Insuline activeert insulinereceptoren (InsR's) in de hypothalamus om verzadiging na een maaltijd aan te geven. De stijgende incidentie van obesitas, die resulteert in chronisch verhoogde insulineniveaus, houdt echter in dat insuline ook kan werken in hersencentra die de motivatie en beloning reguleren. We rapporteren hier dat insuline actie-potentiaalafhankelijke dopamine (DA) -afgifte in de nucleus accumbens (NAc) en caudate-putamen kan versterken via een indirect mechanisme dat striatale cholinerge interneuronen omvat die InsR's tot expressie brengen. Bovendien veranderen twee verschillende chronische dieetmanipulaties bij ratten, voedselrestrictie (FR) en een obesogeen (OB) dieet, tegenovergesteld de gevoeligheid van striatale DA-afgifte voor insuline, met een verbeterde responsiviteit in FR, maar verlies van responsiviteit in OB. Gedragsstudies tonen aan dat intacte insulineniveaus in de NAc-schaal noodzakelijk zijn voor het verkrijgen van voorkeur voor de smaak van een gepaarde glucose-oplossing. Samen impliceren deze gegevens dat striatale insulinesignalering DA-afgifte verbetert om voedselkeuzes te beïnvloeden.

Het is goed vastgesteld dat een aanhoudende toename van plasma-insuline tijdens en na een maaltijd insuline-receptoren (InsR's) in de hypothalamus activeert, die negatieve feedback geven aan appetitieve circuits die verder eten verminderen^{1, 2, 3}. Herseninsuline is voornamelijk afkomstig van pancreatische β-cellen, met actief transport van plasma naar hersenen aan de bloed-hersenbarrière^{4, 5, 6, 7, 8}, hoewel er ook steeds meer aanwijzingen zijn voor neuronale insulinesynthese en -afgifte^{1, 9}. Met name de expressie van InsR's is niet beperkt tot de hypothalamus, hoewel de functie van extra-hypothalamische InsR's nog steeds niet is opgelost^{1, 2, 3}. Gezien de stijgende incidentie van obesitas en diabetes type II, waarbij de circulerende insulinespiegels voortdurend verhoogd zijn en het herseninsulinetransport en de gevoeligheid van de receptor zijn afgenomen^{3, 8, 10, 11}, het is van cruciaal belang om de functie van insuline in hersenregio's te begrijpen die de motivatie en beloning regelen. Hersengebieden van bijzonder belang omvatten de nucleus accumbens (NAc), die de belonende effecten van zowel voedsel als geneesmiddelen medieert^{12, 13}en het caudate-putamen (CPu), dat een rol speelt in op gewoonten gebaseerd gedrag en verlangen¹³. InsR's worden uitgedrukt in deze regio's, waarbij de hoogste dichtheid voorkomt in het NAc^{3, 14}; InsR's worden ook uitgedrukt door dopamine (DA) neuronen in de middenhersenen, inclusief die in het ventrale tegmentale gebied (VTA) en substantia nigra pars compacta (SNc)¹⁵. Hersenniveaus voor insuline zijn evenredig met de plasmaconcentraties van insuline en de adipositas van het lichaam^{6, 7, 8}, leidend tot de hypothese dat insuline op InsRs in deze hersengebieden zou kunnen werken om voedselbeloning te beïnvloeden^{3, 16, 17}.

Eerdere studies in striatale synaptosomen, heterologe cellen, hersenplakken en in vivo hebben aangetoond dat insuline-activering van InsRs leidt tot een verhoging van de DA-opname door de DA-transporter (DAT)^{18, 19, 20, 21, 22, 23}. Dit proces omvat de PI3-kinase-signaleringsroute^{19, 20}en resulteert in DAT-insertie in de plasmamembraan¹⁹. Circulerende insulinespiegels moduleren dynamisch de striatale DAT-activiteit, met verminderde DA-opname en DAT-oppervlakte-expressie waargenomen in diermodellen van diabetes en na voedselbeperking (FR)^{20, 21}. Er is aangetoond dat insuline-afhankelijke toenames in DAT-activiteit de opgeroepen extracellulaire DA-concentratie verlagen ([DA])_o) in de VTA²³, als gevolg van een verschuiving in de balans tussen DA-vrijgave en -opname. In overeenstemming met de gevestigde rol van insuline in verzadiging, kan acute micro-injectie van insuline in de VTA voedselbeloning verminderen^{23, 24}, terwijl muizen die InsR's missen in VTA en SNc DA neuronen een verhoogde voedselinname vertonen en zwaarlijvig worden²⁵. Hoewel insuline langdurige depressie van prikkelende input voor VTA DA-neuronen kan induceren²⁴, opnieuw consistent met een rol in verzadiging, kan blootstelling aan insuline ook de DA-neuronvliegsnelheid verhogen, mogelijk door afname van DA-afgifte en door autoreceptor gemedieerde remming²⁵. Het netto-effect van insuline op de striatale DA-afgifte is daarom moeilijk te voorspellen. Inderdaad, de resultaten van studies naar de invloed van insuline op striatale DA-afgifte in ex vivo plakjes¹⁹ en het effect van lokale micro-injectie van insuline in het NAc op voedselbeloning²⁶ lijken tegenstrijdig. Om dit op te lossen, evalueerden we de axonale DA-afgifte en -opname in de intacte micro-omgeving van de NAc en CPu in ex vivo striatale plakjes met behulp van fast-scan cyclische voltammetrie (FCV) en de effecten van insuline-signalering in het NAc op beloningsgedrag bepaald in vivo.

Onze studies tonen aan dat het primaire effect van insuline in NAc en CPu is om DA-afgifte te verbeteren, ondanks een gelijktijdige toename in DA-opname. Deze dynamische regulatie van DA-afgifte omvat een insulineafhankelijke toename van de exciteerbaarheid van striatale cholinerge interneuronen (ChI's), wat leidt tot verhoogde DA-afgifte via activering van nicotine-acetylcholine (ACh) -receptoren (nAChR's). De invloed van insuline op ChI's en op DA-afgifte wordt gemedieerd door InsR's. Met name het effect van insuline op DA-afgifte wordt versterkt in plakjes van FR-ratten, maar stomp gemaakt bij ratten op een obesogeen (OB) dieet. Deze gegevens tonen versterking van DA-afgifte in ex vivo plakjes door insuline leiden tot de voorspelling dat insuline zou kunnen werken als een beloningssignaal in vivo. Inderdaad vertonen parallelle gedragsstudies een rol voor insuline in de NAc-schaal bij conditionering van smaakvoorkeur. Samen geven deze bevindingen een nieuwe rol aan voor insuline als beloningssignaal dat de voedselkeuze kan beïnvloeden

Insuline die op InsRs werkt, verhoogt de opgewekte striatale DA-afgifte

Eerste onderzoek van lokaal opgeroepen [DA]_o gecontroleerd met FCV in ex vivo striatale plakjes van ratten met ad libitum (AL) toegang tot voedsel en water onthulde de onverwachte bevinding dat acute toediening van insuline over een reeks fysiologisch relevante concentraties^{1, 4} verhoogde single-pulse-evoked [DA]_o (Fig. 1a-c), met insuline-EC₅₀ waarden (de concentratie waarbij het effect half maximaal was) van 2-12 nM (Fig. 1b). Verhoogd opgeroepen [DA]_o was bijzonder verrassend, aangezien dit gepaard ging met een aanzienlijke toename van de maximale snelheid (V_max) voor DAT-gemedieerde opname in elke subregio (Tabel 1), wat zou leiden tot een concurrerende afname van de opgeroepen [DA]_o, zoals eerder gemeld^{22, 23}. In plaats daarvan hebben we dat gevonden [DA] gevonden_o was maximaal geamplificeerd 20-55% door 30 nM insuline; de regio met het grootste proportionele effect was de NAc-schaal, de striatale subregio met de hoogste InsR-expressie^{1, 14}. Plakjes blootgesteld aan 30 nM-insuline onder identieke omstandigheden vertoonden geen verandering in het striatale DA-gehalte (Aanvullende afbeelding 1a), wat impliceert dat insuline de regulatie van dynamische afgifte verandert, in plaats van alleen DA-synthese op te waarderen. Met name het effect van insuline op evoked [DA]_o was verloren bij suprafysiologische concentraties ≥100 nM (Fig. 1b). Dit was niet het gevolg van toegenomen DAT-activiteit die de release inhaalt, omdat het effect van insuline aan is V_max was ook verloren bij deze concentraties (Tabel 1). Over het algemeen laten deze gegevens zien dat in de intacte striatale micro-omgeving het overheersende effect van insuline op evoked [DA]_o is om de afgifte te verhogen, ondanks een gelijktijdige toename van de DA-opname.

  

  

(a) Gemiddelde single-pulse-evoked [DA]_o in NAc-schaal, NAc-kern en CPu voor en na insuline (Ins) geïllustreerd voor 30 nM; foutbalken zijn weggelaten, maar zie (b); pijlen geven de tijd van stimulus aan. Verhoogde insuline verhoogd [DA]_o in de schaal (met 55 ± 10%), kern (met 37 ± 5%) en CPu (met 20 ± 4%) (***P<0.001). (b) Het effect van insuline was concentratieafhankelijk in een fysiologisch bereik (1-30 nM) in de schaal (n=-22 24, F_5,133= 14.471, P<0.001), kern (n=-36 76, F_5,308= 16.318, P<0.001) en CPu (n=-30 62, F_5,253= 13.763, P<0.001), maar verloren bij ≥ 100 nM. (c) Representatieve opnamen van peak-evoked [DA]_o tegen de tijd op een enkele plaats in de NAc-kern in afwezigheid van geneesmiddeltoepassing (Con), tijdens toediening van insuline (30 nM) of wanneer insuline werd aangebracht in de aanwezigheid van een InsR-remmer HNMPA (5 μM). (d) Gemiddeld piekgerelateerd [DA]_o gegevens over preventie van het effect van insuline (30 nM) door HNMPA, InsR-antagonist S961 (1 μM) en PI3K-remmer LY294002 (1 μM), maar niet door IGF-1R-remmer PPP (1 μM) (n=-29 76; P> 0.9 versus insuline alleen). Voor Fig. 1a-d, n= aantal sites per subregio van 3-6 ratten voor elk medicijn of elke insulineconcentratie; one-way ANOVA, Tukey honest significance test (HSD). Zien Aanvullende afbeelding 1b, c voor NAc shell- en CPu-gegevens.

• Afbeelding op volledige grootte (98 KB)

 

 

Omdat insuline ook kan werken op insuline-achtige groeifactor 1-receptoren (IGF-1R's), maar dan bij concentraties van meer dan 100 nM (ref. 1), hebben we geprobeerd te bevestigen dat het versterkende effect van insuline bij evoke [DA]_o was InsR-afhankelijk. Dit bleek het geval te zijn, omdat het effect werd voorkomen door een intracellulaire InsR-remmer, hydroxy-2-naftalenylmethylfosfonzuur (HNMPA) en door een InsR-antagonist, S961, maar niet door een selectieve remmer van IGF-1R's, picropodophyllin²⁴ (PPP; Fig. 1c, d en Aanvullende afbeelding 1b, c). We onderzochten vervolgens de betrokkenheid van PI3-kinase, dat de signaalroute initieert die verantwoordelijk is voor insulineafhankelijke regulatie van de DAT¹⁹. Bij een concentratie van 1 μM had de P13K-remmer LY249002 alleen geen effect op piekgerelateerde [DA]_o or V_max (n= 29-76-sites (NAc-core) per geneesmiddel, P> 0.05, eenzijdige variantieanalyse (ANOVA); gegevens niet getoond), maar het effect van insuline op evoked [DA]_o in alle striatale subregio's (Fig. 1d en Aanvullende afbeelding 1b, c).

