Decodering van neurale circuits die het zoeken naar een dwangssucrose opzoeken (2015) (BINGE MECHANISM)

Om LH-neuronen te identificeren die monosynaptische input leveren aan de VTA in vivo en hun activiteit te observeren tijdens vrij bewegend gedrag, hebben we een dual-virusstrategie gebruikt om selectief channelrhodopsin-2 (ChR2) tot expressie te brengen in LH-neuronen die monosynaptische input leveren aan de VTA (Cijfers 1A en S1). We injecteerden een adeno-geassocieerde virale vector (AAV₅) met ChR2-eYFP in een Cre-recombinase-afhankelijke dubbel-omgekeerde open leeskader (DIO) -construct in de LH om lokale somata te infecteren en een retrogradely reizend herpes simplex-virus (HSV) te injecteren dat Cre-recombinase in de VTA draagt. Daaropvolgende recombinatie maakte opsine- en fluorofoor-expressie selectief mogelijk in LH-neuronen die monosynaptische input voor de VTA leverden. Om onze aanpak te bevestigen, hebben we ex vivo patch-clamp-opnames van hele cellen uitgevoerd in horizontale hersenschijven die de LH bevatten en opgenomen van neuronen die ChR2-eYFP tot expressie brengen, evenals naburige LH-neuronen die ChR2-eYFP-negatief waren (Figuur 1B). Door licht opgewekte spike-latenties, gemeten vanaf het begin van de lichtpuls tot de piek van het actiepotentiaal, varieerden van 3-8 ms (Figuur 1C). We ontdekten ook dat geen van de geregistreerde niet tot expressie brengende (ChR2-negatieve) cellen prikkelende reacties vertoonde op fotostimulatie (n = 14; Figuur 1C), ondanks hun nabijheid tot cellen die ChR2 tot expressie brengen.

Om optogenetisch gemedieerde foto-identificatie in vivo uit te voeren, werd een optrode geïmplanteerd in de LH om neuronale activiteit vast te leggen tijdens een taak om sucrose te zoeken. In dezelfde opnamesessie hebben we verschillende fotostimulatiepatronen verstrekt om LH-VTA-neuronen die ChR2 tot expressie brengen te identificeren (Cijfers 1D en S1). We onderzochten de verdeling van excitatorische fotoresponslatenties in alle LH-neuronen met een in de tijd vergrendelde verandering in de activeringssnelheid in reactie op verlichting en observeerden een bimodale verdeling (Figuur 1E). We observeerden een populatie neuronen tijdens in vivo opnames met latenties in een bereik van 3–8 ms. Dit was identiek aan het latentiebereik dat werd gevonden in LH-VTA-neuronen die ChR2 tot expressie brengen toen we ex vivo opnamen. We noemden deze units 'Type 1'-units (Cijfers 1C, 1E en 1F). Bovendien was er een aparte populatie van cellen met ∼100 ms fotoresponslatenties (Cijfers 1E en 1G), en we noemden deze "Type 2" -eenheden. We hebben ook neuronen waargenomen die werden geremd als reactie op fotostimulatie van LH-VTA-neuronen (Figuur S2), en we noemden deze "Type 3" -eenheden. We vergeleken de duur van de actiepotentiaal (gemeten van piek tot dal) en de gemiddelde activeringssnelheden van Type 1- en Type 2-eenheden, evenals die van eenheden die geen fotorespons vertoonden (Figuur 1H). De verdeling van de duur van actiepotentialen van Type 1 (Figuur 1I) en Type 2 (Figuur 1J) eenheden toont aan dat de meeste Type 1-eenheden een actiepotentiaalduur hebben van minder dan 500 μs (84%; n = 16/19, binominale verdeling, p = 0.002).

Hoewel Type 1-eenheden voldoen aan standaardcriteria om te worden geclassificeerd als ChR2-expressie (Cohen et al., 2012; Zhang et al., 2013), was het onduidelijk of de langere latentie-fotorespons van Type 2-eenheden indicatief was voor ChR2-expresserende neuronen die reageerden. langzamer tot fotostimulatie, of dat dit effect te wijten was aan netwerkactiviteit. Gezien het feit dat de ChR2-expresserende (Type 1) LH-neuronen rechtstreeks naar de VTA projecteren, was een mogelijkheid dat Type 2-neuronen feedback kregen van de VTA (Figuur 1K). Een andere mogelijkheid was dat Type 2 neuronen werden geactiveerd door axon collateralen van Type 1 neuronen (Figuur 1L). Om onderscheid te maken tussen deze twee mogelijke circuitmodellen, hebben we de VTA geremd in combinatie met foto-identificatie in de LH.

