Indian J Pharmacol. 2016 jan-feb; 48 (1): 53-58.
PMCID: PMC4778208
Abstract
Doelstelling:
Nucleus accumbens (NAcc) speelt een rol bij verslaving en eetgedrag. Om het orexinerge systeem dat hierbij betrokken is, te beoordelen, hebben we Orexin A-antagonist toegediend en het effect op de inname van vocht in de voeding en de alcoholvoorkeur in Wistar-ratten beoordeeld.
Materialen en methodes:
Inbred Wistar-ratten (n = 54) werden verdeeld in controle- en experimentele groepen (lage dosis en hoge dosis). Met behulp van de stereotaxische methode werd de geleidingscanule bilateraal op zijn plaats gezet om NAcc te bereiken. Lage dosis (3 ng) en hoge dosis (6 ng) van Orexin A-antagonist (SB-334867) werden toegediend en de voedselconsumptie, waterinname en alcoholinname en twee flesvrije keuze-voorkeurstesten voor alcohol werden uitgevoerd in de experimentele groep. De controlegroep ontving een zoutinfuus en de rest van de gevolgde methoden waren hetzelfde. De metingen werden onmiddellijk na de infusie uitgevoerd, bij 1 h, 2 h, 4 h, en voor de hele dag en weergegeven in de figuur en tabellen.
Resultaten:
Een daling van de waterinname waargenomen direct na de infusie in 1st h (P <0.05) en 2nd h (P <0.01), wat meer was in een hoge dosisgroep in vergelijking met een lage dosis en controles. De alcoholinname volgde ook hetzelfde patroon. Bij een vrije keuze van twee flessen vertoonden ratten geen specifieke voorkeur voor alcohol.
Conclusie:
Er was dosisafhankelijke vermindering van de inname van voedsel en vloeistoffen in behandelde ratten. Dit suggereerde een mogelijke rol voor het orexinerge systeem bij inname. Echter, Orexin A heeft mogelijk geen rol in de modulatie van alcoholverslaving door het belonende centrum NAcc.
Introductie
accumbens (NAcc) is bekend dat het de inname en verslaving aan stoffen beïnvloedt.1,2] Het is ook betrokken geweest bij beloning en motivatie.3] Twee afzonderlijke subregio's zijn beschreven in NAcc en er was veel overlap in het functioneren van deze twee regio's.4] Micro-injectie van verslavende geneesmiddelen in NAcc vertoonde een dosisafhankelijke toename van de dopaminewaarden. Dopamine is een neurochemisch onderdeel van beloningscircuits. Intranucleaire zelftoediening van amfetamine vertoonde een verhoogd beloningsgevoel.5] Andere delen in het subcorticale gebied beïnvloeden ook het eetgedrag, dat mogelijk nauw verbonden is met accumbens. Voedselinname en waterinname bleken te worden beïnvloed door verschillende delen van het basale brein, zoals laterale hypothalamus, [6] paraventricular nucleus, septum pellucidum, [7] en basolaterale amygdala. [8] Er is uitgebreid neuraal netwerken in de regulatie van het gedrag van de patiënt. Er is aangetoond dat NAcc goed verbonden is met de grote subcorticale centra, zoals het ventrale tegmentale gebied (VTA);9] basolaterale amygdala en andere centra. [10] Belangrijke neurotransmitters betrokken bij de modulatie van alcoholinname, beloning en voedselinname werden gerapporteerd van de neurale circuits in dit gebied.11]
Onlangs zijn hypocretinen, een groep heterogene peptiden, geïdentificeerd uit de hypothalamus, hypocretine 1 en 2 (Orexin A en B), respectievelijk peptiden met 32 aa en 29 aa. [12] Oorspronkelijk waren deze stoffen betrokken bij de regulatie van de waakzame slaapcyclus, zoals blijkt uit het toegenomen Orexin A dat wordt aangetroffen in de hypothalamus tijdens de actieve fase van wakker zijn.13] In ons laboratorium ontdekten we dat Orexin A de voedsel- en vochtinname verhoogde bij injectie in NAcc. [14] Het centraal toegediende orexine-antilichaam remt voedselinname dosisafhankelijk in 24 h-gevaste ratten en intraperitoneale toediening van orexine-antilichaam faalde om de voedselconsumptie te onderdrukken, wat erop wijst dat orexine-antilichaam werkt in het centrale zenuwstelsel, maar niet in het perifere weefsel.15] Verder bevestigden ze dat endogene orexins een fysiologische rol spelen in het voedingsgedrag. Hoewel aanvankelijk Orexins werden verondersteld om het gedrag van de inname te beïnvloeden, is het bewijs van de rol van Orexin A in het voedingsgedrag en de alcoholinname en ook de alcoholvoorkeur vaag. In onze vorige studie hebben we aangetoond dat Orexin A de voedsel- en vochtinname verhoogde bij nuchtere ratten.14] Om de rol van Orexin A in de inname-activiteit ondubbelzinnig te verhelderen, hebben we deze reeks experimenten uitgevoerd bij mannelijke Wistar-ratten die 's nachts werden gevast door de Orexin A-antagonist SB-334867 in het NAcc in te brengen [16] We hebben ook de alcoholvoorkeur bij behandelde ratten getest om het effect van Orexin A-antagonisten op de alcoholinname te verduidelijken. De resultaten van de experimenten met voedsel-, water- en alcoholgebruik en alcoholvoorkeur worden hier besproken.
