Gelijktijdige blootstelling aan metamfetamine en seksueel gedrag verbetert de latere geneesmiddelbeloning en veroorzaakt compulsief seksueel gedrag bij mannelijke ratten (2011)

J Neurosci. 2011 Nov 9;31(45):16473-82. doi: 10.1523/JNEUROSCI.4013-11.2011.

Frohmader KS, Lehman MN, Laviolette SR, Coolen LM.

bron

Afdeling Anatomie en Celbiologie, Schulich School voor Geneeskunde en Tandheelkunde, University of Western Ontario, London, Ontario N6A5C1, Canada.

Abstract

Methamphetamine (Meth) -gebruikers melden dat ze seksueel genot hebben verhoogd, talloze seksuele partners hebben en meedoen aan onbeschermde seks als gevolg van verlies van remmende controle. Dit dwangmatig seksueel gedrag draagt ​​bij tot een verhoogde prevalentie van seksueel overdraagbare infecties, maar de neurale basis hiervoor is onbekend. We hebben eerder een paradigma opgesteld voor dwangmatig seksueel gedrag bij mannelijke ratten waarbij viscerale ziekte geïnduceerd door lithiumchloride gepaard was met seksueel gedrag (Davis et al., 2010; Frohmader et al., 2010a). De huidige studie onderzocht de effecten van herhaalde toediening van meth op seksuele prestaties, dwangmatig seksueel gedrag en seks of meth-beloning. Ten eerste lieten de resultaten zien dat zeven dagelijkse toedieningen van 2 mg / kg, maar niet 1 mg / kg, Meth de latenties verhoogden om paring te initiëren. Deze verslechtering was duidelijk 30 min na de laatste toediening van Meth, maar verdween na 1 of 7 d van daaropvolgende medicijnontwenning. Herhaalde 1 mg / kg Meth blootstelling resulteerde in dwangmatig sekszoekgedrag 2 weken na laatste toediening van Meth. Dit effect was afhankelijk van de toediening van meth in combinatie met seksuele ervaring en werd niet waargenomen bij seksueel ervaren dieren die Meth alleen kregen. Bovendien, de gelijktijdige Meth en seksuele ervaring verbeterde geconditioneerde plaatsvoorkeur (CPP) voor Meth, en voor gelijktijdige Meth en paring vergeleken met Meth of alleen paring. CPP voor alleen paring daarentegen was verlaagd. Samen geven deze gegevens aan dat de associatie tussen drugsgebruik en paring mogelijk vereist is voor de expressie van dwangmatig seksueel gedrag en gecorreleerd is aan een verhoogde beloning op zoek naar gelijktijdige blootstelling en paring van Meth.

Introductie

Seksuele gezondheidsgerelateerde ziekten in verslaafde populaties hebben mensen bewust gemaakt van de effecten van drugsmisbruik op seksueel gedrag, aangezien chronisch drugsgebruik wordt geassocieerd met onveilige seksuele praktijken die leiden tot een verhoogde prevalentie van seksueel overdraagbare aandoeningen, waaronder het humaan immunodeficiëntievirus (HIV) (Crowe en George, 1989; Peugh en Belenko, 2001; Sánchez et al., 2002; Raj et al., 2007; Fisher et al., 2011). Deze effecten van medicijnen op seksueel gedrag zijn goed gedocumenteerd voor psychostimulant methamphetamine (Meth). Methgebruikers melden vaak verhoogde seksuele verlangens, opwinding en plezier en identificeren deze factoren als primaire motivatie voor drugsgebruik (Semple et al., 2002; Schilder et al., 2005; Groen en Halkitis, 2006). Bovendien wordt meth-misbruik vaak geassocieerd met verlies van remmende controle op seksueel gedrag of seksueel compulsief gedrag (Halkitis et al., 2001; McKirnan et al., 2001; Rawson et al., 2002; Groen en Halkitis, 2006) en verhoogde prevalentie van HIV (Frosch et al., 1996; Halkitis et al., 2001; Parsons en Halkitis, 2002).