Op basis van onze circuitmodellen zouden we verwachten dat distale remming geen effect heeft op de fotoresponses van Chr2 tot expressie brengende LH-neuronen. Echter, als fotoresponsieve, maar niet tot expressie brengende, LH-neuronen afhankelijk waren van feedback van de VTA om een ​​tijdgebonden respons op verlichting op te wekken (Figuur 1K), verwachten we een verzwakking van fotoresponses in deze neuronen na VTA-remming. We brachten ChR2 tot expressie in LH-VTA-cellen zoals hierboven, maar deze keer bracht ook verbeterde halorhodopsine 3.0 (NpHR) tot expressie in de VTA en implanteerde een optische vezel in de VTA naast de optrode in LH (Figuur 2EEN). We hebben dezelfde belichtingspatronen met blauw licht in de LH geleverd voor alle drie de tijdvakken, maar ook foto-inhibitie van de VTA met geel licht in de tweede periode (Figuur 2EEN).

De fotoresponses van Type 1-eenheden voor blauwlichtbelichting in de LH werden niet beïnvloed door foto-inhibitie van de VTA, wat consistent is met ChR2-expressie in Type 1 LH-VTA-neuronen (Figuur 2B). Daarentegen vertoonden de meeste Type 2-eenheden (87%; n = 13/15, binominale verdeling, p = 0.004) een significante verzwakking van fotoresponsies op blauwlichtpulsen die in de LH werden afgegeven na fotoinhibitie van VTA-neuronen. De reacties van Type 1- en Type 2-eenheden tijdens VTA-fotoinhibitie waren significant verschillend (chikwadraat = 7.64, p = 0.0057; Cijfers 2B en 2C). Deze verschillen zijn ook te zien in de max Z-scores tijdens individuele tijdvakken (Figuur 2D) en met het geel-ON-tijdperk genormaliseerd naar het geel-UIT-tijdvak (Figuur 2E). Deze gegevens suggereren dat Type 2 LH neuronen input (direct of indirect) van de VTA ontvangen (Figuur 1K) in plaats van via lokale axon-collateralen (Figuur 1L).

Nadat we deze twee verschillende soorten LH-neuronen in de LH-VTA-lus hadden geïdentificeerd, wilden we natuurlijk voorkomende neurale activiteit onderzoeken tijdens een zelftoedieningstaak voor sucrose (Figuur 3EEN). Muizen werden getraind om neuspaakreacties uit te voeren voor een signaal dat de afgifte van sucrose in een aangrenzende poort voorspelt (zoals in Tye et al., 2008). Om ons in staat te stellen neurale reacties op de neuspaak en de keu te differentiëren, werden de keu en sucrose afgeleverd volgens een gedeeltelijk versterkingsschema, waarbij 50% van de neuspaken werden gecombineerd met een keu en sucrose-afgifte.

Type 1-eenheden vertoonden fasische reacties op invoer van sucrosepoorten, zoals te zien in een representatieve Type 1-eenheid (Figuur 3B), evenals de bevolkingsgegevens voor alle Type 1-eenheden (Figuur 3C). De fasische reacties van Type 2-eenheden weerspiegelden echter voornamelijk de antwoorden op de beloningsvoorspellende cue (Cijfers 3D en 3E). De genormaliseerde schietpatronen van alle geregistreerde neuronen (n = 198, onderverdeeld in Type 1, 2, 3 en niet-reagerende eenheden) worden weergegeven voor elke taakcomponent: neuspaken gecombineerd met de keu, neuspaken bij afwezigheid van de keu, en sucrose poortingang (Figuur 3F). Alle Type 1-eenheden die taakrelevante fasische veranderingen in activiteit vertoonden (74%; n = 14/19) waren ofwel fasisch opgewonden ofwel geremd door het binnengaan van de sucrosepoort, waarbij een klein aantal ook fasische remming vertoonde van de beloning-voorspellende cue (Cijfers 3B, 3C en 3G). De eenheden van Type 2 waren daarentegen meer heterogeen, waarbij taakgerichte neuronen de reeks selectief codeerden (35%), de sucrosepoort-invoer selectief (26%) of zowel de cue- als poortinvoer (12%; Cijfers 3D, 3E en 3H). Om de sterkte van reacties van Type 1- en Type 2-eenheden op taakgerelateerde gebeurtenissen te illustreren, hebben we elke cel op basis van een Z-score geplot op een driedimensionale plot (Figuur 3IK). Om de distributie van fasische veranderingen in het schieten naar meerdere taakgerelateerde gebeurtenissen op een kwalitatief niveau weer te geven, hebben we het aantal cellen van elk fotoresponsietype uitgezet dat in een bepaalde categorie viel (Figuur 3J).