Materialen en methoden
Vierenvijftig mannelijke Wistar-albinoratten (n = 54) wegen (250 ± 10 g), 3-4 maanden oud werden geselecteerd voor onderzoek. Ze waren verdeeld in drie groepen, namelijk. Watergroep, alcoholgroep en twee flessenvrije keuzegroep (n = 18 elk). Ze waren onderverdeeld in drie subgroepen, namelijk. Groep 1 - Controle (infusie met zoutoplossing); Groep 2 - Lage dosis SB-334867 (3 ng); Groep 3 - Hoge dosis SB-334867 (6 ng, n = 6 elk). Voedsel en vloeistof werd aan alle groepen verstrekt ad lib, behalve waar genoemd voor 's nachts vasten.
Alle dieren werden afzonderlijk gehuisvest in kooien van polypropyleen, met het juiste strooisel en op een 12-h licht / donker-cyclus in een temperatuurgecontroleerde omgeving gehouden. Dieren werden onderhouden volgens de richtlijnen van de commissie voor controle en toezicht op experimenten op dieren en richtlijnen van de Indiase overheid voor het gebruik van proefdieren. Institutional Animal Ethical Committee heeft dit onderzoeksprotocol goedgekeurd.
Medicijnen en apparaten
Zoutoplossing 0.9%, SB-334867 (Uit: Tocris-biowetenschap) werd opgelost in 2% cyclodextran in steriel water. Wanneer ze niet werden gebruikt, werden oplossingen bewaard bij 4 ° C tot 3 weken. Harvard Pico plus (VS) infusiepomp werd gebruikt om medicijnen af te leveren. Leidingwater werd verschaft in plastic drinkflessen, en rattenvoedselpellets (Hindustan Unilever Ltd.,) werden verschaft. Ethylalcohol (Absolute) werd verkregen (Hayman Ltd., Eastways Park, Witham, Essex, CM83YE, VK) en verdund om een 10% alcohol te maken (deze concentratie werd geselecteerd op basis van een pilootstudie over de voorkeur van alcoholconcentratie) . Ketamine (NEON Laboratories limited, Thane, MS) en xylazine (Indian immunological Ltd., Hyderabad) werden gebruikt voor anesthesie.
Chirurgische Procedure
Mannelijke Wistar albinoratten werden geanestheseerd door een mengsel van ketaminehydrochloride (60 mg / kg), xylazinehydrochloride (6 mg / kg) en gemonteerd op een stereotaxisch apparaat (Inco, India) te injecteren. Er werd een incisie gemaakt op de hoofdhuid, grondig gedesinfecteerd met een operatieve geest. Het gebied werd schoongemaakt met katoen en waterstofperoxide. Coördinaten werden op de schedel in overeenkomstige gebieden gemarkeerd om NAcc te bereiken, met de referentie van Paxinos en Watson hersenenatlas [17] (Van Bregma: Anteroposterior + 2.2 mm, lateraal ± 1 mm en verticaal 7.4 mm). Een braamgat werd gemaakt en een roestvrijstalen geleidecanule (22-gaas) werd geïmplanteerd volgens de stereotaxische coördinaten. Zodra de canule op zijn plaats zit, wordt deze vastgezet met behulp van schroeven en tandheelkundig acryl. De geleidecanula werd voorzien van een stilet en men liet de ratten gedurende ten minste 7 dagen voorafgaand aan het experiment herstellen. Infusiecanule (interne canule) werd gefabriceerd van Septoject roestvrijstalen tandheelkundige naald van 30-meters die een hub heeft, handig om mee te werken.18] Infusiecanule verlengt 1 mm voorbij de respectieve geleidecanule. Voorafgaand aan het begin van de experimenten ontvingen alle ratten twee trainingssessies waarin ze werden vastgehouden op 24 h vasten en vervolgens voedsel, water en 10% alcohol ontvingen. Tijdens deze sessie leerden ratten vasten.
