Hypocretine (orexine) vergemakkelijkt beloning door de antireward-effecten van zijn cotransmitter-dynorfine in het ventrale tegmentale gebied (2014) te verzwakken

John W. Muschamp,^a,1 Jonathan A. Hollander,^b Jennifer L. Thompson,^c George Voren,^b Linda C. Hassinger,^a Sara Onvani,^a Theodore M. Kamenecka,^b Stephanie L. Borgland,^c Paul J. Kenny,^b en William A. Carlezon, Jr.^a

Auteursinformatie ► Informatie over auteursrecht en licentie ►

Hypocretine (orexine) en dynorfine zijn neuromodulatoren die een belangrijke rol spelen bij het reguleren van affect en motivatie. Orexin is cruciaal voor beloning en is betrokken bij het zoeken naar drugs, terwijl dynorphin negatieve gemoedstoestanden veroorzaakt en betrokken is bij depressieve toestanden. Gezien deze tegengestelde effecten, meldt dat beide peptiden in dezelfde neuronen tot expressie worden gebracht en in een coreleaat worden gebracht, zijn contra-intuïtief. Hier laten we zien dat orexine en dynorfine samen tot expressie worden gebracht binnen dezelfde synaptische vesicles en dat deze colocalisatie een grote invloed heeft op beloning, drugsgebruik en impulsief gedrag. Het feit dat orexine de depressieve-achtige antireward-effecten van dynorfine afsluit, verandert aanzienlijk de manier waarop we de functionele rol van orexine in de hersenen bekijken.

Hypocretine (orexine) en dynorfine zijn neuropeptiden met tegengestelde acties op gemotiveerd gedrag. Orexin is betrokken bij toestanden van opwinding en beloning, terwijl dynorfine betrokken is bij depressieve toestanden. We laten zien dat, ondanks hun tegengestelde acties, deze peptiden zijn verpakt in dezelfde synaptische vesicles binnen de hypothalamus. Verstoring van de orexine-functie stomp de belonende effecten van laterale hypothalamische (LH) stimulatie af, elimineert door cocaïne geïnduceerde impulsiviteit en vermindert de zelftoediening door cocaïne. Gelijktijdige verstoring van de dynorfine-functie keert deze gedragsveranderingen om. We laten ook zien dat orexin en dynorfine tegengestelde acties hebben op de exciteerbaarheid van dopamine-neuronen van het ventrale tegmentale gebied (VTA), een prominent doelwit van orexine-bevattende neuronen, en dat intra-VTA-orexine-antagonisme dalingen veroorzaakt in zelf-toediening van cocaïne en zelfstimulering van LH die zijn omgekeerd door dynorphin antagonisme. Onze bevindingen identificeren een uniek cellulair proces waarmee orexine de beloningsdrempelverhogende effecten van een coreleasedynorfine kunnen occluderen en daardoor op een tolerante manier werken om beloning te vergemakkelijken.

Orexin en Dynorphin zijn cotransmitters.

We bevestigden de co-expressie van orexine en dynorfine in dezelfde neuronen van de laterale, perifornische en dorsomediale hypothalamus van de muis met behulp van fluorescentiemicroscopie (18) (Fig 1A). Het bestaan ​​van neuronen die meerdere zenders uitdrukken, is beschreven in andere hersencircuits en kan de neurale basis vormen voor filtermechanismen waardoor afgifte van co-geëxprimeerde neurotransmitters optreedt bij verschillende brandsnelheden (19). Met behulp van EM vonden we echter dat orexine en dynorfine zijn gecolokaliseerd binnen dezelfde synaptische vesicles. De meeste gevallen van copackaging werden waargenomen in niet-gemyeliniseerde, varieteuze axonale processen, waarbij immunolabeling werd gevonden in of nabij vesicles. Binnen neuronale cellichamen was significante labeling geassocieerd met het Golgi-complex, terwijl geen enkele werd gevonden in aangrenzende kernen (Fig 1 B en C). Dendrieten bevatten ook vesikel-geassocieerde labeling voor beide peptiden, wat een mogelijke dendritische afgifte van deze zenders suggereert. Een klein aantal microstructurele profielen legde axon terminals vast met labeling voor beide peptiden gelokaliseerd in grote (~ 100 nm) vesicles buiten de release zone van asymmetrische synapsen (Fig 1 B en C), steunend voor de conclusie dat orexin en dynorfine functioneren als cotransmitters en dat ze onder normale omstandigheden samen worden vrijgegeven in plaats van differentieel als een functie van de celfrequentie.

