerd door een designergeneesmiddel) om selectief D1R-MSN of D2R-MSN te manipuleren. Deze benadering heeft geleid tot enige consensus over de rol van MSN's in verslavend gedrag: D1R-MSN's lijken blijkbaar verslavend gedrag te bevorderen, terwijl er geen specifieke rol (of een remmende rol) in de ontwikkeling van door drugs geïnduceerd verslavend gedrag is gesuggereerd voor D2R-MSN's (Hikida et al., 2010; Lobo et al., 2010; Ferguson et al., 2011; Bock et al., 2013). Blootstelling van cocaïne induceert blijkbaar synaptische modificatie en veranderingen in genexpressie in beide MSN-populaties (Lobo et al., 2010; Lobo en Nestler, 2011; Grueter et al., 2013). Hoewel het erop lijkt dat D1R-MSN's en D2R-MSN's tegengestelde rollen spelen in door cocaïne gemedieerd verslavend gedrag, is de precieze rol van D2R-MSN's niet duidelijk.

Eerder is aangetoond dat D2R knock-out (KO) -muizen normale cocaïne-gemedieerde gedragssensibilisatie en cocaïne-zoekgedrag vertonen, met slechts een geringe afname in gevoeligheid veroorzaakt door de afwezigheid van D2R (Baik et al., 1995; Chausmer et al., 2002; Sim et al., 2013). Blootstelling aan stress tijdens het stoppen van het geneesmiddel onderdrukt echter de expressie van door cocaïne geïnduceerde gedragssensibilisatie evenals het cocaïne zoeken en terugvalgedrag van D2R KO-muizen (Sim et al., 2013). Specifieke knock-down van D2R in het NAc heeft geen invloed op basale locomotorische activiteit, noch door cocaïne geïnduceerde gedragssensibilisatie, maar verleent het vermogen van stress om expressie van door cocaïne geïnduceerde gedragssensibilisatie te remmen (Sim et al., 2013). Deze bevindingen suggereren sterk dat blokkade van D2R in het NAc cocaïne-gemedieerde gedragssensibilisatie niet voorkomt. Het lijkt er veeleer op dat D2R in het NAc een aparte rol spelen in de regulatie van de stress-geactiveerde synaptische modificaties tijdens ontwenning die leiden tot een toename van cocaïne-zoekend en terugvalgedrag (Sim et al., 2013).

Hier hebben we optogenetica gebruikt om de rol van NAc D2R-MSN's bij door cocaïne geïnduceerde gedragssensibilisatie verder te evalueren. Met behulp van hersenplakjes, vinden we dat fotostimulatie van D2R-MSN's lokale remmende circuits activeert binnen NAc met naburige MSN's. Fotostimulatie van NAc D2R-MSN's in vivo beïnvloedt noch de initiatie noch de expressie van door cocaïne geïnduceerde gedragssensibilisatie. Echter, herhaalde activering van NAc D2R-MSN's tijdens de periode van het stoppen van het medicijn verzwakt door cocaïne geïnduceerd verslavend gedrag. Onze resultaten tonen aan dat D2R-MSN's van NAc een sleutelrol spelen bij door ontwenning geïnduceerde plasticiteit en kunnen bijdragen aan terugval na stopzetting van drugsmisbruik.

materialen en methodes

Muizen

D2-Cre BAC-transgene muizen op een C57Bl / 6-achtergrond werden verkregen van MMRRC (regionale hulpbronnencentra van mutantmuizen, B6.FVB (Cg) -Tg (Drd2-cre) ER44Gsat / Mmucd). In gedragsexperimenten werden nestgenoten die het D2-Cre-transgen misten, gebruikt als controles voor de D2-Cre-muizen. Muizen werden gehandhaafd in een specifieke pathogeenvrije barrière-faciliteit onder constante omstandigheden van temperatuur en vochtigheid, en op een 12-h licht, 12-h donker schema. Dierverzorging en -behandeling werden uitgevoerd in overeenstemming met normen die zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committees van de Koreaanse universiteit en KIST.

Virus vector voorbereiding

pAAV-EF1a-DIO-hChR2 (H134R) -EYFP-WPRE werd royaal geleverd door Karl Deisseroth (Stanford Univ.). Voor de bereiding van AAV werden HEK293T-cellen gekweekt in DMEM-media met antibiotica en FBS. De dag voor transfectie werden vier platen voorbij 90% confluentie van 10-cm schalen uitgeplaat op vijf 15-cm schalen en geïncubeerd voor 18-22 h of tot 60 tot 70% confluentie. HEK293T-cellen werden getransfecteerd met pAAV-DIO-ChR2-EYFP, pAAV-DJ en pHelper met behulp van jetPEI-transfectiereagens (QBiogene). De DNA / DMEM / PEI-cocktail werd gevortext en geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 20 min. Na incubatie werd het transfectiemengsel aan elke 15 cm-schaal toegevoegd. Getransfecteerde cellen werden 48 h geoogst na transfectie en geïncubeerd met 0.5% natriumdeoxycholaat (Sigma; D6750) en 50 eenheden / ml benzonase nuclease (Sigma; E1014) bij 37 ° C voor 1 h. Na het verwijderen van cellulaire resten door middel van centrifugatie bij 3000 x g gedurende 15 min, werd het supernatant gefiltreerd door een 0.45 mm PVDF-filter (Millipore). Zuivering van AAV-DJ-deeltjes werd uitgevoerd met HiTrap-heparine-affiniteitskolommen (GE Healthcare). Voor concentratie van AAV werden Amicon ultra-15 centrifugale filtereenheden met een 100,000 molecuulgewicht-uitsluiting gebruikt. Geconcentreerd virus in hoeveelheden verdeeld en bevroren voor opslag bij -80 ° C. De uiteindelijke virale concentraties waren 3 ~ 6 × 1012 virusdeeltjes per ml voor elke AAV.

Stereotaxische injectie en plaatsing van optische vezels

Dieren werden verdoofd door ip-injecties van 1.6 µl Zoletil en 0.05 µl xylazine (Rompun, Bayer) per gram lichaamsgewicht en in een stereotactisch apparaat geplaatst (David Kopf Instruments, Tujunga, CA). Voor injectie van virussen werd een injectienaald van 31 gauge gebruikt om bilateraal 2 µl virus in NAc te infuseren onder een hoek van 0 ° (AP +1.7; ML ± 1.3; DV -4.5) met een snelheid van 0.1 ul / min. De naald werd na injectie 10 minuten op zijn plaats gelaten voordat hij langzaam werd teruggetrokken. De vezeloptische canule voor implantatie bestond uit een zirkoniumoxide ferrule (1.25 mm in diameter en 4.5 mm lang) en platte punt van een optische vezel (200 µm in diameter). De implantatie van de vezeloptische canule in NAc voor verlichting van D2-MSN's werd onmiddellijk na injectie van virussen uitgevoerd. De coördinaten voor implantatie van de glasvezelcanule waren een hoek van 0 ° (AP +1.7; ML ± 1.35; DV -4.2) voor het richten op NAc. Om de optische vezel te helpen verankeren, werden twee schroeven in de schedel verankerd aan de achterkant van de implantatieplaats van de vezeloptische canule. Om de glasvezelcanule op de schedel te bevestigen, werd C&B Superbond (Sun Medical) aangebracht op het oppervlak van de schedel rond de basis van de canule. Nadat de C&B Superbond was uitgehard, werd de canule uit de houder gehaald en werd tandheelkundig cement (Poly-F, Dentsply) rond de canule en schroeven aangebracht. Om de incisie rond de canulatieplaats te sluiten, werd Vetbond-weefsellijm (3 M, 7003449) gebruikt. Na implantatie kregen muizen subcutane injectie van antibiotica (Enrofloxacine, 5 mg / kg, elke 12 uur) en analgesie (Carprofen, 5 mg / kg, elke 24 uur) gedurende 3 opeenvolgende dagen.