Lokalisatie van InsR's op DA-axons en ChI's

De waargenomen toename in V_max voor DA-opname met fysiologische niveaus van insuline impliceert de aanwezigheid van InsR's op DA-axons, evenals eerdere resultaten in verschillende striatale preparaten^{18, 19, 20, 21, 22}. Hoewel functionele expressie van InsR's op DA-neuronen van de middenhersenen is aangetoond^{15, 23, 24, 25}, InsR-expressie op striatale DA-axonen is niet gerapporteerd. We hebben dit aangepakt met behulp van immunohistochemie. Dense InsR-immunoreactiviteit in de hele striatum beperkte kwantitatieve beoordeling van InsR-lokalisatie op DA-axons, die werden geïdentificeerd door immunoreactiviteit voor een DA-synthetiserend enzym, tyrosinehydroxylase (TH). Daarom hebben we een eerder gemeld protocol aangenomen²⁷, waarbij het ging om het tellen van InsR-puncta die overlappen met TH + -profielen in de normale beeldweergave en weer meet nadat de InsR-afbeelding alleen werd geroteerd door 90 °. Als de schijnbare overlapping van InsR- en TH + -profielen niet-specifiek was, zou deze procedure statistisch vergelijkbare tellingen moeten geven, ongeacht of normaal of 90 ° uit fase is. Deze analyse toonde echter een afname van de overlapping van InsR-puncta met TH + -profielen van 14 ± 9% (n= 42-velden, P<0.01, tweezijdig paar t-test; gegevens niet getoond), die InsR-aanwezigheid op DA-axons bevestigen. Interessant genoeg onthulde InsR-immunolabeling van het striatum echter verschillende InsR-expressie op grote cellichamen die werden geïdentificeerd als striatale ChI's door co-immunolabelling voor choline-acetyltransferase (ChAT), het primaire enzym dat nodig is voor ACh-synthese. Gebruikmakend van elektrofysiologische criteria²⁸ om ChI's te identificeren in voorlopige whole-cell-recording studies, werden verschillende neuronen gevuld met biocytine en vervolgens verwerkt voor immunohistochemie; al deze (4 / 4) waren immunopositief voor zowel InsR als ChAT (Fig. 2a). Daaropvolgende evaluatie van InsR en ChAT co-lokalisatie in het NAc bevestigde dat vrijwel alle ChAT + neuronen InsR tot expressie brachten (96%; n= 27 / 28-neuronen in vier secties van twee ratten).

  

  

(a) ChI gevuld met biocytine, daarna immunologisch gekenmerkt voor ChAT en InsR (vertegenwoordiger van 4 / 4 biocytine gevulde ChI's); Samengevoegde afbeelding toont co-lokalisatie; schaalbalk, 10 μm. (b-e) Reactie van striatale ChI's op een reeks van depolariserende stroompulsen (3-s duur; 200, 300 en 400 pA; 120-s intervallen) voor en na insuline (30 nM). (b) Spike-frequentieaanpassing in een ChI (bovenste) wordt gezien bij verlies van actiepotentiaal (AP) ontlading tijdens stroominjectie, terwijl spiking aanhoudt gedurende de huidige puls in insuline (lager); complete dataset getoond in d. (c) Representatief tijdsverloop van de door insuline geïnduceerde toename van het AP-aantal met elke huidige stap voor de ChI in b. (d) Samenvatting van het AP-nummer tijdens de huidige pulsen die vóór en bij het piekeffect van de insulineblootstelling zijn afgegeven (n= 21 gepaarde stimulaties, 7-neuronen, 5-ratten) (e) Gemiddelde responsen die het effect van insuline (+ Ins) onder controle-omstandigheden tonen (Con; n= 21 gepaarde stimulaties, 7 neuronen, ***P<0.001, tweezijdig paar t-test), in aanwezigheid van HNMPA (5 μM) (n= 12 gepaarde stimulaties, 4-neuronen, 4-ratten, P>0.05, twee-staand gekoppeld t-test) en in de aanwezigheid van PPP (1 μM) (n= 18 gepaarde stimulaties, 6-neuronen, 6-ratten, **P<0.01, Wilcoxon matched pair signed rank test). (f) Gemiddelde single-pulse-evoked [DA]_o in NAc core voor en na insuline (30 nM) in mecamylamine (Mec; 5 μM) of DHβE (1 μM) genormaliseerd naar 100% piekcontrole (n= 20-40-sites per subregio per conditie van 3-4-ratten, P> 0.05 versus controle, ongepaard t-test). (g) Gemiddelde single-pulse-evoked [DA]_o in voorhersenen plakjes van heterozygote controle (Het) en ChAT KO-muizen voor en na insuline (30 nM), genormaliseerd naar piekdrukregeling van 100%. Verhoogde insuline verhoogd [DA]_o in heterozygote muizen met 190 ± 23% in NAc-schaal, 140 ± 8% in NAc-kern en 137 ± 12% in CPu (n= 15-25-sites per subregio van 3-4-muizen per genotype, **P<0.01, ***P<0.001 versus controle ongepaard t-test), maar had geen effect op de opgeroepen [DA]_o in elke striatale subregio van ChAT KO muizen (P> 0.1).

• Afbeelding op volledige grootte (167 KB)

 

 

Insuline verhoogt ChI-prikkelbaarheid

Om de functionaliteit van InsR's op striatale ChI's te testen, onderzochten we het effect van insuline op ChI-exciteerbaarheid met behulp van whole-cell current-clamp-opname. ChI-exciteerbaarheid werd beoordeeld met behulp van een reeks 3-s depolariserende stroompulsen om een ​​reeks actiepotentialen op te wekken die op betrouwbare wijze piekfrequentieaanpassing vertoonden (Fig. 2b), vaak met verlies van spiking aan het einde van de huidige puls. Opvallend was dat insuline (30 nM) de aanpassing van de piekfrequentie verzwakte, wat resulteerde in een progressieve toename van het aantal actiepotentialen in de loop van de tijd (Fig. 2c), met een maximale verhoging (Fig. 2d, e) meestal gezien tussen 20 en 50 min van insuline blootstelling. Bij afwezigheid van insuline toonden de controle-ChI's geen verandering in het aantal opgewekte actiepotentialen (P> 0.05, tweezijdig paar t-test; data niet weergegeven); vergeleken met controle-neuronen die gedurende hetzelfde tijdsinterval werden gevolgd, vertoonden aan insuline blootgestelde neuronen een significant grotere verandering in het aantal opgewekte actiepotentialen (controle n= 12-stimulusparen van vier neuronen, insuline n= 21-stimulusparen van zeven neuronen, F_1,25= 5.63, P<0.05, tweeweg ANOVA met gemengde maatregelen; data niet weergegeven). Het effect van insuline op het verhogen van het actiepotentiaalgetal werd voorkomen door HNMPA maar niet door de IGF-1R-selectieve remmer PPP (Fig. 2e), wat aantoont dat verhoogde ChI-prikkelbaarheid door insuline door InsR werd gemedieerd.

Insuline-versterking van opgeroepen [DA]_o vereist nAChR's en ACh

Eerdere studies hebben aangetoond dat ChIs en ACh de striatale DA-afgifte krachtig reguleren via nAChR's op DA-axons.^{29, 30, 31, 32, 33, 34}. Overvloedige InsR-expressie op ChI's en de verhoging van de ChI-exciteerbaarheid die werd waargenomen bij acute insuline-blootstelling suggereerden dat deze neuronen nieuwe targets voor insuline kunnen zijn die kunnen leiden tot verbeterde DA-afgifte. Om dit te testen, onderzochten we het effect van insuline in de aanwezigheid van mecamylamine, een niet-selectieve nAChR-antagonist of dihydro-β-erythroidine (DHβE), een selectieve antagonist voor β2-subunitbevattende (β2 *) nAChR's die zijn verrijkt met DA axons³⁵. Evoked [DA]_o werd gemakkelijk gedetecteerd in de aanwezigheid van deze antagonisten, hoewel beide geneesmiddelen de amplitude van single-pulse-evoked [DA] verminderden_o (bijvoorbeeld door 13-26% in NAc core), zoals eerder gemeld^{29, 30, 31, 32}. Ter ondersteuning van een rol voor ACh en nAChR's, het effect van insuline op evoked [DA]_o werd voorkomen door ofwel mecamylamine of DHβE (Fig. 2f). Om de betrokkenheid van striatale ACh-signalering bij met insuline versterkte DA-afgifte te bevestigen, onderzochten we het effect van insuline in ex vivo striatale plakjes van muizen waarin ChAT-expressie genetisch was geablateerd in voorhersenenstructuren (voorhersenen ChAT KO-muizen), inclusief striatum³². Hoewel ChI's intact zijn in deze muizen, wordt de ACh-synthese afgeschaft, wat leidt tot een afgenomen, maar nog steeds gemakkelijk detecteerbare enkelpuls-opgewekte [DA]_o, zoals eerder beschreven³². Bij controle heterozygote nestgenoten, insuline (30 nM) verhoogd opgeroepen [DA]_o in NAc shell en core en in CPu door 37-90% (Fig. 2g), die de amplificatie overschrijdt die wordt gezien in rattenstriatum (bijvoorbeeld Fig 1). Het effect van insuline op evoked [DA]_o was afwezig door het striatale complex in voorhersenen ChAT KO muizen, die aantonen dat insuline-gemedieerde verbetering van DA-afgifte striatale ACh vereist, maar niet gelijktijdig vrijgegeven zenders van ChI's, zoals glutamaat³⁶.

De invloed van insuline op evoked [DA]_o is afhankelijk van het dieet

Plasma- en herseninsulineconcentraties zijn evenredig aan de adipositas van het lichaam^{6, 7, 8}en zou kunnen leiden tot compenserende veranderingen in de gevoeligheid van de hersenen voor insuline. We testten daarom de hypothese dat voeding het vermogen van insuline om DA-afgifte te bevorderen, beïnvloedt door striatumschijfjes van ratten te gebruiken die op een chronisch FR- of OB-dieet versus AL-controles worden gehouden. Zoals verwacht, waren plasma-insulinespiegels gecorreleerd met het lichaamsgewicht, met lagere insuline in FR dan in AL of OB-ratten (Fig. 3a en Tabel 2). Ondanks deze verschillen in circulerende insuline, piek-opgeroepen [DA]_o in NAc schaal en kern, en CPu was significant lager in ex vivo striatale plakjes van beide dieetgroepen in vergelijking met AL (Fig. 3b en Aanvullende afbeelding 2 a, b), wat impliceert dat factoren naast insuline absoluut moeten worden bepaald [DA]_o. Het Striatal DA-gehalte verschilt niet per dieetgroep, wat duidt op een verandering in de afgifteverordening in plaats van in de DA-synthese (Aanvullende afbeelding 2c). Consistent met een verandering in dynamische regulatie was de gevoeligheid van striatale DA-afgifte voor insuline duidelijk afhankelijk van de voeding. Bij FR-ratten waren de insulineconcentraties ≤1 nM, die geen effect hadden in AL (Fig. 1b), verhoogd opgeroepen [DA]_o (Fig. 3c), als gevolg van verhoogde insulinegevoeligheid, met EC₅₀ waarden in FR striatum (0.4-0.6 nM) die ongeveer een orde van grootte lager lagen dan die in AL (vergelijk 1b en 3c). In opvallend contrast was het effect van insuline verloren in OB-striatum; zelfs 30 nM-insuline, dat een maximaal effect had in AL-striatum (Fig. 1b), had geen effect in OB (Fig. 3c).

