Diabetologia. 2017; 60 (8): 1502-1511.
Gepubliceerd online 2017 mei 20. doi: 10.1007/s00125-017-4305-4
PMCID: PMC5491592
1Abstract
Doelstellingen / hypothese
Overeten van voedingsvetten veroorzaakt obesitas bij mensen en knaagdieren. Recente studies bij mensen en knaagdieren hebben aangetoond dat verslaving aan vetten een gemeenschappelijk mechanisme deelt met verslaving aan alcohol, nicotine en narcotica in termen van een disfunctie van hersenbeloningssystemen. Er is benadrukt dat een vetrijk dieet (HFD) dopamine D2-receptor (D2R) signalering in het striatum verzwakt, een centrale regulator van het beloningssysteem van de hersenen, resulterend in hedonische overeten. We hebben eerder gemeld dat het bruine rijst-specifieke bioactieve bestanddeel γ-oryzanol de voorkeur voor een HFD via hypothalamische controle verzwakte. We onderzochten daarom de mogelijkheid dat γ-oryzanol het functioneren van het hersenbeloningssysteem bij muizen zou moduleren.
Methoden
Mannelijke C57BL / 6J-muizen die een HFD kregen, werden oraal behandeld met y-oryzanol en striatale niveaus van moleculen die betrokken zijn bij D2R-signalering werden beoordeeld. De invloed van y-oryzanol op DNA-methylatie van de D2R-promoter en daaropvolgende veranderingen in voorkeuren voor vet in de voeding werd onderzocht. Bovendien werden de effecten van 5-aza-2'-deoxycytidine, een krachtige remmer van DNA-methyltransferasen (DNMT's), op voedselvoorkeur, D2R-signalering en de niveaus van DNMT's in het striatum onderzocht. De remmende effecten van y-oryzanol op de activiteit van DNMT's werden in vitro enzymatisch beoordeeld.
Resultaten
In striatum van muizen die een HFD kregen toegediend, was de productie van D2R's afgenomen via een toename in DNA-methylering van het promotergebied van de D2R. Orale toediening van y-oryzanol verminderde de expressie en activiteit van DNMT's, waardoor het niveau van D2R's in het striatum werd hersteld. Farmacologische remming van DNMT's door 5-aza-2'-deoxycytidine verbeterde ook de voorkeur voor vet uit de voeding. Consistent met deze bevindingen, toonden enzymatische in vitro assays aan dat y-oryzanol de activiteit van DNMT's remde.
Conclusies / interpretatie
We hebben aangetoond dat γ-oryzanol HFD-geïnduceerde DNA-hypermethylering van het promotergebied van D2R in het striatum van muizen verbetert. Ons experimenteel paradigma benadrukt γ-oryzanol als een veelbelovende stof tegen obesitas met de duidelijke eigenschap dat het een nieuwe epigenetische modulator is.
Elektronisch aanvullend materiaal
De online versie van dit artikel (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) bevat collegiaal getoetste maar onbewerkte aanvullende informatie die beschikbaar is voor geautoriseerde gebruikers.
Introductie
Teveel eten in obese individuen deelt, althans gedeeltelijk, gemeenschappelijke mechanismen met verslaving aan alcohol, nicotine en narcotica [1]. Evenals de hypothalamische en hormonale regulatie van de eetlust, is het beloningssysteem van de hersenen, in het bijzonder dopamine-receptorsignalering, nauw verwant aan verslavend of hedonisch voedingsgedrag [2]. Een eerdere studie bij ratten toonde aan dat knockdown van de striatale dopamine D2-receptor (D2R) door lentivirus-gemedieerde korte haarspeld storende RNA snel veroorzaakte verslaving-achtige beloningstekorten en dwangmatig voedsel zoeken [3]. Vanwege de verminderde D2R-dichtheid reageert het dorsale striatum minder op voedselbeloning vergeleken met magere controlegroepen bij mensen met obesitas en knaagdieren [3-5]. In overeenstemming met dit begrip, de TaqIA allel van de ANKK1 gen locus (coderend voor DRD2 / ankyrine herhaling en kinasedomein met 1), die de striatale D2R productie vermindert, is geassocieerd met een zwaarlijvig fenotype bij mensen [6], terwijl de effecten van gewichtsverlies na bariatrische chirurgie samenhangen met een verhoogde striatale D2R-dichtheid [7]. Deze gegevens suggereren sterk het belang van striatale D2R als een nieuw therapeutisch doelwit voor de behandeling van obesitas. Sommige medicijnen die werden ontwikkeld en die op het hersenbeloningssysteem reageerden, veroorzaakten echter aanzienlijke nadelige effecten, waaronder ernstige psychiatrische problemen, resulterend in hun uiteindelijke terugtrekking uit klinieken [8].