Gezien de goed gedefinieerde rol van de VTA bij beloningsvoorspellingsfouten (bijvoorbeeld de fasische reductie van DA-neuronafvuren als reactie op het onverwachte weglaten van een beloning en de fasische excitatie als reactie op onverwachte beloning) (Schultz et al., 1997), onderzochten we of LH-neuronen zouden coderen voor de onverwachte weglating van een sucrose-beloning. Om dit te doen, hebben we de neurale activiteit van fotoresponsieve neuronen geregistreerd tijdens dezelfde cue-reward-taak bij goedgetrainde dieren, maar hebben we willekeurig 30% van de sucrose-leveringen weggelaten na de cue (Figuur 4EEN).

De meerderheid van Type 1-eenheden (88%; n = 15/17, binominale verdeling, p = 0.001) waren ongevoelig voor het weglaten van beloningen (Cijfers 4B en 4D), terwijl een grote subset van Type 2-eenheden (67%; n = 12/18) een significant andere respons vertoonde op door beloning gepresenteerde en belonings-weggelaten onderzoeken (Cijfers 4C en 4D). We concludeerden dat LH-VTA (Type 1) neuronen de actie codeerden voor het invoeren van de poort, omdat deze reacties op poortinvoer persistent waren, zelfs na beloningsmislucitatie (Figuur 4D), in tegenstelling tot Type 2-eenheden (chikwadraat = 10.9804, p = 0.0009).

Om vast te stellen of Type 1-reacties op poortinvoer echt codeerden voor de geconditioneerde respons (CR), in tegenstelling tot algemeen beloningszoekend of verkennend gedrag, hebben we opgenomen in niet-getrainde muizen die de taak nog niet hadden verworven. In taaknaïeve muizen leverden we sucrose aan de poort in de afwezigheid van een voorspellende cue (onvoorziene beloning) en we ontdekten dat Type 1-eenheden geen fasische reacties op poortinvoer vertoonden (Cijfers 4E, 4F en 4I), consistent met het model dat Type 1 neuronen de CR coderen (Figuur 4J).

Vervolgens, om te bepalen of de activiteit van Type 2-eenheid consistent is met een fout-voorspellingsfout-achtig reactieprofiel, hebben we deze neuronen ook opgenomen in goed getrainde dieren tijdens onvoorziene beloningstoediening (Figuur 4G). We ontdekten dat een subset van Type 2-eenheden reageerde op onverwachte sucroseleveringen (50%; Cijfers 4G-4I). Tezamen genomen zijn deelverzamelingen van Type 2-eenheden gevoelig voor onverwachte beloningsmislukkingen (Cijfers 4C en 4D) en onvoorziene beloningstoediening (Cijfers 4G-4I), consistent met een fout-achtig reactieprofiel op beloningsspelling.

Zoals we hierboven hebben laten zien, vormen Type 1-eenheden een neuraal correlaat van CR. Belangrijk is dat de toename van het aantal bommen begint vóór de CR, oplopend tot de CR is voltooid (Cijfers 3B, 3C en 4B). Om te bepalen of activering van de LH-VTA-route CR zou kunnen bevorderen, wilden we het vermogen van LH-VTA-activering testen om CR te besturen met het oog op een negatief gevolg. In wildtype muizen brachten we ChR2-eYFP of eYFP alleen tot expressie in LH cellichamen en implanteerden een optische vezel over de VTA (Cijfers 5A en S4). Omgekeerd, om de rol van de LH-VTA-route bij het bemiddelen van CR of voedingsgerelateerd gedrag te testen, brachten we NpHR-eYFP of eYFP alleen bilateraal tot expressie in LH-cellen en implanteerden we een optische vezel boven de VTA (Cijfers 5A en S4).