Experimentele procedure
Normale zoutoplossing en SB-334867 (in twee doses) werden respectievelijk toegediend in afzonderlijke groepen ratten na 24 h-vasten; niet-verdoofde (vrij bewegende) ratten door de beveiligde geleidecanule. De infusie werd uitgevoerd met een 10 μl Hamilton-injectiespuit verbonden met polyethyleenbuis en inwendige canule. Deze spuit was aangebracht op de Harvard-pomp. Vervolgens werd de stilet in de geleidecanule verwijderd. De interne canule werd in de geleidecanule gestoken en vastgezet. Vervolgens werd de pomp gestart om de oplossing aan de rechter- en linkerkant van NAcc achter elkaar af te leveren, 1 μl / min (na infusie bleef de interne canule voor ongeveer 10 s achter om geneesmiddelendiffusie mogelijk te maken). Twee doses SB-334867 werden geïnfuseerd met 3 ng (lage dosis) en 6 ng (hoge dosis). Aan het einde van de infusie werd de interne canule verwijderd en de stilet opnieuw in positie geplaatst en de tijd werd genoteerd. Post-infusie, onmiddellijk vooraf gemeten hoeveelheid voedsel, water en 10% alcohol werden in respectieve groepen verschaft. Het effect van SB-334867 op het verbruik werd gemeten en nauwkeurig genoteerd bij respectievelijk de infusie-tijdsintervallen 1, 2, 4 en 24 h. Overgebleven pellets, water en alcohol werden verwijderd en de verbruikte hoeveelheid werd berekend (verbruikt verbruik = hoeveelheid afgemeten hoeveelheid-overgebleven hoeveelheid, bijv. Aan het einde van 1 h).
Na voltooiing van het onderzoek werden de ratten opgeofferd door een dodelijke dosis anesthesie en de hersenen werden ontleed en geconserveerd voor histologische verwerking. Zeven micron secties werden in plakjes gesneden en gekleurd met cresyl violet om de plaats van infusie te bevestigen [Figuur 1].
Statistische analyse
Analyse van de gegevens werd gedaan met behulp van de statistische software SPSS versie - 16 (SPSS voor Windows, versie 16.0. Chicago, SPSS Inc. VS); eenrichtings-ANOVA werd gedaan om het consumptiegedrag tussen de groepen te vergelijken. Intervergelijking werd gedaan door post-hoc Tukey's test (consumptie per uur afzonderlijk vergeleken, bijv. 1 uur controle van voedselinname vs. 1 uur SB-334867 behandelde voedselinname). Gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaardfout van gemiddelde P <0.05, werd als significant beschouwd.
Resultaten
Experiment I
Voedsel- en waterverbruik werden gemeten (n = 18) in deze groep, NAcc canule dieren (n = 18), werden onderverdeeld in subgroepen, Groep 1 (0.9% zoutoplossinginfusie), Groep 2 (SB-334867-3 ng), Groep 3 (SB-334867-6 ng). Geneesmiddelen werden bilateraal in NAcc geïnjecteerd [Gegevens getoond in Tabel 1 en Figuur Figure1a, 1a, , bb].
Voedselinname
Vergeleken met controle op 1 h na behandeling met SB-334867 significante afname (F [2, 15] = 9.171 p = 0.003) in de voedselinname (dwz Groep 1 versus Groep 3, p <0.002); terwijl er geen significante verandering werd opgemerkt na 2 uur (F [2, 15] = 0.190 p = 0.829); 4 h (F [2, 15] = 0.160 p = 0.854); 24 h postinfusion-tijdsintervallen (F [2, 15] = 4.873 p = 0.023) (Groep 1 vs. Groep 3, p <0.028; Groep 2 vs. groep 3, p <0.05).
Water inname
SB-334867-behandeling toonde geen effect op de waterinname bij 1 h (F [2, 15] = 0.957 p = 0.406); 2 h (water 2 h F [2, 15] = 0.773 p = 0.479); 4 h (F [2, 15] = 0.288 p = 0.753) postinfusie-tijdsintervallen; maar de totale inname van 24 h water was afgenomen (F [2, 15] = 10.688 p = 0.001) in vergelijking met controle (Groep 1 versus Groep 3, p <0.002; Groep 2 vs. groep 3, p <0.006).