Epigenetische modificaties zijn niet alleen van cruciaal belang voor ontwikkeling en differentiatie, maar ook omdat ze ontstaan als gevolg van veranderingen in het milieu, inclusief in voeding en levensstijl [9]. DNA-methylatie is een belangrijkste epigenetische gebeurtenis voor de stabiliteit van genexpressie [9]. Bij ratten verandert maternale blootstelling aan een vetrijk dieet (HFD) intergenerationeel DNA-methylatie binnen het centrale beloningssysteem bij de nakomelingen, wat leidt tot overconsumptie van HFD door de pups [10]. In het bijzonder spelen DNA-methyltransferasen (DNMT's) een cruciale rol bij de regulatie van zowel het voedingsgedrag als de fysieke activiteit [10, 11], wat suggereert dat DNMT's veelbelovende therapeutische doelen zouden kunnen zijn voor de therapie van obesitas-diabetes syndroom. Belangrijk is dat sommige natuurlijke voedingsstoffen, waaronder cafeïnezuur en epigallocatechine, werken als DNMT-remmers [12, 13].
We hebben onlangs aangetoond dat de bioactieve, bruine rijst-specifieke component y-oryzanol, een mengsel van ferulazuurester en verschillende fytosterolen, de voorkeur voor voedingsvet vermindert door een afname van hypothalamische endoplasmatisch reticulum (ER) stress [14]. Bij muizen en konijnen werd oraal toegediend y-oryzanol snel uit de darm geabsorbeerd en voornamelijk naar de hersenen gedistribueerd [15, 16]. Als deze bevindingen samen worden genomen, kunnen natuurlijke voedselproducten op het centrale zenuwstelsel een alternatief zijn om ongezond voedingsgedrag bij obesitas veilig te verlichten. In deze context hebben we de hypothese getest dat γ-oryzanol de DNA-methyleringsstatus in het beloningssysteem van de hersenen zou veranderen, resulterend in een verzwakking van de voorkeur voor een HFD bij muizen.
Methoden
Dieren
Zeven weken oude mannelijke C57BL / 6J-muizen verkregen van Charles River Laboratories Japan (Kanagawa, Japan) werden gehuisvest (3-4 per kooi) in specifieke pathogeenvrije omstandigheden bij 24 ° C onder een 12 uur / 12 uur licht / donkere cyclus. Na een week acclimatiseren werden 8 weken oude muizen op gewicht afgestemd en verdeeld in twee of drie groepen om elk experiment te ondergaan. De muizen kregen vrije toegang tot voedsel en water. Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Animal Experiment Ethics Committee van de University of the Ryukyus (nrs. 5352, 5718 en 5943).
Toediening van γ-oryzanol en 5-aza-2'-deoxycytidine
Om de voorkeur voor de HFD te evalueren, werd γ-oryzanol (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan) toegediend aan 8-weken oude muizen door sondevoeding tijdens de voedselkeuzetest zoals eerder beschreven [14, 17]. Voor de andere experimenten werd een HFD (D12079B; Research Diets, New Brunswick, NJ, VS) met 0.4% y-oryzanol als pellets vervaardigd. De componenten van het dieet worden weergegeven in de tabel met elektronisch aanvullend materiaal (ESM) 1. Na 12 weken voeden werd weefsel verzameld uit het striatum en de hypothalamus. De dagelijkse inname van γ-oryzanol, geschat op basis van de gemiddelde voedselinname van de muizen, was ongeveer 320 μg / g lichaamsgewicht. De doses γ-oryzanol werden bepaald zoals eerder beschreven [14]. Het 5-aza-2'-deoxycytidine (5-aza-dC; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS) werd intraperitoneaal geïnjecteerd (0.25 μg / g lichaamsgewicht) driemaal per week gedurende 12 weken [18].
Schatting van de voorkeur voor vet uit de voeding
Om de voorkeuren voor vet in de voeding te evalueren, hebben voedselproeven de keuze geboden tussen chow en HFD (D12450B en D12451; Research Diets) zoals eerder beschreven [14]. De componenten van het dieet worden weergegeven in de ESM-tabel 1. In het kort kregen de muizen vrije toegang tot voer en HFD. De inname van voer en HFD werd wekelijks gemeten en geanalyseerd op veranderingen in de voorkeur voor voedingsvet. De HFD-voorkeur werd berekend volgens de formule: HFD-voorkeur = [(HFD-inname / totale voedselinname) × 100].
