Chemie en biologie van Orexin-signalering (2010)

Ga naar:

Abstract

De orexins (ook wel hypocretinen genoemd) zijn neuropeptiden die voor het eerst zijn ontdekt in 1998 door twee onafhankelijke onderzoeksgroepen^{1, 2}. Orexines A (33-aminozuren) en B (28-aminozuren) zijn afgeleid van een enkel pre-pro-orexinepolypeptide³. Ze bemiddelen hun acties via interacties met twee nauw verwante GPCR's, genaamd Orexin Receptor 1 en 2 (OxR1 en OxR2). OxR1 bindt Orexin A met ongeveer 100-voudig hogere affiniteit dan Orexin B, terwijl OxR2 beide peptiden met ongeveer dezelfde affiniteit bindt. De orexins worden geproduceerd door gespecialiseerde neuronen in de hypothalamus, die naar vele verschillende hersengebieden projecteren^{4, 5}.

Zoals hieronder in het kort zal worden besproken, hebben fysiologische onderzoeken van de afgelopen tien jaar aangetoond dat signalering als een centrale rol speelt in een verscheidenheid aan belangrijke biologische processen, waaronder voeding, energiehomeostase, slaap / waakcycli, verslaving en beloning, onder andere⁶. Er is duidelijk bewijs voor defecten in signalering van orexine die betrokken zijn bij door voeding geïnduceerde obesitas en diabetes^{7, 8}narcolepsie^{9, 10}paniekangststoornis¹¹, drugsverslaving¹² en de ziekte van Alzheimer¹³. Aldus is er aanzienlijke interesse in de medicijnindustrie bij de ontwikkeling van krachtige verbindingen voor de manipulatie van orexinesignalering. De recente vooruitgang in het begrijpen en manipuleren van orexin-signalering wordt hier besproken.

Orexinesignalering bij het coördineren van slaap en voeding

De best begrepen rol van orexine signalering is de coördinatie van voeding en slaap. Het niveau van orexineproductie in de hypothalamus is omgekeerd gecorreleerd met bloedglucoseniveaus ¹⁴. Orexinesignalering, op zijn minst op de korte termijn, veroorzaakt een hongergevoel en stimuleert het voedingsgedrag, waarschijnlijk door neuronen in de hersenen te activeren die neuropeptide Y en functioneel gerelateerde hormonen produceren. Bovendien is orexinese signalering een belangrijk onderdeel van het induceren van een staat van wakker zijn bij zoogdieren^{9, 15}. Met andere woorden, signalering van eieren geeft aan dat wanneer dieren honger hebben, ze ook wakker zijn, maar als ze verzadigd zijn, kunnen ze slaperig zijn. Dit is fysiologisch gezien goed omdat dieren willen eten, niet willen slapen, wanneer ze honger hebben.

Genetische ablatie van het orexin-gen of de receptor bij knaagdieren resulteert in een fenotype dat opmerkelijk veel lijkt op menselijke narcolepsie met kataplexie, waarbij het dier onaangename indringing van slaap ondergaat in zijn normale waaktijd, inclusief instorten op vreemde momenten⁹. Hetzelfde geldt voor honden met een inactiverende mutatie in het OxR2 tot expressie brengende gen¹⁰. De meeste, hoewel niet alle menselijke narcoleptica, hoewel ze geen mutaties dragen in de genen die coderen voor orexine en de receptoren ervan, missen desondanks detecteerbare orexine. Er wordt gedacht dat dit te wijten is aan een auto-immuunaanval op de orexine producerende neuronen in de hersenen^{16, 17}. Dit auto-immuunmodel voor menselijke narcolepsie moet echter nog worden bewezen en niets is bekend over de aard van de vermeende auto-immuunreactie.

De bekende biologie van orexinesignalering voorspelt dus dat hersen-penetrante OxR2-agonisten waakzaamheid moeten stimuleren en nuttig kunnen zijn voor de behandeling van narcolepsie. Yanagisawa en collega's hebben proof-of-concept experimenten gepubliceerd die dit idee ondersteunen¹⁸. Ze toonden aan dat directe intracraniale injectie van orexine-peptide in de hersenen van orexine-deficiënte knaagdieren resulteerde in een verhoogde staat van wakker zijn. Omgekeerd kunnen orexinereceptorantagonisten worden gebruikt om slapeloosheid te behandelen¹⁹hoewel de mogelijke inductie van kataplexie, waargenomen bij dieren en mensen met een chronische orexine-deficiëntie, een probleem is (vide infra).