We hebben een Pavloviaanse conditioneringstaak ontworpen waarbij muizen die van voedsel zijn beroofd een shock-grid moesten passeren om een ​​sucrose-beloning te ontvangen (Figuur 5B). In het eerste "basislijn" -tijdperk (met het schokrooster uitgeschakeld), hebben we geverifieerd dat elke muis de Pavloviaanse geconditioneerde aanpakstaak had verworven. In het tweede (“Shock”) tijdperk leverde het shock grid elke seconde milde voetschokken af. Ten slotte bleven we in het derde tijdperk ('Shock + Light') voetschokken toedienen, maar ook verlichte LH-terminals in de VTA met blauw licht (10 Hz) bij muizen die ChR2 uitdrukken en bijpassende eYFP-bedieningselementen en geel licht (constant) voor muizen die NpHR en hun eYFP-controles tot expressie brengen (Figuur 5B).

We observeerden een significant hoger aantal poortinvoeringen per cue gedurende het Shock + Light-tijdperk en een significant hogere verschilscore (Shock + Light epoch - Shock-only epoch) in ChR2-muizen ten opzichte van eYFP-muizen (Figuur 5C en Film S1). In tegenstelling resulteerde fotoinhibitie van de LH-VTA-route in een significante reductie van poortinvoeringen per cue- en verschilscores in de NpHR-muizen ten opzichte van eYFP-muizen (Figuur 5D en Film S2). In-session extinctie-experimenten waarbij cue-presentaties niet werden gevolgd door sucrose-leveringen vertoonden vergelijkbare trends in effect (Figuur S4).

Belangrijk is dat we wilden bepalen of de veranderingen in het zoeken naar sucrose die we hadden verkregen het gevolg waren van veranderingen in het voedingsgerelateerd gedrag of de gevoeligheid voor pijn. We hebben vastgesteld dat fotoactivatie van de LH-VTA-projectie de tijd besteed aan het voeren van goed gevoede muizen in de ChR2-groep (Figuur 5E). Fotoinhibitie van de LH-VTA-route verminderde de voeding echter niet significant (Figuur 5F), hoewel deze dieren voedselarm waren om ons vermogen om een ​​reductie ten opzichte van het basistijdvak te detecteren te verbeteren (vergelijk met sated animals in Figuur 5E). In geen van de ChR2 (Figuur 5G) noch NpHR-groep (Figuur 5H) zagen we een verschil in latentie met het terugtrekken van de staart uit heet water (Ben-Bassat et al., 1959, Grotto en Sulman, 1967), wat aangeeft dat het manipuleren van de LH-VTA-projectie de analgesie niet veranderde?

Om de samenstelling van de snelle transmissiecomponenten van LH-inputs naar de VTA die deze effecten opwekten te bestuderen, hebben we hele cel patch-clamp-opnames gemaakt van VTA-neuronen in een acute slice-voorbereiding, terwijl we LH-inputs optisch activeerden die ChR2-eYFP (Cijfers 6A en S5). Gezien het feit dat er een gevestigde heterogeniteit is binnen de VTA, waaronder ∼65% DA-neuronen, ∼30% GABA-neuronen en ∼5% glutamaatneuronen (Margolis et al., 2006; Nair-Roberts et al., 2008, Yamaguchi et al., 2007, Yamaguchi et al. al., XNUMX), vulden we cellen met biocytine tijdens het opnemen om identificatie van het celtype mogelijk te maken met behulp van post-hoc immunohistochemie voor tyrosinehydroxylase (TH; Figuur 6B), naast het registreren van de hyperpolarisatie-geactiveerde kationstroom (I._h) en de locatie van de cel in kaart brengen (Cijfers 6B en S5).

Ten eerste hebben we opgenomen in stroomtang tijdens fotostimulatie van ChR2-expresserende LH-ingangen en waargenomen dat 23 van 27-neuronen een tijdvertragende reactie toonde op fotostimulatie van LH-ingangen (Figuur 6C). De meerderheid van DA neuronen die werden bemonsterd in de VTA ontvingen een netto exciterende input van de LH (56%), terwijl een andere subset netto remming vertoonde (30%; Figuur 6C). De ruimtelijke verdeling van deze DA-neuronen wordt in kaart gebracht op een atlas voor horizontale plakken met de VTA (Figuur 6D).

Om de monosynaptische bijdrage van LH-inputs aan VTA DA-neuronen vast te stellen, gebruikten we ChR2-ondersteunde circuitmapping, waarbij spanningsklemopnames werden uitgevoerd in aanwezigheid van tetrodotoxine (TTX) en 4-aminopyridine (4AP; Petreanu et al., 2007) . In overeenstemming met onze waarnemingen van stroomklemopnames, zagen we dat de meerderheid van de geregistreerde VTA DA-neuronen uitsluitend exciterende monosynaptische input van de LH ontvingen (67%), vergeleken met VTA DA-neuronen die uitsluitend remmende monosynaptische input ontvingen (11%), of beide (22%; Cijfers 6E en S6).

