Een ghreline-receptor (GHS-R1A) -antagonist verzwakt de belonende eigenschappen van morfine en verhoogt de opioïde peptideniveaus in beloningsgebieden bij muizen (2015)

Acute en chronische blootstelling aan verslavende geneesmiddelen heeft een grote invloed op het mesolimbische dopaminesysteem, een belangrijk sleutelcircuit van de beloningssystemen voor de hersenen (Nestler, 2005). Deze effecten zijn voorgesteld om, tenminste gedeeltelijk, ten grondslag te liggen aan de ontwikkeling van drugsverslaving (Wise, 2004). Drugsverslaving veroorzaakt een breed scala van schadelijke effecten voor zowel het individu als de samenleving en nieuwe farmacologische interventies, die dit grote probleem voor de volksgezondheid behandelen, zijn gerechtvaardigd (Koob en Le Moal, 2001). Door het verduidelijken van de signaleringssystemen die het vermogen van verslavende geneesmiddelen mediëren om het mesolimbische dopaminesysteem te activeren, kunnen unieke behandelingsstrategieën voor stoornissen in het gebruik van stoffen worden geïdentificeerd.

Onderzoek heeft aangetoond dat gemeenschappelijke neurobiologische mechanismen de inname van en beloning veroorzaakt door voedsel en verslavende middelen reguleren (Morganstern et al., 2011), waarbij wordt voorgesteld dat de voedselregulerende darmhersenpeptiden zoals ghreline beloningsbemiddeling omvatten. Aanvankelijk werd aangetoond dat ghreline afgifte van groeihormoon veroorzaakt (Kojima et al., 1999) en adipositas bij ratten induceert (Tschop et al., 2000). Tot op heden is het bekend dat ghrelin de voedselinname, honger verhoogt en de eetlust stimuleert via hypothalamische circuits (voor een overzicht zie Egecioglu et al. (2011)). Naast de hypothalamus worden ghreline-receptoren (GHS-R1A) uitgedrukt in beloningsgerelateerde gebieden zoals de amygdala, striatum, prefrontale cortex, ventraal tegmentaal gebied (VTA) en hippocampus (voor een overzicht zie Engel en Jerlhag (2014)), wat impliceert dat de fysiologische rol van ghreline uitstrekt voorbij energie homeostase regelgeving. Het orexigene peptide ghreline bleek inderdaad een activator te zijn van het mesolimbische dopaminesysteem, evenals een regulator van beloning, motivatie en inname van alcohol, nicotine, amfetamine en cocaïne bij muizen (voor een overzicht zie Engel en Jerlhag (2014)).

Opioïden activeren, net als andere verslavende geneesmiddelen, het mesolimbische dopaminesysteem waardoor dopamine-afgifte wordt opgehoopt via activering van μ- en / of δ-opioïde receptoren in de nucleus accumbens (NAc) (Hirose et al., 2005, Murakawa et al., 2004, Yoshida et al., 1999) en in de VTA, vermoedelijk door het verlagen van de GABA -inhibitie van dopamine-neuronen (Johnson and North, 1992). Bovendien reguleren accumale K-opioïde receptoren de activiteit van mesolimbisch dopamine-systeem (Chefer et al., 2005, Spanagel et al., 1992). Herhaalde blootstelling aan opioïden produceert adaptieve veranderingen van verschillende neurotransmitters, waaronder opioïde peptiden, in beloningsgebieden die bijdragen aan de ontwikkeling van verslaving (De Vries en Shippenberg, 2002). Bij ratten verzwakt farmacologische onderdrukking van de GHS-R1A door morfine geïnduceerde accumulatie van dopamine-afgifte evenals stereotypisch gedrag (Sustkova-Fiserova et al., 2014). Het doel van het eerste deel van de huidige serie experimenten was het onderzoeken van het acute effect van een GHS-R1A-antagonist, JMV2959, op het vermogen van morfine om een ​​locomotorische stimulatie te veroorzaken, ophoping van dopamine-afgifte en geconditioneerde plaatsvoorkeur bij muizen. Het doel van het tweede deel van deze studie was om het effect van herhaalde behandeling met JMV2959 of ghrelin op opioïde peptideniveaus te evalueren (Met-enkefaline-Arg⁶Phe⁷ (MEAP), dynorfine B (DynB) en Leu-enkefaline-Arg⁶ (LeuArg)) in beloningsgerelateerde gebieden, waaronder de amygdala, striatum, prefrontale cortex, VTA en hippocampus.