Menselijke rapporten die Meth-gebruik als voorspeller van seksueel risicogedrag demonstreren, zijn gebaseerd op zelfrapportages van chronische Meth-gebruikers die een betrouwbare meting missen voor de relatie tussen meth-gebruik en seksueel gedrag (Frohmader et al., 2010b). Daarom is een onderzoek naar door Meth geïnduceerde veranderingen in seksueel gedrag onder gecontroleerde experimentele omstandigheden met behulp van een diermodel vereist om de complexe associatie tussen meth en seksueel gedrag te begrijpen.

Onlangs onderzocht ons laboratorium de effecten van acute meth op dwangmatig seks zoeken bij mannelijke ratten (Frohmader et al., 2010a). Deze studies gebruikten een geconditioneerd seksaversie-paradigma waarin mannelijke ratten leerden om paring te koppelen aan latere viscerale ziekte (Peters, 1983; Agmo, 2002). Zodra deze associatie tussen paring en de aversieve stimulus was vastgesteld, zouden dieren geen paringsgedrag initiëren (Davis et al., 2010; Frohmader et al., 2010a). Meth voorbehandeling van een enkele injectie weken voor conditionering verstoorde de verwerving van geremde seksuele reacties (Frohmader et al., 2010a). Meth-voorbehandelde mannelijke ratten waren dus op zoek naar seksueel gedrag, zelfs al was paring geassocieerd met een aversieve stimulus; dit werd onaangepast of dwangmatig paren genoemd.

Aangezien eerdere studies die de effecten van een acute injectie van geneesmiddelen testen en onderzoek naar de effecten van herhaalde meth op het seksuele gedrag van ratten, beperkt zijn, was het belangrijkste doel van het huidige onderzoek om de effecten van herhaalde meth-toediening op verschillende aspecten van seksueel gedrag te onderzoeken, inclusief prestaties, dwangmatig zoeken naar seks en beloning. Eerst werden de effecten van herhaalde Meth op paring getest na medicijntoediening en na perioden van medicijnontwenning om onderscheid te maken tussen korte- en langetermijneffecten van meth op seksuele functie. Vervolgens werden de effecten van herhaalde meth-toediening op onaangepast seksgedrag onderzocht, waarbij het geconditioneerde seksaversie-paradigma werd geïmplementeerd. Daarnaast werd bepaald of geleerde associaties tussen herhaalde blootstelling aan Meth en seksueel gedrag essentieel waren voor de effecten van Meth op onaangepast seksueel gedrag. Ten slotte werd getest of herhaalde meth-blootstelling resulteert in een verbeterde beloning voor meth en / of paring, zoals bepaald met geconditioneerde plaatsvoorkeurparadigma's (CPP).

Materialen en methoden

vakken

Volwassen mannelijke Sprague Dawley-ratten (210-225 g) werden verkregen van Charles River Laboratories en gehuisvest in paren van hetzelfde geslacht in standaard Plexiglas-kooien (thuiskooien) die stukken PVC-pijp bevatten voor omgevingsverrijking. Dieren werden gehuisvest in een kamer die werd onderhouden in een 12 / 12 h omgekeerd licht / donker cyclus (licht uit bij 11: 00 AM) met voedsel en water beschikbaar ad libitum. Alle testen werden uitgevoerd tijdens de donkere cyclus onder rode verlichting. Stimulusvrouwtjes (200-225 g; Charles River Laboratories) gebruikt voor seksueel gedrag werden bilateraal geovariëctomiseerd en kregen een subcutaan implantaat dat 5% estradiolbenzoaat en 95% cholesterol bevatte. Om seksuele ontvankelijkheid te induceren, werden vrouwen 0.5 mg progesteron toegediend in 0.1 ml sesamolie (sc) 4 h vóór seksueel gedrag. Experimentele procedures werden goedgekeurd door de Animal Care Committee van de University of Western Ontario en de University of Michigan Committee on Animal Care and Use en waren in overeenstemming met de richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care and National Institutes of Health.