Bisulfietsequentiebepaling voor DNA-methylatie
DNA werd gezuiverd met behulp van een DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, Tokyo, Japan). De DNA-oplossing werd gemengd met vers bereide 3 mol / l NaOH, 37 min geïncubeerd bij 15 ° C en toegevoegd aan 5.3 mol / l ureum, 1.7 mol / l natriumbisulfiet en 4.9 mmol / l hydrochinon. De oplossing werd onderworpen aan 15 cycli van denaturatie bij 95 ° C gedurende 30 seconden en incubatie bij 50 ° C gedurende 15 minuten [19]. Het met bisulfiet behandelde DNA werd gezuiverd met behulp van MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN) en geamplificeerd met PCR met behulp van een KAPA HiFi HotStart Uracil + ReadyMix PCR Kit (KAPA Biosystems, Woburn, MA, VS) en primers rond de CpG-plaats van het promotergebied van D2R . De primersequenties waren als volgt: voorwaartse primer, 5'-GTAAGAATTGGTTGGTTGGAGTTAAAA-3 '; reverse primer, 5'-ACCCTACCCTCTAAAACCACAACTAC-3 '. Vervolgens werden de adaptersequenties toegevoegd en schoongemaakt met Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, CA, VS). Monsters werden vervolgens samengevoegd en op een GS Junior (Roche Diagnostics, Tokio, Japan) geladen voor sequentiebepaling volgens het protocol van de fabrikant. Het methyleringsniveau werd uitgedrukt als het percentage gemethyleerde cytosinen in alle cytosinenresiduen.
DNMT-activiteitsanalyse
De enzymatische activiteitstest van DNMT werd uitgevoerd met behulp van een EpiQuik DNA Methyltransferase Activity / Inhibitie Assay Kit (Epigentek Group, Brooklyn, NY, VS) en EPIgeneuze Methyltransferase Assay-kit (Cisbio Japan, Chiba, Japan) volgens de protocollen van de fabrikant.
Om de remmende activiteit van elke verbinding op DNA-methylatie te bepalen, is de vorming van S-adenosyl-l-homocysteïne (SAH) werd gemeten in aanwezigheid van elke verbinding (20 μmol / l voor screeningtests), S-adenosylmethionine (SAM; 10 μmol / l) en DNMT-substraat (4 ng / μl) bij 37 ° C gedurende 90 minuten. Om de Michaelis-Menten-kinetiek te evalueren, werd DNMT1 (20 μmol / l) gedurende 5 minuten bij 37 ° C geïncubeerd met γ-oryzanol, SAM (90 μmol / l) en de aangegeven concentratie poly dI-dC. DNMT3a (100 μmol / l) en DNMT3b (100 μmol / l) werden geïncubeerd met γ-oryzanol, SAM (5 μmol / l) en de aangegeven concentratie poly dG-dC bij 37 ° C gedurende 120 minuten. De assays werden in viervoud uitgevoerd. Geëxtraheerd eiwit (0.75 mg / ml) werd 5 minuten bij 5 ° C geïncubeerd met SAM (5 μmol / l), poly dI-dC (40 μg / ml) en poly dG · dC (120 μg / ml), en SAH-vorming werd gemeten.
Oestrogeen-gerelateerde receptor-y activiteitstest
De potentiële antagonistische activiteit van γ-oryzanol op de oestrogeengerelateerde receptor-γ (ERRγ) werd beoordeeld met behulp van het Human Estrogen-Related Receptor Gamma Reporter Assay System (INDIGO Bioscience, State College, PA, VS) volgens het protocol van de fabrikant. In het kort werden niet-menselijke zoogdierreportercellen die actief ERRy constitutief tot expressie brengen, 24 uur in triplo blootgesteld aan de aangegeven concentraties van elke verbinding.
Western blotting
Dit werd uitgevoerd zoals eerder beschreven [20] met antilichamen tegen D2R (1: 500, konijn), dopamine transporter (DAT; 1: 500, konijn), tyrosinehydroxylase (TH; 1: 1000, konijn) (AB5084P, AB1591P en AB152, Merck Millipore, Billerica, MA, VS), signaalomvormer en activator van transcriptie 3α (STAT3α; 1: 1000, konijn), DNMT1 (1: 1000, konijn), DNMT3a (1: 1000, konijn) (nrs. 8768, 5032 en 3598; Cell Signaling Technology, Tokyo, Japan), DNMT3b (1 μg / ml, konijn), ERRγ (1: 1000, konijn) en β-actine (1: 10,000, muis) (ab16049, ab128930 en ab6276; Abcam, Cambridge, MA, VS).