Experiment II
Alcohol (10%) en voedselconsumptie werden gemeten [n = 18, gegevens in Tabel 2 en Figuur 2].
NAcc gecannuleerde ratten werden verdeeld in drie subgroepen, Groep 1 (0.9% zoutoplossing n = 6), Groep 2 (SB-334867-3 ng, n = 6) en Groep 3 (SB-334867-6 ng, n = 6).
10% alcoholopname resultaten
Bij 1 h en 2 h SB-334867 behandeling aanzienlijk verzwakt alcoholgebruik bij 1st h (F [2, 15] = 4.457 p = 0.030), (Groep 1 vs. Groep 3, p <0.004), 2nd h (F [2, 15] = 11.122 p = 0.001) (Groep 1 vs. Groep 3, p <0.001; Groep 2 vs. groep 3, p <0.038). Er was echter geen significante verandering in alcoholgebruik na 4 uur (F [2, 15] = 0.709 p = 0.508) en 24 h (F [2, 15] = 2.631 p = 0.105) intervallen, respectievelijk.
Voedselinname
Bij 1 h en 2 h SB-334867 behandeling aanzienlijk (F [2, 15] = 4.230 p = 0.035) verzwakte voedselinname (Groep 1 vs. Groep 3, p <0.03); (F [2, 15] = 16.558 p = 0.000) (Groep 1 vs. Groep 2, p <0.000; Groep 2 vs. groep 3, p <0.021), respectievelijk, vergeleken met controle. Er werden geen significante veranderingen opgemerkt na 4 uur (F [2, 15] = 0.070 p = 0.933). Terwijl de totale voedselinname was afgenomen (0-24 h) (F [2, 15] = 4.457 p = 0.030) (Groep 1 vs. Groep 3, p <0.025).
Experiment III
Voedsel, 10% alcohol en water [voorkeur voor twee flessen, Tabel 2] consumptie gemeten. NAcc-gecannuleerde ratten werden gesegmenteerd als Groep 1 (0.9% zoutoplossing, n = 6), Groep 2 (SB-334867-3 ng, n = 6) en Groep 3 (SB-334867-6 ng, n = 6), werden geïnjecteerd.
Voedselinname
SB-334867-behandeling bij 1 h (F [2, 15] = 5.111, p = 0.02) verzwakte voedselinname (Groep 1 vs. Groep 3, p <0.011) maar er werd geen significant verschil waargenomen na 2 uur, 4 uur (F [2, 15] = 0.093 p = 0.911), (F [2, 15] = 0.797 p = 0.469), en bij 24 h vertoonde de beide dosis antagonist een afname van de voedselinname (F [2, 15] = 12.698 p = 0.001) (Groep 1 versus Groep 2 en Groep 3, p <0.039, p <0.000, respectievelijk), vergeleken met de controlegroep.
Water inname
SB-334867-behandeling veroorzaakte geen verandering in waterinname in een groep met een tijdsinterval bij 1 h (F [2, 15] = 0.584 p = 0.578), 2 h (F [2, 15] = 0.662 p = 0.530), 4 h (F [2, 15] = 1.655 P = 0.224) en 24 h (F [2, 15] = 0.513 p = 0.609).
Alcohol (10%) inname
Behandeling met SB-334867 verzwakte alcoholinname bij 1 h (F [2, 15] = 9.098 p = 0.003), (Groep 1 versus Groep 2 en Groep 3, p <0.004, p <0.008, respectievelijk). Geen significantieverandering in een groep na 2 uur (F [2, 15] = 0.854 p = 0.446), 4 h (F [2, 15] = 0.931 p = 0.416) en 24 h (F [2, 15] = 0.349 p = 0.711), respectievelijk.
Totale vloeistofinname
Geen significante verandering in een van de groepen, bij 1st h (F [2, 15] = 2.064 p = 0.161), 2nd h (F [2, 15] = 1.023 p = 0.383), 4th h (F [2, 15] = 1.205 p = 0.327) en 24 h (F [2, 15] = 0.484, p = 0.626).