Orexinesignalering bij verslavend en ander pathologisch gedrag

De insula is een hersengebied waarvan bekend is dat het betrokken is bij de ontwikkeling van driften en hunkeren en is over het algemeen betrokken bij beloningsgedrag²⁰. Schade aan dit deel van de hersenen leidt tot een opvallende daling in de motivatie van rokers om hun gewoonte voort te zetten²¹. Daarentegen is het bekend dat onthouding bij sigarettenrookers de insula activeert²². Hetzelfde deel van het brein lijkt betrokken te zijn bij beloningszoekend gedrag naast morfine, cocaïne en alcohol. Orexine-producerende neuronen dichten het gebied van de hersenen dicht en signalering van de zenuwen speelt een sleutelrol in dit gedrag^23-25. Bijvoorbeeld toediening van de OxR1 selectieve antagonist SB-334867 (zie Figuur 5) aanzienlijk verminderd de aandrijving van knaagdieren om zichzelf te injecteren met nicotine¹². Vergelijkbare resultaten zijn verkregen voor andere verslavende verbindingen. Interessant is dat in de nicotinestudie de farmacologische blokkade van OxR1 de voedselinname niet substantieel onderdrukte. Men denkt dat dit, samen met wakker zijn, hoofdzakelijk wordt gemedieerd door OxR2. De preklinische gegevens bij knaagdieren wijzen er dus sterk op dat OxR1-selectieve antagonisten interessante anti-verslavende geneesmiddelen kunnen zijn.

 

Figuur 5

Structuren van orexinereceptorantagonisten ontwikkeld door Glaxo Smith Kline (GSK) en Merck.

Orexine signalering is onlangs ook aangetoond betrokken te zijn bij paniekaanvallen en angst¹¹. Met behulp van een rattenmodel waarin paniekaanvallen worden geïnduceerd door behandeling van het dier chronisch met een GABA-syntheseremmer gevolgd door een acute behandeling met natriumlactaat, werd aangetoond dat SB-334867-gemedieerde blokkering van OxR1 of siRNA-gemedieerde silencing van orexineproductie sterk vermindert. onderdrukt paniekaanvallen in dit model. Bovendien hebben menselijke subjecten die onderhevig zijn aan paniekaanvallen verhoogde niveaus van orexine in hun cerebrospinale vloeistof (CSF) ¹¹, consistent met een rol van orexinesignalering bij menselijke angststoornissen.

Zeer recent verscheen een rapport waarin de slaap / waakcyclus werd gekoppeld aan de ziekte van Alzheimer¹³. In het bijzonder werd aangetoond dat de accumulatie van amyloïde bèta, een kenmerk van de ziekte, gecorreleerd is met waakzaamheid. Chronische slaapdeprivatie verhoogde bijvoorbeeld amyloïde bèta-niveaus in het CSF van het dier. Interessant genoeg verlaagde de toediening van de orexinereceptorantagonist SB-334867 de niveaus van dit neurotoxische tussenproduct. Het is dus mogelijk dat een geschikt behandelingsregime met OxR-antagonisten een levensvatbare behandeling kan zijn om de ontwikkeling van de ziekte van Alzheimer te vertragen, als deze vroeg genoeg werd gediagnosticeerd.

Orexine signalering in energiehomeostase, door voeding geïnduceerde obesitas en diabetes

Er is indirect bewijs dat orexinesignalering belangrijk is in energiehomeostase. Narcoleptische mensen met een deficiëntie aan orexine vertonen bijvoorbeeld een hogere body mass index dan die van narcoleptische personen met normale niveaus van orexine²⁶. Genetische ablatie van orexine-neuronen bij muizen resulteert in zwaarlijvige dieren²⁷ en deze muizen ontwikkelen ook aan leeftijd gerelateerde insulineresistentie⁷. Deze resultaten lijken contra-intuïtief te zijn doordat farmacologische inductie van orexinesignalering het voedingsgedrag acuut bevordert¹. Dit suggereert dat de effecten op korte en lange termijn van orexinesignalering op energiehomeostase anders zijn.

Recentelijk is dit gebied van de orexinebiologie verduidelijkt door een landmarkstudie die overtuigend aantoonde dat orexinesignalering sterk tegen dieet-geïnduceerde obesitas en de daaropvolgende ontwikkeling van insulineresistentie bij knaagdieren is⁸. Er werd aangetoond dat chronische overexpressie van het orexinegen of farmacologische inductie van de orexinereceptor de ontwikkeling van obesitas en insulineresistentie bij muizen met een vetrijk dieet bijna volledig blokkeerde. Dit bleek grotendeels te wijten te zijn aan toegenomen energieverbruik, hoewel er geen verandering was in het respiratoire quotiënt, een indirecte indicator van koolhydraat versus lipidegebruik. Chronische stimulatie van orexinesignalering verminderde ook de voedselconsumptie. Een verscheidenheid aan zowel genetische als farmacologische experimenten gaf aan dat het grootste deel van dit effect werd gemedieerd door middel van signalering via OxR2, niet OxR1. Tot slot, een opvallende bevinding van deze studie is dat chronische stimulatie van orexinesignalering geen effect had op muizen zonder leptine. Deze dieren werden, wanneer zij een vetrijk dieet kregen, nog steeds obses- tent en insulineresistent, zelfs wanneer zij werden behandeld met de orexine-receptoragonist. Het beschermende effect van orexine lijkt dus te zijn geworteld in het verbeteren van de leptine-gevoeligheid. Deze studie heeft duidelijke therapeutische implicaties voor de behandeling van door voeding geïnduceerde obesitas en diabetes.