Kwantitatieve real-time PCR
Genexpressie werd onderzocht zoals eerder beschreven [14]. mRNA-niveaus werden genormaliseerd naar Rn18s (18S rRNA). De primerreeksen die worden gebruikt voor de kwantitatieve real-time PCR-analyses zijn samengevat in de ESM-tabel 2.
statistische analyse
Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. Eenrichtings-ANOVA en ANOVA met herhaalde metingen gevolgd door meerdere vergelijkingstests (Bonferroni-Dunn-methode) werden waar van toepassing gebruikt. Student's t test werd gebruikt om verschillen tussen twee groepen te analyseren. Verschillen werden als significant beschouwd op p <0.05.
Resultaten
Farmacologische remming van DNMT's door 5-aza-dC verzwakte de voorkeur voor voedingsvet in muizen
Bij muizen die de HFD kregen toegediend, was de DNA-methylatie in het promotergebied van D2R in het striatum significant verhoogd in vergelijking met muizen die een voer voor het voer kregen (fig. (Fig.1a) .1een). Aan de andere kant was hypothalamische DNA-methylatie in het promotergebied van D2R kennelijk hoger dan die in het striatum onder een dieet met voer (p <0.01) (Afb. (Fig.1a, 1a, f) en werd niet gewijzigd door de HFD (Afb. (Fig.1f) .1f). Bij muizen die de HFD kregen toegediend, werd de versterkte DNA-methylatie in het promotergebied van D2R in het striatum genormaliseerd door behandeling met 5-aza-dC, een krachtige DNMT-remmer (Fig. (Fig.1a) .1een). Daarentegen werd DNA-methylatie in het promotergebied van D2R in de hypothalamus niet significant veranderd door behandeling met 5-aza-dC (Fig. (Fig.1f) .1f). In het striatum van 20 weken oude mannelijke muizen die gedurende 12 weken de HFD kregen, waren de mRNA- en eiwitniveaus van D2R significant verlaagd (Fig. (Fig.1b, 1b, k, l). In tegenstelling hiermee zijn de niveaus van dopamine D1-receptoren (D1R's, gecodeerd door Drd1), die op een tegengestelde manier reageren op D2R's op adenylylcyclase en cAMP-gemedieerde intracellulaire signalering, waren onveranderd (Fig. (Fig.1c) .1c). Bovendien was er geen verandering in de niveaus van andere moleculen gerelateerd aan D2R-signalering, zoals TH en DAT op het mRNA en / of eiwitniveau (Fig. (Fig.1d, 1d, e, k, m). Aan de andere kant werden geen duidelijke veranderingen waargenomen in de hypothalamus, inclusief voor D2R (Fig. (Fig.1g-m) .1g-m). Opmerkelijk waren de eiwitgehalten van D2R en TH in hypothalamus veel lager dan die in het striatum (Fig. (Fig.1l, 1l, m), mogelijk reflecterend op het relatieve belang van dopamine-receptorsignalering in het beloningssysteem van de hersenen vergeleken met de hypothalamus.
Om te onderzoeken of DNA-methylatie in het promotergebied van D2R de voorkeur voor voedingsvet zou veranderen, werd het voedingsgedrag van met 5-aza-dC behandelde muizen geanalyseerd. Zoals verwacht verhoogde 5-aza-dC mRNA- en eiwitniveaus significant voor D2R in het striatum van HFD-gevoede muizen (Fig. (Fig.1b, 1b, k, l). Aan de andere kant was er geen effect op de niveaus van Drd1, Th en Slc6a3 (coderen DAT) in het striatum, of op niveaus van Drd2, Drd1, Th en Slc6a3 in de hypothalamus (Fig. (Fig.1c-e, 1c-e, g-m). Terwijl met drager behandelde muizen de voorkeur gaven aan de HFD, was de voorkeur voor de HFD significant verminderd bij met 5-aza-dC behandelde muizen (88% van de waarden voor met drager behandelde muizen) (Fig. (Fig.1n) .1n). Dientengevolge verminderde behandeling met 5-aza-dC de toename in lichaamsgewicht (Fig. (Fig.11o).
γ-oryzanol verlaagt niveaus van DNMT's in striatum van HFD-gevoede muizen
Zoals we eerder meldden [14], orale toediening van y-oryzanol aan mannelijke muizen door sondevoeding verzwakte significant de voorkeur voor een HFD (93% van de waarden voor met drager behandelde muizen) (Fig. (Fig.2a), 2a), wat resulteert in een duidelijke verzwakking van de toename van het lichaamsgewicht (Fig. (Fig.2b) .2b). We onderzochten daarom de potentiële impact van γ-oryzanol op epigenetische modulatie van D2R's in het striatum.