 

Fig. 1.

Orexin en dynorfine zijn cotransmitters in neuronen van de hypothalamus. (A, uiterst links) Fotomicrografie met helder veld toont het onderzochte gebied van de hypothalamus voor orexine (rood) en dynorfine (groen) immunoreactiviteit. (A, uiterst rechts) Samengevoegd tweekanaals beeld ...

Beloningsdrempel - Verhogende effecten van Orexin blokkade worden omgekeerd door Dynorphin blokkade.

Om de functionele significantie van dit unieke patroon van transmitteruitdrukking te onderzoeken, onderzochten we of verstoringen in orexine en dynorfinesignalering complexe gedragingen kunnen beïnvloeden die een normale en afwijkende motivatie weerspiegelen. In C57BL / 6 muizen getraind om intracraniële zelfstimulatie (ICSS) uit te voeren versterkt met laterale hypothalamische (LH) stimulatie (20), blokkade van OX₁Rs door N- (2-methyl-6-benzoxazolyl) -N "-1,5-naftyridine-4-ylureum (SB334867) tijdens de lichte fase veroorzaakte dosisafhankelijke toenames in beloningsdrempels (Fig 2A; one-way herhaalde metingen ANOVA voor dosis: F_3,12 = 4.44, P <0.02). Verhogingen van ICSS-drempels weerspiegelen door de behandeling geïnduceerde verlagingen van de belonende impact van de stimulatie, een depressief-achtig teken dat indicatief is voor een verminderde gevoeligheid voor beloning (20). Dit effect was niet het gevolg van sedatie of andere niet-specifieke gedragsstoornissen, omdat de ICSS-responspercentages niet werden beïnvloed (Fig 2B; one-way herhaalde metingen ANOVA voor dosis: F_3,24 = 0.33, P > 0.80).

 

Fig. 2.

Beloningsdrempelverhogende effecten van orexineblokkade worden omgekeerd door dynorphin-blokkade. (A) Blokkade van orexinesignalering bij OX₁R door SB334867 (0-30 mg / kg, ip) verhoogt de beloningsdrempels in de ICSS-test, wat een verminderde beloning aangeeft. Dit effect ...

Verhogingen in beloningsdrempels veroorzaakt door SB334867 werden voorkomen door voorbehandeling met nor-binaltorphimine (norBNI) [tweeweg herhaalde metingen ANOVA voor Geneesmiddel (tussen patiënten factor) × Dosis SB (binnen subjectfactor) interactie: F_3,24 = 3.98, P <0.01], wat een langdurige blokkade van dynorfine-acties bij KOR's (10). Deze gegevens suggereren dat het verlies van orexinesignalering latente antireward effecten van coreleased dynorphin onthult. Toediening van norBNI alleen verminderde de beloningsdrempels niet. Hoewel dit effect gerelateerd kan zijn aan de unieke farmacodynamiek van norBNI en andere prototypische KOR-antagonisten (10), kan het ook aangeven dat er redundantie is in processen die de activiteit van hersen-beloningscircuits moduleren of dat fasische toenames in orexin-toon alleen (ongehinderd door coreleasedynorfine) onvoldoende zijn om een ​​beloningssignaal van de stimulatieplaats in de laterale hypothalamus over te brengen. Deze bevindingen lijken in eerste instantie inconsistent met het werk van anderen die SB334867 op ICSS-drempel in de donkere fase (21). Er is echter aanzienlijk bewijs dat afname van de orexine-functie gevolgen kan hebben die afhangen van het feit of dieren tijdens hun lichte of donkere fase worden getest. Voedsel en water behouden hun belonende effecten bijvoorbeeld in orexin KO-muizen wanneer tests worden uitgevoerd tijdens de donkere fase, maar niet tijdens de lichte fase (22), het tijdstip waarop we al onze gedragstesten hebben uitgevoerd.