We identificeerden VTA GABA-neuronen door een Cre-afhankelijke fluorofoor (AAV₅-DIO-mCherry) in de VTA van VGAT :: Cre-muizen en gebruikten mCherry-expressie om de opname van VTA GABA-neuronen (n = 24; Figuur 6F). Zesenveertig procent van de VTA GABA-neuronen reageerde met netto-excitatie, terwijl 54% reageerde met netto-inhibitie, op fotostimulatie van ChR2-expresserende LH-ingangen (Figuur 6G). De ruimtelijke verdeling van deze cellen wordt getoond in Figuur 6H. Bij onderzoek van de monosynaptische input van de LH (zoals hierboven beschreven), vonden we dat 18% van de gesamplede GABA-neuronen exclusief exciterende input ontving en 9% uitsluitend remmende input ontving (Figuur 6IK). Ten opzichte van VTA DA-neuronen vonden we echter dat meer VTA GABA-neuronen zowel exciterende AMPAR-gemedieerde als remmende GABA ontvingen._AR-gemedieerde monosynaptische input van de LH (73%; chikwadraat = 5.0505, p = 0.0246; Cijfers 6ik en S6).

Aangezien onze ex vivo opnames bewijs leverden ter ondersteuning van robuuste input van zowel GABAergic als glutamaterge LH-projecties naar de VTA, hebben we vervolgens de rol van elke component onafhankelijk onderzocht. Om dit te doen, gebruikten we transgene muislijnen die Cre-recombinase tot expressie brachten in neuronen die ofwel vesiculaire glutamaattransporter 2 (VGLUT2) of vesiculaire GABA-transporter (VGAT) tot expressie brachten. We hebben AAV geïnjecteerd₅-DIO-ChR2-eYFP of AAV₅-DIO-eYFP in de LH van VGLUT2 :: Cre en VGAT :: Cre muizen en geïmplanteerd een optische vezel over de VTA (Figuur S7). Deze dieren werden vervolgens op elk van de gedragstests uitgevoerd die worden getoond in Figuur 5.

We hebben geen detecteerbare verschillen waargenomen in het aantal poortinvoeringen dat per cue is gemaakt tussen muizen die ChR2 of eYFP in de LH uitdrukken^overvoeren-VTA projectie (Figuur 7A) of in de LH^GABA-VTA projectie (Figuur 7B). Bij video-analyse merkten we afwijkende knagende gedragingen in de LH^GABA-VTA: ChR2-groep bij blauwlichtverlichting (zie Films S3 en S4). In LH^overvoeren-VTA-muizen, hoewel er een trend was in de richting van een vermindering van de voeding na fotostimulatie in de ChR2-groep in vergelijking met de eYFP-groep, was dit niet statistisch significant (Figuur 7C). In tegenstelling hiermee zagen we een robuuste toename in de tijd besteed aan het voeren in sated muizen bij verlichting in de LH^GABA-VTA: ChR2-groep ten opzichte van besturingselementen (Figuur 7D en Film S3). In geen enkele groep dieren was er een effect van lichtstimulatie in de staartopname-test (Cijfers 7E en 7F).

Tijdens de voedingstaak, zoals we deden tijdens de sucrose-zoektaak, merkten we opnieuw afwijkende, aan voer gerelateerde motorische sequenties op die niet op voedsel waren gericht. We filmden een representatieve muis in de LH^GABA-VTA: ChR2-groep in een lege transparante kamer, en na 20 Hz fotostimulatie, zagen we ongebruikelijke motorische sequenties, zoals likken en knagen aan de vloer of lege ruimte (Film S4). We kwantificeerden deze "knagende" gedragingen tijdens de voedingstaak in de wildtype LH-VTA (Figuur 7G), LH^overvoeren-VTA (Figuur 7H) en LH^GABA-VTA (Figuur 7I) groepen en liet dat LH zien^GABA-VTA: ChR2-muizen hebben meer geknaagd dan wildtype of LH^overvoeren-VTA: ChR2-muizen bij fotostimulatie, in vergelijking met hun respectieve eYFP-groepen (Figuur 7J). We hebben overwogen of de afwijkende voedingsgerelateerde gedragingen zouden kunnen worden gescheiden van passend gerichte voeding op lagere frequenties. Toen we de LH echter testten^GABA-VTA: ChR2-groep met 5 Hz en 10 Hz treinen van blauw licht, we observeerden een proportioneel verband tussen de stimulatiefrequentie en zowel voeden als knagen (Figuur 7K).