Bij zoogdieren zijn er drie belangrijke DNMT's - DNMT1, 3a en 3b. DNMT1 functioneert om DNA-methylatie te handhaven, terwijl DNMT3a en 3b een rol spelen bij het faciliteren van de novo DNA-methylatie [21]. Om de mogelijke impact van γ-oryzanol op DNMT's in vivo te onderzoeken, evalueerden we niveaus van DNMT's in de hersenen van HFD-gevoede muizen. Hoewel de HFD op zich geen effect had op mRNA- en eiwitniveaus van DNMT's in zowel het striatum als de hypothalamus, nam suppletie met γ-oryzanol significant de DNMT's in het striatum maar niet in de hypothalamus (Fig. (Fig.2c-e, 2c-e, g-i, k-n). Deze gegevens verhogen de mogelijkheid dat γ-oryzanol niveaus van DNMT's op een striatum-specifieke manier zou kunnen reguleren. Op vergelijkbare wijze verlaagde 5-aza-dC de mRNA-niveaus van DNMT3a en 3b bij voorkeur in het striatum significant (ESM Fig. 1advertentie).
Op basis van een eerdere studie die aantoonde dat het mRNA-niveau van DNMT1 positief werd gereguleerd, tenminste gedeeltelijk, door de nucleaire receptor ERRγ [22], hebben we het mogelijke effect van γ-oryzanol op ERRγ-activiteit onderzocht. In niet-menselijke zoogdiercellen die constitutief actieve ERRy tot expressie brengen, 4-hydroxytamoxifen, een krachtige inverse agonist van ERRy, nam de ERRy-activiteit duidelijk af. Merk op dat γ-oryzanol de ERRγ-activiteit gedeeltelijk verminderde (een ongeveer 40% vermindering van de aangeboren waarde) (Fig. (Fig.3a) .3een). Belangrijk is dat ERRγ in hoge mate tot expressie werd gebracht in het striatum maar niet in de hypothalamus (Fig. (Fig.3b-d) .3b-d). In tegenstelling tot de situatie voor het striatum, verhoogde γ-oryzanol de eiwitniveaus van DNMT1 alleen significant in de hypothalamus (Fig. (Fig.2k, 2k, l). Deze resultaten kunnen, althans gedeeltelijk, worden verklaard door onze bevinding dat STAT3α, een positieve regulator van DNMT1-niveau [23], werd overvloedig tot expressie gebracht in de hypothalamus maar niet in het striatum (Fig. (Fig.33e-g).
Om de impact van γ-oryzanol op de activiteit van DNMT's in vivo verder te beoordelen, werd de vorming van SAH, een bijproduct van DNA-methylatie en ook een krachtige remmer van DNMT's, geëvalueerd in met y-oryzanol behandelde muizen die met de HFD werden gevoed. Er waren geen significante veranderingen in de SAH-vorming in het striatum of de hypothalamus tussen HFD-gevoede en chow-fed muizen (Fig. (Fig.2f, 2f, j). Opmerkelijk was dat γ-oryzanol de SAH-vorming in het striatum significant verminderde (afb. (Fig.2f) 2f) maar niet in de hypothalamus (Fig. (Fig.2j), 2j), wat suggereert dat γ-oryzanol de activiteit van DNMT's op een striatum-specifieke manier in HFD-gevoede muizen kan onderdrukken.
Enzymatische analyses op remmende eigenschappen van γ-oryzanol voor DNMT's in vitro
Vervolgens hebben we de impact van γ-oryzanol op de activiteit van DNMT's in vitro beoordeeld. De remmende potenties van y-oryzanol, ferulinezuur, 5-aza-dC, haloperidol (een representatieve D2R-antagonist), quinpirol (een representatieve D2R-agonist) en SAH tegen DNMT's werden beoordeeld. Als positieve controle verzwakte SAH de activiteiten van DNMT's sterk op een dosisafhankelijke manier (Fig. (Fig.4a-f) .4a-f). Zoals verwacht vertoonden haloperidol en quinpirol geen effect op de activiteiten van DNMT's (ESM Fig. 2). Opmerkelijk was dat γ-oryzanol de activiteiten van DNMT1 (IC50 = 3.2 μmol / l), 3a (IC50 = 22.3 μmol / l) en 3b (maximale remming 57%) (Fig. (Fig.4d-f) .4d-f). Daarentegen was de remmende activiteit van ferulinezuur, een metaboliet van y-oryzanol, veel lager dan die van y-oryzanol (Fig. (Fig.44d-f).