Experimentele ontwerpen

Seksueel gedrag

Het huidige experiment onderzocht de effecten van herhaalde Meth op seksuele prestaties en motivatie onmiddellijk na de injectie van het geneesmiddel en na de periode van onthouding door geneesmiddelen. Drieëndertig mannelijke ratten hebben seksuele ervaring opgedaan in afzonderlijke testkooien (paararen; 60 × 45 × 50 cm) met schoon beddengoed tijdens vijf dubbelwekelijkse paring sessies. Tijdens elke paarssessie mochten mannetjes paren met een receptieve vrouw tot de weergave van één ejaculatie of voor 1 h, wat het eerst plaatsvond. Een week na de laatste paar sessie, werden mannen gewend aan experimentele procedures en kregen gedurende drie achtereenvolgende dagen een subcutane injectie van 1 ml / kg zoutoplossing. Na elke injectie werden de dieren in plexiglaslokotorkrachtactiviteitskamers geplaatst (40.5 x XUMMX cm; Med Associates) uitgerust met 40.5 x 16 fotobeammatrices; locomotorische activiteit werd opgenomen voor 16 min. Naast het opnemen van ambulant gedrag na injectie van de behandeling verschafte het plaatsen van mannen in de bewegingskamers een medicijngerelateerde omgeving die verschilt van die van het paringsgedrag. Vervolgens ontvingen mannen een dagelijkse injectie van 30 of 1 mg / ml / kg Meth of vehikel (zoutoplossing, 2 ml / kg; n = 11 elk) voor opeenvolgende dagen van 7. Na elke injectie werden mannetjes in de bewegingskamer van het bewegingsapparaat geplaatst en werd bewegingsactiviteit vastgelegd voor 30 min. Daarna keerden ze terug naar hun bedrijfskooien. Op de laatste dag van Meth-toediening werden mannetjes na 30 min verwijderd uit de locomotoreactiekamer en in de paringsarena geplaatst om te testen op de effecten van Meth op seksueel gedrag. Dieren werden opnieuw getest op seksueel gedrag in de paring arena's na 1 d of 1 week van medicijn onthouding.

Tijdens de paringssessies werden standaardparameters voor seksueel gedrag waargenomen en vastgelegd, inclusief latencies om te monteren (tijd vanaf introductie van vrouw tot eerste mount) en intromissie (tijd vanaf introductie van vrouw tot eerste intromissie), die indicatief zijn voor seksuele motivatie (Hull et al., 2002), evenals latentie tot ejaculatie (tijd van eerste intromissie tot ejaculatie), aantallen mounts en intromissies voorafgaand aan ejaculatie, en postejaculatie-interval, die metingen zijn van seksuele prestaties (Hull et al., 2002; Pfaus, 2009). Verschillen tussen groepen werden bepaald voor elke parameter van seksueel gedrag met behulp van niet-parametrische Kruskal-Wallis-analyse en Dunn's post hoc vergelijkingen, op significantieniveaus van 0.05.

Locomotorische activiteit

De motorische activiteit na elke Meth-injectie werd geanalyseerd met behulp van Med Associates-analysesoftware als afgelegde afstand binnen intervallen van 5 minuten. Groepsverschillen werden onderzocht met behulp van niet-parametrische Kruskal-Wallis-analyse en Dunn's post hoc vergelijkingen. Om de door Meth geïnduceerde locomotorisibilisatie te onderzoeken, werd de door Meth geïnduceerde activiteit tijdens de laatste 10 min van de test vergeleken tussen de eerste en de zevende injectiedag binnen elke behandelingsgroep voor de medicijndosis met behulp van gepaarde t testen. Een significantieniveau van 0.05 is toegepast op alle vergelijkingen.

Geconditioneerde seksaversie

Experimenteer 1.