Om de effecten van systemische SB334867- en norBNI-toediening op ICSS te lokaliseren, werd een afzonderlijk cohort muizen geïmplanteerd met LH-stimulerende elektroden en VTA-geleidingscanules. Microinfusie van SB334867 in VTA veroorzaakte duidelijke verhogingen van beloningsdrempels, wat wijst op verminderde beloningsgevoeligheid. Hoewel intra-VTA norBNI alleen geen effect had op ICSS-drempels, blokkeerde het de drempelverhogende effecten van daaropvolgende SB334867-infusie (Fig 2C; one-way herhaalde maatregelen ANOVA voor geneesmiddelen: F_3,9 = 10.98, P <0.01). Hoewel intracraniële medicijninfusies de neiging hadden om een ​​bescheiden vermindering van de maximale responspercentages te produceren in vergelijking met systemische medicijninjecties, bereikten deze effecten geen statistische significantie (Fig 2D; one-way herhaalde maatregelen ANOVA voor geneesmiddelen: F_3,9 = 1.03, P = 0.112).

Impulsiviteit gereguleerd door Orexin en Dynorphin Transmission.

Impulsiviteit wordt gekenmerkt door gebreken in de onderdrukking van beloningszoekgedrag, waarbij een hoog niveau van impulsiviteit een veelvoorkomend kenmerk is van veel psychiatrische aandoeningen (23). Drugsmisbruik, waaronder cocaïne, kan ook een toename van de impulsiviteit veroorzaken, waarvan wordt verondersteld dat deze de ontwikkeling van verslaving stimuleert (24). Rekening houdend met de sleutelrol voor coreleased-orexine en dynorfine bij het beheersen van de gevoeligheid voor het lonende effect van LH-stimulatie in de ICSS-test, stelden we de hypothese voor dat interacties tussen deze twee neuropeptiden basislijn-impulsiviteit en door cocaïne geïnduceerde tekorten in dit gedrag zouden kunnen beïnvloeden. Impulsiviteit kan bij knaagdieren worden gekwantificeerd door voortijdige responsen te meten in de 5-keuze seriële reactietijdstaak (5-CSRTT) (25), een diermodel dat analoog is aan de continue prestatietest die wordt gebruikt om de aandacht bij mensen te bestuderen. Voortijdig reageren in deze test heeft de neiging onder normale omstandigheden laag te zijn en wordt verergerd door geneesmiddelen die DA-transmissie bevorderen (26). We gebruikten de 5-CSRTT om de bijdrage van het orexin-dynorfinesysteem aan spontaan en door cocaïne geïnduceerd impulsief gedrag te onderzoeken. Wanneer het alleen werd toegediend, verminderde SB334867 het reeds lage aantal spontane premature reacties verder (Fig 3A; F_3,21 = 4.89, P <0.01). Deze verlagingen deden zich voor bij afwezigheid van effecten op de nauwkeurigheid van de respons (F_3,21 = 1.45, P = 0.25), latentietijd van pellets (F_3,21 = 0.91, P = 0.44), of het aantal uitgevoerde stimulusonderzoeken (F_3,21 = 1.46, P = 0.25), wat aangeeft dat ze niet te wijten waren aan verminderde waakzaamheid of motorische vermogens. Toediening van norBNI heeft echter de effecten van SB334867 op vroegtijdige reacties omgekeerd (Fig 3B; F_3,18 = 0.45, P = 0.71), wat suggereert dat ongehinderde overdracht van dynorfine cruciaal is om deze anti-impulsieve effecten te bemiddelen. Gegeven alleen of in combinatie met SB334867, heeft norBNI geen effect op maatstaven voor responsnauwkeurigheid (F_3,18 = 0.66, P > 0.58), latentie (F_3,18 = 3.09, P > 0.06), of het aantal voltooide stimulusproeven (F_3,18 = 2.38, P > 0.10). Voorbehandeling met SB334867 voorkwam ook de dubbele toename van voortijdige respons veroorzaakt door cocaïne (Fig 3C; F_6,24 = 5.84, P <0.01). Deze gegevens leveren het bewijs dat orexine-neurotransmissie impulsief gedrag kan reguleren onder zowel basislijn- als door cocaïne gestimuleerde omstandigheden op een dynorfinegevoelige manier.

 

Fig. 3.