In vivo fotostimulering

Een patchkoord van 200 μm werd verbonden met het uitwendige gedeelte van de chronisch implanteerbare optische vezel met gebruikmaking van een huls. Optische vezels werden bevestigd via een FC / PC-adapter aan een blauwe laserdiode (473 nm, MBL-III 473-150 mW), en lichtpulsen werden gegenereerd door een stimulator (BNC 575). Voor fotostimulatie van ChR2 tot expressie brengende neuronen was het stimulatieparadigma 20 Hz-frequentie, 5 ms-pulsduur en 2-5 mW van lichtvermogen. Het door de patchkabel uitgestraalde lichtvermogen werd gemeten met behulp van een vermogensmeter (PM100D) met een S121C-lichtsensor.

Gedragsanalyse

Gedragsexperimenten werden uitgevoerd met mannelijke D2-Cre muizen op 11-13 weken oud, met uitzondering van muizen onderworpen aan elektrofysiologische analyse die 5-6 weken oud waren. Aan leeftijd gekoppelde D2-Cre en Cre-muizen met negatieve controle werden geïnjecteerd met virus en individueel gehuisvest en toegestaan ​​om te acclimatiseren aan de kooi tot de gedragstest. Voor elke manipulatie werden muizen vóór de start van het experiment overgebracht naar de experimentele ruimte 60 minus om gewenning mogelijk te maken en om stress te verminderen (helderheid van de experimentele kamer was 70 lux). Elk experimenteel apparaat werd tussen experimenten gereinigd met 70% ethanol om mogelijke geuraanwijzingen te verwijderen.

Cocaïne sensibilisatie

Voor de initiatie van cocaïnesensibilisatie werden muizen opeenvolgende dagen gewend aan zoutoplossinginjecties (ip) voor 3 en vervolgens geïnjecteerd met zoutoplossing of cocaïne (15 mg kg-1, ip) voor opeenvolgende dagen van 5. Muizen werden intraperitoneaal (ip) geïnjecteerd met ofwel cocaïnehydrochloride (Johnson Mattney, Edinburgh, VK) opgelost in zoutoplossing (0.9% NaCl) of zoutoplossing met een 30 G-naald. Direct na elke injectie werden muizen getest op horizontale locomotorische activiteit in een open veldkamer voor 30 min. Voor het meten van het effect van fotostimulatie op de start en expressie van sensibilisatie (Figuur (fig​​​5) 5), kregen muizen twee-voudige lichtbelichting bilateraal via dubbele glasvezel patchkabels op de NAc gedurende vier 3-min perioden tijdens 30 min-sessies in thuiskooien. Patchkoorden van de vezeloptische canule op de schedelkop van de muis werden verwijderd en muizen kregen minstens 10 min. Rust. Muizen werden vervolgens geïnjecteerd met ofwel cocaïne of zoutoplossing (coc 1d-coc 5d). Na het starten van sensibilisatie werd cocaïne gedurende 14 dagen teruggetrokken zonder enige injectie van zoutoplossing. Tijdens deze wachttijd werd geen fotostimulatie toegepast. De uitdrukking van gedragssensibilisatie voor cocaïne werd vervolgens bepaald door injectie van een uitdagingsdosis van het medicijn (10 mg kg-1, ip) na fotostimulatie van het NAc zoals geïllustreerd in figuur Figure5A.5A. Om het effect van fotostimulatie tijdens de cocaïne-onthoudingsperiode te meten (fig (Figure6), 6), werden muizen onderworpen aan hetzelfde protocol voor sensibilisatie zoals hierboven beschreven (voor Fig Figure5) 5) behalve dat fotostimulatie werd gegeven. Na de start van de sensibilisatie van cocaïne, werd de fotostimulatie dagelijks toegepast op het NAc voor 1 h tijdens de totale wachttijd van 14-dagen. Na 14-dagen van ontwenning, werden alle groepen muizen geïnjecteerd met de uitdagingsdosering van cocaïne, (10 mg kg-1).

Figuur 1 

Selectieve fotostimulatie van middelgrote stekelige neuronen in nucleus accumbens. (EEN) Selectieve expressie van ChR2 in NAc D2R neuronen door levering van virale AAV-DIO-ChR2-EYFP-vectoren. schaalbalken: achtergrondafbeelding, 1 mm: invoegen, 200 μm. (B) Confocale afbeeldingen ...
Figuur 2 

Fotostimulatie van D2RCre-MSN's stuurt lokale remmende circuits. (EEN) Confocale afbeelding van een levende NAc-plak met een met kleurstof gevuld neuron dat geen ChR2 tot expressie brengt en een naburige cel (pijlpunt) die ChR2 tot expressie bracht en die kon worden gestimuleerd door foto's. (B) IPSC ...
Figuur 3 

Eigenschappen van NAc-cellen. (EEN) Twee-foton fluorescentiebeeld van neuronen gevuld met Alexa 594. (A1) toont een neuron uit de ChR2 + / AP-groep, terwijl (A3) toont een neuron uit de ChR2- / IPSC-groep. (A2) en (A4) zijn afbeeldingen met een hoge vergroting van de ...
Figuur 4 

Effecten van in vivo optogenetische activering van D2-MSN's in NAc op basale locomotorische activiteit. (A) Sagittale weergave van D2 Cre-muizen geïnjecteerd bij het NAc met AAV-DIO-ChR2-EYFP gevolgd door bilaterale implantatie van vezeloptische canules. 473 nm stimulatie van blauw licht ...
Figuur 5 

Effecten van activering van D2-MSN tijdens sensibilisatie voor cocaïne. (EEN) Experimenteel schema voor foto-stimulatie van D2-MSN's tijdens initiatie en expressie van sensibilisatie voor cocaïne. Blue-light-verlichting (2 ~ 5 mW, 5-ms, 20 Hz) werd voor vier ...
Figuur 6 

Effecten van activering van D2-MSN tijdens ontwenning op herhaalde blootstelling aan cocaïne. (EEN) Experimenteel schema voor foto-stimulatie van D2-MSN's tijdens ontwenning aan cocaïne. Blue-light verlichting (2 ~ 5 mW, 5 ms, 20 Hz) werd geleverd voor acht 3-min periodes ...

Immunofluorescentie en confocale lasermicroscopie

Voor immunofluorescentie werden muizen verdoofd met Zoletil (Virbac, 1.6 μl / g, intraperitoneaal) en 0.05 μl / g Rompun (Bayer) en geperfuseerd met filter-gesteriliseerde 0.1 M PBS gevolgd door fixatie met behulp van 4% paraformaldehyde / PBS-oplossing (Sigma). De hersenen werden vervolgens verwijderd en post-gefixeerd voor 4 h met ijskoud fixeermiddel zoals hierboven. De hersenen werden vervolgens gedehydrateerd in 30% sucrose / 0.1 M PBS gedurende 2 dagen. Hersenen werden vervolgens bevroren en 40-pm-dikke opeenvolgende coronale coupes werden op een cryostaat bereid (Leica CM 1900, Duitsland). Secties (40 μm) werden geblokkeerd voor 1 h in 0.1 M PBS met 5% normaal geitenserum en 0.2% Triton X-100 en geïncubeerd met konijn polyklonaal anti-D2R (1: 500, Millipore, AB5084P) bij 4 ° C gedurende de nacht. Na wassen met PBS met 0.2% Triton X-100, werden monsters geïncubeerd bij RT voor 1 h met Alexa Fluor 568 geiten-anti-konijnen-IgG (1: 500; Molecular Probes, Eugene, OR, VS) en 0.2 μl / ml 4, 6-diamidino-2-fenyl-indol HCl (DAPI; Sigma, St. Louis, MO, VS) in PBS met 1% normaal geitenserum en 0.2% Triton X-100. Als een negatieve controle werden monsters alleen met DAPI en het secundaire antilichaam geïncubeerd. Secties werden onderzocht op een C1 Plan-waterloalscocaal laserscansysteem (LSM 40, Zeiss, Berlijn, Duitsland).