Hoewel deze studie meestal signalering door OxR2 impliceerde als belangrijk voor het obesitas-resistieve fenotype, werden sommige OxR1-gemedieerde effecten opgemerkt⁸. De auteurs ontdekten dat genetische ablatie van OxR1 alleen werd beschermd tegen door vet veroorzaakt door voeding veroorzaakte hyperglycemie, maar niet overgewicht. Dit geeft aan dat orexinesignalering door OxR1 door normale fysiologische niveaus van orexine een permissieve rol spelen bij de ontwikkeling van door ouderdom of vetrijk dieet geïnduceerde insulineresistentie. Echter, in het niet-fysiologische scenario van aanhoudende orexine ten opzichte van expressie via een transgen, zowel OxR1- als OxR2-gemedieerde bescherming tegen de ontwikkeling van insulineresistentie op het vetrijke dieet. Deze gecompliceerde reeks resultaten met betrekking tot OxR1 suggereert dat de receptor verschillende rollen speelt onder omstandigheden van normale en suprafysiologische expressie of expressie, of dat de receptor verschillende fysiologische effecten medieert die de ontwikkeling van hyperinsulinemie kunnen versterken of tegenwerpen en dat de 'winnaar' van deze concurrerende effecten zijn verschillend afhankelijk van het niveau van orexin of de timing en duur van de signalering.

De koppeling van het orexine-effect aan leptinesignalering is interessant met betrekking tot een ander recent gepubliceerd onderzoek waarin werd gevonden dat suprafysiologische niveaus van leptine het mogelijk maken dat diabetische knaagdieren volledig insuline missen ²⁸. Eerder was bekend dat leptine de bloedglucosespiegel verlaagde door het potentiëren van restniveaus van endogene insuline bij streptozotocine (STZ) -geïnduceerde diabetische ratten met gedeeltelijke insulinedeficiëntie ²⁹. Het idee dat leptine alleen insulinedeficiënte dieren kon redden van diabetische symptomen was echter nog nooit getest en deze bevinding kwam als een grote verrassing. De vergelijkbare fenotypes geïnduceerd door chronische behandeling van dieren met suprafysiologische niveaus van orexine en leptine, gekoppeld aan de bevinding dat orexine lijkt te werken door de leptine-gevoeligheid te verbeteren, doet iemand zich afvragen of deze twee studies verschillende kanten van dezelfde medaille waren en dat stimulatie van de orexine / leptinesignaleringsroutes kunnen inderdaad een veelbelovende behandeling zijn voor diabetes type I of type II.

Heeft orexinsignalering effecten in de periferie?

Van de meeste van de hierboven beschreven effecten van orexinesignalering wordt gedacht dat ze in de hypothalamus voorkomen. De rollen van orexine signalering, indien aanwezig, buiten het zenuwstelsel zijn controversieel. De expressie van de orexins en hun receptoren is gedetecteerd in verschillende perifere weefsels, waaronder de darm, pancreas, nier, bijnieren, vetweefsel en voortplantingsstelsel ^30-33, maar functioneel bewijs van een rol voor het signaleren van orexine in de periferie is zeldzaam.

Een recente studie toonde aan dat de incidentie van OxR1 tot expressie brengende cellen in de pancreaseilandjes toenam met streptozotocine (STZ) -geïnduceerde hyperglycemie bij ratten en co-gelokaliseerd met glucagon³⁴. Bovendien splitste gesplitst caspase-3 zich immunochemisch samen met OxR1 in de eilandjes. Dieren die orexine misten, vertoonden aan de andere kant verminderde hyperglycemie en betere glucosetolerantie dan wild-type dieren. Deze resultaten suggereren dat orexine signalering via OxR1 in de pancreas kan bijdragen aan beta-cel-apoptose en de ontwikkeling van diabetes als reactie op STZ-behandeling. Hoewel de verbinding zwak is, is het mogelijk dat dit effect de waarnemingen van Funato, et al., Hierboven vermeld, zou kunnen verklaren, dat genetische ablatie van OxR1 beschermend was tegen door vet veroorzaakt, door voedsel geïnduceerde hyperglycemie en hyperinsulinemie.⁸.