Impulsiviteitsgedrag geregeld door balans van orexin en dynorfine. (A) SB334867 verzwakt voortijdige reacties in het 5-CSRTT rattenmodel van motorische impulsiviteit. Metingen van nauwkeurigheid, latentie om de voedselpellet op te halen en aantal weggelaten trials waren ...

Dynorphin bemiddelt verminderde zelf-toediening van cocaïne in OX₁R-nulmuizen.

De kwetsbaarheid voor verslaving is aanzienlijk toegenomen bij impulsieve individuen, en door cocaïne geïnduceerde stijgingen van de impulsiviteit worden verondersteld bij te dragen aan het ontstaan ​​van verslaving (23, 27). Bovendien zijn orexine transmissie en dynorfine-overdracht onafhankelijk betrokken geweest bij het reguleren van de lonende effecten van cocaïne en andere drugs van misbruik (28-32). We stelden de hypothese voor dat interacties tussen orexine en dynorfine-overdracht het gebruik van geneesmiddelen direct kunnen beheersen. Om deze mogelijkheid te onderzoeken, onderzochten we iv cocaïne zelftoediening bij genetisch gemodificeerde muizen zonder OX₁Rs (OX₁R^{- / -}). Muizen van dit genotype vertonen significant lagere cocaïnen zelftoediening over een breed bereik van doses (0.1-1 mg / kg per infusie) maar tonen onveranderd reageren voor voedselbeloningen onder dezelfde versterkingsschema's (33), wat suggereert dat reducties in cocaïnegebruik niet ondergeschikt zijn aan tekortkomingen in gedragsprestaties. Bovendien, OX₁R^{- / -} muizen vertonen normale snelheden van cocaïne zelftoediening tijdens de ongeveer drie initiële sessies van cocaïnegebruik, maar dan zien ze snel dalingen in het nemen van cocaïne (33). We bevestigden dit fenotype in een dosis van 0.3 mg / kg per infuus, wat duidt op signalering via OX₁Rs speelt een cruciale rol bij het vaststellen en behouden van zelftoedieningsgedrag van cocaïne [Fig 4; tweeweg herhaalde metingen ANOVA, Genotype (tussen factor van de patiënt) × Geneesmiddelbehandeling (binnen de factor van de proefpersonen): F_1,12 = 12.91, P <0.01]. Net zoals voorbehandeling met norBNI normaal ICSS en impulsief gedrag herstelde bij muizen die SB334867 kregen, herstelde het ook gedeeltelijk de zelftoediening van cocaïne in OX.₁R^{- / -} muizen, een uniek voorbeeld waarbij een gedragstekort geproduceerd door genetische ablatie in de functie van één neurotransmittersysteem wordt gered door blokkade van een ander. Deze bevindingen suggereren dat, in OX₁R^{- / -} muizen, de ongehinderde acties van dynorfine verminderen de belonende eigenschappen van cocaïne en verminderen daardoor de zelftoediening van het medicijn. Interessant, in OX₁R^{+ / +} (controle) muizen, norBNI verlaagden onverwacht cocaïne zelftoediening. Een mogelijke verklaring voor dit effect is dat dynorphin die wordt vrijgegeven door nonorexine-neuronen, zoals de zogenaamde "directe" striatonigrale middelgrote stekelige neuronen, de tegenovergestelde effecten heeft op de cocaïne-inname en de belonende effecten van cocaïne feitelijk kan vergemakkelijken. Het bestaan ​​van twee populaties KOR's met tegengestelde rollen bij de cocaïnebeloning zou ook verklaren waarom norBNI de tekorten in het cocaïnegebruik Gedrag in de OX slechts gedeeltelijk heeft omgekeerd₁R KO-muizen. Als alternatief vermindert KOR-antagonisme de aversieve of stressvolle effecten van cocaïneonttrekking (34), die bijdragen tot patronen van inname van drugs (17). Hoe dan ook, deze gegevens suggereren dat de depressieve-achtige effecten van dynorfine de overhand hebben bij afwezigheid van intacte orexin-signalering, waardoor de belonende effecten van cocaïne worden verminderd, terwijl de effecten van orexine de lonende effecten van cocaïne vergemakkelijken, waardoor de duur ervan wordt verlengd in afwezigheid van cocaïne. dynorfinesignalering.

 

Fig. 4.