We hebben de remmende eigenschappen van γ-oryzanol op DNMT's verder onderzocht. De vorming van SAH werd gemeten om de remmende activiteit van y-oryzanol op DNMT's in vitro te bepalen. Gegevens over SAH-vorming tijdens DNMT-gemedieerde DNA-methylatie duiden op een verzadigbaar patroon van Michaelis-Menten-kinetica voor zowel de aanwezigheid als de afwezigheid van y-oryzanol (Fig. (Fig.4g-i) .4g-i). Bij DNMT1-gemedieerde DNA-methylatie toonde Eadie-Hofstee-analyse aan dat γ-oryzanol geen effect had op de V max van SAH-vorming (vehiculum, 597 pmol / min; γ-oryzanol 2 μmol / l, 619 pmol / min; γ-oryzanol 20 μmol / l, 608 pmol / min), terwijl γ-oryzanol blijkbaar de K m (drager, 0.47 μg / ml; γ-oryzanol 2 μmol / l, 0.67 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.89 μg / ml) (Fig. (Fig.4j) .4j). Deze resultaten suggereren dat γ-oryzanol DNMT1 op zijn minst gedeeltelijk op een competitieve manier remt. Aan de andere kant, voor DNMT3a- en 3b-gemedieerde DNA-methylatie, verlaagde γ-oryzanol de V max van vorming van SAH (DNMT3a: drager, 85.3 pmol / min; γ-oryzanol 2 μmol / l, 63.1 pmol / min; γ-oryzanol 20 μmol / l, 42.5 pmol / min; DNMT3b: vehikel, 42.3 pmol / min; γ -oryzanol 2 μmol / l; 28.0 pmol / min, γ-oryzanol 20 μmol / l, 15.0 pmol / min) en evenzo de K m voor deze reactie (DNMT3a: vehikel, 0.0086 μg / ml; γ-oryzanol 2 μmol / l, 0.0080 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.0058 μg / ml; DNMT3b: vehikel, 0.0122 μg / ml; γ- oryzanol 2 μmol / l, 0.0097 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.0060 μg / ml) (Fig. (Fig.4k, 4k, l). Deze resultaten suggereren dat γ-oryzanol DNMT3a en 3b op zijn minst gedeeltelijk op een niet-competitieve manier remt.
γ-oryzanol verhoogt de niveaus van D2R in striatum van HFD-gevoede muizen
We testten vervolgens de mogelijkheid dat γ-oryzanol het striatale D2R-gehalte zou verhogen door een remming van DNMT's. In HFD-gevoede muizen verminderde orale toediening van y-oryzanol significant de striatale DNA-methylatie in het promotergebied van de D2R's (Fig. (Fig.5a), 5a), terwijl dit dit niet deed in de hypothalamus (Fig. (Fig.5f) .5f). In overeenstemming met deze bevindingen werden mRNA- en eiwitniveaus van D2R wederzijds verhoogd (Fig. (Fig.5b, 5b, g, k, l). Vergelijkbaar met de gegevens over de behandeling met 5-aza-dC (Fig. (Fig.1), 1), waren er geen duidelijke effecten op de RNA- en eiwitgehalten van Drd1, Th en Slc6a3 (DAT) in het striatum en geen effecten op niveaus van Drd1, Th en Slc6a3 in de hypothalamus (Fig. (Fig.5c-e, 5c-e, h-k, m).
Eerdere studies hebben aangetoond dat niveaus van D2R en DNMT1 worden gereguleerd door ER-stress en -ontsteking, tenminste gedeeltelijk via NF-KB [17, 24, 25]. We onderzochten daarom de niveaus van ER-stressgerelateerde en aan ontsteking gerelateerde genen. Zoals eerder aangetoond [26], verhoogde de HFD de expressie van de genen die coderen voor TNF-α (TNFa), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) (Ccl2), Homoloog C / EBP-eiwit (Chop), ER-gelokaliseerde DnaJ 4 (ERdj4) (Dnajb9) en de gesplitste vorm van X-box-bindend eiwit 1 (Xbp1s) in de hypothalamus maar niet in het striatum (fig. (Fig.6) .6). Met name de suppletie van de HFD met γ-oryzanol verminderde de verhoogde expressie van Ccl2, Chop, Dnajb9 en Xbp1s uitsluitend in de hypothalamus maar niet in het striatum (fig. (Fig.66).
Discussie
De belangrijkste bevinding in de onderhavige studie is dat y-oryzanol werkt als een krachtige DNMT-remmer in het striatum van muizen, waardoor ten minste gedeeltelijk de voorkeur voor een HFD via de epigenetische modulatie van striatale D2R wordt verzwakt. In striatum van HFD-gevoede muizen waren de niveaus van D2R significant verlaagd, terwijl die van D1R, TH en DAT niet waren veranderd (Fig. (Fig.1b-e, 1b-e, k-m). Deze gegevens komen overeen met het idee dat ontregeling van striatale D2R een cruciale rol speelt in de perceptie van voedselbeloning op een HFD, leidend tot hedonistische overconsumptie van HFD bij zwaarlijvige dieren [3]. In de huidige studie verhoogde de behandeling van HFD-gevoede muizen met 5-aza-dC significant de niveaus van striatale D2R (Fig. (Fig.1b, 1b, k, l) mogelijk door een verlaging van het DNA-methyleringsniveau in het promotergebied van D2R (Fig. (Fig.1a), 1a), en dienovereenkomstig verzwakt de voorkeur voor dieetvet (fig. (Fig.1n) .1n). Deze bevinding ondersteunt ook een cruciale rol van striatale D2R's in de beleving van voedselbeloningen op een HFD.