De LH-projectie op de VTA is onderzocht met onderzoek naar elektrische stimulatiebotsingen (Bielajew en Shizgal, 1986) en het is al langelijk verondersteld dat deze een rol spelen in beloningsverwerking (Hoebel en Teitelbaum, 1962, Margules en Olds, 1962), maar toch dit vaststellen rol is een uitdaging. Hier geven we een gedetailleerde ontleding van hoe individuele componenten van de LH-VTA-lus verschillende aspecten van een op beloning betrekking hebbende taak verwerken.

Door het gebruik van optogenetisch gemedieerde fototagging (Figuur 1), hebben we twee afzonderlijke populaties van LH-neuronen geïdentificeerd: cellen die projecties naar de VTA verzenden (Type 1) en cellen die feedback van de VTA ontvangen (Type 2; Figuur 2) -Hoewel deze populaties elkaar niet exclusief hoeven te zijn, omdat het mogelijk is dat LH-neuronen zowel input naar als van de VTA kunnen verzenden en ontvangen. Interessant genoeg vonden we dat relatief weinig fotoresponsieve neuronen buiten de bimodale verdeling vielen die deze twee populaties omhulde (Figuren S2B en 1E). Gezien dit, in combinatie met de lange latentievertraging in Type 2-fotoresponses (∼100 ms), speculeren we dat er mogelijk één dominante route is die bijdraagt ​​aan de activiteit van Type 2-neuronen. Omdat DA bovendien G-eiwit-gekoppelde receptoren bindt, is de kinetiek langzamer dan de meeste glutamaterge synapsen (Girault en Greengard, 2004) en kan dit cluster van 100 ms latency fotoresponsieve eenheden verklaren. Het is ook mogelijk dat de VTA indirecte feedback kan geven via andere distale regio's, via prikkelende tussenliggende regio's zoals de amygdala, of met ontremming via de nucleus accumbens (NAc) of bedkern van de stria terminalis (BNST).

Interessant is dat, terwijl fotostimulatie van Type 1-eenheden prikkelende reacties oproept in Type 2-eenheden, Type 1- en Type 2-eenheden verschillende gedragscoderingseigenschappen vertonen. De aantallen Type 1- en Type 2-eenheden die selectief de beloning-voorspellende cue coderen, zijn bijvoorbeeld significant verschillend (n = 0/19 Type 1 versus n = 12/34 Type 2, chi-kwadraat = 8.67, p = 0.003) . Dit paradoxale responspatroon kan het gevolg zijn van rekenprocessen bij een tussenkringelement, zoals de VTA, die mogelijk een actieve rol spelen tijdens de gedragstaak, maar inactief zijn tijdens fototagging. Bovendien kan de gedragstoestand van het dier van invloed zijn op hoe deze gegevens worden verwerkt.

Onze beloning-omissie-experimenten lieten ons onderscheid maken tussen LH-neurale codering van de CR en het gebruik van de ongeconditioneerde stimulus (US). In deze experimenten reageerde een subset van Type 2-eenheden op de beloningsvoorspellingskou (CS) en de VS en toonde ook een afname van de activeringssnelheid wanneer verwachte beloningen werden weggelaten. Bovendien vertoont een subset van Type 2-eenheden ook fasische excitatie bij onverwachte beloning (Cijfers 4G en 4H). Deze gegevens doen denken aan de manier waarop DA-neuronen in de VTA coderen voor beloningsvoorspellingsfouten (Cohen et al., 2012; Schultz et al., 1997). We speculeren dat VTA-neuronen beloningsvoorspellingsfoutsignalen kunnen verzenden naar een subset van LH-neuronen, die goed gepositioneerd zijn om deze signalen te integreren voor het bepalen van een geschikte gedragsoutput. In het bijzonder is de LH robuust verbonden met een groot aantal andere hersengebieden (Berthoud en Münzberg, 2011) en is causaal verbonden met homeostatische toestanden zoals slaap / opwinding en honger / verzadiging (Carter et al., 2009, Jennings et al. , 2013).