Volwassen post-puberale, aan leeftijd aangepaste mannelijke NMRI-muizen (8-12 weken oud en 25-40 g lichaamsgewicht; Charles River, Sulzfeld, Duitsland) werden gebruikt. In het kort werden alle muizen in een groep gehuisvest en bij een 12 / 12 h licht / donker cyclus gehouden (lichten op om 7 uur). Kraanwater en voedsel (normale voeding, Harlan Teklad, Norfolk, Engeland) werden geleverd ad libitum, behalve tijdens de experimentele opstellingen. Nieuwe muizen werden gebruikt voor elke afzonderlijke gedragstest alsook voor de opioïde peptide-analyse. De experimenten werden goedgekeurd door de Zweedse ethische commissie voor dieronderzoek in Göteborg. Alle inspanningen werden geleverd om dierenleed te minimaliseren en om het aantal gebruikte dieren te verminderen. Alle dieren mochten minimaal één week voor aanvang van de experimenten acclimatiseren.

Morfinehydrochloride (Apoteksbolaget Sahlgrenska Hospital, Göteborg, Zweden) werd opgelost in een drager (0.9% natriumchloride-oplossing) en werd ip toegediend met een dosis 20 mg / kg 10 min voorafgaand aan de start van het experiment. Deze dosis werd gekozen omdat een lagere dosis (10 mg / kg, ip) geen locomotorstimulatie veroorzaakte bij onze muizen (gegevens niet getoond). De geselecteerde dosis (6 mg / kg, ip) van JMV2959 (gesynthetiseerd aan het Institut des Biomolécules Max Mousseron (IBMM), UMR5247, CNRS, Montpellier 1 en 2 Universities, Frankrijk), een GHS-R1A-antagonist, werd eerder bepaald en heeft geen effect op de locomotorische activiteit, geaccumuleerde dopamine-afgifte en geconditioneerde plaatsvoorkeur bij muizen (Jerlhag et al., 2009). JMV2959 werd opgelost in een drager (0.9% natriumchloride-oplossing) en werd altijd 20 minuten voorafgaand aan blootstelling aan morfine of onthoofding toegediend voor analyse van opioïde peptideniveaus. De geselecteerde dosis JMV2959 had geen invloed op het grove gedrag van muizen in een willekeurig experiment. Voor de gedragstests werd JMV2959 acuut toegediend, omdat uit onze doorzichtige onderzoeken blijkt dat een enkele injectie met JMV2959 de door geneesmiddelen geïnduceerde beloning vermindert (voor een overzicht zie Engel en Jerlhag (2014)). JMV2959 werd subchronisch gedurende vijf opeenvolgende dagen toegediend voor de opioïde peptide-analyse om de mogelijkheid om een ​​robuust effect te detecteren te vergroten. Bovendien vermijdt u met herhaalde injecties het mogelijke verstorende effect van acute injectiestress op peptiden. Geacyleerde ghreline van de rat (Bionuclear; Bromma, Zweden) werd verdund in 0.9% natriumchloride en de geselecteerde dosis van ghrelin (0.33 mg / kg, ip) heeft eerder aangetoond dat het beloning in muizen veroorzaakt (Jerlhag, 2008). Een uitgebalanceerd ontwerp werd gebruikt voor alle drugsproblemen.

Eerdere studies hebben aangetoond dat morfine een locomotorische stimulatie veroorzaakt bij knaagdieren (Wise en Bozarth, 1987). Locomotorische activiteit werd geregistreerd in acht geluidgedempte, geventileerde en zwak verlichte locomotorboxen (420 × 420 × 200 mm, Kungsbacka mät- och reglerteknik AB; Fjärås, Zweden). Vijf bij vijf rijen fotocelbundels, op het vloerniveau van de doos, waardoor fotoceldetectie mogelijk was, liet een op een computer gebaseerd systeem toe om de activiteit van de muizen te registreren. Locomotorische activiteit werd gedefinieerd als het geaccumuleerde aantal nieuwe fotocelbundels onderbroken gedurende een 60-min-periode. Bij alle experimenten mochten de muizen één uur voorafgaand aan de geneesmiddeluitdagingen gewend zijn aan de locomotoreactievak. Er waren geen verschillen tussen gewenning in een van de behandelingsgroepen (gegevens niet getoond).

In de eerste serie experimenten werden de effecten van JMV2959 (6 mg / kg, ip) op morfine-geïnduceerde (20 mg / kg, ip) locomotorstimulatie onderzocht. JMV2959 werd 20 min vóór morfine toegediend en de activiteitsregistratie startte tien minuten na de laatste injectie. Elke muis ontving één behandelcombinatie (vehikel / voertuig, JMV2959 / drager, morfine / drager of JMV2959 / morfine; n= 8 per behandelcombinatie) en werd slechts aan één experimentele proef onderworpen.