Ten eerste werden 50-mannetjesratten gedurende drie achtereenvolgende dagen gewend aan zoutoplossinginjecties en mannen kregen seksuele ervaring tijdens drie paar sessies. Vóór elke paarssessie werden de dieren geïnjecteerd met ofwel 1 mg / kg Meth of 1 ml / kg zoutoplossing (sc), geplaatst in paring arena's, en, 30 min. Later, werden toegestaan ​​om te paren met een receptieve vrouw tot ejaculatie of 1 h. Parameters voor seksueel gedrag werden geregistreerd en geanalyseerd (zie Seksueel gedrag, hierboven). Twee weken later werden dieren onderworpen aan een geconditioneerd seksaversie-paradigma. Mannetjes werden onderverdeeld in vier experimentele groepen volgens voorbehandeling (Meth of zoutoplossing) en conditionering [lithiumchloride (LiCl) -geschakeld of -gepunkt]; groepen waren zout-ongepaard (n = 12), Meth-ongepaard (n = 12), zoutoplossing-gekoppeld (n = 13), en Meth-gepaarde (n = 13). Het geconditioneerde aversieparadigma bestond uit acht opeenvolgende 2 d-conditietrajecten. Tijdens de eerste dag werden alle mannen in de paringsarena geplaatst voor een 10 min gewenningsperiode, waarna een receptieve vrouw werd geïntroduceerd. Vrouwen werden geparfumeerd door de amandelolie op de nek en de basis van de staart af te nemen voordat ze paring hadden, omdat is aangetoond dat olfactorische aanwijzingen mannelijk naderingsgedrag vergemakkelijken en de conditionering versterken (Lawrence en Kiefer, 1987; Agmo, 2002). Mannetjes mochten paren voor 30 min of tot één ejaculatie. Als intromissies niet binnen de eerste 15 min plaatsvonden, werd de paring beëindigd. Eén minuut na ejaculatie of beëindiging van de proef kregen mannen een 127.2 mg / kg intraperitoneale injectie van 10 ml / kg LiCl (gepaarde mannetjes) of zoutoplossing (ongepaarde mannetjes). LiCl of zoutoplossing werden toegediend ongeacht of paring plaatsvond. De volgende dag ontvingen ongepaarde mannetjes een 10 ml / kg injectie van LiCl terwijl gepaarde mannetjes zoutoplossing kregen. Dieren werden na injecties in de huiskooi teruggebracht.

Experimenteer 2.

Om te testen of de effecten van Meth-voorbehandeling op geconditioneerde seksaversie afhankelijk waren van de gelijktijdige blootstelling aan Meth en paring of alleen vanwege Meth, werd een extra experiment uitgevoerd. Mannelijke ratten (n = 20) ontving seksuele ervaring tijdens vijf paringssessies maar zonder Meth- of zoutoplossing (n = 10 elk). In plaats daarvan, 1 week na seksuele ervaring, ontvingen ze zeven eenmaal daagse injecties van Meth (1 mg / kg, sc) of zoutoplossing en 2 weken later werden onderworpen aan het geconditioneerde seksaversie-paradigma (zie Experiment 1, hierboven).

Voor beide experimenten en tijdens elke conditioneringsproef werden parameters voor seksueel gedrag geanalyseerd en werden groepsverschillen bepaald voor elke conditietraining met behulp van een tweewegs ANOVA (factoren: Meth / zoutoplossing voorbehandeling, conditionering). Pearson χ2 analyse werd gebruikt om verschillen tussen groepen te vergelijken in de percentages van mannen die bergen, intromissies of ejaculatie vertoonden binnen elke conditioneringsroute.