  

  

(a) Plasma-insulineconcentratie is positief gecorreleerd met het lichaamsgewicht over voedingsgroepen (R= 0.76). (b) Gemiddelde single-pulse-evoked [DA]_o in NAc core (zie Aanvullende afbeelding 2a, b voor NAc-schaal en CPu) was lager in FR (38 ± 4%) en OB (25 ± 4%) versus AL (n= 50-60-sites van 5-6 ratten per dieetgroep, F_2,156= 23.337, one-way ANOVA, Tukey HSD; ***P<0.001); OB versus FR (P<0.08). (c) Gevoeligheid van opgeroepen [DA]_o insuline was verbeterd in FR, maar verloren in OB (n= 21-49-sites per subregio per concentratie van 2-4-ratten per dieetgroep, one-way ANOVA, Tukey HSD), met grotere gevoeligheid in FR versus AL-ratten in alle subregio's (P<0.001 voor elke regio; bidirectionele ANOVA; Processor: F_{(conc × dieet; 3,286)}= 10.253; kern: F_{(conc × dieet; 3,353)}= 6.166; shell: F_{(conc × dieet; 3,195)}= 10.735).

• Afbeelding op volledige grootte (124 KB)

 

 

Deze gegevens impliceren een omgekeerde relatie tussen striatale InsR-gevoeligheid en lichaamsadavantie. Als alternatief echter, kunnen deze van het dieet afhankelijke verschillen de veranderde nAChR-gevoeligheid weerspiegelen. We hebben daarom de concentratierespons op nicotine bepaald in de NAc-kern van elke dieetgroep. Nicotine veroorzaakt nAChR-desensitisatie, die kan worden gekwantificeerd door de verhouding van [DA] te vergelijken_o opgeroepen door een korte trein van vijf pulsen bij 100 Hz tot single-pulse-evoked [DA]_o (5 p: 1 p-verhouding) als een index van nAChR activering / desensitisatie^{30, 31}. Met behulp van deze benadering vonden we geen verschillen tussen dieetgroepen in nAChR-gevoeligheid in de NAc-kern (Aanvullende afbeelding 3a-c). Verder verschilde de controle 5 p: 1 p-verhouding niet tussen de dieetgroepen in de NAc-kern (Aanvullende afbeelding 3d) of CPu (niet geïllustreerd), hetgeen impliceert dat het dieet geen invloed heeft op de nAChR-afhankelijke DA-vrijmakingsregeling. Aldus lijkt de striatale InsR-gevoeligheid te zijn verhoogd in FR versus AL-ratten, maar afwezig in OB-ratten, met verlies van regulatie van striatale DA-afgifte bij fysiologische concentraties van insuline.

NAc-schaalinsuline moduleert geconditioneerde smaakvoorkeur

Voedselvoorkeuren worden gegenereerd door zowel pre- als post-inname factoren; de mechanismen voor elk zijn niet volledig opgelost, maar het huidige bewijs impliceert NAc DA-signalering in beide^{37, 38}. Aangezien de insulinespiegels in plasma en cerebrospinale vloeistof (CSF) snel stijgen na perifere glucoseverhoging⁶en dat een toename van insuline in het striatum kan worden gedetecteerd binnen 5 min. van plasma-insuline verhoging⁷, het is logisch om te veronderstellen dat perifere insulineafgifte tijdens een maaltijd de NAc DA-afgifte kan verbeteren en kan bijdragen aan beloningsmechanismen na opname. We hebben een eerder beschreven smaakvoorkeurprotocol aangepast³⁷ met saccharine-gezoete glucose-oplossingen bij ratten om de hypothese te testen dat het blokkeren van het effect van endogene insuline door lokale toediening van een insuline-antilichaam (InsAb) in de NAc de voorkeur voor de gepaarde smaak zou verminderen. De werkzaamheid van InsAb bij het blokkeren van de effecten van insuline werd getest in een in vitro bepaling van DA-opname in striatale synaptosomen. Insuline (30 nM) veroorzaakte een aanzienlijke toename van V_max in synaptosomen van NAc of CPu (Aanvullende afbeelding 4), consistent met onze V_max gegevens van striatale plakjes (Tabel 1) en met eerdere onderzoeken^{18, 19, 20, 21, 22, 23}. In afwezigheid van insuline veranderde InsAb noch een controle-antilichaam immunoglobuline G (IgG) de V_max voor DA-opname versus controle. In aanwezigheid van IgG veroorzaakte insuline nog steeds een aanzienlijke toename van V_max; echter, het effect van insuline op V_max werd verloren in de aanwezigheid van InsAb (Aanvullende afbeelding 4).

Om weefselschade te minimaliseren en de gevoeligheid van het weefseldoel te behouden, werden twee groepen proefpersonen getest waarin we intra-NAc-micro-injectie afwisselden met een schijn-micro-injectieprocedure, in plaats van een enkele groep proefpersonen te gebruiken en een gearomatiseerde oplossing te koppelen met InsAb en een andere met voertuig. Bijgevolg ontving de experimentele groep tijdens éénconditioneringssessies InsAb-micro-injecties gecombineerd met een van de twee smaken, en bij afwisselende sessies werden nagebootste micro-injecties gepaard met de andere smaak (Fig. 4a, links). De controlegroep ontving schijn-micro-injecties afgewisseld met micro-injecties van ofwel fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) of IgG. Beide gearomatiseerde oplossingen bevatten glucose tijdens conditionering. Er werd geen differentiële voorkeur tussen smaakstoffen verwacht in de controle-micro-geïnjecteerde groep, terwijl de voorkeur werd verwacht te verschuiven naar de schijn-micro-injectie-gepaarde smaak in de InsAb-micro-geïnjecteerde groep.

  

  

(a) Diagram dat conditionering met één fles (links) en de test met twee flessen (rechts) illustreert. (b) Volume verbruikt (ml) tijdens conditioneringssessies met één fles. Er was een significante interactie tussen infusie-conditioneringssessie en micro-injectiebehandeling (n= 19-20 ratten per groep, F_(3,111)= 3.088, P<0.05, 2 × 4 gemengde ANOVA met herhaalde metingen tijdens infusie-conditioneringssessie). InsAb-micro-injectie verminderde het verbruik significant in vergelijking met controle tijdens de derde (t(40) = 3.026, **P<0.01) en vierde (t(40) = 3.052, **P<0.01, eenzijdig beschermd t-tests) infusies. Mock-injecties hadden geen effect op de consumptie in beide groepen (F_3,111= 1.110, 2 × 4 gemengde ANOVA met herhaalde metingen op schijnverversingsessie). (c) Het volume dat is verbruikt tijdens de test met de smaakvoorkeur voor twee flessen. Er was een significante interactie tussen smaak- en micro-injectiebehandeling tijdens conditionering (F_1,37= 5.36, P<0.05, tweeweg gemengde ANOVA met herhaalde metingen van smaak). De InsAb-groep consumeerde significant minder van de InsAb-gepaarde smaak in vergelijking met de neppaarsmaak (t(18) = 2.82, ** P<0.01, eenzijdig beschermd t-test); de controlegroep vertoonde geen smaakvoorkeur (t(19) = 0.803, P> 0.05, beschermd t-test). Terwijl ze de groepen vergeleken, dronken InsAb-ratten significant minder van de infusie-gepaarde smaak (t(40) = 1.96, *P<0.05) en significant meer van de mock-paired flavour (t(40) = 1.77, *P<0.05, eenzijdig beschermd t-test) dan controles.

• Afbeelding op volledige grootte (161 KB)

 

 

Tijdens de één-fles conditioneringssessies, verminderde InsAb-micro-injectie significant het verbruik in vergelijking met het voertuig tijdens de derde en vierde infusie (Fig. 4b). Beide groepen verbruikten daarentegen hetzelfde volume oplossing tijdens alle vier onechte injectiesessies (F_3,111= 0.127, P>0.05, gemengde tweewegs-ANOVA) (Fig. 4b). Na in totaal acht conditioneringssessies, werd de smaakvoorkeur beoordeeld in een test met twee flesjes waarin ratten gelijktijdig toegang hadden tot beide gearomatiseerde oplossingen (Fig. 4a). Statistische analyse bracht een significante interactie aan het licht tussen de smaak en de micro-injectie die tijdens de conditionering werd ontvangen (Fig. 4c). De InsAb-groep had aanzienlijk minder InsAb-gepaarde smaak in vergelijking met de schijn-gepaarde smaak (Fig. 4c), terwijl de voertuiggroep geen smaakvoorkeur vertoonde (Fig. 4c), wat impliceert dat intacte insulinesignalering bijdroeg tot de selectie van een zoete calorieoplossing. In vergelijking met vehikel dronken InsAb-micro-geïnjecteerde ratten aanzienlijk minder van de infusie-gepaarde smaak en significant meer van de schijn-injectie-gepaarde smaak (Fig. 4c). Micro-injectie van IgG (t(9) = 0.792. P>0.05, beschermd t-tests) of PBS (t(9) = 0.442. P>0.05, beschermd t-tests) hadden geen effect op de smaakvoorkeur (gegevens niet getoond), wat de mogelijkheid aantoont dat een niet-specifiek effect van InsAb-micro-injectie het verbruik of de smaakvoorkeur verminderde. Er moet ook worden opgemerkt dat de voorkeur van de InsAb-groep bij de test geen voorkeur heeft voor de minder nieuwe smaak, omdat er geen interactie was tussen sessie- en sessietype (feitelijke infusie versus onechte infusie) voor de InsAb-groep (F_3,54= 1.584, P> 0.05, tweeweg ANOVA). Dat wil zeggen dat de InsAb-groep niet meer van de mock-infusion-gepaarde smaak consumeerde in vergelijking met de InsAb-infusie-gepaarde smaak; verschillen tussen behandelingsgroepen kwamen eerder pas naar voren tijdens infusieconditioneringssessies. Over het algemeen geven deze gegevens aan dat insuline in het NAc een rol speelt bij het versterken van de voorkeur voor een smaak die een glycemische lading signaleert.

We rapporteren hier dat insuline de striatale DA-afgifte op een nAChR-afhankelijke manier versterkt door ChI-exciteerbaarheid via InsR's te moduleren. Onze resultaten impliceren dat insuline kan dienen als een beloningssignaal, naast de gevestigde rol in het signaleren van verzadiging. Met name het effect van insuline op DA-afgifte wordt gemoduleerd door een dieet, met een duidelijk verhoogde gevoeligheid voor insuline na FR, maar een volledig verlies van insuline-versterkte regulatie op een OB-dieet. Deze veranderingen lijken veranderingen in de InsR-gevoeligheid te weerspiegelen die omgekeerd evenredig zijn aan circulerende insulinespiegels, aangezien plasma-insulinespiegels afhankelijk waren van de voeding, maar nAChR-gevoeligheid niet. Tenslotte impliceren onze smaakvoorkeurstudies in gedragende dieren dat insulinesignalering in de NAc-schaal de voedselvoorkeur beïnvloedt, wat niet alleen insuline impliceert in voedingsgerelateerd leren, maar ook de rol ervan als beloningssignaal bevestigt.

Net [DA]_o weerspiegelt de balans tussen DA-afgifte en DA-opname via de DAT. Eerder bewijs dat aantoont dat insuline DAT-activiteit kan reguleren^{18, 19, 20, 21, 22, 23} geleid tot de voorspelling dat een toename van insuline een netto daling van de opgeroepen [DA] zou veroorzaken_o via verhoogde DA-opname. We vonden echter dat in het striatum het effect van insuline complexer is dan dit. Hoewel de insulineblootstelling is toegenomen V_max voor DAT, was het primaire effect van insuline op DA-release, niet op DA-opname, met een consistente toename in opgeroepen [DA]_o over een fysiologisch bereik van insulineconcentraties in NAc schaal en kern en in CPu. Hoewel de toename in evoked [DA]_o keerde terug naar controleniveaus bij een suprafysiologische concentratie van 100 nM, V_max was ook onveranderd van controle, waardoor een overheersend effect op de DAT als een verklaring werd geëlimineerd. In plaats daarvan impliceert het verlies van het effect op opname en vrijzetting desensibilisatie van InsR's of downregulatie van stroomafwaartse signaalroutes bij hoge insulineconcentraties. Inderdaad, InsR's ondergaan snelle endocytose en afbraak na insulinebinding in perifere weefsels¹, met opkomend bewijs voor verlies van neuronale InsR-gevoeligheid na kortdurende blootstelling aan hoge niveaus van insuline of caloriearme voeding^{10, 11, 39}.