Om de effecten van JMV2959 op de lonende effecten van morfine in nieuwe muizen te evalueren, werden geconditioneerde place preferenceesten getest in muizen zoals eerder beschreven (Jerlhag, 2008). In het kort werd een CPP-apparaat met twee kamers gebruikt, met 45 lx-verlichting en verschillende visuele en tactiele signalen. Eén compartiment werd gedefinieerd door zwart en wit gestreepte muren en door een donkere gelamineerde vloer terwijl de andere een wit geschilderde houten vloer en muren met houten textuur had. De procedure bestond uit voorconditionering (dag 1), conditionering (dagen 2-5) en na-conditionering (dag 6). Bij preconditionering werden muizen ip met vehiculum geïnjecteerd en werd ze in de kamer geplaatst met vrije toegang tot beide compartimenten gedurende 20 min om de voorkeur voor de eerste plaats (of zijkant) te bepalen. Conditionering (20 min per sessie) werd uitgevoerd met behulp van een vooringenomen procedure waarbij morfine (20 mg / kg) gepaard was met het compartiment met de minste voorkeur en drager met het voorkeurscompartiment. Alle muizen ontvingen elke dag één injectie van morfine en van het vehiculum en de injecties werden tussen ochtend en middag veranderd in een evenwichtsontwerp. Bij post-conditioning van de muizen (n= 16) werden geïnjecteerd met JMV2959 (6 mg / kg, ip) of een gelijk volume voertuigoplossing en 20 min. Later geplaatst op de middellijn tussen de twee compartimenten met vrije toegang tot beide compartimenten voor 20 min (waardoor de volgende behandelingsgroepen werden gecreëerd; Morph-Veh en Morph-JMV2959).

Voorkeursplaats voorkeur werd berekend als het verschil in% van de totale tijd doorgebracht in de drug-gepaarde (d.w.z. minst geprefereerd) compartiment tijdens de na-conditionering en de pre-conditioneringssessie.

Aangezien JMV2959 de door morfine geïnduceerde locomotorische stimulatie en geconditioneerde plaatsvoorkeur bij muizen verzwakt, werd het effect van JMV2959 (6 mg / kg, ip) op morfine-geïnduceerde (20 mg / kg, ip) accuma- bale dopamine-afgifte onderzocht met behulp van in vivo microdialyse bij vrij bewegende muizen. Voor metingen van extracellulaire dopaminegehalten werden muizen unilateraal geïmplanteerd met een microdialysesonde gepositioneerd in de nucleus accumbens. Daarom werden de muizen geanesthetiseerd met isofluran (Isofluran Baxter, Univentor 400 anesthesie-eenheid, Univentor Ldt., Zejtun, Malta), geplaatst in een stereotaxisch frame (David Kopf Instruments; Tujunga, CA, VS) en op een verwarmingskussen gehouden om te voorkomen dat hypothermie. Xylocain adrenaline (5 μg / ml; Pfizer Inic; New York, VS) werd gebruikt als lokale anesthetica en carprofen (Rimadyl, 5 mg / kg ip) (Astra Zeneca; Gothenburg, Zweden) werd gebruikt om mogelijke pijn te verlichten. Het schedelbot werd blootgelegd en een gat voor de sonde en een gat voor de verankeringsschroef werden geboord. De sonde werd willekeurig afgewisseld naar de linker- of de rechterkant van de hersenen. De coördinaten van 1.5 mm vóór de bregma, ± 0.7 lateraal naar de middellijn en 4.7 mm onder het oppervlak van het hersenoppervlak werden gebruikt voor de nucleus accumbens (Franklin en Paxinos, 1997). De blootgestelde punt van het dialysemembraan (20,000 kDa afgesneden met een od / id van 310 / 220 μm, HOSPAL, Gambro, Lund, Zweden) van de sonde was 1 mm. Alle sondes werden chirurgisch geïmplanteerd twee dagen voorafgaand aan het experiment. Na de operatie werden de muizen tot de testdag in afzonderlijke kooien gehouden (Macrolon III).

Op de testdag was de sonde verbonden met een microperfusiepomp (U-864 spuitpomp; AgnThós AB) en geperfundeerd met Ringer-oplossing met een snelheid van 1.5 μl / min. Na één uur gewenning aan de microdialyseopstelling werden per 20 min perfusiemonsters verzameld. Het baseline dopaminegehalte werd gedefinieerd als het gemiddelde van drie opeenvolgende monsters vóór de eerste geneesmiddel / drageruitdaging, en de toename van dopamine in de accumulatie werd berekend als het percentage toename ten opzichte van de uitgangswaarde. Na de basislijnmonsters (-40 min tot 0 min) werden muizen geïnjecteerd met JMV2959 of drager (op 0 min.), Gevolgd door een morfine- of vehikelinjectie (bij 20 min). Na deze medicijntoedieningen werden nog eens acht 20 min-monsters verzameld. Collectief de volgende behandelingsgroepen (n= 8 in elke groep) werden gecreëerd: voertuig-voertuig (Veh-Veh), voertuig-morfine (Veh-Morph), JMV2959-voertuig (JMV2959-Veh) en JMV2959-morfine (JMV2959-Morph).