Dwangmatig beloningszoekgedrag is voornamelijk besproken in de context van drugsverslaving, waarbij een klassiek paradigma voor het dwangmatig zoeken naar drugs is geweest om te onderzoeken in welke mate drugszoekgedrag aanhoudt bij een negatief gevolg, zoals een voetschok. (Belin et al., 2008, Pelloux et al., 2007, Vanderschuren en Everitt, 2004). We hebben deze taak aangepast voor sucrose om ons in staat te stellen te onderzoeken of activering van de LH-VTA-route voldoende was om het dwangmatig zoeken naar sucrose te bevorderen. Aangezien een duidelijk verschil tussen medicijn en natuurlijke beloning is dat medicijnbeloningen niet nodig zijn om te overleven, is er controverse over welk gedrag dwangmatig sucrose- of voedselzoekend gedrag zou zijn. Een alternatieve interpretatie van onze gegevens is dat activering van de LH-VTA-route eenvoudigweg de motiverende drive of de drang om appetitieve bekrachtigers te zoeken, verhoogt. Aangezien het aantal gevallen van zwaarlijvigheid de afgelopen decennia is toegenomen (Mietus-Snyder en Lustig, 2008), zijn dwangmatig overeten en suikerverslaving veel voorkomende aandoeningen die een grote bedreiging vormen voor de menselijke gezondheid (Avena, 2007). Het voedingsgedrag bij verzadigde (volledig gevoede) muizen na activering van de LH-VTA-route doet denken aan eetgedrag dat wordt waargenomen bij mensen met de diagnose dwangmatige overetenstoornis (of eetbuistoornis) (DSM-V).

Er is voorgesteld dat herhaalde acties leiden tot de vorming van gewoonten, die zelf leiden tot de dwangmatige beloning die kenmerkend is voor verslaving (Everitt en Robbins, 2005). Onze bevinding dat LH-VTA-neuronen alleen poortinvoer na conditionering coderen, suggereert dat deze route selectief een geconditioneerde respons codeert, niet alleen een gemotiveerde actie. Dit is consistent met onze observaties dat optisch activeren van deze projectie dwangmatig belonen kan bevorderen in het gezicht van een negatief gevolg (Figuur 5C), evenals in de afwezigheid van behoefte (zoals gezien bij gematigde muizen, Figuur 5E). Deze interpretatie wordt verder onderbouwd door onze bevinding dat fotoinhibitie van de LH-VTA-route selectief dwangmatig sucrose-zoeken vermindert (Figuur 5D) maar vermindert niet het voeren van voedselbeperkte muizen (Figuur 5F). Een van de grootste uitdagingen bij het behandelen van dwangmatige overeten of eetbuienstoornissen is het risico op het verstoren van het voedingsgedrag in het algemeen. Vanuit een translationeel perspectief hebben we mogelijk een specifiek neuraal circuit geïdentificeerd als een potentieel doelwit voor de ontwikkeling van therapeutische interventies voor dwangmatige overeten of suikerverslaving zonder het natuurlijke voedingsgedrag op te offeren.

We laten zien dat naast een glutamaterge LH-VTA-component (Kempadoo et al., 2013) er ook een significante GABA-erge component in de projectie zit (Leinninger et al., 2009), en dat LH-neuronen direct synaps op zowel DA als GABA-neuronen in de VTA (Figuur 6). Er is echter een verschil in de balans van de prikkelende / remmende input op VTA DA- en GABA-neuronen.