Elektrofysiologie en fotostimulatie in plakjes nucleus accumbens

Muizen werden gebruikt voor experimenten 4 weken na virusinjectie om optimale expressie van ChR2-EYFP te bereiken. Muizen werden vervolgens geanesthetiseerd en onthoofd voor de bereiding van acute hersenkoekjes. De hersenen werden snel verwijderd en onmiddellijk in een ijskoude snijoplossing geplaatst die (in mM) 250 Sucrose, 26 NaHCO bevatte3, 10 D-Glucose, 3 Myo-inositol, 2.5 KCl, 2 Na-pyruvate, 1.25 NaH2PO4, 0.5 Ascorbinezuur, 1 Kynurenic zuur en 7 MgCl2 die borrelde met 95% O2/ 5% CO2 (pH = 7.4). Coronale hersenschijfjes (250 μm dik) die het NAc bevatten, werden bereid met behulp van een vibratome (Leica VT 1200 S) en werden vervolgens geïncubeerd in kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) met gom (in mM): 11 D-glucose, 125 NaCl, 25 NaHCO3, 1.25 NaH2PO4, 2.5 KCl, 1.25 MgCl2 en 2.5 CaCl2 bij 34 ° C voor 1 h voor opname. Plakjes werden vervolgens overgebracht naar een onderdompelingsopnamekamer waarin O2verzadigde ACSF-oplossing werd continu gesusfundeerd. Cellen in NAc en VTA werden gevisualiseerd met behulp van een 2-fotonmicroscoop (Olympus FV1000 MPE, Tokyo, Japan) uitgerust met een 25X wateronderdompelingslens en infrarood DIC-optica. Klemopnamen in hele cellen werden verkregen uit NAc-cellen met een Multiclamp 700B-versterker en Digidata 1440A-digitizer (Molecular Devices, LLC). Gegevens werden gesampled met behulp van pCLAMP 10.2-software en verder geanalyseerd met Clampfit 10.2-software (Molecular Devices, LLC). Patch-elektroden met weerstanden tussen 3-5 MΩ werden gevuld met een interne oplossing die (in mM) bevat: 130 K-gluconaat, 2 NaCl, 2 MgCl2, 20 HEPES, 4 Na2ATP, 0.4 Na3GTP, 0.5 EGTA en 10 Na2- fosfocreatine, met pH ingesteld op 7.3 met 1 N KOH. Bicuculline (10 µM) werd in een bad aangebracht op hersenplak om GABA-receptoren te blokkeren in een subset van experimenten.

NAc-cellen die ChR2-EYFP tot expressie brachten werden door foto's gestimuleerd door een LED-lichtbron (460 ± 27 nm, UHP-Mic-LED-460, Prizmatix). Blauw licht van de LED werd verder gefilterd en verzwakt door een filterkubus uitgerust met een excitatiefilter (470-495 nm); lichtflitsen (duur 10 ms, 0.0366-0.354 mW / mm2) werden via de 25X-objectieflens met de frequenties 5-40 Hz aan de hersenplak geleverd. In een deelreeks van experimenten werden fotostromen gemeten in cellen die ChR2 tot expressie brachten in reactie op 2's duurlichtflitsen.

Statistische analyse

Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelden ± sem en werden geanalyseerd met de tweezijdige studenten t-test, of met tweewegsanalyse van variantie gevolgd door Bonferroni's post hoc test. EEN P-waarde van <0.05 werd als statistisch significant beschouwd.

Resultaten

Selectieve fotostimulatie van middelgrote stekelige neuronen in nucleus accumbens

Om de rol van NAc D2R-MSN's in door cocaïne gemedieerd verslavend gedrag te bepalen, hebben we een optogenetische benadering gebruikt om NAc D2R-neuronen te stimuleren. Om selectief de activiteit van D2R-MSN's in NAc door licht te regelen, werden virale vectoren die coderen voor AAV-DIO-ChR2-EYFP stereotaxisch geïnjecteerd in de NAc van D2R-Cre BAC-transgene muizen. 4 weken na virale injectie, werd robuuste expressie van ChR2-EYFP waargenomen in het NAc (figuur (Figure1A) .1A). De specificiteit van ChR2-expressie in D2R-MSN's werd bevestigd met behulp van immunofluorescentie confocale analyse: expressie van YFP-gelabeld ChR2 werd co-gelokaliseerd met D2R in NAc (figuur (Figure1B), 1B), wat aantoont dat ChR2 tot expressie werd gebracht in neuronen die D2R tot expressie brengen in NAc.

Hoewel een dergelijke benadering in andere studies is gebruikt (bijv. Lobo et al., 2010), zullen de details van de procedures voor virusinjectie van laboratorium tot laboratorium verschillen, waardoor het belangrijk is optogenetische controle te documenteren onder onze specifieke experimentele omstandigheden. We hebben de functionele expressie van ChR2 beoordeeld door patch-klemopnamen van MSN's in plakken van NAc te maken. MSN's werden geïdentificeerd door: (1) een relatief gehyperpolariseerde rustmembraanpotentiaal (RMP), doorgaans negatiever dan -80 mV; (2) een regelmatig patroon van AP-afvuren in reactie op aangelegde stroompulsen; (3) lange wachttijd voor het afvuren van het eerste AP tijdens een huidige puls; (4) afwezigheid van een "doorbuigingsspanning" tijdens hyperpolarisatie veroorzaakt door een hyperpolarisatie-geactiveerde kationstroom (Ih); en (5) relatief kleine afmetingen van hun cellichamen (Chang en Kitai, 1985; O'Donnell en Grace, 1993; Le Moine en Bloch, 1996; Taverna et al., 2008). Blauw licht (470 nm) werd over het gehele gezichtsveld (0.78 mm2) terwijl de MSN's spanningsdicht worden gehouden met een houdpotentiaal van -69 mV. Sommige MSN's brachten ChR2 tot expressie, duidelijk als YFP-fluorescentie in hun somata (pijlen in figuren 1C1, C3). Dergelijke neuronen vertoonden aanzienlijke fotostromen, met helderdere lichtstimuli die grotere fotostromen opwekten (fig (Figure1D) .1D). De relatie tussen piekamplitude-amplitude en lichtintensiteit (fig (Figure1E) 1E) had een half-maximale lichtgevoeligheid van 0.054 ± 0.0023 mW / mm2 en een maximale piekamplitude van 1.16 ± 0.16 nA (gemiddelde ± sem, n = 4).

Onder stroomklemomstandigheden vertoonden MSN's die CHR2 ontvlamden AP's op betrouwbare wijze in reactie op treinen van lichtpulsen (10 ms-duur; Figure1F) .1F). Onder deze omstandigheden zijn de lichtintensiteiten groter dan 0.1 mW / mm2 waren voldoende om AP's op te roepen (Figuur (Figure1G, 1G, n = 5). AP's werden betrouwbaar opgeroepen bij fotostimulatie-frequenties tot 20 Hz, terwijl bij 40 Hz de door licht geïnduceerde responsen opgeteld om een ​​aanhoudende depolarisatie te veroorzaken die minder effectief was bij het oproepen van AP's (figuren 1F, G).

Fotostimulatie van D2R-MSN's stuurt lokale remmende circuits

Om de gevolgen van de activiteit van D2R-MSN's op lokale circuits in NAc te onderzoeken, hebben we presynaptische MSN die ChR2 tot expressie brachten gestimuleerd tijdens het meten van postsynaptische responsen in ChR2-negatieve MSN's (figuur (Figure2A) .2A). Het neuron in figuur Figure2A2A geeft geen expressie van ChR2, zoals aangegeven door de afwezigheid van EYFP-fluorescentie evenals de afwezigheid van korte-latency-fotostromen zoals die weergegeven in figuur Figure1D.1D. Wanneer de postsynaptische MSN's echter als een potentiaal van -69 mV werden gehouden, knippert het 10 ms-duurlampje opgewekte buitenwaartse stromen na een wachttijd van 9.0 ± 0.42 ms (figuur (Figure2B, 2B, n = 15). Om de aard van deze reacties te bepalen, werd de postsynaptische membraanpotentiaal gevarieerd tussen -99 mV tot -39 mV, terwijl een lichtflits werd toegepast (figuur (Figure2C) .2C). Door licht geïnduceerde responsen varieerden met membraanpotentiaal (fig (Figure2D, 2D, n = 6) en hun polariteit omgedraaid bij -81 ± 3.4 mV. Gegeven het feit dat het evenwichtspotentieel voor chloride-ionen -80 mV is onder onze ionische omstandigheden, zouden de door licht geïnduceerde uitwaartse stromen kunnen worden veroorzaakt door chlorideflux veroorzaakt door postsynaptische GABAA receptoren. Om deze mogelijkheid te testen, de GABAA receptorantagonist bicuculline (10 μM) werd toegevoegd aan de externe oplossing. Dit medicijn blokkeerde volledig door licht geïnduceerde responsen (Figuur (Figure2B), 2B), wat bevestigt dat de door licht geïnduceerde responsen GABAergic-remmende postsynaptische stromen (IPSC's) waren.