De dopaminegehalten in de dialysaten werden bepaald met HPLC met elektrochemische detectie. Een pomp (Gyncotec P580A, Kovalent AB, V. Frölunda, Zweden), een ionenwisselingskolom (2.0 × 100 mm, Prodigy 3 μm SA; Skandinaviska GeneTec AB; Kungsbacka, Zweden) en een detector (Antec Decade; Antec Leyden; Zoeterwoude , Nederland) uitgerust met een VT-03 stroomcel (Antec Leyden) werden gebruikt. De mobiele fase (pH 5.6), bestaande uit sulfonzuur 10 mM, citroenzuur 200 mM, natriumcitraat 200 mM, 10% EDTA, 30% MeOH, werd onder vacuüm gefiltreerd met behulp van een 0.2 μm-membraanfilter (GH Polypro; PALL Gelman Laboratory; Lund, Zweden). De mobiele fase werd afgegeven met een stroomsnelheid van 0.2 ml / min door een ontgasser (Kovalent AB) en de analyt werd geoxideerd bij + 0.4 V.

Nadat de microdialyse-experimenten waren voltooid, werden de muizen onthoofd en werden de sondes geperfundeerd met pontamine sky blue 6BX om probe lokalisatie te vergemakkelijken. De hersenen werden op een vibro-schijfapparaat (752 M Vibroslice; Campden Instruments Ltd., Loughborough, VK) gemonteerd en in 50 μm-coupes gesneden. De locatie van de probe werd bepaald door middel van grove observatie met behulp van lichtmicroscopie. De exacte positie van de sonde werd geverifieerd (Franklin en Paxinos, 1997) en alleen muizen met correcte plaatsing werden gebruikt in de statistische analyse.

De effecten van de behandeling met JMV2959 op de niveaus van MEAP, DynB en LeuArg in beloningsgerelateerde gebieden werden onderzocht. Muizen werden geïnjecteerd met JMV2959 (6 mg / kg, ip, n= 8) of een gelijk volume voertuig (ip, n= 8) gedurende vijf opeenvolgende dagen. 20 min na de laatste injectie werden de muizen opgeofferd en de hersenen van deze muizen werden verzameld. Afzonderlijke muizen werden geïnjecteerd met ofwel ghreline (0.33 mg / kg, ip, n= 8) of een gelijk volume voertuig (ip, n= 8) gedurende vijf opeenvolgende dagen. Vijf minuten na de laatste injectie werden de muizen opgeofferd en de hersenen van deze muizen werden verzameld. De amygdala, striatum, prefrontale cortex, VTA en hippocampus werden snel ontleed en onmiddellijk op droog ijs gezet en vervolgens bij -80 ° C opgeslagen tot verdere verwerking.

De homogenisatie- en peptide-extractieprocedures volgden een standaardprocedure, eerder in detail beschreven (Nylander et al., 1997). In het kort werd warm (95 ° C) azijnzuur (1 M) aan de bevroren monsters toegevoegd. De monsters werden verwarmd in een waterbad (95 ° C) gedurende 5 min, gekoeld op ijs en vervolgens gehomogeniseerd met een Branson Sonifier (Danbury, CT, VS). Het homogenaat werd opnieuw verwarmd bij 95 ° C gedurende 5 min en afgekoeld op ijs vóór centrifugatie voor 15 min bij 4 ° C en 12,074 ×g in een Beckman GS-15R centrifuge (Fullerton, CA, VS). De extracten werden verder gezuiverd volgens een eerder beschreven procedure (Nylander et al., 1997). Twee fracties werden verzameld: fractie III (Leu-Arg en MEAP) en fractie V (DynB). De monsters werden gedroogd in een vacuümcentrifuge (Savant SpeedVac Plus SC210A; Thermo Scientific Inc., Waltham, MA USA) en bewaard in de vriezer (-20 ° C) tot peptide-analyse.