De orexin signalerende cascade

Hoewel orexinesignalering op fysiologisch niveau intensief is bestudeerd, is er veel minder moeite gedaan om de intracellulaire gebeurtenissen veroorzaakt door binding van de orexine-hormonen aan hun receptoren te karakteriseren. Het is bekend dat binding van het hormoon aan zijn receptor een influx van calcium veroorzaakt, die gekoppeld is aan activering van Erk ³⁵. De receptoren koppelen ook aan een fosfolipase C (PLC) -gemedieerde route die intracellulaire calciumvoorraden vrijgeeft.

De meest grondige analyse van de gentranscriptieprogramma's getriggerd door orexinesignalering werd gerapporteerd in 2007 ³⁶. Deze studie maakte gebruik van globale genexpressieprofilering om genen te identificeren die sterk omhoog of omlaag werden gereguleerd in HEK293-cellen die OxR1 stabiel tot expressie brengen. 260-genen bleken up-geregeld te zijn en 64 down-geregeld door tweevoudig of meer wanneer bemonsterd zowel twee als vier uur na orexin-stimulatie. De genannotaties gaven aan dat ongeveer de helft van de sterk gereguleerde genen betrokken was bij celgroei (30%) of metabolisme (27%). Een pathway-analyse met behulp van het commerciële Ingenuity-programma betekende verschillende trajecten als zijnde gereguleerd door signalering van de orexine (Figuur 1). De canonieke TGF-β / Smad / BMP-, FGF-, NF-kB- en hypoxische signaleringsroutes waren de meest prominente. Deze studie concentreerde zich in detail op de hypoxische route, wat een vreemde "hit" was in deze studie omdat de cellen werden gekweekt onder normoxische omstandigheden. Niettemin, de hypoxie-induceerbare factor 1-a (HIF-1α) transcriptiefactor, waarvan eerder bekend was dat deze steeg als reactie op hypoxie, en veel van zijn doelwitgenen werden sterk geïnduceerd door behandeling met orexine. In hypoxische kankercellen, waar de HIF-1α-actie het best is bestudeerd, werkt het samen met HIF-1β om een ​​heterodimerische transcriptiefactor (HIF-1) te vormen die een herprogrammering van het cellulaire metabolisme stimuleert³⁷. Met name reguleert het de glucose-import en glycolyse enorm, met bindingsplaatsen stroomopwaarts van bijna alle genen die bij deze gebeurtenissen zijn betrokken. In hypoxische cellen werkt HIF-1 om het product van glycolyse, pyruvaat, om te zetten naar de productie van lactaat in plaats van om te zetten in acetyl-CoA en de TCA-cyclus binnen te gaan en oxidatieve fosforylatie. Dit wordt ten minste gedeeltelijk gedaan door de HIF-1-afhankelijke opwaartse regulatie van de expressie van lactaat dehydrogenase A (LDH-A), het enzym dat de omzetting van pyruvaat in lactaat, evenals pyruvaat dehydrogenase kinas ( PDHK), die PDH inactiveert, het enzym dat de transformatie van pyruvaat naar Acetyl Co-A bewerkstelligt (zie Figuur 2). Verrassend genoeg leken de met orexine behandelde cellen het grootste deel van hun metabolische flux door de TCA-cyclus te duwen en oxidatieve fosforylatie. ³⁶, resulterend in een sterk verhoogde productie van ATP en, vermoedelijk, andere biosynthetische tussenproducten die gepaard gaan met activering van deze routes. Het is niet bekend hoe orexinesignalering en hypoxie beide HIF-1α-activiteit kunnen stimuleren, maar toch wordt slechts een subset van genen die gewoonlijk door deze transcriptiefactor in hypoxie worden geactiveerd in met orexine behandelde cellen geactiveerd.

 

Figuur 1

Samenvatting van de bevindingen van een genexpressie-analyse van het effect van orexine op cellen die de orexinereceptor 1 tot expressie brengen. Boven: cirkeldiagram met een overzicht van de geannoteerde functies van genen die significant worden beïnvloed door signalering van de orexine. Bodem: voorgestelde signaleringsroutes ...

 

Fig 2

Schematische samenvatting van het belangrijkste effect van orexinesignalering op het glucosemetabolisme. OxSig = signalering van signalen. Het oranje ovaal vertegenwoordigt een glucosetransporteur. Pijlen geven een stimulatie van het aangegeven proces aan en de verticale lijnen vertegenwoordigen een ...