Op basis van hun reacties op fotostimulatie konden de MSN's die we hebben opgenomen worden geclassificeerd in een van 4-groepen: (1) cellen die een voldoende hoeveelheid ChR2 tot expressie brengen om AP's af te vuren in reactie op fotostimulatie (ChR2 + / AP), die hierboven werden beschreven; (2) cellen die een kleine hoeveelheid ChR2 tot expressie brengen, wat een sub-drempel depolarisatie vertoonde in reactie op licht (ChR2 + / No AP); (3) stille cellen die geen expressie van ChR2 vertoonden maar IPSC's met lichtinductie ontvingen van presynaptische MSN's die ChR2 tot expressie brengen (ChR2- / IPSC); en (4) ChR2-negatieve cellen die geen IPSC's vertoonden in reactie op fotostimulatie van andere MSN's (ChR2- / No IPSC). Het relatieve aandeel cellen in elk van deze categorieën wordt weergegeven in de figuur Figure2E2E (n = 53). In totaal bracht bijna de helft van de cellen (45.3%) ChR2 tot expressie (som van groepen (1) en (2)). Geen van de MSN's die we hebben opgenomen vertoonde zowel fotostromen als IPSC's in reactie op fotostimulatie; dit geeft aan dat D2R-positieve MSN's geen andere leden van dezelfde celpopulatie binnen het NAc innerveren.

Deze classificatie van reacties op licht geeft aan dat fotostimulatie van ChR2 + / No AP-cellen (groep 2) en ChR2- / No IPSC-cellen (groep 4) geen elektrische signalen genereren die kunnen bijdragen aan circuitactiviteit. Om dus de effecten van fotostimulatie op de circuitfunctie te definiëren, hebben we in detail de eigenschappen van ChR2 + / AP MSN's (groep 1) gekarakteriseerd, die AP's zullen genereren wanneer het NAc is gestimuleerd en ChR2- / IPSC-cellen (groep 3), die zijn postsynaptisch voor de ChR2 + / AP MSN's omdat ze door licht geïnduceerde IPSC's ontvangen. ChR2 + / AP- en ChR2- / IPSC-cellen in NAc werden beide geïdentificeerd als stekelige neuronen (figuur (Figure3A) .3A). Er waren geen significante verschillen in de morfologische of elektrofysiologische eigenschappen van neuronen in deze twee groepen. De somata van de neuronen in die twee groepen waren bijvoorbeeld vergelijkbaar in grootte (Figuur (Figure3B) .3B). Bovendien zijn hun RMP's (-83.0 ± 1.7 versus -85.0 ± 1.8 mV; gemiddelde ± sem; n = 10, afbeelding Figure3C) 3C) en ingangsweerstanden (113 ± 15 versus 133 ± 13 MΩ, n = 6, afbeelding Figure3D) 3D) waren ook niet verschillend (p > 0.05 tweezijdige studenten t-test) terwijl hun AP-afvuurpatronen reageren op stroompulsen (Figuren 3E, F) waren ook vergelijkbaar (p > 0.05 tweezijdige studenten t-test, n = 6). Samenvattend activeert fotostimulatie van D2R-MSN's in NAc lokale remmende circuits met postsynaptische neuronen die erg lijken op de D2R-MSN's maar geen D2R tot expressie brengen.

Optogenetische stimulatie van NAc D2R-MSN's bij door cocaïne geïnduceerde gedragssensibilisatie

We onderzochten vervolgens de gedragsmatige gevolgen van in vivo fotostimulatie van NAc D2R-MSN's. Omdat fotostimulatie van D2R-MSN's in dorsale striatum locomotorische activiteit vermindert (Kravitz et al., 2010), begonnen we met het karakteriseren van de effecten van accumbens D2R-MSN-activering op basale locomotorische activiteit. Voor dit doel werden D2R-Cre-muizen bilateraal geïnjecteerd met DIO-AAV-ChR2-EYFP-virus in de NAc (D2-Cre (+) NAc-ChR2). D2R-MSN's werden vervolgens gefoto-stimuleerd met blauw licht (473 nm, 5 ms pulsduur, 20 Hz) afgeleverd aan het NAc via een optische vezel. Photostimuli werden toegepast gedurende vier 3-min tijdsperioden binnen de 50 min-sessie wanneer muizen werden gehouden in de bewegingsregistratiekamer (Figuur (Figure4A) .4A). Parallel daaraan werden als een controle niet-Cre WT-nestgenootmuizen op soortgelijke wijze geïnjecteerd met virus en ontvingen een vergelijkbare blauwlichtbelichting. D2-Cre (+) NAc-ChR2-muizen vertoonden een vergelijkbaar of enigszins verhoogd niveau van basale locomotorische activiteit in vergelijking met de controle-D2R-Cre (-) NAc-ChR2-muizen (figuren 4B, C). Fotostimulatie van D2R-MSN's in D2-Cre (+) NAc-ChR2-muizen veroorzaakte een significante afname van de locomotorische activiteit die herstelde nadat de lichtstimulus was gestopt (Figuur (Figure4B) .4B). Dergelijke effecten werden niet waargenomen in de controle D2R-Cre (-) NAc-ChR2 muizen (figuren 4B, C), wat aangeeft dat de effecten van fotostimulatie werden veroorzaakt door activering van ChR2, in plaats van mogelijke niet-specifieke effecten zoals verwarming van hersenweefsel. Daarom gaven onze gegevens aan dat fotostimulatie van D2R-MSN's in NAc een afname in locomotorische activiteit veroorzaakte.

Deze resultaten stelden ons in staat om de activiteit van D2R-MSN's binnen NAc te controleren in vivo. Vervolgens hebben we dit vermogen gebruikt om de invloed van D2R-MSN-activiteit op gedragssensibilisatie op herhaalde toediening van cocaïne te onderzoeken. Gedragssensibilisatie verwijst naar het proces dat een initiële blootstelling aan psychostimulantia, zoals cocaïne, toelaat om het vermogen van opeenvolgende blootstelling aan geneesmiddelen om locomotorische activiteit te stimuleren, te verbeteren. Dit proces kan worden gescheiden in initiatie- en expressiefasen: initiatie beschrijft de directe neurale gebeurtenissen die gedragssensibilisatie veroorzaken (Vanderschuren en Kalivas, 2000; Sim et al., 2013), terwijl expressie bekend staat als een langdurige vorm van gedragsplasticiteit die aanhoudt na het staken van de drug (Vanderschuren en Kalivas, 2000; Sim et al., 2013). We onderzochten daarom cocaïne-geïnduceerde gedragssensibilisatie tijdens herhaalde intraperitoneale (ip) injecties van cocaïne, terwijl we optogenetica gebruikten om de activiteit van D2R-MSN's in NAc te controleren tijdens elk van deze fasen.

Na gewenning aan injectie met zoutoplossing gedurende 3-dagen, werden muizen geïnjecteerd met cocaïne (15 mg / kg) op opeenvolgende dagen 5 en werden motorische responsen geregistreerd voor 30 min na elke injectie (figuur (Figure5A) .5A). Photostimuli werden afgeleverd tijdens 30 min. Sessies vóór cocaïne-injectie, 3 min-perioden van verlichting werden afgewisseld met 5 min-perioden waarin het licht was uitgeschakeld (figuur (Figure5A) .5A). Aangezien fotostimulatie van D2R-MSN's in NAc de basale locomotorische activiteit verlaagt (Figuur (Figure4), 4) werden fotostimuli onmiddellijk voorafgaand aan toediening van cocaïne toegediend om mogelijke interferentie met gedragsreacties op cocaïne-injectie te voorkomen.