Verminderde cocaïne zelftoediening in OX₁R KO-muizen worden hersteld door KOR-blokkade. Aantasting van orexinesignalering bij OX₁R door genetische deletie van deze receptor vermindert iv zelf-toediening van cocaïne (0.3 mg / kg per infusie). Dit tekort is gedeeltelijk ...

Orexin en Dynorphin kunnen evenwichtige, tegengestelde effecten op de exciteerbaarheid van VTA DA-neuronen uitoefenen.

Hersenstructuren die input ontvangen van hypothalamische orexine- en dynorfine-neuronen worden mogelijk blootgesteld aan beide peptiden en zijn dus onderworpen aan hun tegengestelde effecten op neuronale exciteerbaarheid (35, 36). De mate waarin de effecten van één peptide prevaleren boven die van de andere hangt waarschijnlijk van talrijke factoren af, waaronder de relatieve abundantie van elk peptide, de levensduur in de extracellulaire ruimte en receptor-expressie in verschillende populaties van doelneuronen, evenals interacties tussen de receptoren en hun intracellulaire signaleringsmechanismen in postsynaptische cellen. Impulsiviteit en cocaïne-beloning worden, tenminste gedeeltelijk, gereguleerd door DA-neuronen in de VTA (26), een prominent doelwit van hypothalamische orexine bevattende cellen (37). Bovendien verbetert infusie van orexine in de VTA het zoeken naar geneesmiddelen (6). Om de relatieve bijdragen van elk peptide op de activiteit van VTA-neuronen te beoordelen, hebben we elektrofysiologische opnames gemaakt van DA-cellen in C57BL / 6 muizenhersenen die zijn blootgesteld aan orexine en dynorfine, afzonderlijk of samen toegepast. Zoals verwacht, was, indien afzonderlijk toegepast, orexine uniform exciterend, terwijl dynorfine alleen remmende effecten produceerde (Fig 5 A en B; F_2,50 = 18.95, P ≤ 0.01). In de geregistreerde populatie DA-neuronen reageerden de meesten op verzadigende concentraties van beide peptiden, hoewel een kleine minderheid selectief alleen reageerde op orexine of dynorfine (Fig 5B). Opmerkelijk was dat beide peptiden werden toegepast op de dubbel reagerende neuronen (n = 10), was er geen netto-effect op de activeringssnelheid (Fig 5A), wat suggereert dat de tegengestelde effecten van elk peptide bij verzadigende concentraties elkaar effectief opheffen na corelease. Vier van de 10 neuronen vertoonden preferentiële remming door dynorfine ondanks de aanwezigheid van orexine, terwijl één cel preferentieel werd geëxciteerd (> 1.5-voudige verandering) door orexine ondanks de aanwezigheid van dynorfine (Fig 5 A en C). Over het geheel genomen, hoewel meer cellen gevoelig waren voor orexine dan dynorfine, hadden die cellen die reageerden op beide peptiden geen netto verandering in de snelheid van het afvuren wanneer orexine en dynorfine gelijktijdig werden toegediend, hetgeen suggereert dat de tegengestelde invloeden van elk peptide in de set van VTA DA in evenwicht waren neuronen bestudeerd.

 

Fig. 5.

Orexine en dynorfine oefenen gebalanceerde maar tegengestelde effecten uit op VTA DA-neuronen. (Een linker) Co-plated orexin en dynorfine resulteren in geen netto verandering in de activeringssnelheid van VTA DA-neuronen (n = 10). Alleen toegepast, dynorfine was remmend en orexine was prikkelend. ...

Om de potentiële orexine-dynorfine-interacties binnen VTA DA-neuronen die gevoelig waren voor zowel orexine als dynorfine verder te verhelderen, hebben we als alternatief de remmende effecten van bad-toegepast dynorfine door behandeling met SB334867 (Fig. S2A; F_5,25 = 2.13, P <0.01) of om de prikkelende effecten van in het bad aangebrachte orexine te versterken door behandeling met norBNI (Fig. S2B; F_3,27 = 5.48, P <0.01). In beide experimenten, OX₁R- en KOR-blokkade konden deze effecten niet produceren, wat suggereert dat SB334867 en norBNI geen effecten via niet-specifieke acties uitoefenen. Belangrijker is dat deze gegevens suggereren dat de tonus van elk peptide in vitro onvoldoende is om te worden beïnvloed door toepassing van antagonisten met een klein molecuul zoals SB334867 en norBNI. Deze bevinding komt overeen met eerder werk dat aangeeft dat exocytose van grote, peptide-bevattende vesicles meestal alleen optreedt bij hoge aanhoudende bakfrequenties die normaal niet voorkomen in plakpreparaten (38).