Parallelle studies van hypothalamische plakjes verkregen uit wild-type of OxR1 knock-out muizen kwamen in het algemeen overeen met deze conclusies en bevestigden dat de waargenomen effecten het resultaat waren van orexinesignalering ³⁶. In sommige opzichten is dit resultaat aantrekkelijk omdat het een raadsel verklaart in ons begrip van orexinbiologie op fysiologisch niveau. Als we een staat van wakker zijn gelijkstellen aan hoge neuronale metabolische activiteit, wat redelijk lijkt, is het vreemd dat dit zou gebeuren wanneer de hersenen baden in lage glucosewaarden. Daarom is het logisch dat wakker zijn een override van deze situatie vereist via een mechanisme dat de efficiëntie van glucoseopname en -verwerking verhoogt. Een orexine-gemedieerde opwaartse regulatie van cellulair metabolisme lijkt ook consistent te zijn met de waarneming van verhoogd energieverbruik en weerstand tegen vetrijk dieet-geïnduceerd obesitas ⁸. Het is echter belangrijk om te onthouden dat deze studie zich concentreerde op cellen die OxR1 tot expressie brengen en neuronale plakjes die zijn verkregen uit wild-type of OxR1 knock-out muizen. Waakzaamheid en weerstand tegen door voeding geïnduceerde obesitas, zoals hierboven vermeld, wordt nu verondersteld meer een effect te zijn van door OxR2 gemedieerde signalering. Het kan zijn dat de waargenomen routes relevanter zijn voor beloningsgedrag en andere processen die gedomineerd lijken te worden door OxR1-gemedieerde signalering. Er zal veel meer werk nodig zijn in verschillende celtypes en weefsels om deze problemen op te lossen. Maar het idee dat orexinese signalering een belangrijke regulator van het energiemetabolisme is, is een interessant model dat toekomstige studies zal leiden.

Is orexin signalering belangrijk bij kanker?

De bevinding dat orexinesignalering in staat is om door de turbo op te laden glucoseverbruik suggereert een mogelijke link naar celproliferatie in delende cellen en dus kanker. De hierboven besproken gepubliceerde resultaten geven echter aan dat orexine het metabolisme van oxidatieve energie kan stimuleren ³⁶, terwijl veel kankercellen voor het grootste deel van hun metabolisme anaërobe glycolyse gebruiken ³⁸. Eén mogelijkheid is dat kankercellen die een oxidatief metabolisme toepassen, gebruik kunnen maken van orexinese signalering op een autocriene of paracriene manier om hun metabolisme en proliferatie te stimuleren en, indien dat zo is, zouden orexinereceptorantagonisten interessante therapeutische opties kunnen zijn. Aan de andere kant, als orexine signalering krachten metabolische flux door middel van TCA en oxidatieve fosforyleringsroutes ten koste van anaerobe glycolyse, dan activering van deze route kan giftig zijn voor tumorcellen "verslaafd" aan een glycolytische levensstijl.

Er zijn enkele aanwijzingen voor een rol voor orexine signalering in kankercellen en, zoals je uit de bovenstaande analyse zou kunnen voorspellen, lijkt het effect van orexinesignalering verschillend te zijn in verschillende soorten kankercellen. Orexins onderdrukken bijvoorbeeld de celgroei door apoptose te induceren bij humane colonkanker, neuroblastomacellen en tumorcellen van de alvleesklier van ratten. ³⁹. Aan de andere kant zijn de expressie van OxR1 en OxR2 hoger bij adenomen dan bij de normale bijnierschors. Orexine A en B kunnen celproliferatie in deze cellen stimuleren en de effecten waren meer uitgesproken in gekweekte adenomateuze dan normale adrenocorticale cellen. ⁴⁰. Hoewel deze rapporten interessant zijn, staat ons begrip van het belang van orexine signalering bij kanker, als die er is, nog in de kinderschoenen en is er veel meer werk nodig om te bepalen of de orexinereceptoren of stroomafwaartse effectoren van de signaalroute levensvatbare doelen voor kankerchemotherapie vertegenwoordigen .

Farmacologische controle van Orexine-signalering

De hierboven besproken biologie suggereert dat agonisten, antagonisten en potentiatoren van orexinese signalering van klinisch belang zouden kunnen zijn. De behandeling van narcolepsie en kataplexie veroorzaakt door een tekort aan productie van orexine zou bijvoorbeeld behandelbaar moeten zijn met behulp van een orexinereceptoragonist. Aan de andere kant moet verslavend gedrag behandelbaar zijn met een orexinereceptorantagonist. Dieet-geïnduceerde obesitas en diabetes kunnen worden bestreden met een orexinereceptoragonist of misschien een positieve allosterische potentiator. Verschillende grote farmaceutische bedrijven zijn begonnen met de ontwikkeling van moleculen die zich richten op de orexin-receptoren ⁴¹.