Het dominante effect van insuline om de striatale DA-afgifte te verbeteren die hier wordt gerapporteerd, staat in contrast met de resultaten van twee andere recente ex vivo plak studies. In de eerste veroorzaakte insuline een afname van de elektrisch opgewekte overflow van [³H] DA uit striatale plakjes, hoewel toegenomen [³H] DA-overloop werd gedetecteerd toen de DAT werd geremd²². Gezien het feit dat [³H] DA moet ontsnappen aan DAT-gemedieerde opname in het te detecteren weefsel in de superfusing-oplossing; dit protocol is bijzonder gevoelig voor DAT-regulatie. Onze resultaten tonen aan dat insuline de DA-afgifte via ChI's en nAChR-activering verbetert, naast de verbetering van DAT-gemedieerde opname, de schijnbaar paradoxale toename van de insuline-versterkte [³H] DA overloop gezien wanneer concurrerende effecten op de DAT werden geblokkeerd²². Het tweede onderzoek gebruikte FCV voor directe detectie van somatodendritische DA-afgifte in de VTA, maar vond ook een overheersend effect van insuline op DA-opname, weerspiegeld in verminderde opgeroepen [DA]_o (Ref. 23). Verschillen in een aantal factoren, van lokale microcircuits tot mechanismen voor somatodendritische versus axonale DA-vrijmaking⁴⁰, zou kunnen bijdragen aan dit regionale verschil. Zoals hieronder wordt besproken, is het echter waarschijnlijk dat regionaal afhankelijke rollen van insuline complementair zijn, in plaats van tegenstrijdig.

Eerder werd aangenomen dat elke rol van insulineafhankelijke regulatie van DA-signalering werd gemedieerd door directe activering van InsR's op DA-neuronen. We laten hier zien dat InsR's ook tot expressie worden gebracht op striatale ChI's en dat insuline de ChI-exciteerbaarheid moduleert om de striatale DA-afgifte te versterken, wat een cruciale rol kan spelen in de invloed van insuline op het dieet. Striatale ChI's ontvangen projecties van neuronen van de intralaminaire nucleus van de thalamus, die burst-bursting vertonen als reactie op saillante sensorische stimuli en helpen burst-pause-spikingpatronen in ChI's te stimuleren die belangrijk zijn bij het richten van aandacht, versterking en associatief leren⁴¹. Daarom zou de werking van insuline bij InsR's op striatale ChI's het effect van sensorische voedselaanwijzingen op striatale gevoeligheid voor thalamisch vuren kunnen verbeteren, wat bijdraagt ​​aan een verhoogde perceptie van de beloningswaarde van een ingenomen maaltijd. Directe promotie van striatale DA-release door ChI-activering heeft geleid tot de suggestie dat factoren die ChI's stimuleren een bevoorrechte rol zullen spelen als triggers van DA-release³³. Onze gegevens leveren hiervoor het eerste bewijsmateriaal, met insuline-versterkte ChI-exciteerbaarheid en ACh-signalering die dynamische toename in DA-afgifte veroorzaken.

Verhoogde DA-afgifte in de aanwezigheid van insuline pleit ook tegen een verhoging van de ACh-signalering in een mate die nAChR-desensitisatie of muscarinische ACh-receptoractivatie (mAChR) veroorzaakt, die beide eenpuls-opgewekte [DA] kunnen onderdrukken_o (scheidsrechters 29, 30, 31, 42). De mechanismen die hier worden gerapporteerd, verschillen dus van ACh-activering van mAChR's, wat is geassocieerd met afkeer en verzadiging⁴³.

Single-puls-evoked [DA]_o was lager in zowel FR- als OB-ratten dan in AL-ratten; hoewel deze resultaten in overeenstemming zijn met eerdere rapporten^{44, 45, 46}, onze studies bieden de eerste systematische vergelijking van drie striatale subregio's in de twee dieetgroepen over een constant tijdsbestek. De mechanismen die ten grondslag liggen aan dieetafhankelijke veranderingen in de afgifte van DA zijn niet opgehelderd en vallen buiten het bestek van de huidige onderzoeken. Aangezien plasma-insulinespiegels echter tegengesteld zijn veranderd door FR- en OB-diëten, is het onwaarschijnlijk dat verminderde evoked [DA]_o in beide groepen is een gevolg van van de voeding afhankelijke insulinespiegels.

Aan de andere kant vormen veranderingen in de InsR-gevoeligheid met een dieet en de daaruit voortvloeiende dieetafhankelijke plasmainsuline-niveaus de meest waarschijnlijke verklaring voor een verhoogde gevoeligheid voor insuline in FR en verlies van gevoeligheid voor insuline in OB. Er was geen bewijs voor de alternatieve verklaring voor veranderde nAChR-gevoeligheid in FR- of OB-ratten versus AL. Hoewel onze bevindingen bij de eersten zijn die wijzen op verhoogde striatale InsR-gevoeligheid met FR¹⁸, gewichtsverlies kan gepaard gaan met een verlaagd insulinegehalte in liquor⁷, wat zou bijdragen tot een verhoogde gevoeligheid van DA-afgifte voor insuline in FR. Omgekeerd is verlies van insulineresponsiviteit in OB-ratten consistent met eerder bewijs voor verminderde InsR-gevoeligheid van de hersenen veroorzaakt door gewichtstoename of OB-diëten^{3, 10, 11}.

Onze ex vivo slice-gegevens ondersteunen de hypothese dat insuline zowel beloning als verzadiging kan signaleren. We testten deze hypothese door het effect van endogene insuline met bilaterale InsAb-micro-injectie in de NAc-schaal te blokkeren tijdens de conditionering van de smaakvoorkeur. Consistent met een rol bij beloning, blokkeerde het blokkeren van het effect van insuline de voorkeur voor de smaak van een gepaarde glucosebevattende oplossing versus de smaak geassocieerd met intacte insulinesignalering. Het blokkeren van insuline in de NAc-schaal verminderde ook het verbruik van een gepaarde oplossing tijdens conditionering met één fles, terwijl schijn-of controle-micro-injecties geen effect hadden op de consumptie. Deze gegevens suggereren dat insuline in de NAc-schaal een rol speelt bij de voedselvoorkeur. Eerdere studies hebben aangetoond dat intacte DA-signalering in het NAc noodzakelijk is voor het verkrijgen van smaakconditionering^{37, 38}, wat een rol bevestigt voor NAc DA bij het bemiddelen van de versterkende effecten van voedingsoplossingen. In dit licht pleit de voorkeur voor de glucose-oplossing gepaard met intacte insulinebeschikbaarheid tegen een primair effect van insuline op DAT-gemedieerde DA-opname in de NAc-schaal, omdat verwacht wordt dat dit afneemt [DA]_o en daarom vermindert het verbruik van de controle-gepaarde smaak. Onze resultaten komen ook overeen met die van een eerdere studie waarin micro-injectie van insuline in de NAc-schaal de tijd verhoogde dat de dieren betrokken waren bij orale sucrose zelftoediening, met een borderline toename in sucroseconsumptie²⁶, wat tegengesteld was aan de verwachte gevolgen van een verhoogde opname van DA. Over het algemeen komen deze gedragsgegevens overeen met de voorspelde invloed van insuline op striatale ChI's en verbeterde DA-afgifte. Deze resultaten sluiten echter niet de betrokkenheid uit van andere elementen van striatale microcircuits in het gecontroleerde gedrag, gegeven wijdverspreide InsR-expressie in heel striatum^{1, 14}.

De hier gerapporteerde studies leveren het eerste bewijs dat insuline een rol speelt bij de communicatie van de calorische waarde en daarmee de lonende effecten van een maaltijd, wat belangrijke implicaties heeft voor de invloed van insuline bij zowel ondergewicht als obese personen. Verschillende onderzoeken geven aan dat de post-ingestie effecten van voedsel, ongeacht of de smaaktransductieroutes intact zijn⁴⁷, verhoging van NAc DA-afgifte en positieve versterking van gedrag^{37, 47}. Aldus kan de post-absorptieve insulinereactie de glycemische opbrengst van een maaltijd coderen en bijdragen aan de versterking van voedselvoorkeuren en -gedragingen die consumptie mogelijk maken. Extreme veranderingen in circulerende insulinespiegels en centrale InsR-gevoeligheid kunnen echter een rol spelen bij abnormaal gedrag en bij adaptief gedrag. Hypoinsulinemie en compensatoire opregulatie van de gevoeligheid van de InsR bij FR-patiënten kan bijvoorbeeld een factor zijn bij hun⁴⁸. Omgekeerd kan centrale insuline-ongevoeligheid bij diabetes type II of obesitas, hier gespiegeld in OB-ratten, bijdragen tot een verminderd gevoel van beloning na inname, waardoor de inname van voedingsmiddelen met een hoge glycemische index als compensatie wordt^{49, 50}. Daarom kan een verhoging of een afname van de striatale insulinegevoeligheid bijdragen aan pathologisch eten, leidend tot eetaanvallen en / of obesitas.

Over het algemeen laten onze bevindingen een nieuwe rol zien voor insuline als beloningssignaal. Een dergelijke rol staat in contrast met zijn bekende functie als verzadigingssignaal, inclusief recente bevindingen dat insuline die micro-geïnjecteerd wordt in de VTA, hedonische voeding en voorkeur voor aanwijzingen in verband met voedselbeloning kan verminderen^{23, 24}. Dit doet de vraag rijzen hoe schijnbaar tegengestelde rollen voor insuline in deze DA-afhankelijke functies met elkaar verzoend kunnen worden. Het antwoord kan zijn dat deze effecten complementair zijn, en niet tegenstrijdig. De huidige resultaten geven aan dat insuline in het striatum de beloningswaarde van een ingenomen maaltijd communiceert. Een dubbele rol in het signaleren van verzadiging kan het eenvoudig toestaan ​​dat insuline het belangrijke doel van het beëindigen van een maaltijd dient, terwijl tegelijkertijd een geheugen van de nutritionele en dus belonende kwaliteiten ervan wordt vastgesteld, waardoor de herhaling van het ingenomen gedrag wordt versterkt.

Behandeling van dieren

Dierprocedures waren in overeenstemming met de NIH-richtlijnen en goedgekeurd door de NYU School of Medicine Animal Care en Use Committee. Alle dieren waren op 12 h licht: donker cyclus, met lichten aan van 06: 00 naar 18: 00; ex vivo er zijn segmenten gemaakt tussen 08: 00 en 12: 00. Mechanistische studies bij AL-ratten en muizen werden uitgevoerd in ex vivo plakjes van dieren gehuisvest in paren, terwijl ratten afzonderlijk werden gehuisvest voor alle dieetgroepvergelijkingen en voor gedragsstudies.