Om te verifiëren dat norBNI het gedrag niet beïnvloedde door "off-target" -acties direct bij OX₁Rs, we hebben vervolgens de effecten van deze antagonist op OX onderzocht₁R-signalering. Specifiek gebruikten we een fluorometrische imaging-plaatlezer (FLIPR) -test om het vermogen te bepalen van door bad aangebrachte orexine A, SB334867 of norBNI om intracellulaire calciumtransiënten in gekweekte CHO-cellen die menselijke OX tot expressie brengen te induceren.₁Rs. Hoewel orexine A de verwachte toenames in intracellulair calcium veroorzaakte (EC₅₀ = 0.01 μM) en SB334867 verminderden dit effect dosisafhankelijk (EC₅₀ = 0.035 μM) en norBNI kon geen effecten op baseline of orexine A-opgewekte verhogingen van intracellulair calcium produceren. Dit suggereert dat de effecten van norBNI op de neuronale fysiologie van VTA DA uitsluitend via voorgestelde KOR-signaalmechanismen zijn en dat het geneesmiddel geen direct effect heeft op OX₁R (39) (Fig. S3 A-C).

Orexin-Dynorfine-interacties in VTA reguleren cocaïne zelftoediening.

Onze elektrofysiologische studies tonen aan dat dynamische interacties tussen orexine en dynorfine de VTA DA-activiteit reguleren en dat VTA-neuronen waarschijnlijk dienen als een belangrijk substraat voor de effecten van het orexin-dynorfinesysteem op gemotiveerd gedrag. Om deze hypothese rechtstreeks te testen, onderzochten we de effecten van intra-VTA-infusie van SB334867 op iv cocaïne zelftoediening bij ratten. Vergeleken met intra-VTA-voertuiginfusie veroorzaakte intra-VTA SB334867 een duidelijke vermindering van de cocaïne-inname die werd geblokkeerd door norBNI (Fig 6; one-way ANOVA: F_3,24 = 11.56, P <0.01), wat suggereert dat ongehinderde dynorfine-acties in dit hersengebied de cocaïnebeloning verzwakken. Deze resultaten lijken in strijd te zijn met de resultaten die de afwezigheid van intra-VTA SB334867 hebben aangetoond over zelftoediening van cocaïne in lage-inspanning fixed ratio 1 (FR1) versterkingsschema's (40). Verschillende rapporten hebben echter laten zien dat naarmate de taakomvang toeneemt, SB334867 effectiever is in het verminderen van het nemen van medicijnen (2, 33). Omdat ratten in dit experiment een FR5-schema met een hogere inspanning uitvoerden, zijn de huidige bevindingen consistent met deze literatuur. Deze gegevens leveren direct bewijs dat de tegengestelde aard van orexin en dynorfine op de neuronale fysiologie van VTA DA aanzienlijke effecten op beloningsgedreven gedrag kan uitoefenen.

 

Fig. 6.

Orexine-dynorfine interacties in VTA bemiddelen druggebruik. De zelftoediening door cocaïne wordt verminderd door intra-VTA SB334867 (3 μg per zijde), terwijl dit effect wordt omgekeerd door voorbehandeling met norBNI (10 mg / kg, ip) (n = 9). ***P < ...

Dieren.