Onze in vitro assay toonde aan dat de remmende activiteit van y-oryzanol tegen DNMT's blijkbaar sterker was dan die van zijn metabolietferulinezuur (Fig. (Fig.4d-f), 4d-f), wat het belang suggereert van de volledige structuur van y-oryzanol voor zijn remmende werking op DNMT's. In HFD-gevoede muizen suggereren onze studies dat, na orale toediening, y-oryzanol de hersenen bereikt als een complete structuur en de niveaus en activiteiten van DNMT's bij voorkeur in het striatum verlaagt, met als gevolg een afname in DNA-methylatie in het promotergebied van D2R in het striatum. Bovendien hebben onze in vitro studies aangetoond dat γ-oryzanol werkt als een gedeeltelijke antagonist tegen ERRγ, die vooral dient als een positieve regulator voor de productie van DNMT1 [22], en bijgevolg de activiteit van DNMT1 (Afb. (Fig.3a) .3een). Van de opmerking was ERRγ in hoge mate tot expressie gebracht in het striatum maar niet in de hypothalamus bij muizen (Fig. (Fig.3b) .3b). Deze gegevens suggereren dat γ-oryzanol het potentieel heeft om het mRNA-niveau van DNMT1 te verlagen, tenminste gedeeltelijk, door de remming van ERRγ. In tegenstelling tot striatum vertoonde γ-oryzanol geen effect op het niveau van D2R in hypothalamus van HFD-gevoede muizen (Fig. (Fig.5g, 5g, k, l).
Aan de andere kant hebben we aangetoond dat γ-oryzanol de niveaus van DNMT1 significant verhoogde in de hypothalamus maar niet in het striatum (Fig. (Fig.2k, 2k, l). Het is aangetoond dat STAT3 de inhoud van DNMT1 in kwaadaardige T-lymfoomcellen [verhoogt23]. Met name hebben we eerder aangetoond dat γ-oryzanol de door leptine veroorzaakte STAT3-fosforylering in hypothalamus significant verhoogde van HFD-gevoede muizen [14]. Er moet ook worden opgemerkt dat STAT3α in hoofdzaak tot expressie werd gebracht in de hypothalamus maar niet in het striatum in de muizen (Fig. (Fig.3e-g) .3e-g). Deze gegevens verleiden ons om te speculeren dat het schijnbare verschil in effect van γ-oryzanol op DNMT1-niveaus tussen de hypothalamus en het striatum op zijn minst gedeeltelijk kan worden toegeschreven aan de regiospecifieke inhoud van STAT3α en ERRγ in de hersenen van muizen ( Fig. (Fig.3b-g) .3b-g). Gezamenlijk lijkt er een reciproke patroon van expressie van ERRγ en STAT3α tussen het striatum en de hypothalamus bij muizen. Op basis van onze resultaten is het daarom redelijk om te speculeren dat in striatum, waar ERRγ-productie overvloedig is, y-oryzanol bij voorkeur het mRNA-niveau en de enzymactiviteit van DNMT1 als een negatieve regulator van ERRγ kan verlagen. Daarentegen, in de hypothalamus, waar de productie van STAT3α dominant is, kan y-oryzanol bij voorkeur de DNMT1-waarden verhogen.
Een recente studie toonde aan dat een verzwakking van striatale D2R-signalering geïnduceerd door een HFD het voedingsgedrag schaadt [3], wat duidt op het potentiële belang van de remming van striatale DNMT's voor de behandeling van obesitas. Aan de andere kant toonde een eerdere studie de mogelijkheid dat de status van DNA-methylatie van het melanocortine receptor 4-gen dat tot expressie wordt gebracht in specifieke hypothalamische kernen, transgenerationele vormen van obesitas in agouti-levensvatbare gele muizen kan moduleren [27]. Hoewel verdere studies gerechtvaardigd zijn om de onderliggende mechanismen op te helderen, suggereren deze studies het belang van weefsel-, gen- en sequentiespecifieke DNA-methylatie in de pathofysiologie van door HFD geïnduceerde obesitas.