De immunoreactieve (ir) niveaus van DynB, LeuArg en MEAP werden geanalyseerd met goed vastgestelde radioimmunoassays en de protocollen zijn elders in detail beschreven (Nylander et al., 1997). In de DynB-assay werd anti-konijn-IgG van geit (GARGG; Bachem, Bubendorf, Zwitserland) gebruikt om vrij en aan antilichaam gebonden peptide te scheiden. Het Dyn-antiserum (113 +) werd gebruikt in een uiteindelijke verdunning van 1: 600000. De kruisreactiviteit met grote Dyn was 100% en met DynB (1-29) 1%. Er werd geen kruisreactiviteit met andere opioïde peptiden waargenomen. In de LeuArg- en MEAP-assays werd een houtskoolsuspensie gebruikt om vrij en aan antilichaam gebonden peptide te scheiden. Voor het LeuArg-antiserum (91: 6D +, uiteindelijke verdunning 1: 60000) was de kruisreactiviteit minder dan 0.01% voor Leu-enkefaline en MEAP, 0.02% voor DynB, 0.04% voor DynA en 0.08% voor alpha-neoendorphin. Het MEAP-antiserum 90: 3D (II) werd gebruikt in een uiteindelijke verdunning van 1: 160 000. Kruisreactiviteit met Met-enkefaline, Met-enkefaline-Arg⁶, Met-enkephalin-Arg⁶Gly⁷Leeuw⁸Leu-enkefaline en Leu-enkefaline-Arg⁶ was <0.1%

Een algemeen hoofdeffect van de behandeling werd gevonden op de locomotorische activiteit bij muizen na systemische toediening van morfine (20 mg / kg) en JMV2959 (6 mg / kg) (F (3,27) = 7.409, P= 0.0009; n= 8 voor Veh-Veh, JMV2959-Veh, JMV2959-Morph en n= 7 voor Veh-Morph). Zoals getoond in Figuur 1A, posthoc-analyse onthulde dat voorbehandeling met een enkele injectie met JMV2959 (P<0.001) verminderde significant de door morfine geïnduceerde locomotorische stimulatie (P<0.01 Veh-Veh vs Veh-Morph). De geselecteerde dosis JMV2959 had geen effect op de locomotorische activiteit in vergelijking met de behandeling van het voertuig (P> 0.05). Er was geen verschil in locomotorische activiteitsrespons bij met vehikel behandelde muizen en met JMV2959-morfine behandelde muizen (P> 0.05).

  

Figuur 1

De GHS-R1A-antagonist JMV2959 verzwakt morfine-geïnduceerde locomotorstimulatie, accuma- le dopamineafgifte en geconditioneerde plaatsvoorkeur bij muizen. (A) Morfine-geïnduceerde (20 mg / kg ip) locomotorische stimulatie werd verzwakt door een enkele injectie van JMV2959 (6 mg / kg ip) (n= 7-8 in elke groep; **P<0.01, ***P<0.001 eenmalige ANOVA gevolgd door een Bonferroni post-hoc test). (B) De door morfine geïnduceerde (20 mg / kg ip) conditieplaatsvoorkeur (CPP) werd verzwakt door een acute enkele injectie van JMV2959 (6 mg / kg ip) bij muizen (n= 8 in elke groep, *P<0.05, ongepaarde t-test). (C) Eerst hebben we een significant effect aangetoond van morfine (20 mg / kg ip) om de dopamine-afgifte te verhogen in vergelijking met voertuigbehandeling (tijdsinterval 40-180 min (P<0.001), Veh – Veh vs Veh-Morph). Zoals aangetoond in (C), verminderde voorbehandeling met JMV2959 (6 mg / kg ip) de morfine-geïnduceerde toename in dopamine-afgifte in vergelijking met de voorbehandeling van het voertuig in het tijdsinterval 40-100 en 140-180 min (^##P<0.01, ^###P <0.001, JMV2959-Morph vergeleken met Veh-Morph-behandeling). De geselecteerde dosis JMV2959 had geen significant effect op de accumulatie van dopamine-afgifte in vergelijking met voertuigbehandeling op enig tijdsinterval (P> 0.05, Veh – Veh vs JMV2959-Veh). JMV2959 reduceerde, maar blokkeerde niet volledig, de door morfine teweeggebrachte dopamine-afgifte per dag met tijdsinterval 60-140 (*P<0.05, **P<0.01, ***P <0.001, JMV2959-Morph vergeleken met Veh-Morph-behandeling). Pijlen vertegenwoordigen tijdstippen van injectie van JMV2959, drager en morfine. Gegevens geanalyseerd met een tweeweg ANOVA gevolgd door een Bonferroni post-hoc test (n= 8 in elke groep). Veh-veh (Square), Veh-Morph (rhomb), JMV2959-Veh (Triangle), JMV2959-Morph (cirkel). Alle waarden vertegenwoordigen het gemiddelde ± SEM.

Bekijk grote afbeelding | Bekijk Hi-Res Image | Download PowerPoint-dia

De door morfine geïnduceerde locatievoorkeur (20 mg / kg) (Morph-Veh) was significant verzwakt door een acute enkele injectie van JMV2959 (6 mg / kg) (Morph-JMV2959) op de post-conditioneringsdag (P= 0.025, n= 8 in elke groep; Figuur 1B).