De volwassen mannelijke C57BL / 6J-muizen (8 wk van leeftijd; Jackson Laboratory) die werden gebruikt in EM-experimenten werden in een groep gehuisvest (drie tot vijf per kooi); die gebruikt voor ICSS werden afzonderlijk gehuisvest na een operatie. Volwassen mannelijke (350 g) Sprague-Dawley-ratten (Charles River Laboratories) werden gebruikt in de 5-CSRTT en cocaïne-zelftoedieningsexperimenten en werden gehuisvest in groepen van vier. De volwassen mannelijke C57BL / 6J-muizen (postnatale dagen 19-21) die voor de elektrofysiologie-experimenten werden gebruikt, waren in een groep ondergebracht (drie tot vijf per kooi). De OX1^{- / -} muizen en hun OX1^{+ / +} nestgenoten (6 wk van leeftijd) die werden gebruikt voor de zelftoedieningsstudies werden verkregen van Jackson Laboratory en werden meer dan zeven generaties teruggekruist voor C57BL / 6-muizen. Deze muizen waren in een groep gehuisvest (twee per kooi). Alle dieren werden gehuisvest onder temperatuurgecontroleerde condities op een 12-h licht / donker cyclus, en gedragstesten vonden plaats 4-5 h in de lichtcyclus; voedsel en water waren ad libitum beschikbaar, tenzij anders aangegeven. Procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health Gids voor de verzorging en het gebruik van laboratoriumdieren (50) en werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committees van McLean Hospital, de University of British Columbia, en Scripps Florida.

Immunohistochemie en microscopie.

Fluorescentie en zilver-versterkte gouden immunolabeling voor orexine A of prodynorfine werd uitgevoerd op alternatieve hersensecties van muizen volgens eerder gemelde procedures (51) en verwerkt volgens standaard EM-protocollen. Niet-overlappende gebieden van immunologisch gemerkt weefsel werden vervolgens willekeurig geselecteerd en gefotografeerd voor kwantificering van deeltjes met behulp van ImageJ-software (National Institutes of Health) (SI-materialen en -methoden, immunohistochemie en microscopie).

Elektrofysiologie.

Patch pipetten (3-5 MΩ) werden gevuld met 143 mM kaliumgluconaat, 10 mM Hepes, 0.2 mM EGTA, 2 mM MgATP, 0.3 mM NaGTP (met een pH van 7.2), en 270-280 mM mOsmol. Gegevens werden verzameld bij 20 kHz en gefilterd op 2 kHz met behulp van pClamp 10.0-software (Molecular Devices). Na het verkrijgen van een configuratie met een hele cel werden de cellen spanning-vastgeklemd op -70 mV en een reeks spanningsstappen (250 ms, van -60 tot -130 mV in 10-mV-stappen) werden toegepast om hyperpolarisatie te detecteren (I_h) stromingen. I_h werd bepaald als de stroomverandering tussen ~30 ms en 248 ms nadat de spanningsstap was toegepast. Intrinsieke activiteit van VTA DA-neuronen werd gemeten in de stroomklemmodus. Experimenten begonnen toen een stabiele basislijn-activeringssnelheid werd bereikt; substraten werden vervolgens gedurende 5 min toegepast en vervolgens uitgewassen met kunstmatige cerebrospinale vloeistof. De laatste 3 min van elk 5-min-segment werd gebruikt voor gegevensanalyse. Dynorfine A (1-17; 200 nM) en orexine A (100 nM) werden verkregen van Amerikaans peptide en opgelost in gedestilleerd water. Deze concentraties bleken eerder verzadigende effecten op VTA-celactiviteit te hebben (5, 52). Thiorphan (1 μM) en bestatin (10 μM) werden verkregen van Sigma-Aldrich, opgelost in gedestilleerd water en aangebracht samen met dynorphin A (SI-materialen en -methoden, elektrofysiologie).

FLIPR-test.

OX₁R-activiteit werd bepaald door het meten van intracellulaire calciumgehalten met FLIPR-assay zoals eerder beschreven (53) (SI-materialen en -methoden, Fluorometrische beeldplaatlezerbepaling).

ICSS.

Muizen werden geïmplanteerd met monopolaire stimulerende elektroden of canules (PlasticsOne) onder ketamine / xylazine (80 en 10 mg / kg, respectievelijk ip; Sigma) stereotactisch gericht naar de LH (18) en / of contralaterale VTA [van bregma: anteroposterior (AP), -3.2 mm; mediolateral (ML), -0.5 mm; dorsoventral (DV), -4.7 mm van dura]. Na een 7-d herstelperiode werden muizen getraind om te reageren op hersenstimulatie zoals eerder beschreven (18). De laagste frequentie die ondersteunde antwoorden (drempelwaarde) werd berekend met behulp van least-squares line-of-best-fit analyse. Wanneer muizen voldeden aan de stabiliteitscriteria voor ICSS-drempels (± 10% ten opzichte van 5 opeenvolgende dagen), werden effecten van medicamenteuze behandelingen gemeten. SB334867 (Scripps Florida) of DMSO-vehiculum werd om de andere dag toegediend met behulp van een Hamilton-injectiespuit (0.1 ml / kg ip) en drempels werden onmiddellijk gekwantificeerd in 15-min testsessies. De norBNI (10 mg / kg ip; Sigma) werd gegeven in zoutoplossing (10 ml / kg) 48 h vóór de start van ICSS-testen.