Discussie
Modulatie van voedsel en waterinname door verschillende neurochemicaliën is onder controle geweest. Van verschillende kandidaat-moleculen waarvan is aangetoond dat ze het voedingsgedrag beïnvloeden, waaronder alcoholinname, zijn Orexines ook betrokken.19] Orexinen werden oorspronkelijk verondersteld stimulerende middelen te zijn voor de voedselinname en regulering van de inname-activiteit; later bleken ze invloed te hebben op de slaap en waakzame toestanden.20] Dube c.s.. hebben aangetoond dat centrale toediening van Orexins een modulerende rol speelt bij inname, voornamelijk in de hypothalamus. [21] In ons huidige experiment hebben we het effect van Orexin A-antagonist (SB-334867) op NAcc getest. NAcc heeft een centrale rol in verslavings- en voedingsgerelateerde activiteiten. [22] Orexinen zijn ook betrokken bij bemiddeling van deze actie van NAcc. [4] NAcc vertoonde echter twee histologisch verschillende districten, [23] die functionele verschillen kunnen hebben [24] en hun functies leken aanzienlijk te overlappen.25] Bij onze eerdere experimenten hebben we vastgesteld dat infusie van Orexin A in NAcc met behulp van de micro-injectietechniek de voedsel- en wateropname verhoogde in de uren onmiddellijk na de infusie, maar er was geen bijzondere voorkeur voor alcohol wanneer deze werd getest met twee flessenvrije keuzes.14] Daarom hebben we gepoogd Orexin A-antagonist in NAcc te injecteren en de voedselinname, waterinname en alcoholinname bij ratten, die 's nachts vasten, te analyseren.
Het verbruik in 1st h daalde significant in met orexineantagonisten behandelde dieren. Onze studie bewijst verder de rol van Orexin A in voedingsgedrag. Orexinereceptor type 1 (OX1R) antagonist SB-334867 infusie verzwakt het eten en drinken. Orexin A toonde consequent het stimulerende effect op voeding en drinken. OX1R-antagonist heeft 10 maal grotere affiniteit voor Orexin A dan B. [26,27]
Orexinergische neuronen projecteren op de AccSh en beide orexinereceptoren (OX1R en OX2R) zijn aanwezig in de NAcc, met OX2R in grotere mate uitgedrukt.28,29] Orexin A verhoogde GABAergische stromen en afgenomen N-methyl-D-aspartaatstromen in geïsoleerde accumbens-neuronen.30] Daarnaast exciteren orexins dopaminerge VTA-neuronen.31] Omdat dopaminerge VTA-neuronen de AccSh GABAergic (remmende) neuronen innerveren en exciteren, zou orexinese signalering de lokale inhibitie in de Acc verder kunnen verhogen door de neuronale activiteit in de VTA te verhogen, wat resulteert in een verdere verbetering van het consumptiegedrag. Maar dit werd tegengesproken door Baldo en Kelley, [32] die geen effect op de voeding of locomotorische activiteit vonden met intra-AccSh Orexin A.
We hebben de mogelijkheid getest dat Orexin A fungeert als een modulator voor alcoholgebruik [Tabel 2] samen met eten. Uit onze vorige studie hebben we vastgesteld dat ratten de voorkeur geven aan alcohol met 10% -oplossing, wat is bevestigd in ons eigen eerdere onderzoek.33] Daarom hebben we in deze studie alcohol in deze verdunning verstrekt na de infusie van het geneesmiddel in NAcc. We vonden een significante afname van de alcoholinname in de uren onmiddellijk na de infusie van Orexin A-antagonist. De afname in voedsel- en waterinname was lager in de infusiegroep met lage dosis (3 ng) terwijl deze hoger was in de groep met de hoge dosis (6 ng). Om de alcoholvoorkeur te testen, hebben we de ratten twee fleskeuzetoestanden gegeven, waarbij één fles water en een andere die 10% alcohol bevatte gelijktijdig werden verstrekt. Na infusie van de Orexin A-antagonist was er een significante daling van de voedselinname en alcoholinname. Dit type achteruitgang werd zowel in lage als hoge dosis gevonden, maar beperkt tot 1st h na de infusie. De daling van de voedselinname was echter groter in vergelijking met het water of alcohol. Dit bewijs geeft steun voor de betrokkenheid van Orexin A bij de regulering van de voedselinname, maar biedt geen ondersteuning voor de mogelijkheid dat Orexin A wordt betrokken bij de voorkeur voor alcohol.
Financiële steun en sponsoring
Afdeling Biotechnologie, Onderdeel van DBT-project, Ref: Ref: BT / PR14012 / MED / 30 / 315 / 2010 van 30.09.2010 Government of India.
Belangenconflicten
Er zijn geen belangenconflicten.
Danksagung
De auteurs zijn dankbaar aan het ministerie van Biotechnologie, de regering van India, voor de financiële steun. Kasturba Medical College, Mangalore, Manipal University, voor de aangeboden faciliteiten.
Referenties
;