Geconditioneerde plaatsvoorkeur

Om te testen of Meth-voorbehandeling de beloning voor Meth of seksueel gedrag beïnvloedde, werden CPP-experimenten uitgevoerd. Een apparaat met drie compartimenten (Med Associates) met twee grotere buitenkamers (28 x 22 x 21 cm) met zichtbare en voelbare signalen en gescheiden door een klein centraal compartiment (13 x 12 x 21 cm), werd gebruikt voor alle CPP-experimenten . Deuren aan beide zijden van het centrale compartiment scheidden de kamers en konden worden opgetild om de dieren vrij te laten bewegen door het apparaat, of kunnen worden verlaagd om ze tot een bepaald gebied te beperken. Het apparaat was uitgerust met fotobundels om de tijd die in elke kamer werd doorgebracht te meten. Op de eerste dag werd een pretest van 15 minuten uitgevoerd om de aanvankelijke kamervoorkeur van elk dier te bepalen, waarbij elk dier vrij tussen de kamers van het CPP-apparaat kon rondlopen. Tussen experimentele groepen werden geen significante voorkeuren voor beide kamers gedetecteerd. Dieren werden uitgesloten van het onderzoek als ze een uitgebreide voorkeur vertoonden voor een specifieke kamer (een verschil van meer dan 120 seconden; aangetoond door <10% van de proefpersonen). Conditionering werd uitgevoerd gedurende dagen 2 en 3. Tijdens conditionering werd de aanvankelijk niet-geprefereerde kamer (gepaarde kamer) gedurende 30 minuten gepaard met een beloningsmanipulatie. De aanvankelijk geprefereerde kamer (ongepaarde kamer) ging gepaard met een bedieningsmanipulatie. De volgorde waarin de dieren werden blootgesteld aan de gepaarde en ongepaarde kamers werd gecompenseerd binnen elke experimentele groep. Op de vierde en laatste dag werd een posttest uitgevoerd die procedureel identiek was aan de pretest.

Experimenteer 1.

Ten eerste werden 50-mannetjesratten gedurende drie achtereenvolgende dagen gewend aan zoutoplossinginjecties en mannen kregen seksuele ervaring tijdens drie paar sessies. Tijdens elke paarssessie werden de dieren geïnjecteerd met ofwel 1 mg / kg Meth of 1 ml / kg zoutoplossing (sc), geplaatst in testkooien en, 30 min. Later, liet men paren met een receptieve vrouw tot ejaculatie of 1 h. Parameters voor seksueel gedrag werden geregistreerd en geanalyseerd (voor beschrijving, zie Seksueel gedrag, hierboven). Een week later werden de dieren verdeeld in vier experimentele groepen gematched voor medicamenteuze behandeling en seksuele prestaties voor CPP-testen. Tijdens conditionering werden mannetjes geïnjecteerd met hetzij Meth hetzij zoutoplossing (overeenkomend met de eerdere geneesmiddelbehandeling) en 30 min. Later liet men paren tot ejaculatie. Eén minuut na ejaculatie werd het dier in de gepaarde kamer geplaatst. De ongepaarde kamer was geassocieerd met een injectie (Meth of zoutoplossing) of paring zonder een injectie. Na de posttest, een voorkeursscore (het percentage van de tijd doorgebracht in de gepaarde kamer tijdens de voor- en nameting, berekend als de tijd doorgebracht in de gepaarde kamer gedeeld door de tijd in de gepaarde + ongepaarde kamer x 100) en de CPP score (experiment 1; verschil in de tijd doorgebracht in de gepaarde kamer tijdens de nameting minus de pretest) werden berekend voor elk subject. Voorkeurscores werden vergeleken binnen experimentele groepen met behulp van gepaarde t tests en CPP-scores werden vergeleken tussen experimentele groepen met behulp van een one-way ANOVA en Fisher's minst significante verschiltest voor post hoc vergelijkingen, allemaal met 95% betrouwbaarheidsniveaus.

Experimenteer 2.