De 5-CSRTT.

Ratten waren voedselbeperkt (tot 85% vrij-voergewicht) en getraind in computergestuurde operatiekamers ondergebracht in geventileerde, geluiddempende kasten (Med Associates), en 5-CSRTT-procedures uitgevoerd zoals beschreven (25). SB334867 (in DMSO, 0.1 ml / kg) en / of cocaïne (in zoutoplossing, 1 ml / kg; Sigma) werd toegediend door ip-injectie 10 min voor het testen, net als in andere experimenten, en norBNI kreeg ten minste 48 h vóór de begin van testen (SI-materialen en -methoden, De 5-Keuze Seriële Reactietijd Taak).

IV Cocaïne zelftoediening.

Ratten en muizen werden geanesthetiseerd met een isofluraan (1-3% vol / vol) zuurstofdampmengsel en chirurgisch bereid met Silastic (VWR Scientific) katheters in de halsader volgens vastgestelde procedures (54). Onmiddellijk na de implantatie van de katheter bij de ratten werden bilaterale roestvrijstalen geleidecanules (23 gauge, 17 mm lang) geïmplanteerd in de VTA (van bregma: AP, 5.3 mm; ML, ± 0.7 mm; DV, -7.5 mm van dura ). Testen met SB334867 of norBNI tijdens dagelijkse sessies van 60 minuten werd uitgevoerd nadat stabiele cocaïne-inname was bereikt (<20% variatie in respons gedurende 3 opeenvolgende dagen; SI-materialen en -methoden, IV Cocaïne zelftoediening).

Statistieken.

Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. Voor ICSS-experimenten werd tweewegs herhaalde metingen ANOVA gebruikt om gemiddelden te vergelijken tussen met SB334867 behandelde en norBNI + SB334867-behandelde aandoeningen. One-way herhaalde metingen ANOVA met Newman-Keuls post hoc testen werden gebruikt om gemiddelden te vergelijken binnen SB334867 en norBNI + SB334867 condities. Herhaalde metingen in één richting ANOVA- en Newman-Keuls-testen werden ook gebruikt om middelen te vergelijken in alle 5CSRTT-experimenten. Herhaalde tweewegsmetingen ANOVA werd gebruikt om gemiddelden te vergelijken tussen behandelingsgroepen bij cocaïne zelftoedieningsexperimenten met OX₁R KO-muizen. Herhaalde metingen in één richting ANOVA- en Newman-Keuls-testen werden gebruikt om de gemiddelde respons op orexine en dynorfine door VTA DA-neuronen te vergelijken. Herhaalde metingen in één richting ANOVA- en Newman-Keuls-testen werden ook gebruikt voor het vergelijken van middelen voor de inname van cocaïne bij ratten die werden behandeld met SB334867 en norBNI. Verschillen werden als significant beschouwd als P <0.05.

We bedanken Dr. Garrett Fitzmaurice voor nuttige opmerkingen over het manuscript en Miranda S. Gallo en Melissa Chen voor hulp bij het verzamelen van gegevens. Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health Grants F32-DA026250 en K99-DA031767 (naar JWM), F32-DA024932 en K99-DA031222 (naar JAH), R01-DA023915 (naar. PJK) en R01-MH063266 (naar WAC ) en door een ontdekkingsbeurs van de Natural Sciences and Engineering Research Council (aan SLB).

Verklaring betreffende belangenconflicten: WAC heeft een patent (Amerikaans octrooi 6,528,518; gemachtigde: McLean Hospital) in verband met het gebruik van kappa-opioïde-antagonisten voor de behandeling van depressieve stoornissen. Alle andere auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dit artikel is een PNAS Directe inzending.

Zie Toelichting op pagina 5765.

Dit artikel bevat ondersteunende informatie online op www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1315542111/-/DCSupplemental.