Terwijl we immunohistochemische verwerking gebruikten om de identiteit van VTA-neuronen te verifiëren, hebben we ook I gemeten_h, een hyperpolarisatie-geactiveerde naar binnen gerichte rectificerende niet-specifieke kationstroom (Lacey et al., 1989; Ungless en Grace, 2012). De aanwezigheid van deze stroom is veel gebruikt in elektrofysiologische studies om DA-neuronen te identificeren, maar er is aangetoond dat deze alleen aanwezig is in subpopulaties van DA-neuronen, afgebakend door projectiedoelwit (Lammel et al., 2011). Hoewel eerder in een recensie van Fields en collega's is voorgesteld dat "LH-neuronen synaps op VTA-projecties naar de PFC sturen, maar niet die projecties naar het NAc" (Fields et al., 2007), suggereren onze gegevens dat deze controverse opnieuw wordt geopend. voor verder onderzoek. Ook al hebben we een subset van DA-neuronen waargenomen die netto excitatie van de LH ontvingen en een zeer kleine I_h (consistent met mPFC- of NAc mediale schaalprojectieve DA-neuronen), we hebben ook een subset van DA-neuronen waargenomen die netto exciterende input ontvingen en een grote I vertoonden_h (consistent met kenmerken van DA-neuronen die naar de laterale schil van het NAc projecteren; Figuur S5; Lammel et al., 2011). Omgekeerd vertoonden VTA DA-neuronen die een netto remmende input ontvingen een zeer kleine I_h of miste deze stroom, wat consistent is met het idee dat de LH overwegend remmende input stuurt naar VTA DA-neuronen die naar de mPFC of de mediale schaal van het NAc projecteren. We laten ook zien dat LH-inputs kunnen worden waargenomen in zowel mediale als laterale VTA, wat suggereert dat de LH input levert op VTA-neuronen met verschillende projectiedoelen, omdat bekend is dat VTA-projectiedoel enigszins overeenkomt met de ruimtelijke locatie langs een mediaal-laterale as ( Lammel et al., 2008).

De rol van de LH-VTA-route bij het bevorderen van beloning is eerder toegeschreven aan glutamaterge transmissie in de VTA (Kempadoo et al., 2013), omdat vaak wordt gedacht dat de CaMKIIα-promotor selectief is voor exciterende projectie-neuronen. Onze gegevens laten echter duidelijk zien dat het tot expressie brengen van ChR2 onder controle van de CaMKIIα-promotor ook gericht is op GABAergische projectie-neuronen in de LH (Figuur 6).

Het gedrag veroorzaakt door fotostimulatie van de LH^GABA-VTA-pad was waanzinnig, verkeerd geregisseerd en onaangepast (Film S4). Eén interpretatie is die activering van de LH^GABA-VTA-pad verzendt een signaal naar de muis dat de herkenning van een stimulerende versterker veroorzaakt. Een alternatieve interpretatie is dat de LH^GABA-VTA-pad kan incentive-salience of een intens 'willen' stimuleren, consistent met een signaal dat ten grondslag ligt aan geconditioneerde aanpak, maar op een niet-fysiologisch niveau dat dit afwijkende voedingsgerelateerde gedrag produceert (Berridge en Robinson, 2003). In overeenstemming hiermee is het mogelijk dat de LH wordt geactiveerd^GABA-VTA-projectie produceert in feite intense gevoelens van begeerte, of dringt aan om te voeden. Onze experimenten tonen echter aan dat activatie van LH^GABA-VTA produceert geen verhoging van het zoeken naar compulsieve sucrose, maar dit is waarschijnlijk te wijten aan het buitensporig knagende en afwijkende appetijtgedrag dat zich richt op niet-voedselobjecten in de testkamer. Hoewel het moeilijk is om de ervaring van de muis tijdens deze manipulatie te bepalen, is het duidelijk dat passend gericht voedingsgerelateerd gedrag de gecoördineerde activering van zowel de GABAergische als de glutamaterge componenten van de LH-VTA-route vereist.

Optogenetische en farmacogenetische manipulaties zijn krachtige hulpmiddelen voor het vaststellen van oorzakelijke relaties, maar onthullen niet de endogene, fysiologische eigenschappen van neurale circuitelementen. Onze studie verenigt informatie over de synaptische connectiviteit, de van nature voorkomende endogene functie en de oorzakelijke rol van de LH-VTA-route, waardoor een nieuw niveau van inzicht wordt verschaft in de manier waarop informatie in dit circuit is geïntegreerd. Deze resultaten benadrukken het belang van het onderzoeken van de functionele rol van neuronen door connectiviteit, naast genetische markers. LH-VTA-neuronen codeerden selectief voor de actie van beloning, maar codeerden niet voor omgevingsstimuli, terwijl belonende stimuli en beloningsvoorspellende cues werden gecodeerd door een afzonderlijke populatie van LH-neuronen stroomafwaarts van de VTA. Bovendien hebben we een specifieke projectie geïdentificeerd die oorzakelijk verband houdt met dwangmatig sucrose-zoek- en voedingsgedrag. De heterogeniteit in de LH-VTA-projectie is noodzakelijk om een ​​adaptieve balans te bieden tussen motivatie voor het besturen en het reguleren van op de juiste wijze gericht appetijtgedrag. Deze bevindingen bieden inzichten die relevant zijn voor pathologische aandoeningen zoals dwangmatige overetenstoornissen, suikerverslaving en obesitas