Beide controle-D2-Cre (-) NAc-ChR2-muizen en D2-Cre (+) NAc-ChR2-muizen vertoonden een duidelijke toename in locomotorische activiteit als reactie op de herhaalde cocaïnespuiten (Figuur (Figure5B), 5B), aangevend initiatie van sensitisatie. Fotostimulatie van D2R-MSN's in NAc leek de start van gedragssensibilisatie niet te beïnvloeden, omdat door cocaïne geïnduceerde gedragssensibilisatie vergelijkbaar was in D2-Cre (+) NAc-ChR2-muizen en controle-D2-Cre (-) NAc-ChR2-muizen.

Na inductie van gedragssensibilisatie door het herhalen van dergelijke injecties van cocaïne (15 mg / kg) gedurende 5-dagen, werd het medicijn gedurende 14 dagen teruggetrokken en werd de graad van expressie van sensibilisatie onderzocht door de muizen uit te dagen met een lagere dosis cocaïne (10 mg /kg). Expressie van sensibilisatie is een langdurige vorm van gedragsplasticiteit die aanhoudt na het stoppen van het gebruik van drugs (Steketee en Kalivas, 2011; Sim et al., 2013). Om de rol van D2R-MSN's in expressie van sensibilisatie te onderzoeken, werd NAc onmiddellijk voorafgaand aan de toediening van cocaïne gestimuleerd (Figuur (Figure5A) 5A) en sensibilisatie werd gemeten als de hoeveelheid locomotorische activiteit geïnduceerd door de cocaïne-injectie.

In beide met cocaïne voorbehandelde groepen muizen-D2-Cre (-) NAc-ChR2-muizen (D2-Cre (-) :: coc-coc) en D2-Cre (+) NAc-ChR2 (D2-Cre (+): : coc-coc) -robiele expressie van sensibilisatie optrad (fig (Figure5C) .5C). Het tijdsverloop van door cocaïne gestimuleerde voortbewegingsveranderingen was ook vergelijkbaar tussen de twee groepen (Figuur (Figure5C), 5C), zonder significant verschil tussen twee groepen. Samengenomen laten deze twee fotostimulatie-experimenten zien dat activering van D2R-MSN's in het NAc geen invloed heeft op initiatie of expressie van door cocaïne geïnduceerde gedragssensibilisatie.

Fotostimulatie van NAc D2R-MSN's tijdens ontwenning van het geneesmiddel

Chronische stress tijdens het stoppen van de drug na herhaalde blootstelling aan cocaïne resulteert in selectieve rekrutering van een D2R-afhankelijk aanpassingsmechanisme dat de door stress veroorzaakte toename van cocaïne-zoekend en terugvalgedrag in samenhang met veranderingen in synaptische plasticiteit in het NAc (Sim et al., 2013). Dit geeft aan dat de mechanismen die betrokken zijn bij het stoppen van het gebruik van drugs verschillen van die welke betrokken zijn bij op drugs gebaseerde sensibilisatie. We onderzochten vervolgens of fotostimulatie van D2R-MSN's in NAc tijdens het stoppen van cocaïne de expressie van door cocaïne geïnduceerde gedragssensibilisatie beïnvloedt.

Na inductie van gedragssensibilisatie door herhaalde injectie van cocaïne zoals hierboven, werden de D2-Cre (-) - en D2-Cre (+) -muizen in twee groepen onderverdeeld voor de terugtrekkingsperiode van de 14-dag: één groep werd dagelijks onderworpen aan blauwlichtstimulatie van NAc voor 1 h (3 min × 8 keer), terwijl de andere groep dat niet was (figuur (Figure6A) .6A). Herhaalde fotostimulatie van D2R-MSN's in NAc tijdens het stoppen met cocaïne had geen effect op de expressie van sensitisatie in D2-Cre (-) :: coc-coc-muizen (Figuur (Figure6B) .6B). Daarentegen werd in D2-Cre (+) :: coc-coc-muizen de expressie van sensitisatie significant verzwakt door herhaalde fotostimulatie tijdens het stoppen van het geneesmiddel (figuur (Figure6B), 6B), hoewel het tijdsverloop van de door cocaïne geïnduceerde stimulatie van de locomotie niet werd beïnvloed (fig (Figure6C) .6C). Zo heeft fotostimulatie van D2R-MSN's van NAc tijdens het stoppen van het geneesmiddel de expressie van cocaïne-geïnduceerde gedragssensibilisatie verminderd (cocaïne × foto-stimulatie interactie F(1,18) = 11.08, P = 0.0037, afbeelding Figure6B) .6B). Deze gegevens geven aan dat activering van D2R-NAc MSN's tijdens de periode van ontwenning van drugs het gedrag van cocaïne en terugval beïnvloedt.

Discussie

Aanzienlijk bewijs geeft aan dat door cocaïne geïnduceerde gedragssensibilisatie gepaard gaat met een verhoogde dopaminerge transmissie in het mesocorticolimbische systeem dat het ventrale tegmentale gebied, de prefrontale cortex en nucleus accumbens (NAc) omvat. In het bijzonder wordt de expressiefase van gedragssensibilisatie gekenmerkt door een persisterende hyperreactiviteit van het geneesmiddel na stopzetting van het medicijn, wat geassocieerd is met een cascade van aanpassingsmechanismen (Kalivas en Duffy, 1990; Robinson en Berridge, 1993; Kalivas et al., 1998) die zouden kunnen bijdragen aan de behoefte aan compulsieve drugs (Robinson en Berridge, 1993; Kalivas et al., 1998; Steketee en Kalivas, 2011). Er is gesuggereerd dat cocaïne-geïnduceerde veranderingen in moleculaire, cellulaire en gedragsmatige plasticiteit in het NAc, in associatie met DA-receptorsignalering bij MSN's, geneesmiddelgemedieerd verslavend gedrag kunnen reguleren (Lobo et al., 2010; Schmidt en Pierce, 2010; Ferguson et al., 2011; Pascoli et al., 2011; Bocklisch et al., 2013; Grueter et al., 2013).

Recente studies met genetisch gemanipuleerde muizen die Cre recombinase conditioneel tot expressie brengen, hebben rollen onthuld voor D1R-MSN's of D2R-MSN's in cocaïneverslavend gedrag. Optogenetische activering van D1R-MSN's van NAc na 6-dagen van herhaalde toediening van cocaïne verhoogt de locomotorische activiteit, terwijl activering van D2R-MSN's naar verluidt geen effect heeft (Lobo et al., 2010). Deze gegevens suggereren dat herhaalde blootstelling aan cocaïne de output van D1R-MSN's van het NAc verbetert. Remming van D1R tot expressie brengende MSN's met tetanustoxine (Hikida et al., 2010) vermindert de voorkeurspositie voor cocaïne-geconditioneerd (CPP), terwijl er geen wijzigingen in cocaïne CPP werden waargenomen na het afschaffen van synaptische transmissie in D2R-MSN's (Hikida et al., 2010). Optogenetische activering van D1R-MSN's in dorsale striatum induceert aanhoudende versterking, terwijl stimulering van neuronen die D2-receptor tot expressie brengen aanleiding geeft tot tijdelijke bestraffing (Kravitz et al., 2012). Een recente studie heeft ook gemeld dat remming van D2R-MSN's via een chemicogenetische benadering de motivatie voor het verkrijgen van cocaïne verhoogt, terwijl optogenetische activering van D2R-MSN's cocaïne zelftoediening onderdrukt (Bock et al., 2013). Aan de andere kant, Bocklisch et al. (2013) rapporteerden dat D1R-MSN's van het NAc-project naar de VTA, specifiek naar GABAergic-neuronen binnen de VTA, terwijl D2R-MSN's niet rechtstreeks naar de VTA projecteren. Dit circuit betekent dat optogenetische activering van D1R-MSN's DA-neuronen ontkracht, wat uiteindelijk cocaïnegeïnduceerd verslavend gedrag verbetert (Bocklisch et al., 2013).