Rattendieetregimes

Volwassen mannelijke Sprague-Dawley-ratten (Taconic) waren 8-10 weken oud bij het starten van dieetregimes die 21-30-dagen duurden. Ratten werden semi-willekeurig toegewezen aan de dieetgroepen: proefpersonen werden gerangschikt op basisgewicht, vervolgens werd elk opeenvolgend trio van ratten willekeurig verdeeld onder de dieetgroepen. AL ratten hadden vrije toegang tot rattenvoer voor dezelfde periode als gepaarde ratten op FR- of OB-diëten. Alle ratten hadden vrije toegang tot water. Voedselbeperking werd geïmplementeerd zoals eerder⁵¹; in het kort ontvingen ratten dagelijks 40-50% van de AL-inname van standaard rattenvoer tot het lichaamsgewicht met 20% was verlaagd, waarna het voedsel werd getitreerd om dit gewicht te handhaven. OB-ratten hadden vrije toegang tot rattenvoer en chocolade. Zorg voor een zeer smakelijke vloeistof met matig veel vet en suiker⁵².

voorhersenen ChAT knock-out muizen

Muizen met een conditioneel floxed allel van ChAT (ChAT^flox) werden gekruist met een Nkx2.1^Cre transgene lijn om muizen te produceren waarin ablatie van ACh-synthese beperkt is tot voorhersenen³². Niet-mutante transgene nestgenoten waren controles; hun genotypen Cre⁺;ChAT^{flox / +} en Cre^-;ChAT^{flox / flox} worden 'heterozygoten' genoemd. Volwassen mannelijke muizen die voor plakonderzoek werden gebruikt, hadden ad libitum toegang tot voer en water.

Ex vivo bereiding van plakjes en fysiologische oplossingen

Ratten of muizen werden diep geanesthetiseerd met 50 mg kg^-1 pentobarbital (intraperitoneaal (ip)) en onthoofd. Voor voltammetrie werden coronale voorhersenenplakken (300-400-μm dikte) gesneden op een Leica VT1200S vibrerende bladmicrotoom (Leica Microsystems; Bannockburn, IL) in ijskoude HEPES-gebufferde kunstmatige CSF (aCSF) bevattende (in mM): NaCl (120); NaHCO₃ (20); glucose (10); HEPES-zuur (6.7); KCl (5); HEPES natriumzout (3.3); CaCl₂ (2); en MgSO₄ (2), geëquilibreerd met 95% O₂/ 5% CO₂. Segmenten werden vervolgens in deze oplossing bij kamertemperatuur gehouden voor 1 h vóór het experiment^{30, 32, 53}. Voor elektrofysiologie werden ratten, na verdoving, transcardiaal geperfundeerd met ijskoude oplossing die (in mM) bevat: sucrose (225); KCl (2.5); CaCl₂ (0.5); MgCl₂ (7); NaHCO₃ (28); NaH₂PO₄ (1.25); glucose (7); ascorbaat (1); en pyruvaat (3) en geëquilibreerd met 95% O₂/ 5% CO₂. Plakjes werden gesneden in deze oplossing en vervolgens overgebracht naar een herstelkamer in gemodificeerd aCSF bevattende (in mM): NaCl (125); KCl (2.5); NaH₂PO₄ (1.25); NaHCO₃ (25); MgCl₂(1); CaCl₂ (2); glucose (25); ascorbaat (1); pyruvaat (3); en myo-inositol (4), geëquilibreerd met 95% O₂/ 5% CO₂; deze oplossing was aanvankelijk bij 34 ° C, waarna men deze geleidelijk tot kamertemperatuur liet afkoelen⁵⁴. Alle voltammetrie- en fysiologie-experimenten werden uitgevoerd in een onderdompelingsregistratiekamer bij 32 ° C die superfused was bij 1.5 ml min.^-1 met aCSF bevattende (in mM): NaCl (124); KCl (3.7); NaHCO₃ (26); CaCl₂ (2.4); magnesiumsulfaat₄ (1.3); KH₂PO₄ (1.3); en glucose (10) en runderserumalbumine (BSA, 0.05-0.1 mg ml^-1) geëquilibreerd met 95% O₂/ 5% CO₂; plakjes werden toegestaan ​​in deze omgeving te equilibreren gedurende 30 min. voorafgaand aan het experiment.

Fast-scan cyclische voltammetrie

Evoked DA-vrijgavestudies werden uitgevoerd met FCV in hersenplakjes^{32, 53} bereid uit mannelijke ratten of ChAT forebrain knock-out muizen en heterozygote controles (5-8 weken). Studies in ChAT knockout-muizen waren geblindeerd, maar ratten-dieetgroepen hadden duidelijke fenotypen die blinden uitsluiten. Voltametrische metingen werden uitgevoerd met een Millar Voltammeter (beschikbaar op speciaal verzoek aan Dr. Julian Miller in St Bartholomew's en de Royal London School of Medicine and Dentistry, University of London). Een conventionele driehoeksgolfvorm werd gebruikt voor FCV, met een scanbereik van -0.7 tot + 1.3 V (versus Ag / AgCl), scansnelheid van 800 V s^-1en bemonsteringsinterval van 100-ms^{30, 32, 53}. Gegevens werden verkregen met behulp van een DigiData 1200B A / D-kaart bestuurd door Clampex 7.0-software (Molecular Devices). DA-afgifte werd opgeroepen met behulp van een concentrische stimulatie-elektrode; stimulus-pulsamplitude was 0.4-0.6 mA en de duur was 100 μs^{30, 32, 53}. Lokale single-pulse stimulatie werd gebruikt in NAc core en CPu; er werd echter een korte hoogfrequente pulstrein (vijf pulsen bij 100 Hz) gebruikt om opgewekt [DA] te amplificeren_o in NAc-schaal. Beide stimulusparadigma's roepen DA-release op die actiepotentiaal is en Ca²⁺ afhankelijk, niet beïnvloed door gelijktijdig afgegeven glutamaat en GABA^{42, 55}en gefaciliteerd door gelijktijdig afgegeven ACh^{29, 30, 31, 32, 33, 34}. Gegenereerd [DA] kwantificeren_oelektroden werden gekalibreerd met bekende DA-concentraties bij 32 ° C na elk experiment in aCSF en in de aanwezigheid van elk medicijn dat tijdens een bepaald experiment werd gebruikt⁵³.

Voltammetrie-experimenten om het effect van insuline op opgewonden te bepalen [DA]_o werden verkregen met behulp van een van de twee protocollen. Initiële experimenten om het tijdsverloop voor het effect van insuline (Sigma, I5523) te bepalen, werden uitgevoerd door bewaking van opgeroepen [DA]_o elke 5 min op een enkele site. Insuline werd aangebracht na consistent opgeroepen [DA]_o werd verkregen (typisch 4-5-metingen); het effect van insuline was maximaal na 50-60 min. en vervolgens opgeroepen [DA]_o bleef op dit niveau gedurende de duur van het experiment (meestal 90 min. totale insuline blootstelling; Fig. 1c). Vervolgens werd het effect van insuline beoordeeld door het opnemen van opgeroepen [DA]_o op 4-5 discrete sites in plakjes (+ 1.5 mm van bregma) in elk van de drie striatale subregio's onder controlevoorwaarden (aCSF of aCSF plus medicijn) en opnieuw op het moment van maximaal insuline-effect (bemonsteren met 60-80 min), vervolgens deze monsters werden gemiddeld voor elke subregio. Het effect van insuline nam af met de tijd na de bereiding van de plakjes; om de tijd te minimaliseren ex vivo en om het gebruik van dieren te optimaliseren, werden typerend twee plakjes van een bepaald dier tegelijkertijd in de registratiekamer getest. Geneesmiddelen die werden gebruikt om het effect van insuline aan te vechten, werden 15 min voor insuline toegediend via superfusing aCSF, waaronder HNMPA-trisacetoxymethylester (HNMPA-AM_3; Enzo Life Sciences), S961 (Novo Nordisk), LY294002 (Sigma), picropodophyllotoxine (PPP; Tocris), mecamylamine (Tocris) en DHβE (Tocris). Zoals beschreven in Results, werd de mogelijke veranderde gevoeligheid van nicotine-ACh-receptoren bij dieetgroepen getest door de ratio van piek [DA] te vergelijken._o opgeroepen door 5 p (100 Hz) met dat opgewekt door 1 p evoked (5 p: 1 p ratio)^{30, 31} in NAc-kern in de aanwezigheid van 0-500 nM nicotine (Sigma).

Bepaling van V _max van opgeroepen [DA]_o transiënten in striatale plakjes

Voor het evalueren van insuline-geïnduceerde veranderingen in DAT-gemedieerde DA-opname, het eerste deel van de dalende fase van opgeroepen [DA]_o krommen werden gepast om de Michaelis-Menten-vergelijking te extraheren V_max (maximale opnamesnelheidsconstante)⁵⁶. K_m (die omgekeerd evenredig is aan de affiniteit van de DAT voor DA) werd vastgesteld op 0.2 μM en is bekend dat het vergelijkbaar is in striatale subregio's⁵⁷ en onaangetast door insuline (zie Aanvullende afbeelding 4 onderschrift).

Gehele cel opname

Hersenenplakjes werden bereid van 29- naar 35-dag-oude mannelijke ratten; de registratievoorwaarden waren identiek aan die gebruikt in DA-releasestudies. Op opnamen met volwaardige stroomtangen werden conventionele methoden gebruikt⁵⁴. Striatale ChI's werden gevisualiseerd met behulp van een Olympus BX51WI-microscoop (Olympus America, Center Valley, PA) met infrarood contrast-interferentie contrastoptica en een × 40 wateronderdompelingsdoel. De pipetoplossing bevatte (in mM): K-gluconaat (129); KCl (11); HEPES (10); MgCl₂ (2); EGTA (1); na₂-ATP (2); na₃-GTP (0.3); en aangepast tot pH 7.2-7.3 met KOH. Voor opgenomen neuronen die moeten worden beoordeeld op ChAT-immunoreactiviteit, werd 0.3% biocytine opgenomen in de pipetoplossing en de neuronen werden kort geregistreerd (~ 5 min) om verdunning van intracellulaire inhoud te minimaliseren. De pipetweerstand was ~ 3-5 MΩ. Opnamen werden verkregen met behulp van een Axopatch 200B-versterker (Molecular Devices, Sunnyvale CA) en low-pass gefilterd met 2 kHz. ChI's werden geïdentificeerd aan de hand van gevestigde elektrofysiologische criteria²⁸; de meeste waren aanvankelijk tonisch actief, maar de activiteit verminderde variabel na het patchen. De responsiviteit ten opzichte van de huidige injectie was in het algemeen echter robuust en consistent in de tijd en werd daarom gebruikt om het effect van insuline op ChI-exciteerbaarheid te onderzoeken (zie Resultaten). In experimenten om de rol van InsR's en IGF-1R's in deze respons te onderzoeken, werd HNMPA of PPP minstens voor minimaal 20 toegepast voordat een ChI werd gepatcht. Maximale effecten van insuline alleen werden doorgaans waargenomen na ~ 16 min van blootstelling, hoewel in sommige cellen de toename niet maximaal was tot 50 min of langer. Bovendien veroorzaakte insuline bij vier van de zes neuronen die zijn geregistreerd in PPP een initiële afname van het spike-aantal alvorens te herstellen tot een beginnend pieknummer en deze te overschrijden. Bijgevolg werd het effect van insuline in alle experimenten gekwantificeerd door het maximale effect op het aantal spikes te vergelijken met het aantal pieken dat werd opgeroepen direct voor insulinetoediening. Het duidelijke verschil in de tijd om het piekeffect te bereiken, kan een aantal factoren weerspiegelen, waaronder de diepte van de opgenomen cel in de plak. Evoked actiepotentialen werden ook opgenomen in ChI's bij afwezigheid van insuline op vergelijkbare tijdstippen.