Om te testen of de effecten van Meth-voorbehandeling op CPP voor Meth of paring afhankelijk waren van de gelijktijdige blootstelling aan Meth en paring of alleen vanwege Meth, werd een extra experiment uitgevoerd. Mannelijke ratten ontvingen Meth (1 mg / kg) en paring gelijktijdig gedurende 4 opeenvolgende dagen (n = 10). Twee controlegroepen bleven seksueel naïef en kregen Meth of zoutoplossing (n = 10 elk). Een week later werd CPP voor Meth uitgevoerd. Alle mannen ontvingen een injectie van Meth in de gepaarde kamer en een zoutoplossinginjectie was geassocieerd met de ongepaarde kamer. Voorkeurscores werden berekend en vergeleken binnen experimentele groepen met behulp van gepaarde t tests met significantieniveau van 0.05.

Experimenteer 3.

Om te testen of gelijktijdige blootstelling aan Meth en paring van cruciaal belang is voor veranderde seksuele beloning, werd een paring CPP-onderzoek uitgevoerd. Mannelijke ratten ontvingen gelijktijdig Meth met (1 mg / kg) of zoutoplossing met paring gedurende vier opeenvolgende dagen (n = 10 elk). Een week later werd CPP op seksueel gedrag getest. Alle mannetjes werden geplaatst in de gepaarde kamer na paring en geen paring was geassocieerd met de ongepaarde kamer. Voorkeurscores werden berekend en vergeleken binnen experimentele groepen met behulp van gepaarde t tests met significantieniveau van 0.05.

Geconditioneerde plaatsaversie

Om te testen of de blootstelling aan meth de gevoeligheid voor LiCl-geïnduceerde ziekte verandert, werd een experiment met geconditioneerde plaatsafwijking (CPA) uitgevoerd. CPA-testen werden uitgevoerd tijdens de eerste helft van de donkere periode met hetzelfde apparaat als dat werd gebruikt voor CPP-experimenten (zie Geconditioneerde plaatsvoorkeur, hierboven). Gedurende drie opeenvolgende dagen kregen mannelijke ratten gelijktijdig seksuele ervaring met Meth (1 mg / kg) of zoutoplossing (n = 10 elk). Een week later ontvingen alle mannen een LiCl-injectie (10 ml / kg, ip) gepaard met de aanvankelijk de voorkeur verdienende kamer, terwijl een equivalente dosis zoutoplossing werd geassocieerd met de aanvankelijk niet geprefereerde kamer. Na de posttest, gemiddelde voorkeursscore (het percentage van de tijd doorgebracht in de gepaarde kamer tijdens de voor- en nameting, berekend als de tijd doorgebracht in de gepaarde kamer gedeeld door de tijd in de gepaarde + ongepaarde kamer x 100) en de CPA-score (verschil in tijdsbesteding in de gepaarde kamer tijdens de nameting minus de voormeting) werden berekend voor elk individu. Voorkeurscores werden vergeleken binnen experimentele groepen met behulp van gepaarde t tests, terwijl CPA-scores werden vergeleken tussen experimentele groepen die ongepaard gebruikten t tests, allemaal met significantieniveau van 0.05.

Resultaten

Seksueel gedrag

Meth beïnvloedde significant de initiatie van seksueel gedrag toen de paring 30 min werd getest na de laatste medicijninjectie. Dit effect was dosisafhankelijk bij 2 mg / kg, maar niet 1 mg / kg, Meth. Meth aanzienlijk toegenomen mount en intromission latencies (p = 0.001 en 0.002, respectievelijk) vergeleken met zoutcontroles (Fig 1A). Meth had geen invloed op de percentages mannetjes die het gedrag veroorzaakten, en 100% van de mannetjes ging gepaard in alle drie de behandelingsgroepen. Meth had geen langetermijneffecten op de start van seksueel gedrag, omdat meth-voorbehandelde mannen geen veranderd paargedrag vertoonden in vergelijking met zoutoplossing-voorbehandelde controles wanneer de paring werd getest tijdens de dagen van drugontwenning 1 en 7 (Fig 1B,C). Ten slotte had Meth op geen enkel moment invloed op de seksuele prestaties omdat er geen effecten waren op latencies naar ejaculatie (Fig 1) of aantallen mounts en intromissies (gegevens niet getoond). Dus herhaalde Meth-gestoorde initiatie van paring bij testen kort na toediening, maar had geen langetermijneffecten op seksuele motivatie of prestaties.