Ondanks de ogenschijnlijk eenvoudige organisatie van deze twee MSN-populaties, is het feit dat MSN's meerdere ingangen ontvangen en verschillende outputs van / naar andere hersengebieden hebben, evenals het vormen van lokale circuits tussen MSN's en andere klassen van interneuronen, de resulterende output van D1R- MSN's en D2R-MSN's kunnen complexe en verschillende moleculaire, cellulaire en gedragsconsequenties opleveren.

Eerder is aangetoond dat D2R bijdraagt ​​aan synaptische modificaties die worden geïnduceerd tijdens ontwenning van het geneesmiddel en deze de terugval naar cocaïne-zoeken potentiëren, zonder de aanvankelijke geneesmiddelverwerving of het zoeken naar drugs te beïnvloeden (Sim et al., 2013). Onze huidige gegevens geven aan dat fotostimulatie van D2R-MSN's in NAc een afname in basale locomotorische activiteit veroorzaakt. Lobo et al. (2010) gedetecteerd geen verandering in voortbeweging wanneer een van beide MSN-subtypen was geactiveerd, maar ze onderzochten alleen de totale locomotorische activiteit in plaats van het onderzoeken van onmiddellijke responsen van basale locomotorische activiteit op fotostimulatie. Kravitz et al. (2010) bleek ook dat optogenetische activering van D2R-MSN's in dorsale striatum ook de locomotorische activiteit verlaagt. Onze gegevens zijn dus de eerste om aan te tonen dat basale locomotorische activiteit wordt geremd door fotostimulatie van D2R-MSN's van NAc en de eerste om systematisch het tijdsverloop van basale locomotorische activiteit tijdens fotostimulatie van deze neuronen te onderzoeken.

In de onderhavige studie hebben we waargenomen dat optogenetische activering van D2R-MSN's in NAc geen invloed had op de initiatie of expressie van gedragssensibilisatie. De fotostimulatie van D2R-MSN's tijdens de periode van het stoppen van het gebruik van drugs stompte echter de expressie van door cocaïne geïnduceerde sensibilisatie. Daarom geven onze gegevens aan dat D2R-MSN's specifiek signaal werven tijdens de wachttijd die doorgaat om genexpressie of andere vormen van signalering te veranderen en daardoor veranderingen in synaptische plasticiteit teweeg te brengen, wat leidt tot veranderingen in door cocaïne geïnduceerde gedragssensibilisatie. Hoe deze MSN's celtypespecifieke aanpassingen toepassen die hun verschillende consequenties in verslavingsgerelateerd gedrag kunnen produceren, is niet bekend. Grueter et al. (2013) suggereerde dat ΔFosB in NAc op verschillende manieren synaptische eigenschappen en beloningsgerelateerd gedrag moduleert op een celtype- en subregionspecifieke manier. Onlangs hebben Chandra et al. (2013) rapporteerde dat herhaalde ChR2-activering van D1R-MSN's maar niet van D2R-MSN's een neerwaartse regulatie veroorzaakte van het Tiam1-gen, een eiwit dat betrokken is bij de herschikking van het actine-cytoskelet, vergelijkbaar met de effecten van cocaïne. Daarom is het voor het begrijpen van de mechanismen die blijvende effecten van door drugs geïnduceerd gedrag opleveren, belangrijk om de celselectieve inductie van moleculaire gebeurtenissen in deze MSN's af te bakenen die de synaptische aanpassing aan herhaalde blootstelling aan geneesmiddelen regelen.

In samenhang met herhaalde blootstelling aan geneesmiddelen, is intrekking voorgesteld om een ​​belangrijke rol te spelen omdat sommige veranderingen pas enkele weken na de laatste blootstelling aan cocaïne verschijnen. Dit suggereert dat onthouding een belangrijke bemiddelaar is in de ontwikkeling van plasticiteit (Robinson en Berridge, 2003; Boudreau en Wolf, 2005; Boudreau et al., 2007; Kourrich et al., 2007). Deze waarnemingen verhogen de mogelijkheid dat intrekking zelf een trigger zou kunnen zijn voor de wijzigingen in het NAc die onder controle staan ​​van D2R-afhankelijke signalering. Ons resultaat laat zien dat activering van D2R-MSN's in NAc tijdens ontwenning van geneesmiddelen invloed heeft op door cocaïne geïnduceerde gedragssensibilisatie, biedt een overtuigende ondersteuning voor dit idee.

Eerder is aangetoond dat herhaalde blootstelling aan stress tijdens het stoppen van het geneesmiddel de expressie van door cocaïne geïnduceerde gedragssensibilisatie en het zoeken naar cocaïne en terugval in D2R KO-muizen onderdrukt (Sim et al., 2013). Het is daarom interessant dat fotostimulatie van D2R-MSN's tijdens ontwenning van medicatie ook de expressie van sensibilisatie verzwakt. Stress-geïnduceerde synaptische plasticiteit bij glutamategische synapsen is veranderd in het NAc van D2R KO-muizen (Sim et al., 2013). Hoewel het nog niet bekend is of fotostimulatie van D2R MSN's of chronische stress tijdens de ontwenningsperiode vergelijkbare veranderingen in synaptische plasticiteit teweegbrengt, ondersteunen onze huidige bevindingen de hypothese dat D2R-MSN's van NAc een sleutelrol spelen in door terugval geïnduceerde plasticiteit en kunnen bijdragen aan terugval na stopzetting van drugsmisbruik. Verder onderzoek zal nodig zijn om de functionele neurale circuits te achterhalen waarin D2R MSN's deelnemen tijdens het stoppen van het medicijngebruik en om de consequenties van de fotostimulatie en chronische stress van D2R-MSN op synaptische plasticiteit in dit specifieke circuit te analyseren en vergelijken.

Een andere mogelijke rol voor D2R-expresserende MSN's zou kunnen zijn om de uitvoer van D1R-MSN's van NAc te remmen. Eerder onderzoek toont aan dat, hoewel MSN's lange axonen projecteren naar verre doelen, er een uitgebreide overlap optreedt tussen axon collaterals en de dendritische bomen van aangrenzende spiny projection neuronen (Grofová, 1975; Preston et al., 1980; Wilson en Groves, 1980). Dit kan duiden op mogelijke lokale synaptische connectiviteit voor MSN binnen het NAc. Intracellulaire opnamen van paren spiny projectie-neuronen hebben functionele remmende verbindingen tussen MSN's in rattenstriatum (Czubayko en Plenz, 2002; Tunstall et al., 2002; Koos et al., 2004; Gustafson et al., 2006). Er is ook gemeld dat de synapsen gevormd door recurrente collaterale axons van MSN's in striatum niet willekeurig zijn, D2R-MSN's synaptische verbindingen maken zowel met andere D2R-MSN's als met D1R-MSN's, terwijl D1R-MSN's bijna uitsluitend synaptische verbindingen vormen met andere D1R-MSN's (Taverna et al., 2008). Hoewel de GABAergic interconnectie door lokale recurrente axonale collateralen tussen accumale MSN's ook is gemeld (Taverna et al., 2004), het is nog steeds niet duidelijk of D2R-MSN's willekeurig lokale microschakelingen vormen of ze dragen bij tot microschakelingen in NA met een preferentiële verbinding zoals in striatum. Onze gegevens suggereren dat D2R-MSN's in NAc die ChR2 tot expressie brengen synaptische verbindingen maken met naburige MSN's die D1R tot expressie brengen, en dat D2R-MSN's vervolgens een inhiberend contact met D1-MSN's uitoefenen om de door D1R gemedieerde promotie van verslavend gedrag te moduleren.