Hoogwaardige vloeistofchromatografie

Het DA-gehalte van striatale plakjes van de rat (dikte 400-μm) werd bepaald met behulp van hogedrukvloeistofchromatografie met elektrochemische detectie⁵⁸. Segmentparen werden geëquilibreerd voor 30 min bij 32 ° C in aCSF en vervolgens werd één plak per paar geïncubeerd voor een extra 60 min bij 32 ° C in aCSF terwijl de andere werd geïncubeerd in aCSF met 10 of 30 nM insuline. Voor vergelijkingen tussen de voedingsgroepen werd striataal weefsel verzameld tussen 30-60 min na herstel. Na incubatie werd de overmaat aCSF voorzichtig uit de plakjes verwijderd, een monster van striataal weefsel (7-10 mg) werd gewogen, op droogijs bevroren en vervolgens opgeslagen op het moment dat het werd bewaard bij -80 ° C. Op de dag van analyse werden monsters gesoniceerd in ijskoud, eluens, gedesoxygeneerd met argon⁵⁸, gecentrifugeerd in een microcentrifuge voor 2 min, en het supernatant rechtstreeks in de HPLC-kolom geïnjecteerd (BAS, West Lafayette, IN); de detector was een glasachtige koolstofelektrode ingesteld op 0.7 V versus Ag / AgCl.

immunohistochemie

Voor immunohistochemische labeling werden ratten geanesthetiseerd met natriumpentobarbital (50 mg kg^-1ip), vervolgens transcardiaal geperfundeerd met PBS (154 mM NaCl in 10 mM fosfaatbuffer, pH 7.2) gevolgd door 4% paraformaldehyde in deze PBS; hersenen werden verwijderd en coronale secties (20 μm) werden conventioneel gesneden en verwerkt^{27, 59}. Immunofluorescentiebeelden werden verkregen met een Nikon PM 800 confocale microscoop uitgerust met een digitale camera bestuurd door Spot-software (Diagnostic Instruments Inc.) en met behulp van een 100-objectief (numerieke lensopening = 1.4) of met een Zeiss LSM 510 confocale microscoop met behulp van een 63 × objectief (numerieke lensopening = 1.2). De lasers waren Argon (488 nm), He / Ne (543 nm) en He / Ne (633 nm). Passende filters voor elke laser werden geselecteerd door de confocale microscoopsoftware. De grootte van de speldenprik varieerde met het gebruikte doel en de geselecteerde dikte van de sectie z-stapelegeneratie; we kozen voor de optimale pinhole-waarde die wordt aangegeven door de software (meestal 30 μm). Digitale bestanden werden geanalyseerd met deconvolutie-software (AutoQuant Imaging), waarbij de laatste beelden werden verwerkt met Adobe Photoshop 7.0. Alle afbeeldingen zijn aangepast voor helderheid en contrast; dergelijke aanpassingen werden gelijkmatig aangebracht op alle delen van de afbeelding. Striatale DA-axonen werden geïdentificeerd met behulp van twee TH-antilichamen: polyklonaal AB152 konijn anti-TH (1: 800) en monoklonaal MAB318 muis anti-TH (1: 500) (beide van Chemicon). Drie InsR-antilichamen werden gebruikt: sc-57342 en sc-09 (1: 100; Santa Cruz) en PP5 (een geschenk van Pfizer). De specificiteit van elk is eerder aangetoond^{60, 61}en werd in de onderhavige onderzoeken bevestigd door de afwezigheid van immunolabeling met antilichamen sc-57342 of PP5 in de aanwezigheid van het overeenkomstige blokkerende peptide. ChAT-antilichaam was AB144 (1: 200; Millipore) en biotine was van Vector (1: 200). Secundaire antilichamen die werden gebruikt waren ezel-anti-konijn Alexa 488 (Invitrogen) of ezel-anti-konijn Cy2 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME), ezel-anti-geit Cy3 (Jackson) en ezel-anti-muis Cy5 (Jackson).

Om co-lokalisatie van InsR's in TH + -axonen te evalueren, hebben we eerder beschreven methoden gebruikt om de aanwezigheid van Kir6.2, de porievormende subeenheid van ATP-gevoelig K, te identificeren.⁺ kanalen in DA-axons²⁷. Puncta die InsR's voorstellen, werd verdeeld over aangepaste beelden, wat aangeeft dat superpositie met TH-immunoreactiviteit tot op zekere hoogte toevallig kan optreden. Om deze aanname te testen, telden we insR / TH-superimposities in 42-onafhankelijke velden in drie NAc-cellen met immunolabel van twee ratten. De InsR digitale bestanden werden vervolgens 90 ° met de klok mee geroteerd en de tellingen werden herhaald; rotatie verminderde het aantal InsR puncta dat samen met TH is gelokaliseerd in de meeste velden (zie Resultaten). De afname van het aantal superposities met rotatie²⁷ aangegeven het aandeel insR-puncta in elk striataalveld geassocieerd met DA-axons.

Bloedglucose en insuline-ELISA

Boomstambloed werd verzameld op het moment van onthoofding voor plakonderzoek. Bloedglucose werd onmiddellijk bepaald met een standaard bloedglucosemonitor. Voor insuline werd extra bloed verzameld in EDTA-bevattende buizen en gecentrifugeerd bij 1,500g voor 15 min; supernatant (plasma) werd verzameld en bewaard bij -80 ° C tot verwerking met een ALPCO ELISA-kit met ratteninsuline.

Plaatsing van de canule en histologische verificatie

Eenenveertig volwassen mannelijke Sprague-Dawley-ratten (Taconic en Charles River) die aanvankelijk 350-425 g wogen, werden met ketamine verdoofd (100 mg kg^-1, ip) en xylazine (10 mg kg^-1, ip) en stereotaxisch geïmplanteerd met twee chronisch verblijvende gidscanules (26-meter) bilateraal geplaatst 2.0 mm dorsaal ten opzichte van infusieplaatsen in de mediale schaal van het NAc⁶² (1.6 mm voor naar bregma; 2.1 mm lateraal tot de sagittale hechting, uiteinden gebogen 8 ° naar de middellijn, 5.8 mm ventraal naar schedeloppervlak). Ratten kregen banamine (2.0 mg kg^-1, subcutaan) als een postchirurgische pijnstiller na herstel van de anesthesie en de ochtend erna. Eén week na de operatie werden ratten geplaatst op FR (hierboven beschreven) en gehandhaafd op 80% van hun postoperatieve herstelgewicht voor de rest van het onderzoek. De plaatsing van de canule werd histologisch bepaald na voltooiing van gedragstesten. Elke rat werd gedood met CO₂, onthoofd en de hersenen verwijderd en gedurende> 10 uur gefixeerd in 48% gebufferde formaline. Bevroren coronale secties (dikte 40 μm) werden gesneden op een Reichert-Jung Cryostat, ontdooid op met gelatine beklede glasplaatjes en gekleurd met cresylviolet. Gegevens van een bepaalde rat werden alleen gebruikt als beide canules zich in de mediale NAc-schaal bevonden⁶² (inclusief de schil / kern of schil / olfactorische tuberkelgrens) (Aanvullende afbeelding 5); op basis van deze criteria werden twee ratten uitgesloten van de uiteindelijke analyse.

Smaak-voorkeur conditionering voorbelichting

Ratten kregen er één overnachting (in de kooi thuis) en zes 30-min-per-dag sessies van pre-blootstelling (in testkamers) aan 0.2% natriumsacharine (Sigma) in water met een 48-h-interval tussen de sessies. Daarna ontvingen de ratten twee 5-min-per-dag sessies van blootstelling aan 0.2% natriumsacharine in 0.05% ongezoete druiven of kersen Kool-Aid (Kraft Foods) in water. Voor de eerste Pre-exposure-sessie met Kool-Aid kreeg de helft van de ratten een oplossing met kersensmaak en de andere helft kreeg een oplossing met een druivensmaak. De smaken waren omgekeerd tijdens de tweede voorblootingssessie van Kool-Aid om ervoor te zorgen dat alle ratten elke smaak proefden. Inname werd gemeten voor alle pre-expositiesessies. De testkamers waren doorzichtige plastic kooien met vers strooisel. Voor alle sessies vóór blootstelling hadden ratten toegang tot dezelfde oplossing aan beide zijden van de kamer. Met uitzondering van de pre-exposure sessie 's nachts, werden alle sessies uitgevoerd in een gedragskamer met procedures, met een 30-min gewenningsperiode voorafgaand aan een training of testen.

Conditionering met één fles

Eerdere studies hebben aangetoond dat micro-injectie van InsAb in ventromediale hypothalamus het effect van insuline op voedingsgedrag en glucagonsecretie kan blokkeren^{63, 64}. Hier hebben we deze benadering gebruikt om een ​​mogelijke rol van insuline in de versterking van voedselkeuze te beoordelen. Ratten werden semi-willekeurig toegewezen op basis van het gemiddelde voorbelichtingsinname-volume in twee groepen, controle of experimenteel (InsAb). In de controlegroep ontvingen ratten drager (micro-injectie PBS; 137 mM NaCl en 2.7 mM KCl in 10 mM fosfaatbuffer) of IgG (Abcam ab81032; 0.5 μg μl^-1 in PBS, zoals ontvangen) micro-injectie in NAc-schaal voor het nuttigen van een van de twee gearomatiseerde oplossingen, en een schijn-micro-injectie voor het consumeren van de andere gearomatiseerde oplossing. In de experimentele groep ontvingen ratten NAc-schaal-micro-injectie van InsAb (Abcam ab46707; 0.5 μl van 1 μg μl^-1 in PBS, zoals ontvangen) vóór blootstelling aan één gearomatiseerde oplossing, en onechte micro-injectie voorafgaande aan blootstelling aan de andere. Twee sets proefpersonen met afwisseling tussen vloeibare micro-injectie en schijn-micro-injectie werden gebruikt, zodat het totale aantal micro-injecties beperkt was tot vier, waardoor mogelijke weefselbeschadiging en verlies van gevoeligheid op de micro-injectieplaats tot een minimum werd beperkt.⁶⁵. Voor vloeibare micro-injectie werd controleoplossing of InsAb geladen in twee 30-cm-lengten PE-50-buis bevestigd aan één uiteinde aan 5 μl Hamilton-spuiten gevuld met gedestilleerd water en aan het andere uiteinde aan 31-gauge injectorcanules, die 2.0 mm verlengden voorbij de geïmplanteerde handleidingen. De 0.5 μl-infusievolumes werden over 90 s toegediend met een snelheid van 0.005 μl s^-1; de injector werd op zijn plaats gelaten voor ~ 60 s om tijd voor diffusie mogelijk te maken, waarna de injector werd vervangen door de stilet.

Ratten werden direct naar de gedragskamers binnen 2 min. Na voltooiing van de micro-injectie of schijn-micro-injectie overgebracht. Conditioneringsoplossingen bevatten 0.2% natriumsacharine, 0.05% ongezoete druiven of kersen Kool-Aid en 0.8% glucose. De toegang tot oplossingen was beperkt tot 30 min per sessie. De gepaarde smaak en de zijkant van de kamer met toegang voor drinken werden semi-willekeurig toegewezen en in elke groep gecompenseerd. Het interval tussen micro-injecties was ten minste 72 h, afwisselend tussen infusie- en schijnsessies voor in totaal acht conditioneringssessies.

Voorkeurstest met twee flessen

Achtenveertig uur na de laatste conditioneringssessie werden ratten geplaatst in testkamers met simultane toegang tot beide conditioneringsaroma's; oplossingen waren 0.2% natriumsaccharine in 0.05% druif of kers Kool-Aid, zonder glucose. Testen deden zich voor gedurende 2-dagen (60 min. Per dag). De positie van de drinkbuis met mock-paired of infusie-gepaarde oplossing werd afgewisseld om te verzekeren dat elke rat werd getest op consumptie van elke oplossing aan beide zijden van de kooi. De inname van elke op smaak gebrachte oplossing werd gedurende de twee testdagen gemiddeld om de voorkeur te bepalen.