Orexin Receptor Antagonisten

Omdat orexinesignalering in de hersenen waakzaamheid bevordert, is het logisch dat farmacologische blokkade van dit pad zou resulteren in slaperigheid en dus orexinereceptorantagonisten nuttige geneesmiddelen kunnen zijn voor de behandeling van slapeloosheid. Een groot probleem zou echter de inductie van kataplexie zijn. De centrale vraag in de ontwikkeling van therapeutisch bruikbare orexinereceptorantagonisten is inderdaad de vraag of tijdelijke farmacologische remming van de orexinereceptor het narcoleptische en kataplectische fenotype van chronische orexine-deficiëntie fenocopie.

De preklinische en klinische gegevens die tot nu toe beschikbaar zijn, stellen dat het antwoord "nee" is. De meeste gegevens komen uit studies van Almorexant (Figuur 3; ook bekend als ACT-078573), die door Actelion Pharmaceuticals wordt ontwikkeld voor de behandeling van slapeloosheid. Almorexant is een oraal beschikbaar tatrahydroisoquinoline dat zowel OxR1 als OxR2 krachtig tegenwerkt. Actelion publiceerde een voorbereidende studie in het vroege 2007 waarin melding werd gemaakt van de succesvolle behandeling van proefpersonen bij ratten, honden en mensen met Almorexant of een klassieke GABA-receptoragonist, zolpidem ¹⁹. Almorexant is in deze studie aangetoond als veilig en goed verdragen. Het veroorzaakte subjectieve en objectieve fysiologische tekenen van slaap. Bij de experimenten met ratten werd aangetoond dat Almorexant zowel niet-REM- als REM-slaap induceerde. Dit is significant omdat zolpidem geen REM-slaap induceert. Belangrijk is dat er geen tekenen van kataplexie werden waargenomen in een van de proefdieren of humane patiënten.

 

Figuur 3

Samenvatting van de ontwikkeling van Almorexant, een klinische kandidaat voor de behandeling van slapeloosheid en verwante verbindingen met verschillende selectiviteit voor de twee orexinereceptoren.

Aan het einde van 2009 kondigde Actelion de voltooiing aan van een uitgebreide fase III-studie van een behandeling van twee weken voor volwassenen en ouderen met primaire chronische slapeloosheid. Het bedrijf beweert dat het primaire eindpunt van het onderzoek, de superieure werkzaamheid van Almorexant ten opzichte van de placebo, was bereikt, evenals verschillende secundaire eindpunten (zie http://www1.actelion.com/en/our-company/news-and-events/index.page?newsId=1365361). Een cryptische regel in de persmededeling stelde echter dat "... bepaalde veiligheidsobservaties werden gemaakt die verdere evaluatie en beoordeling vereisen in fase III-onderzoeken voor de langere termijn." Het zal interessant zijn om te weten wat dit betekent wanneer de gegevens beschikbaar komen.

Almorexant was het resultaat van een uitgebreid ontwikkelingsprogramma dat begon met de tatrahydroisoquinoline 1 (Figuur 3) ⁴². Deze verbinding ontstond als een primaire treffer uit een scherm met hoge doorvoer met behulp van een op FLIPR gebaseerde calciumbepaling in ovariumcellen van de Chinese hamster (CHO) die hoge niveaus van menselijke OxR1 of OxR2 tot expressie brengen. Let op dat verbinding 1 is redelijk selectief voor OxR1. Inderdaad, dit medicinale programma produceerde veel verschillende krachtige verbindingen, waarvan sommige dubbele receptorantagonisten waren, terwijl sommige redelijk selectieve remmers van OxR1 of OxR2 waren (zie Figuur 3). Vrij grote schommelingen in de mate van selectiviteit werden waargenomen als gevolg van bescheiden structurele veranderingen. Bijvoorbeeld de vervanging van een van de methoxygroepen in de aromatische ring "linksboven" van 1 met een isopropylether resulteerde in een volledig OxR1 specifieke antagonist. Een ander interessant contrast is samenstelling 3, dat nogal selectief is voor OxR2, maar veel structurele kenmerken deelt met de dubbele antagonist Almorexant. Helaas zijn er geen structurele gegevens over de orexinereceptor en dus is de moleculaire basis van deze selectiviteit onbekend.

De tetrahydroisoquinolines zijn ver van de enige gerapporteerde orexinereceptorantagonisten. Actelion heeft bijvoorbeeld structureel verschillende verbindingen zoals sulfonamiden gerapporteerd 4 en 5, die respectievelijk krachtige duale en OxR2 selectieve antagonisten zijn (Figuur 4) ⁴³. Door inspectie van de structuren, waaronder een sterk gemodificeerde glycine kern, is men geneigd te concluderen dat de tetrahydroisoquinolines en sulfonamides overlappende plaatsen op de receptor kunnen innemen, maar dit is naar ons beste weten nog niet getest.

 

Figuur 4

Structuren van andere orexinereceptorantagonisten ontwikkeld door Actelion Pharmaceuticals.