Accumbal microdialyse metingen van dopamine bij muizen toonden een algemeen hoofdeffect van de behandeling aan (F(3,33) = 24.15, P<0.0001), tijd F(11,308) = 7.05, P<0.0001) en behandeling × tijdinteractie (F(11,308) = 8.63, P<0.0001) (Figuur 1C; n= 8 in elke groep). Morfine verhoogde de dopamine-afgifte in het bloed ten opzichte van de behandeling met het medium 40-180 min (P<0.001). Zoals getoond in Figuur 1C dit effect werd verminderd door voorbehandeling met JMV2959 met tijdsinterval 40-80 (P<0.01), 100 (P<0.001), 140 (P<0.01) en 160-180 min (P<0.001). JMV2959 verminderde, maar blokkeerde niet volledig, de door morfine geïnduceerde accumulatie van dopamine-afgifte, aangezien er een verschil was tussen vehiculumbehandeling en JMV2959-morfinebehandeling met een tijdsinterval van 60-80 (P<0.01), 100 (P<0.001), 140 (P<0.01) en 160 min (P<0.05). De geselecteerde dosis JMV2959 had geen significant effect op de accumulatie van dopamine-afgifte in vergelijking met voertuigbehandeling op enig tijdsinterval (P> 0.05).

De huidige studie ondersteunt verder de hypothese dat de fysiologische rol van het orexigene peptide beloningsregulering omvat. We toonden inderdaad aan dat perifere toediening van een GHS-R1A-antagonist het vermogen van morfine om een ​​locomotorische stimulatie te veroorzaken verzwakt, de dopaminegehalten in NAc verhoogt en een geconditioneerde plaatsvoorkeur bij muizen induceert. We ontdekten ook dat de subchronische JMV2959, maar niet de ghreline-behandeling de ir-weefselniveaus van MEAP in de VTA, DynB in de hippocampus en LeuArg in striatum verhoogde, en het eerste bewijs opleverde dat het vermogen van ghreline-signalering om wapening te reguleren opioïde peptiden kan omvatten .

De hierin gepresenteerde gegevens laten zien dat GHS-R1A-antagonisme het vermogen van morfine om het mesolimbische dopaminesysteem bij muizen te activeren, beïnvloedt. In overeenstemming zijn de bevindingen die aantonen dat JMV2959 het vermogen van morfine blokkeert om de extracellulaire niveaus van accumulerend dopamine te verhogen en om stereotiep gedrag bij ratten te veroorzaken (Sustkova-Fiserova et al., 2014). Ondersteunend vergroot centrale ghreline-toediening het breekpunt, maar niet het aantal actieve hefboomdrukken, in het progressieve ratio-versterkingsschema bij ratten die zelf heroïne toedienen (Maric et al., 2012). De bewering dat ghrelinesignalering ten grondslag ligt aan drugsverslaving wordt verder ondersteund door de bevindingen die aantonen dat JMV2959 zowel de inname als de motivatie om alcohol te consumeren bij ratten vermindert en dat door amfetamine, cocaïne en nicotine geïnduceerde beloning wordt geblokkeerd door het GHS-R1A-antagonisme bij knaagdieren ( voor een overzicht zie Engel en Jerlhag (2014)) en dat polymorfismen in ghreline-gerelateerde genen geassocieerd zijn met de inname van alcohol, roken en amfetamine (voor een overzicht zie Engel en Jerlhag (2014)).

De huidige bevindingen met verhoogde niveaus van opioïde peptiden in het striatum, VTA en hippocampus na subchronische JMV2959-behandeling suggereren voor de eerste keer interacties tussen opioïde peptiden en ghreline-signalering. De endogene opioïden zijn betrokken bij belonende effecten, niet alleen geïnduceerd door opioïden maar ook andere drugs van misbruik en natuurlijke beloningen, en in adaptieve processen waargenomen na herhaalde blootstelling aan geneesmiddelen (Trigo et al., 2010, Van Ree et al., 2000). Inderdaad wordt de activiteit van het mesolimbische dopaminesysteem gereguleerd door endogene opioïden op zowel het niveau van de VTA als de NAc (Hirose et al., 2005, Spanagel et al., 1992) en de acties zijn aangetoond dat ze direct of indirect zijn door modulatie van andere zenders (Charbogne et al., 2014).