We hebben onlangs gemeld dat HFD het niveau van D2R in de pancreatische eilandjes van muizen [17, 24]. Het is waarschijnlijk dat een dergelijke vergroting wordt gemedieerd, tenminste gedeeltelijk, door ER-stress en ontsteking via NF-KB, omdat er verschillende NF-KB-responsieve elementen in het promotergebied van D2R [17, 24]. Bovendien heeft een recente studie aangetoond dat TNF-α en IL-1β het niveau en de activiteit van DNMT1 in vetweefsel van HFD-gevoede muizen [25]. Belangrijk is dat de huidige studie aantoonde dat HFD ER-stress en -ontsteking bij voorkeur in de hypothalamus induceerde maar niet in het striatum (Fig. (Fig.6) .6). Diepgaande mechanismen van weefsel-, regio- en locatiespecifieke DNA-methylatie en -demethylatie in ons experimentele paradigma moeten wachten op verder onderzoek.
Samen met ons vorige rapport dat aantoont dat γ-oryzanol de voorkeur voor een HFD verzwakt via hypothalamische regulatie van ER-stress bij muizen [14], vertegenwoordigt γ-oryzanol ook een unieke eigenschap van het verbeteren van zowel hedonische als metabolische ontregeling van het voedingsgedrag. Omdat sommige anti-obesitasgeneesmiddelen waarvan bekend is dat ze kritische nadelige effecten veroorzaken [8], wordt verwacht dat een natuurlijke, op voedsel gebaseerde aanpak van het beloningssysteem voor de hersenen obesitas-diabetes-syndroom veilig zal behandelen [16]. In dit paradigma is γ-oryzanol een veelbelovende kandidaat tegen obesitas met een duidelijke eigenschap dat het een epigenetische modulator is.
Danksagung
We zijn S. Okamoto (Universiteit van Ryukyus, Japan) dankbaar voor het beoordelen van het manuscript. Wij danken M. Hirata, H. Kaneshiro, I. Asato en C. Noguchi (Universiteit van Ryukyus, Japan) voor secretariaatsassistentie.
Afkortingen
| 5-aza-dC | 5-aza-2'-deoxycytidine |
| D1R | Dopamine D1-receptor |
| D2R | Dopamine D2-receptor |
| DAT | Dopamine transporter |
| DNMT | DNA-methyltransferase |
| ER | Endoplasmatisch reticulum |
| ERR | Oestrogeen-gerelateerde receptor |
| HFD | Hoog-vetgehalte dieet |
| SAH | S-Adenosyl-l-homocysteine |
| SAM | S-Adenosyl methionine |
| STAT3α | Signaaltransducer en activator van transcriptie 3α |
| TH | Tyrosine hydroxylase |
Opmerkingen
Beschikbaarheid van data
Gegevenssets die tijdens het huidige onderzoek zijn gegenereerd en / of geanalyseerd, zijn op redelijke verzoeken verkrijgbaar bij de betreffende auteur.
Financiering
Dit werk werd deels ondersteund door Grants-in-Aid van de Japan Society for the Promotion of Science (JSPS, KAKENHI Grant Numbers 15K19520 en 24591338), de Council for Science, Technology and Innovation (CSTI), het Cross-ministerial Strategic Innovation Promotion Program (SIP) 'Technologieën voor het creëren van de volgende generatie landbouw, bosbouw en visserij', de Lotte Foundation, de Japan Foundation for Applied Enzymology, New Energy and Industrial Technology Development Organization (NEDO), het project voor de vorming van een life science-netwerk (farmaceutisch veld) ) (Okinawa Prefecture, Japan) en het promotieproject voor medische clustering van de prefectuur Okinawa, Japan, samen met een subsidie van de prefectuur Okinawa voor de promotie van geavanceerde medicijnen (Okinawa Prefecture, Japan).
Dualiteit van belang
De auteurs verklaren dat er geen dualiteit van interesse is verbonden aan dit manuscript.
Bijdrage verklaring
CK en HM hebben het onderzoek ontworpen. CK en TK hebben de experimenten uitgevoerd en de gegevens geanalyseerd. TK, CS-O, CT, MT, MM en KA droegen bij aan de interpretatie van gegevens. CK en HM hebben het manuscript geschreven. Alle auteurs hebben bijgedragen aan de interpretatie van gegevens. Alle auteurs deden mee aan de herziening van het manuscript en keurden de definitieve versie goed. HM is de garant van dit werk, had volledige toegang tot alle gegevens en neemt de volledige verantwoordelijkheid voor de integriteit van gegevens en de nauwkeurigheid van gegevensanalyse.
voetnoten
Elektronisch aanvullend materiaal
De online versie van dit artikel (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) bevat collegiaal getoetste maar onbewerkte aanvullende informatie die beschikbaar is voor geautoriseerde gebruikers.
Referenties
;