Figuur 1.   

Effecten van herhaalde meth op seksuele prestaties. A-C, Latenties om te monteren (ML), intromissie (IL) en ejaculatie (EL) na toediening van 0, 1 of 2 mg / kg Meth 30 min na de zevende en laatste medicijninjectie (A) en drugsonthoudingsdagen 1 (B) en 7 (C). Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. * Aanzienlijke verschillen ten opzichte van zoutoplossing-geïnjecteerde mannen (p <0.05).

Locomotorische activiteit

Meth bij zowel 1- als 2 mg / kg-doses verhoogde locomotorische activiteit in vergelijking met controles (p <0.001, 1 en 2 mg / kg; Fig 2A,B). Herhaalde toediening van Meth resulteerde in een gesensibiliseerde locomotorische respons-mannetjes die 1 mg / kg toegediend kregen. Meth vertoonde een significant grotere locomotorische activiteit na de laatste medicijninjectie in vergelijking met de eerste injectie (p = 0.042; Fig 2C). Daarentegen resulteerde 2 mg / kg Meth in significant verminderde locomotorische activiteit op de laatste dag vergeleken met de eerste dag (p = 0.009; Fig 2C), wat een aanwijzing kan zijn voor toename van stereotypisch gedrag.

Figuur 2.   

Effecten van herhaalde meth op locomotorische activiteit. A, B, Afgelegde afstand door mannen toegediend met 0, 1 of 2 mg / kg Meth na de eerste (A) en als laatste (B) Meth injectie. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. * Aanzienlijke verschillen met controle voor alle behandelingsgroepen (p <0.05); #significante verschillen tussen 1 mg / kg Meth en alleen controle (p <0.05). C, Meth-geïnduceerde gesensibiliseerde locomotorische respons. Afgelegde afstand door mannen die 0, 1 of 2 mg / kg Meth kregen toegediend na de eerste en laatste Meth-injectie tijdens de laatste 10 min van de opnames van bewegingsactiviteit. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. * Aanzienlijk verschil met seksueel naïeve mannen van dezelfde behandelingsgroep (p <0.05).

Geconditioneerde seksaversie

Seksueel gedrag

Tijdens de Meth-voorbehandelingsfase van Experiment 1 werd het seksuele gedrag niet beïnvloed door behandeling met 1 mg / kg Meth tijdens elk van de drie opeenvolgende sessies in vergelijking met met zoutoplossing voorbehandelde mannetjes (Tabel 1). Deze resultaten bevestigen het gebrek aan effecten van deze dosis Meth op seksueel gedrag, zelfs wanneer het in dezelfde omgeving wordt toegediend. Bovendien veranderde Meth-voorbehandeling het seksuele gedrag niet tijdens de eerste dag van het conditioneringsparadigma (vóór LiCl-paring; Tabel 1) of tijdens een van de conditioneringsonderzoeken in de LiCl-ongepaarde groepen. Deze resultaten bevestigen dat Meth geen langetermijneffecten op seksueel gedrag had.

Bekijk deze tafel:   

Tafel 1.    

Overzicht van seksueel gedrag

Dwangmatig seksueel gedrag

Experimenteer 1.