We vonden hierin dat subchronische JMV2959-behandeling de niveaus van MEAP in de VTA verhoogde. MEAP is exclusief afkomstig van proenkephalin en werd gebruikt als een marker voor proenkephalin-peptiden die voornamelijk δ-opioïde-receptoren activeren. We veronderstellen dat de verhoogde niveaus van endogene MEAP in de VTA na behandeling met JMV2959 mogelijk het vermogen van morfine om de GABA-remming van mesoaccumbal dopamine neuronen (Johnson en North, 1992) te verminderen, die kunnen bijdragen aan de verminderde morfine-geïnduceerde effecten die volgen na JMV2959. Ondersteunend bevindt GHS-R1A zich op GABAergic-interneuronen in de VTA (Abizaid et al., 2006). Bovendien hebben eerdere studies aangetoond dat intra-VTA-infusie van JMV2959, via onbekende mechanismen, verzwakt ghrelin-geïnduceerde beloning (Jerlhag et al., 2011) evenals ghreline-gemedieerde sucrose-inname bij knaagdieren (Skibicka et al., 2011), suggereren dat ventrale tegmentale GHS-R1A belangrijk zijn voor beloningsregulering. Ter ondersteuning van een dergelijke bewering zijn de bevindingen die aantonen dat andere hongerregulerende peptiden, zoals galanine en orexine, de belonende eigenschappen van morfine mediëren via lokale mechanismen binnen de VTA (Narita et al., 2006, Richardson en Aston-Jones, 2012).

In het striatum vonden we dat subchronisch JMV2959 de ir-niveaus van LeuArg verhoogde, wat suggereert dat het vermogen van JMV2959 om de door morfine veroorzaakte geconditioneerde plaatsvoorkeur, dopamine-afgifte en locomotorstimulatie te verzwakken, althans gedeeltelijk afhangt van een verbeterde accumassa δ- opioïde receptoractiviteit. Verhoogde LeuArg-spiegels kunnen het gevolg zijn van verhoogde enzymatische conversie van dynorfine-peptiden naar enkephalinen of van verhoogde Dyn-afgifte in het NAc als een reactie op toegenomen dopamine, gevolgd door afbraak in LeuArg. Hoewel eerdere studies hebben aangetoond dat de activiteit van het mesolimbische dopamine-systeem wordt gereguleerd via K-opioïde receptoren in het NAc (Spanagel et al., 1992) en endogene K-opioïde receptoren zorgen voor een tonische remming van mesoaccumbal dopamine neurotransmissie en verzwakken door cocaïne geïnduceerde afgifte van dopamine in NAc (Chefer et al., 2005), wij niet laten zien dat JMV2959 de ir-DynB-niveaus in het striatum verandert. Daarom zijn verdere studies gerechtvaardigd over prodynorfine-peptiden om de interacties tussen GHS-R1A-antagonisme en -dynorfinen op te helderen.

In de huidige studie hebben we ook aangetoond dat de behandeling met JMV2959 de niveaus van hippocampale DynB significant verhoogt. Ghreline verhoogt de geheugenconsolidatie en de vorming van dendritische wervels, genereert potentiatie op de lange termijn en zorgt voor geheugenfacilitatie via hippocampus GHS-R1A bij knaagdieren (Carlini et al., 2010, Diano et al., 2006). Bovendien vertonen GHS-R1A knockout-muizen een verbeterd ruimtelijk geheugen in de Morris water doolhoftest en een verstoord contextueel geheugen in het angstconditionerende paradigma vergeleken met wild-type muizen (Albarran-Zeckler et al., 2012). Dynorfine-peptiden, waaronder DynB, zijn overvloedig aanwezig in de hippocampus en ze verzwakken langetermijnpotentiëring (Chavkin et al., 1985, Wagner et al., 1993) en verminderen ook ruimtelijk leren bij ratten (Sandin et al., 1998). We stellen daarom de hypothese dat de GHR-R1A-antagonist het geheugen van beloning kan dempen door hippocampale langetermijnpotentiatie te remmen via activering van DynB. Samen bieden deze gegevens een nieuw potentieel mechanisme waarmee JMV2959 via opioïde peptiden kunnen de versterking veranderen. Opioïde receptoren zijn echter wijd verspreid in de hersenen, wat suggereert dat andere gebieden, die niet zijn opgenomen in de huidige studie, mogelijk betrokken zijn bij GHS-R1A gereguleerde door morfine geïnduceerde beloning. Ghreline-geïnduceerde voedselopname en hefboompersing voor sucrose wordt bijvoorbeeld verminderd door centrale of intra-hypothalamische toediening van een K-opioïde receptorantagonist (Romero-Pico et al., 2013). De rol van opioïde peptiden in andere gebieden moet echter worden opgehelderd in aankomende studies.