[³H] DA-opname in striatale synaptosomen om de werkzaamheid van InsAb te beoordelen

Striatale synaptosomen^{21, 66} werden bereid uit AL-ratten (mannelijk, 350-400 g), met NAc (schaal en kern) en CPu ontleed en afzonderlijk bereid. Weefsel van elke regio werd gehomogeniseerd in 15 volumes van een ijskoude 0.32 M sucrose-oplossing in een glazen homogenisator met een door een motor aangedreven Teflon-stamper; na spoelen en centrifugeren werd de uiteindelijke pellet opnieuw gesuspendeerd in ijskoude 0.32 M-sucrose^{21, 66}. Voordat u de [³H] DA-opnameassay⁶⁶, werden synaptosomale aliquots in een totaal volume 180 μl opnamebuffer geïncubeerd in een shaker voor 15 min bij 30 ° C in de aanwezigheid of afwezigheid van 30 nM insuline, in medium (PBS) of in InsAb (eindverdunning 1: 500) , in IgG (eindverdunning 1: 500) of in het voertuig. Opnamebuffer bevatte (in mM): NaCl (122); na₂HPO₄ (3); NaH₂PO₄ (15); KCl (5); magnesiumsulfaat₄ (1.2); glucose (10), CaCl₂ (1); nialamide (0.01); tropolone (0.1); en ascorbinezuur (0.001), pH 7.4. Gebruik van [³H] DA werd geïnitieerd door 20 μl van elke synaptosomale suspensie snel in de 96-wellplaten af ​​te geven met variërende concentraties DA (0.003-1.0 μM) en [³H] DA (5 nM); na 5 min in een plaat-schudinrichting bij 25 ° C, werd de opname beëindigd door koude, snelle vacuümfiltratie⁶⁶. Tellingen per putje werden omgezet in pmoles, vervolgens gecorrigeerd tot mg totaal eiwit per minuut. Alle assays werden in triplo uitgevoerd en minstens vier keer herhaald; V_max en K_m werden berekend met behulp van Biosoft Kell Radlig-software (Cambridge, VK).

statistische analyse

Gegevens worden gegeven als gemiddelden ± sem; significantie werd beoordeeld met behulp van gepaarde of ongepaarde Student's t-testen of ANOVA, tenzij anders aangegeven. Voor voltammetry-gegevens, n is het aantal opnamesites, gegeven dat de variabiliteit van site-to-site binnen een striataal subregio groter is dan de interdier- of tussenplak-variabiliteit^{30, 32, 55, 56}; diernummer wordt genoteerd voor elke dataset. De EC₅₀ voor het effect van insuline en nicotine op peak-evoked [DA]_o werd berekend met behulp van Prism 6.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Voor elektrofysiologische gegevens werd de statistische significantie beoordeeld met behulp van gepaarde t-tests of een Wilcoxon-test in Prism 6.0, of een gemengde tweewegs-ANOVA in SAS 9.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC). Voor de evaluatie van de insulinebetrekking bij conditionering van de smaakvoorkeur werden twee volledige onderzoeken voltooid met behulp van protocollen die identiek waren met uitzondering van de gebruikte vehikelbehandeling. In de eerste studie ontvingen 10-ratten dragerinfusies van PBS en ontving 9 infusies van InsAB. In de tweede studie ontvingen 10-ratten dragerinfusies van IgG en ontving 10 infusies van InsAb. Er was geen significant verschil tussen de twee voertuiggroepen (PBS of IgG) tijdens infusie-conditioneringssessies (F₁₉= 0.619, gemengde tweewegs-ANOVA) met herhaalde metingen tijdens infusie-conditioneringssessie) of tijdens de test (F₁₉= 0.012, tweeweg gemengde ANOVA met herhaalde metingen van smaak). Bijgevolg werden de twee experimenten gecombineerd voor analyse. Voor deze analyse werd een 2 × 4 gemengde ANOVA (met herhaalde metingen op infusie-conditioneringsdag) gebruikt om de effecten van micro-injectiebehandeling tijdens conditionering te bepalen, gevolgd door beschermde t-testen (één staart om te bepalen in welke conditioneringssessies de micro-injectie behandeling het inname volume verminderde). Dezelfde analyse werd voltooid voor schijnconditioneringssessies. Om het effect van de conditioneringsbehandeling tijdens een smaakstoevoorkeurtest met twee flessen te bepalen, werden de gegevens geanalyseerd met behulp van een gemengde tweewegs-ANOVA (met herhaalde metingen op smaak), gevolgd door beschermde t-tests (één staart om de hypothese te testen dat InsAb de voorkeur zou verlagen).

Hoe dit artikel citeren: Stouffer, MA c.s.. Insuline verbetert de afgifte van striatale dopamine door cholinerge interneuronen te activeren en geeft daarmee blijk van beloning. Nat. Commun. 6: 8543 doi: 10.1038 / ncomms9543 (2015).