GSK meldde een van de eerste orexinereceptorantagonisten, SB-334867 ^44-46 (Figuur 5), een verbinding die relatief selectief is voor OxR1 en de meest gebruikte "hulpmiddelcompound" blijft in onderzoekslaboratoria die orexinbiologie bestuderen. Ze meldden ook een relatief ver familielid van SB-334867, 6, inclusief een proline-eenheid, met veel betere potentie tegen beide receptoren, maar met behoud van redelijke OxR1-selectiviteit ⁴⁷. Er is gespeculeerd dat 6 mogelijk een naast familielid is van een samenstelling van onbekende structuur die door GSK in klinische proeven voor de behandeling van slapeloosheid is opgenomen, genaamd SB-674042 ⁴¹. GSK heeft de progressie van dit middel aangekondigd in Fase II klinische studies in 2007, maar er zijn naar ons beste weten geen verdere klinische gegevens verstrekt.

Een Merck-team heeft proline-bevattende orexinereceptorantagonisten ontwikkeld ⁴⁸. samenstelling 7 (Figuur 5) kwam voort uit een screening met hoge verwerkingscapaciteit en vertoonde uitstekende in vitro potentie tegen OxR2 evenals bescheiden activiteit tegen OxR1, maar vertoonde in vivo een slechte doorbloeding van de hersenbarrière. Dit bleek het resultaat te zijn van het feit dat het een substraat is voor het P-glycoproteïne. Ze vonden dat dit probleem kon worden verlicht door methylatie van de benzimidazolstikstof ^{41, 48}. samenstelling 8, dat ook een fenylring bevat in plaats van een pyrroolgroep in het kwadrant "bovenrecht" van het molecuul, is een krachtige dubbele receptorantagonist met uitstekende penetratie van de hersenbarrière. 8 is aangetoond dat het actief is bij ratten.

Andere farmaceutische bedrijven hebben enkele verbindingen met in vitro activiteit tegen orexine-receptoren gerapporteerd, maar deze zullen hier niet worden beoordeeld.

Het is verleidelijk om te speculeren dat dezelfde verbindingen die worden ontwikkeld als slaapmiddelen ook nuttig kunnen zijn voor de behandeling van chronische verslavingen, hoewel een voor de hand liggend neveneffect van dit behandelingsregime zou zijn dat het de proef slaperig maakt als ze dubbele receptorantagonisten zijn. De ontdekking van de rol van orexinesignalering bij verslavend gedrag is echter relatief recent en voor zover ons bekend zijn er geen klinische onderzoeken gestart met de hierboven besproken verbindingen voor deze indicatie.

Orexin Receptor Agonisten en Potentiatoren

Zoals hierboven besproken, hebben Yanagisawa en zijn collega's in diermodellen bewijs van het principe geleverd dat narcolepsie moet worden behandeld met een orexinereceptoragonist ¹⁸. Ze gebruikten een gemodificeerd orexine peptide in deze studies. Merkwaardig genoeg zijn er echter geen niet-peptide-agonisten in de literatuur naar ons beste weten gerapporteerd. Het is moeilijk voor te stellen dat schermen voor dergelijke verbindingen niet zijn uitgevoerd, gezien de uitgebreide hoeveelheid werk gedaan op receptorantagonisten. Het lijkt dus waarschijnlijk dat krachtige agonisten moeilijk te vinden zijn, hoewel het niet duidelijk is waarom dit zo is.

Zeer recentelijk was de eerste positieve allostere potentiator van de orexinereceptor, 9 (Figuur 6), werd geïdentificeerd. Deze verbinding werd toevallig ontdekt in de loop van een bescheiden medicinale chemiecampagne gericht op het vergroten van de potentie van een op peptoïden gebaseerde orexinereceptorantagonist. ⁴⁹. peptoïd- 10 werd geïdentificeerd in een scherm waarin cellen die wel of niet OxR1 tot expressie brengen, maar verder identiek zijn, werden gemerkt met verschillende gekleurde kleurstoffen (respectievelijk rood en groen) en gehybridiseerd met een microarray die enkele duizenden peptoïden toont die geïmmobiliseerd zijn op een glasplaatje. Verbindingen die de OxR1 tot expressie brengende cellen selectief bonden, werden geïdentificeerd door een hoge rood: groen-verhouding van de fluorescerende kleurstoffen die op die plek waren opgevangen (zie ref. ⁵⁰ voor de ontwikkeling van deze methodologie). Een sarcosine-scanexperiment ⁵¹ onthulde dat slechts twee van de negen zijketens aanwezig in het molecuul essentieel waren voor binding aan de cellen die receptor tot expressie brengen (in rood gemarkeerd) Fig 6). Daaropvolgende synthese en analyse van de verbinding 11 bevestigd dat het de "minimale farmacofoor" was voor receptorbinding. 11 is een erg zwakke antagonist van beide orexinereceptoren met een IC₅₀ van slechts ongeveer 300 μM in vitro.