De endogene μ-receptorliganden, endomorfines en beta-endorfine zijn hierin niet geanalyseerd, zodat we een mogelijk effect van JMV2959 op deze peptiden niet kunnen uitsluiten. De belonende eigenschappen van morfine betreffen immers zowel μ-opioïde receptoren in de VTA als NAc (Hirose et al., 2005, Johnson en North, 1992, Murakawa et al., 2004, Yoshida et al., 1999). Een μ-receptorantagonist verzwakt echter niet de door ghrelin geïnduceerde voedselinname (Naleid et al., 2005) noch ghreline-geïnduceerde locomotorstimulatie en accumale dopamine-afgifte (Jerlhag et al., 2011), wat impliceert dat het vermogen van de GHSR- 1A-antagonist om wapening te reguleren omvat geen μ-receptoren. Aan de andere kant had JMV2959 wel degelijk invloed op opioïde-peptiden die zijn afgeleid van proenkephalin en prodynorfine, wat aantoont dat zij mogelijk betrokken zijn bij de effecten die worden geïnduceerd door GHSR-1A-antagonisten.

Hoewel eerdere studies hebben aangetoond dat systemische toediening van ghreline leidt tot beloning (Jerlhag, 2008) en de belonende eigenschappen van verslavende geneesmiddelen verbetert (voor een overzicht zie Engel en Jerlhag (2014)), laten we hier zien dat subchronische ghreline-behandeling niet veranderde de ir-weefselniveaus van opioïdenpeptiden in een van de bestudeerde beloningsgerelateerde gebieden. Systemische toediening van ghreline activeert c-fos-expressie in hypothalamische gebieden, maar niet in mesolimbische en hippocampusgebieden (Pirnik et al., 2011) en de binding van fluorescent gelabeld ghreline is beperkt tot regulerende neuronen van de hypothalamus (Schaeffer et al., 2013 ). Samen genomen met de bevindingen die aantonen dat ghrelin, behalve sporenhoeveelheden in de hypothalamus, niet kan worden gedetecteerd in diepere hersengebieden na toediening van perifere ghreline (Furness et al., 2011, Grouselle et al., 2008, Sakata et al., 2009 ), verhoogt de mogelijkheid dat systemische ghrelin het beloningssysteem activeert via indirecte mechanismen onafhankelijk van endogene opioïden. Op ondersteunende wijze vereist door ghreline geïnduceerde accumulatie van dopamine afgifte stroomopwaartse ofexigene hypothalamische signalering (Cone et al., 2014), perifere toediening van ghrelin verandert de alcoholinname bij muizen niet (Lyons et al., 2008) en dat neutralisatie van perifere ghreline verzwakt geen alcohol geïnduceerde beloning bij muizen of alcoholinname bij ratten (Jerlhag et al., in druk). De mogelijkheid dat sub-chronische toediening van ghreline de ir-weefselniveaus van opioïdenpeptiden verhoogt, moet echter worden overwogen, maar dit moet in de komende onderzoeken in detail worden onderzocht.

Het vermogen van verslavende medicijnen om stimulatie te veroorzaken, dopamine-afgifte en om een ​​geconditioneerde plaatsvoorkeur te induceren, is nauw verbonden met de versterkende eigenschappen van verslavende geneesmiddelen en deze parameters worden beschouwd als onderdeel van het verslavingsproces (Wise, 2004). Aangezien we hier hebben vastgesteld dat JMV2959 deze beloningsparameters bij muizen verzwakt, veronderstellen we dat GHS-R1A een belangrijke rol kan spelen in verslavingsprocessen en dat endogene opioïden bij deze processen betrokken zijn. Collectief duiden deze gegevens erop dat GHS-R1A-antagonisten moeten worden opgehelderd als behandeling van drugsverslaving.

JE en EJ worden ondersteund door subsidies van de Zweedse Onderzoeksraad (Grant nr. 2011-4646, 2009-2782 en 2011-4819), de Zweedse hersenfundering, LUA / ALF (Grant nr. 148251) van het Sahlgrenska University Hospital, Alcohol onderzoeksraad van het Zweedse alcoholverkoop monopolie en de grondslagen van Adlerbertska, Fredrik en Ingrid Thuring, Tore Nilsson, Längmanska, Torsten en Ragnar Söderberg, Wilhelm en Martina Lundgren, NovoNordisk, Knut en Alice Wallenberg, Magnus Bergvall, Anérs, Jeansons, Åke Wiberg , de Swedish Society of Medicine, Swedish Society for Medical Research en Gothenburg Psychiatry Research Foundation. Alcohol Research Council van het Zweedse Monopoly Alcohol Detailhandel en de Swedish Research Council (K2012-61X-22090-01-3) hebben IN ondersteund. De financieringsbronnen hadden geen rol in het onderzoeksontwerp, in de verzameling, analyse en interpretatie van de gegevens, in het schrijven van het rapport en in de beslissing om de gegevens te publiceren