Concluderend hebben we aangetoond dat optogenetische activering van NAc D2R-MSN's de door terugkomst geïnduceerde plasticiteit veroorzaakt tijdens cocaïneverslaving verandert. Gegeven dat activiteit van D2R-afhankelijke signalering gedurende de wachttijd een belangrijke regulator van de expressie van door cocaïne geïnduceerde gedragssensibilisatie lijkt te zijn, stellen we voor dat D2R-MSN's een belangrijke mediator zijn van langdurige aanpassing voor het zoeken naar en hervallen van drugs. De identificatie van moleculaire substraten van D2R-afhankelijke signalering, samen met de identificatie van specifieke circuits van NAc D2R-MSN's die worden gebruikt onder herhaalde blootstelling van geneesmiddelen, zou nieuwe doelen moeten bieden voor therapeutische interventie bij terugval van geneesmiddelen.

Belangenconflict verklaring

De auteurs verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd in afwezigheid van commerciële of financiële relaties die kunnen worden beschouwd als een potentieel belangenconflict.

Dankwoord

Dit werk werd ondersteund door de subsidie ​​van de National Research Foundation of Korea (NRF), gefinancierd door het ministerie van Wetenschap, ICT en Toekomstplanning door het Brain Research Program (aan Ja-Hyun Baik; Grant nr. 2013M3C7A1056101) en door de bio- en medische technologie. Ontwikkelingsprogramma (aan Ja-Hyun Baik; Grant No. 2013M3A9D5072550) en het World Class Institute (WCI) -programma van de National Research Foundation of Korea (NRF), gefinancierd door het ministerie van Wetenschap, ICT en Toekomstplanning (aan George J. Augustine ; WCI 2009-003), evenals door een Korea University Grant (aan Ja-Hyun Baik) en een CRP-subsidie ​​van de National Research Foundation van Singapore (aan George J. Augustine).