 

Figuur 6

Ontwikkeling van een orexin receptor positieve potentiator. De structuur van het peptoid dat ontstond als een primaire treffer van een bindscherm wordt bovenaan weergegeven. Het deel van het molecuul dat belangrijk werd gevonden voor receptorbinding is rood gemarkeerd. Deze ...

De structuur van 11 leek te suggereren een zwakke gelijkenis met Almorexant (Figuur 6) doordat de verbinding een piperonylring bevatte die bevestigd was aan een glycine-eenheid, terwijl bijna dezelfde eenheden, maar met een dimethoxybenylring in de plaats van piperonyl, aanwezig zijn in Almorexant. Gebruikmakend van dit model als richtlijn, verschillende derivaten van 11 werden gesynthetiseerd waarin koolwaterstofeenheden werden toegevoegd aan de amine stikstof via reductieve aminering. Een benzyl-derivaat, 12, waarin ook een extra methyleen was ingevoegd tussen de aromatische ring en de stikstof bleek een sterk verbeterde antagonist te zijn, zij het met nog slechts een bescheiden potentie (Fig 6), wat suggereert dat het model mogelijk correct is. Competitiestudies om te bepalen of het peptoïdederivaat 12 en Almorexant met elkaar concurreren voor binding aan de receptor zijn niet gerapporteerd.

Tijdens verdere optimalisatie-inspanningen, verbinding 9 werd gesynthetiseerd, wat verschilde van 12 alleen doordat de piperonylring werd geopend tot twee methoxyeenheden en de enkele methyleenlinker tussen de glycinestikstof en de aromatische ring die aanwezig was in de verbinding 10 werd hersteld. Opmerkelijk, 9 OxR1 antagoniseerde niet in een celcultuurtest maar leek de expressie van een orexine-afhankelijk reportergen enigszins te verhogen. De assays werden daarom herhaald bij lagere orexineconcentraties (EC₂₀ van het hormoon) en de resultaten toonden duidelijk aan dat 9 is een positieve potentiator van orexine-gemedieerde activatie van de receptor. Bij deze hormoonconcentratie, 9 vertoonde een EC₅₀ van ongeveer 120 nM. Wanneer de assay werd uitgevoerd op verzadigende niveaus van de potentiator 9 en het niveau van orexine werd getitreerd, het bleek dat de EC₅₀ van orexine was bij benadering verviervoudigd en dat het maximale niveau van reportergenexpressie ongeveer drievoudig groter was dan die veroorzaakt door verzadigende niveaus van orexine. Vergelijkbare resultaten werden verkregen in experimenten met cellen die OxR2 tot expressie brachten, wat dat aantoont 9 is een dubbele receptorpotentiator.

De ontdekking van de eerste orexin receptor-potentiator is potentieel opwindend met betrekking tot mogelijke toepassingen als een behandeling tegen obesitas / diabetes ⁸, hoewel tot op heden niet in vivo Er zijn experimenten gemeld met deze verbinding. Zoals hierboven vermeld, heeft Yanagisawa aangetoond dat een op peptide gebaseerde orexinereceptoragonist dieetgeïnduceerde zwaarlijvigheid en de ontwikkeling van type II diabetes bij knaagdieren blokkeert ⁸. Omdat deze dieren, en vermoedelijk ook over gevoede mensen, nog normale niveaus van het orexine-hormoon tot expressie brengen, kan een positieve potentiator nuttig zijn bij het stimuleren van de gunstige natuurlijke werking van het hormoon bij deze personen. Natuurlijk is het onwaarschijnlijk dat een potentiator van belang is bij de behandeling van narcolepsie, omdat getroffen personen weinig of geen orexine produceren.

Samengevat

Het is nu duidelijk dat het neuropeptide orexine en de bijbehorende receptoren een centrale rol spelen bij het reguleren van eten, slapen, energieverbruik, beloning zoeken en een verscheidenheid aan ander gedrag. Er is weinig bekend over de intracellulaire gebeurtenissen die worden veroorzaakt door orexineseinen. Er is duidelijk een grote medische belofte in de farmacologische manipulatie van signalering door orexine en een aantal farmaceutische bedrijven en academische laboratoria hebben actieve programma's op dit gebied. Hoewel dergelijke verbindingen nog niet in de kliniek zijn, heeft de krachtige dubbele orexinereceptorantagonist Almorexant een kennelijk succesvolle fase III klinische studie afgerond voor de behandeling van slapeloosheid. Tot nu toe zijn er geen orexinereceptoragonisten gemeld. Het lijkt waarschijnlijk dat er de komende jaren veel activiteit op dit gebied zal plaatsvinden.

Dankwoord

Referenties