1. Schulingkamp, ​​RJ, Pagano, TC, Hung, D. & Raffa, RB Insulinereceptoren en insulineactie in de hersenen: beoordeling en klinische implicaties. Neurosci. Biobehav. Rev. 24, 855-872 (2000).
   • CAS
   • ISI
   • PubMed
   • Artikel
   • Toon context
2. Gerozissis, K. Brain-insuline, energie- en glucosehomeostase; genen, omgeving en metabole pathologieën. EUR. J. Pharmacol. 585, 38-49 (2008).
3. CAS
4. PubMed
5. Artikel
6. Toon context
7. CAS
8. PubMed
9. Artikel
10. Toon context
11. CAS
12. PubMed
13. Artikel
14. Toon context
15. CAS
16. PubMed
17. Artikel
18. Toon context
19. CAS
20. ISI
21. PubMed
22. Artikel
23. Toon context
24. ISI
25. PubMed
26. Artikel
27. Toon context
28. CAS
29. PubMed
30. Artikel
31. Toon context
32. Toon context
33. CAS
34. ISI
35. PubMed
36. Artikel
37. Toon context
38. CAS
39. ISI
40. PubMed
41. Artikel
42. Toon context
43. CAS
44. ISI
45. PubMed
46. Toon context
47. ISI
48. PubMed
49. Artikel
50. Toon context
51. CAS
52. ISI
53. PubMed
54. Artikel
55. Toon context
56. CAS
57. ISI
58. PubMed
59. Artikel
60. Toon context
61. Toon context
62. CAS
63. ISI
64. PubMed
65. Artikel
66. Toon context
67. CAS
68. ISI
69. PubMed
70. Artikel
71. Toon context
72. CAS
73. ISI
74. PubMed
75. Artikel
76. Toon context
77. PubMed
78. Artikel
79. Toon context
80. Toon context
81. CAS
82. PubMed
83. Artikel
84. Toon context
85. ISI
86. PubMed
87. Artikel
88. Toon context
89. CAS
90. ISI
91. PubMed
92. Artikel
93. Toon context
94. CAS
95. ISI
96. PubMed
97. Artikel
98. Toon context
99. CAS
100. PubMed
101. Artikel
102. Toon context
103. Toon context
104. CAS
105. ISI
106. PubMed
107. Artikel
108. Toon context
109. CAS
110. ISI
111. PubMed
112. Artikel
113. Toon context
114. CAS
115. ISI
116. PubMed
117. Artikel
118. Toon context
119. CAS
120. ISI
121. PubMed
122. Artikel
123. Toon context
124. PubMed
125. Artikel
126. Toon context
127. CAS
128. ISI
129. PubMed
130. Artikel
131. Toon context
132. CAS
133. PubMed
134. Artikel
135. Toon context
136. CAS
137. ISI
138. PubMed
139. Artikel
140. Toon context
141. CAS
142. PubMed
143. Artikel
144. Toon context
145. ISI
146. PubMed
147. Artikel
148. Toon context
149. Toon context
150. Toon context
151. CAS
152. ISI
153. PubMed
154. Artikel
155. Toon context
156. CAS
157. ISI
158. PubMed
159. Artikel
160. Toon context
161. CAS
162. ISI
163. PubMed
164. Artikel
165. Toon context
166. CAS
167. ISI
168. PubMed
169. Artikel
170. Toon context
171. CAS
172. ISI
173. PubMed
174. Toon context
175. CAS
176. ISI
177. PubMed
178. Artikel
179. Toon context
180. PubMed
181. Artikel
182. Toon context
183. CAS
184. ISI
185. PubMed
186. Artikel
187. Toon context
188. CAS
189. ISI
190. PubMed
191. Artikel
192. Toon context
193. CAS
194. ISI
195. PubMed
196. Artikel
197. Toon context
198. CAS
199. ISI
200. PubMed
201. Artikel
202. Toon context
203. Toon context
204. CAS
205. ISI
206. PubMed
207. Toon context
208. Toon context
209. Toon context
210. Toon context
211. CAS
212. ISI
213. PubMed
214. Artikel
215. Toon context
216. CAS
217. PubMed
218. Artikel
219. Toon context
220. CAS
221. ISI
222. PubMed
223. Toon context
224. Toon context
225. CAS
226. PubMed
227. Artikel
228. Toon context
229. ISI
230. PubMed
231. Artikel
232. Toon context
233. Toon context
234. ISI
235. PubMed
236. Artikel
237. Toon context
238. Toon context
239. CAS
240. ISI
241. PubMed
242. Artikel
243. Toon context
244. Toon context
245. Vogt, MC & Bruning, JC CNS-insulinesignalering bij de controle van energiehomeostase en glucosemetabolisme - van embryo tot ouderdom. Trends Endocrinol. Metab. 24, 76-84 (2013).
246. Havrankova, J., Schmechel, D., Roth, J. & Brownstein, M. Identificatie van insuline in rattenhersenen. Proc. Natl Acad. Sci. USA 75, 5737-5741 (1978).
247. King, GL & Johnson, S. Receptor-gemedieerd transport van insuline door endotheelcellen. Science 227, 1583-1586 (1985).
248. Strubbe, JH, Porte, D. Jr & Woods, SC Insulinereacties en glucosespiegels in plasma en cerebrospinale vloeistof tijdens vasten en hervoeding bij de rat. Physiol. Gedrag. 44, 205-208 (1988).
249. Banks, WA & Kastin, AJ Differentiële permeabiliteit van de bloed-hersenbarrière voor twee pancreaspeptiden: insuline en amyline. Peptides 19, 883-889 (1998).
250. Banks, WA De bron van cerebrale insuline. EUR. J. Pharmacol. 490, 5-12 (2004).
251. Nemoto, T. c.s.. Nieuwe inzichten met betrekking tot de insulinesynthese en de secretie ervan in de hippocampus van de rat en de hersenschors: amyloïde-β1-42-geïnduceerde verlaging van het niveau van pro-insuline via glycogeen synthase kinase-3β. Cell Signal. 26, 253-259 (2014).
252. De Souza, CT c.s.. Consumptie van een vetrijk dieet activeert een pro-inflammatoire reactie en induceert insulineresistentie in de hypothalamus. Endocrinologie 146, 4192-4199 (2005).
253. Anthony, K. c.s.. Verzwakking van door insuline opgewekte reacties in hersennetwerken die de eetlust en beloning in insulineresistentie regelen: de cerebrale basis voor verminderde controle van voedselinname bij het metabool syndroom? Diabetes 55, 2986-2992 (2006).
254. Kelley, AE & Berridge, KC De neurowetenschap van natuurlijke beloningen: relevantie voor verslavende medicijnen. J. Neurosci. 22, 3306-3311 (2002).
255. Koob, GF & Volkow, ND Neurocircuit van verslaving. Neuropsychopharmacology 35, 217-238 (2010).
256. Werther, GA c.s.. Lokalisatie en karakterisering van insulinereceptoren in de hersenen van de rat en de hypofyse met behulp van in vitro autoradiografie en geautomatiseerde densitometrie. Endocrinologie 121, 1562-1570 (1987).
257. Figlewicz, DP, Evans, SB, Murphy, J., Hoen, M. & Baskin, DG Expressie van receptoren voor insuline en leptine in ventraal tegmentaal gebied / substantia nigra (VTA / SN) van de rat. Brain Res. 964, 107-115 (2003).
258. Daws, LC c.s.. Insulinesignalering en verslaving. Neurofarmacologie 61, 1123-1128 (2011).
259. Figlewicz, DP & Sipols, AJ Energieregulerende signalen en voedselbeloning. Pharmacol. Biochem. Gedrag. 97, 15–24 (2010).
260. Patterson, TA c.s.. Voedseldeprivatie vermindert mRNA en activiteit van de ratten-dopaminetransporteur. Neuro-endocrinologie 68, 11-20 (1998).
261. Carvelli, L. c.s.. PI 3-kinase regulatie van dopamine-opname. J. Neurochem. 81, 859-869 (2002).
262. Williams, JM c.s.. Hypoinsulinemie reguleert door amfetamine geïnduceerd reverse transport van dopamine. PLoS Biol. 5, e274 (2007).
263. Zhen, J., Reith, MEA & Carr, KD Chronische voedselbeperking en dopaminetransportfunctie in rattenstriatum. Brain Res. 1082, 98-101 (2006).
264. Schoffelmeer, AN c.s.. Insuline moduleert de cocaïnegevoelige monoamineretransportfunctie en het impulsieve gedrag. J. Neurosci. 31, 1284-1291 (2011).
265. Mebel, DM, Wong, JC, Dong, YJ & Borgland, SL Insuline in het ventrale tegmentale gebied vermindert hedonistische voeding en onderdrukt de dopamineconcentratie via verhoogde heropname. EUR. J. Neurosci. 36, 2336-2346 (2012).
266. Labouebe, G. c.s.. Insuline induceert langdurige depressie van ventrale tegmentale gebieden dopamine neuronen via endocannabinoïden. Nat. Neurosci. 16, 300-308 (2013).
267. Konner, AC c.s.. De rol van insulinesignalering bij catecholaminerge neuronen die de energiehomeostase regelen. Cel Metab. 13, 720-728 (2011).
268. Figlewicz, DP, Bennett, JL, Aliakbari, S., Zavosh, A. & Sipols, AJ Insuline werkt op verschillende CZS-locaties om de acute sucrose-inname en sucrose-zelftoediening bij ratten te verminderen. Ben. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 295, R388-R394 (2008).
269. Patel, JC, Witkovsky, P., Coetzee, WA & Rice, ME Subseconde regulatie van striatale dopamine-afgifte door presynaptische K_ATP kanalen. J. Neurochem. 118, 721-736 (2011).
270. Tepper, JM & Bolam, JP Functionele diversiteit en specificiteit van neostriatale interneuronen. Curr. Opin. Neurobiol. 14, 685-692 (2004).
271. Zhou, FM, Liang, Y. & Dani, JA Endogene nicotine cholinerge activiteit reguleert de afgifte van dopamine in het striatum. Nat. Neurosci. 4, 1224-1229 (2001).
272. Rice, ME & Cragg, SJ Nicotine versterkt beloningsgerelateerde dopaminesignalen in striatum. Nat. Neurosci. 7, 583-584 (2004).
273. Zhang, H. & Sulzer, D. Frequentieafhankelijke modulatie van dopamine-afgifte door nicotine. Nat. Neurosci. 7, 581-582 (2004).
274. Patel, JC, Rossignol, E., Rice, ME & Machold, RP Tegengestelde regulatie van striatale dopamine-afgifte en verkennend motorisch gedrag door cholinerge inputs van de voorhersenen en hersenstam. Nat. Commun. 3, 1172 (2012).
275. Threlfell, S. c.s.. Striatale dopamine-afgifte wordt veroorzaakt door synchrone activiteit in cholinerge interneuronen. Neuron 75, 58-64 (2012).
276. Cachope, R. c.s.. Selectieve activering van cholinerge interneuronen verhoogt de accumulatie van fasische dopamine afgifte: de toon zetten voor de verwerking van beloningen. Cell Rep. 2, 1-9 (2012).
277. Jones, IW, Bolam, JP & Wonnacott, S.Presynaptische lokalisatie van de nicotine acetylcholinereceptor beta2-subeenheid immunoreactiviteit in nigrostriatale dopaminerge neuronen van ratten. J. Comp. Neurol. 439, 235-247 (2001).
278. Higley, MJ c.s.. Cholinergische interneuronen mediëren snelle VGluT3-afhankelijke glutamaterge transmissie in het striatum. PLoS ONE 6, e19155 (2011).
279. Touzani, K., Bodnar, R. & Sclafani, A. Activering van dopamine D1-achtige receptoren in nucleus accumbens is van cruciaal belang voor de verwerving, maar niet de expressie, van door voedingsstoffen geconditioneerde smaakvoorkeuren bij ratten. EUR. J. Neurosci. 27, 1525-1533 (2008).
280. Sclafani, A., Touzani, K. & Bodnar, RJ Dopamine en geleerde voedselvoorkeuren. Physiol. Gedrag. 104, 64-68 (2011).
281. Mayer, CM & Belsham, DD Centrale insulinesignalering wordt verzwakt door langdurige insulineblootstelling via insulinereceptorsubstraat-1 serinefosforylering, proteasomale afbraak en lysosomale insulinereceptorafbraak. Endocrinology 151, 75-84 (2010).
282. Rice, ME, Patel, JC & Cragg, SJ Dopamine-afgifte in de basale ganglia. Neuroscience 198, 112–137 (2011).
283. Smith, Y., Surmeier, DJ, Redgrave, P. & Kimura, M. Thalamic-bijdragen aan basale ganglia-gerelateerde gedragsverandering en versterking. J. Neurosci. 31, 16102-16106 (2011).
284. Threlfell, S. c.s.. Striatale muscarinereceptoren bevorderen de activiteitsafhankelijkheid van dopamine-overdracht via verschillende receptorsubtypen op cholinerge interneuronen in ventrale versus dorsale striatum. J. Neurosci. 30, 3398-3408 (2010).
285. Hoebel, BG, Avena, NM & Rada, P. Accumbens dopamine-acetylcholine-balans in nadering en vermijding. Curr. Opin. Pharmacol. 7, 617-627 (2007).
286. Pothos, EN, Creese, I. & Hoebel, BG Beperkt eten met gewichtsverlies vermindert selectief extracellulaire dopamine in de nucleus accumbens en verandert de dopamine-respons op amfetamine, morfine en voedselinname. J. Neurosci. 15, 6640-6650 (1995).
287. Geiger, BM c.s.. Tekorten van mesolimbische dopamine neurotransmissie bij ratten obesitas bij de rat. Neuroscience 159, 1193-1199 (2009).
288. Morris, JK c.s.. Insulineresistentie verslechtert de nigrostriatale dopaminefunctie. Exp. Neurol. 231, 171-180 (2011).
289. De Araujo, IE c.s.. Voedselbeloning in afwezigheid van signaalreceptorsignalering. Neuron 57, 930-941 (2008).
290. Stice, E., Spoor, S., Bohon, C. & Small, DM De relatie tussen obesitas en afgestompte striatale respons op voedsel wordt gemodereerd door TaqIA A1-allel. Science 322, 449-452 (2008).
291. Wang, GJ c.s.. Hersenen dopamine en obesitas. Lancet 357, 354-357 (2001).
292. Johnson, PM & Kenny, PJ Dopamine D2-receptoren bij verslavingsachtige beloningsstoornissen en dwangmatig eten bij zwaarlijvige ratten. Nat. Neurosci. 13, 635-641 (2010).
293. Carr, KD, Kim, G.-Y. & Cabeza de Vaca, S. Belonende en locomotor-activerende effecten van directe dopaminereceptoragonisten worden versterkt door chronische voedselbeperking bij ratten. Psychopharmacology (Berl.) 154, 420-428 (2001).
294. Levin, BE & Keesey, RE Verdediging van verschillende instelpunten voor het lichaamsgewicht bij door voeding geïnduceerde zwaarlijvige en resistente ratten. Ben. J. Physiol. 274, R412-R419 (1998).
295. Patel, JC & Rice, ME Monitoring van axonale en somatodendritische dopamine-afgifte met behulp van cyclische voltammetrie met snelle scan in hersenplakken. Methods Mol. Biol. 96, 243-273 (2013).
296. Lee, CR, Witkovsky, P. & Rice, ME Regulatie van substantia nigra pars reticulata GABAergische neuronactiviteit door H₂O₂ via flufenaminezuurgevoelige kanalen en K_ATP kanalen. Voorkant. Syst. Neurosci. 5, 14 (2011).
297. Chen, BT, Moran, KA, Avshalumov, MV & Rice, ME Beperkte regulering van somatodendritische dopamine-afgifte door spanningsgevoelige Ca²⁺ kanalen in contrast met sterke regulatie van axonale dopamine-afgifte. J. Neurochem. 96, 645-655 (2006).
298. Li, X. c.s.. Verbeterde striatale dopamine transmissie en motorische prestaties met LRRK2 overexpressie bij muizen wordt geëlimineerd door familiaire Parkinson-mutatie G2019S. J. Neurosci. 30, 1788-1797 (2010).
299. Wu, Q., Reith, MEA, Wightman, RM, Kawagoe, KT & Garris, PA Bepaling van afgifte- en opnameparameters van elektrisch opgewekte dopamine-dynamica gemeten door real-time voltammetrie. J. Neurosci. Methods 112, 119–133 (2001).
300. Chen, BT, Avshalumov, MV & Rice, ME H₂O₂ is een nieuwe, endogene modulator van synaptische dopamine-afgifte. J. Neurophysiol. 85, 2468-2476 (2001).
301. Witkovsky, P., Patel, JC, Lee, CR & Rice, ME Immunocytochemische identificatie van eiwitten die betrokken zijn bij de afgifte van dopamine uit het somatodendritische compartiment van nigrale dopaminerge neuronen. Neuroscience 164, 488-496 (2009).
302. Sugimoto, K. c.s.. Insuline-receptor in de perifere zenuw van de rat: de locatie en alternatief gesplitste isovormen. Diabetes Metab. Res. Rev. 16, 354-363 (2000).
303. Sanchez-Alavez, M. c.s.. Insuline veroorzaakt hyperthermie door directe remming van warmgevoelige neuronen. Diabetes 59, 43-50 (2010).
304. Paxinos, G. & Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates 6th edn Academic (2007).
305. Strubbe, JH & Mein, CG Verhoogde voeding als reactie op bilaterale injectie van insuline-antilichamen in de VMH. Physiol Behav. 19, 309-313 (1977).
306. Paranjape, SA c.s.. Invloed van insuline in de ventromediale hypothalamus op de uitscheiding van glucagon van de pancreas in vivo. Diabetes 59, 1521-1527 (2010).
307. Wise, RA & Hoffman, DC Lokalisatie van beloningsmechanismen voor geneesmiddelen door intracraniële injecties. Synapse 10, 247-263 (1992).
308. Zhen, J., Maiti, S., Chen, N., Dutta, AK & Reith, MEA Interactie tussen een hydroxypiperidine-analoog van 4- (2-benzhydryloxy-ethyl) -1- (4-fluorbenzyl) piperidine en aspartaat 68 in de menselijke dopaminetransporteur. EUR. J. Pharmacol. 506, 17-26 (2004).

Referenties downloaden

Deze onderzoeken werden ondersteund door NIH-subsidies DA033811 (MER, KDC en MEAR), NS036362 (MER), DA03956 (KDC) en een NARSAD Independent Investigator Award (KDC). S961 was een genereus geschenk van Dr. Lauge Schaffer, Novo Nordisk. PP5-antilichaam was een genereus geschenk van Pfizer. We danken dr. Charles Nicholson, NYU School of Medicine voor het extraheren van software V_max waarden van FCV-gegevens.