Referenties

  1. Baik JH (2013). Dopamine signalering in gedrag gerelateerd aan beloning. Voorkant. Neurale circuits 7: 152 10.3389 / fncir.2013.00152 [PMC gratis artikel] [PubMed] [Kruis Ref]
  2. Baik JH, Picetti R., Saiardi A., Thiriet G., Dierich A., Depaulis A., et al. (1995). Parkinsonachtig motorisch defect bij muizen zonder dopamine D2-receptoren. Nature 377, 424-428 10.1038 / 377424a0 [PubMed] [Kruis Ref]
  3. Berridge KC (2007). Het debat over de rol van dopamine bij beloning: het pleidooi voor incentive-salience. Psychopharmacology (Berl) 191, 391-431 10.1007 / s00213-006-0578-x [PubMed] [Kruis Ref]
  4. Bock R., Shin JH, Kaplan AR, Dobi A., Markey E., Kramer PF, et al. (2013). Versterking van de accumbal indirecte route bevordert de veerkracht voor compulsief cocaïnegebruik. Nat. Neurosci. 16, 632-638 10.1038 / nn.3369 [PMC gratis artikel] [PubMed] [Kruis Ref]
  5. Bocklisch C., Pascoli V., Wong JC, House DR, Yvon C., de Roo M., et al. (2013). Cocaïne remt dopamine-neuronen door versterking van GABA-transmissie in het ventrale tegmentale gebied. Wetenschap 341, 1521-1525 10.1126 / science.1237059 [PubMed] [Kruis Ref]
  6. Boudreau AC, Reimers JM, Milovanovic M., Wolf ME (2007). AMPA-receptoren op het celoppervlak in de nucleus accumbens van ratten nemen toe gedurende het onttrekken van cocaïne, maar internaliseren na cocaïne-provocatie in combinatie met veranderde activatie van door mitogeen geactiveerde proteïnekinasen. J. Neurosci. 27, 10621-10635 10.1523 / jneurosci.2163-07.2007 [PMC gratis artikel] [PubMed] [Kruis Ref]
  7. Boudreau AC, Wolf ME (2005). Gedragssensibilisatie voor cocaïne is geassocieerd met verhoogde AMPA-receptoroppervlakte-expressie in de nucleus accumbens. J. Neurosci. 25, 9144-9151 10.1523 / jneurosci.2252-05.2005 [PubMed] [Kruis Ref]
  8. Chandra R., Lenz JD, Gancarz AM, Chaudhury D., Schroeder GL, Han MH, et al. (2013). Optogenetische remming van D1R met nucleus accumbens neuronen verandert cocaïne-gemedieerde regulatie van Tiam1. Voorkant. Mol. Neurosci. 6: 13 10.3389 / fnmol.2013.00013 [PMC gratis artikel] [PubMed] [Kruis Ref]
  9. Chang HT, Kitai ST (1985). Projectie-neuronen van de nucleus accumbens: een intracellulair labelingonderzoek. Brain Res. 347, 112-116 10.1016 / 0006-8993 (85) 90894-7 [PubMed] [Kruis Ref]
  10. Chausmer AL, Elmer GI, Rubinstein M., Low MJ, Grandy DK, Katz JL (2002). Cocaïne-geïnduceerde locomotorische activiteit en cocaïnediscriminatie in dopamine D2-receptor-mutante muizen. Psychopharmacology (Berl) 163, 54-61 10.1007 / s00213-002-1142-y [PubMed] [Kruis Ref]
  11. Chevalier G., Deniau JM (1990). Disinhibitie als een basisproces in de expressie van striatale functies. Trends Neurosci. 13, 277-280 10.1016 / 0166-2236 (90) 90109-n [PubMed] [Kruis Ref]
  12. Czubayko U., Plenz D. (2002). Snelle synaptische transmissie tussen striatale stekelige projectie-neuronen. Proc. Natl. Acad. Sci. VS 99, 15764-15769 10.1073 / pnas.242428599 [PMC gratis artikel] [PubMed] [Kruis Ref]
  13. Ferguson SM, Eskenazi D., Ishikawa M., Wanat MJ, Phillips PE, Dong Y., et al. (2011). Voorbijgaande neuronale remming onthult tegengestelde rollen van indirecte en directe paden in sensitisatie. Nat. Neurosci. 14, 22-24 10.1038 / nn.2703 [PMC gratis artikel] [PubMed] [Kruis Ref]
  14. Ga naar Y., Grace AA (2005). Dopaminerge modulatie van limbische en corticale aandrijving van nucleus accumbens in doelgericht gedrag. Nat. Neurosci. 8, 805-812 10.1038 / nn1471 [PubMed] [Kruis Ref]
  15. Grofová I. (1975). De identificatie van striatale en pallidale neuronen die naar substantia nigra projecteren. Een experimenteel onderzoek door middel van retrograde axonaal transport van mierikswortelperoxidase. Brain Res. 91, 286-291 10.1016 / 0006-8993 (75) 90550-8 [PubMed] [Kruis Ref]
  16. Grueter BA, Robison AJ, Neve RL, Nestler EJ, Malenka RC (2013). ΔFosB moduleert differus nucleus accumbens directe en indirecte route functie. Proc. Natl. Acad. Sci. VS 110, 1923-1928 10.1073 / pnas.1221742110 [PMC gratis artikel] [PubMed] [Kruis Ref]
  17. Gustafson N., Gireesh-Dharmaraj E., Czubayko U., Blackwell KT, Plenz D. (2006). Een vergelijkende spannings- en stroomklemanalyse van feedback en feedforward synaptische transmissie in de striatale microcircuit in vitro. J. Neurophysiol. 95, 737-752 10.1152 / jn.00802.2005 [PubMed] [Kruis Ref]
  18. Hikida T., Kimura K., Wada N., Funabiki K., Nakanishi S. (2010). Verschillende rollen van synaptische transmissie in directe en indirecte striatale paden naar beloning en aversief gedrag. Neuron 66, 896-907 10.1016 / j.neuron.2010.05.011 [PubMed] [Kruis Ref]
  19. Kalivas PW, Duffy P. (1990). Effect van acute en dagelijkse cocaïnebehandeling op extracellulair dopamine in de nucleus accumbens. Synapse 5, 48-58 10.1002 / syn.890050104 [PubMed] [Kruis Ref]
  20. Kalivas PW, Pierce RC, Cornish J., Sorg BA (1998). Een rol voor sensibilisering bij craving en recidive bij cocaïneverslaving. J. Psychopharmacol. 12, 49-53 10.1177 / 026988119801200107 [PubMed] [Kruis Ref]
  21. Koos T., Tepper JM, Wilson CJ (2004). Vergelijking van IPSC's opgeroepen door spiny en fast-spiking neuronen in de neostriatum. J. Neurosci. 24, 7916-7922 10.1523 / jneurosci.2163-04.2004 [PubMed] [Kruis Ref]
  22. Kourrich S., Rothwell PE, Klug JR, Thomas MJ (2007). Ervaring met cocaïne bepaalt bidirectionele synaptische plasticiteit in de nucleus accumbens. J. Neurosci. 27, 7921-7928 10.1523 / jneurosci.1859-07.2007 [PubMed] [Kruis Ref]
  23. Kravitz AV, Freeze BS, Parker PR, Kay K., Thwin MT, Deisseroth K., et al. (2010). Regulatie van motorisch gedrag van de motorinson door optogenetische controle van basale ganglia-circuits. Nature 466, 622-626 10.1038 / nature09159 [PMC gratis artikel] [PubMed] [Kruis Ref]
  24. Kravitz AV, Tye LD, Kreitzer AC (2012). Verschillende rollen voor directe en indirecte route striatale neuronen in versterking. Nat. Neurosci. 15, 816-818 10.1038 / nn.3100 [PMC gratis artikel] [PubMed] [Kruis Ref]
  25. Kreitzer AC, Malenka RC (2008). Striatale plasticiteit en basale ganglia-circuitfunctie. Nature 60, 543-554 10.1016 / j.neuron.2008.11.005 [PMC gratis artikel] [PubMed] [Kruis Ref]
  26. Le Moine C., Bloch B. (1996). Expressie van de D3-dopaminereceptor in peptidergische neuronen van de nucleus accumbens: vergelijking met de D1- en D2-dopaminereceptoren. Neuroscience 73, 131-143 10.1016 / 0306-4522 (96) 00029-2 [PubMed] [Kruis Ref]
  27. Lobo MK, Covington HE, 3rd, Chaudhury D., Friedman AK, Sun H., Damez-Werno D., et al. (2010). Celtype-specifiek verlies van BDNF-signalering bootst optogenetische controle van cocaïnebeloning na. Wetenschap 330, 385-390 10.1126 / science.1188472 [PMC gratis artikel] [PubMed] [Kruis Ref]
  28. Lobo MK, Nestler EJ (2011). De striatale evenwichtsoefening bij drugsverslaving: verschillende rollen van directe en indirecte pad middelgrote stekelige neuronen. Voorkant. Neuroanat. 5: 41 10.3389 / fnana.2011.00041 [PMC gratis artikel] [PubMed] [Kruis Ref]
  29. Lüscher C., Malenka RC (2011). Door drugs opgewekte synaptische plasticiteit bij verslaving: van moleculaire veranderingen tot herindeling van circuits. Neuron 69, 650-663 10.1016 / j.neuron.2011.01.017 [PMC gratis artikel] [PubMed] [Kruis Ref]
  30. O'Donnell P., Grace AA (1993). Fysiologische en morfologische eigenschappen van accumbens-kern- en schil-neuronen vastgelegd in vitro. Synapse 13, 135-160 10.1002 / syn.890130206 [PubMed] [Kruis Ref]
  31. Pascoli V., Turiault M., Lüscher C. (2011). Omkering van door cocaïne opgewekte synaptische potentiëring herstelt het door drugs geïnduceerde adaptieve gedrag. Nature 481, 71-75 10.1038 / nature10709 [PubMed] [Kruis Ref]
  32. Preston RJ, Bishop GA, Kitai ST (1980). Medium stekelige neuron projectie van de rat neostriatum: een intracellulaire mierikswortel peroxidase studie. Brain Res. 183, 253-263 10.1016 / 0006-8993 (80) 90462-x [PubMed] [Kruis Ref]
  33. Robinson TE, Berridge KC (1993). De neurale basis van het hunkeren naar drugs: een incentive-sensitisatie theorie van verslaving. Brain Res. Brain Res. Rev. 18, 247-291 10.1016 / 0165-0173 (93) 90013-p [PubMed] [Kruis Ref]
  34. Robinson TE, Berridge KC (2003). Verslaving. Annu. Rev. Psychol. 54, 25-53 10.1146 / annurev.psych.54.101601.145237 [PubMed] [Kruis Ref]
  35. Schmidt HD, Pierce RC (2010). Cocaïne-geïnduceerde neuroadaptaties bij glutamaattransmissie: potentiële therapeutische doelen voor hunkering en verslaving. Ann. NY Acad. Sci. 1187, 35-75 10.1111 / j.1749-6632.2009.05144.x [PubMed] [Kruis Ref]
  36. Sesack SR, Grace AA (2010). Cortico-basale ganglia-beloningsnetwerk: microcircuitry. Neuropsychopharmacology 35, 27-47 10.1038 / npp.2009.93 [PMC gratis artikel] [PubMed] [Kruis Ref]
  37. Sim HR, Choi TY, Lee HJ, Kang EY, Yoon S., Han PL, et al. (2013). De rol van dopamine D2-receptoren in de plasticiteit van door stress geïnduceerd verslavend gedrag. Nat. Commun. 4: 1579 10.1038 / ncomms2598 [PubMed] [Kruis Ref]
  38. Smith RJ, Lobo MK, Spencer S., Kalivas PW (2013). Cocaïne-geïnduceerde aanpassingen in D1 en D2 accumbens projectie-neuronen (een dichotomie niet noodzakelijkerwijs synoniem met directe en indirecte paden). Curr. Opin. Neurobiol. 23, 546-552 10.1016 / j.conb.2013.01.026 [PMC gratis artikel] [PubMed] [Kruis Ref]
  39. Steketee JD, Kalivas PW (2011). Drugswens: gedragssensibilisatie en terugval naar drugszoekend gedrag. Pharmacol. Rev. 63, 348-365 10.1124 / pr.109.001933 [PMC gratis artikel] [PubMed] [Kruis Ref]
  40. Taverna S., Ilijic E., Surmeier DJ (2008). Terugkerende collaterale connecties van striatale medium stekelige neuronen zijn verstoord in modellen van de ziekte van Parkinson. J. Neurosci. 28, 5504-5512 10.1523 / JNEUROSCI.5493-07.2008 [PMC gratis artikel] [PubMed] [Kruis Ref]
  41. Taverna S., van Dongen YC, Groenewegen HJ, Pennartz CM (2004). Direct fysiologisch bewijs voor synaptische connectiviteit tussen middelgrote stekelige neuronen in rattenucleus accumbens in situ. J. Neurophysiol. 91, 1111-1121 10.1152 / jn.00892.2003 [PubMed] [Kruis Ref]
  42. Thomas MJ, Kalivas PW, Shaham Y. (2008). Neuroplasticiteit in het mesolimbische dopamine-systeem en cocaïneverslaving. Br. J. Pharmacol. 154, 327-342 10.1038 / bjp.2008.77 [PMC gratis artikel] [PubMed] [Kruis Ref]
  43. Tunstall MJ, Oorschot DE, Kean A., Wickens JR (2002). Remmende interacties tussen spiny projection neuronen in het striatum van de rat. J. Neurophysiol. 88, 1263-1269 10.1152 / jn.00886.2001 [PubMed] [Kruis Ref]
  44. Vanderschuren LJ, Kalivas PW (2000). Veranderingen aan dopaminerge en glutamaterge transmissie bij de inductie en expressie van gedragssensibilisatie: een kritische beoordeling van preklinische studies. Psychopharmacology (Berl) 151, 99-120 10.1007 / s002130000493 [PubMed] [Kruis Ref]
  45. Wilson CJ, PM van Groves (1980). Fijne structuur en synaptische verbinding van het gewone stekelige neuron van het neostriatum van de rat: een onderzoek waarin intracellulaire injectie van mierikswortelperoxidase wordt toegepast. J. Comp. Neurol. 194, 599-615 10.1002 / cne.901940308 [PubMed] [Kruis Ref]
  • Wijs RA (2004). Dopamine, leren en motivatie. Nat. Rev Neurosci. 5, 483-494 10.1038 / nrn1406 [PubMed] [Kruis Ref]