Daarentegen verhoogde de herhaalde Meth-behandeling het dwangmatig zoeken naar seks. In de controle remden zoutoplossing-voorbehandelde dieren, geconditioneerde seksaversie significant seksueel gedrag. In het bijzonder waren de verlaagde percentages van LiCl-gepaarde mannetjes die zich hadden opgehangen en geïntromiteerd in vergelijking met niet-gepaarde door zoutoplossing voorbehandelde mannetjes voor het eerst duidelijk op de zesde (p = 0.039) conditioneringsproef en volgehouden door conditioneringsproef 7 (p = 0.005; gegevens niet getoond) en 8 (p <0.001; Fig 3B). Een significant verschil in het percentage mannen dat ejaculeerde was voor het eerst duidelijk op de vierde (p = 0.041) conditioneringsproef en bleef gedurende de conditionering (p <0.001; Fig 3C). Meth-voorbehandeling had echter een negatieve invloed op de geconditioneerde seksaversie, omdat meth-voorbehandelde mannen gepaard met LiCl geen significante remming van seksueel gedrag bereikten tot de laatste conditioneringsproef vergeleken met niet-gepaarde meth-voorbehandelde mannen. In het bijzonder waren de percentages van met Meth-voorbehandelde LiCl-gepaarde mannetjes die intromissies en ejaculatie vertoonden significant verlaagd alleen tijdens conditioneringsproef 8 (p = 0.03 en p = 0.011, respectievelijk). Zo heeft Meth voorbehandeling 2 weken voor het begin van conditionering geleid tot slecht aanpassingsvermogen of dwangmatig sekszoekgedrag.

Figuur 3.   

Effecten van gelijktijdige paring (geslacht) en meth-voorbehandeling op geconditioneerde seksaversie (experiment 1). A, Experimentele groepen omvatten met zoutoplossing (Sal) of Meth voorbehandelde mannetjes die LiCl ontvingen na paring (gepaarde mannetjes) en met zoutoplossing of met Meth voorbehandelde mannetjes die zout kregen na paring (ongepaarde mannetjes). Tijdens de tweede dag van elke conditioneringsproef ontvingen gepaarde mannetjes zoutoplossing en ongepaarde mannetjes LiCl. B, C, Percentage van de montage van de mannetjes (B) en ejaculeren (C) tijdens geconditioneerde seksaversie na Meth-voorbehandeling gelijktijdig toegediend met seksuele ervaring. * Aanzienlijk verschil met door zoutoplossing voorbehandelde ongepaarde mannetjes (p <0.05); #significant verschil met Meth-voorbehandelde ongepaarde mannetjes (p <0.05).

Experimenteer 2.

De effecten van Meth-voorbehandeling op geconditioneerde seksaversie waren afhankelijk van gelijktijdige Meth en paringservaring. Met name de geconditioneerde seksaversie werd niet beïnvloed bij seksueel ervaren mannen die Meth voorbehandeling en paringservaring op verschillende tijdstippen kregen (niet-constant). Percentages van Meth-voorbehandelde LiCl-gepaarde mannetjes die mounts en ejaculaties vertoonden waren niet verschillend van zoutoplossing-voorbehandelde gepaarde mannetjes (Fig 4). Deze gegevens suggereren dat de initiële associatie tussen Meth en seksuele ervaring een factor was die bijdroeg aan de effecten van Meth op compulsief seksueel gedrag.

Figuur 4.    

Effecten van niet-gelijktijdige paring (geslacht) en meth-voorbehandeling op geconditioneerde seksaversie (Experiment 2). Percentage mannelijke montage (A) en ejaculeren (B) tijdens LiCl-geconditioneerde seksaversie na Meth-voorbehandeling die niet is geassocieerd met seksuele ervaring. Twee groepen werden omvat: LiCl-gepaard voorbehandeld met zoutoplossing en LiCl-gepaard voorbehandeld met Meth.

Geconditioneerde plaatsaversie

Bijkomende controle-experimenten onthulden dat het onvermogen om paring na meth-voorbehandeling te remmen niet het gevolg is van een afgestompte gevoeligheid voor LiCl-geïnduceerde viscerale ziekte, aangezien alle mannetjes een afkeer vormden van de kamer die was geassocieerd met een enkele dosis LiCl. In het bijzonder brachten zowel met zoutoplossing als Meth-voorbehandelde mannen significant minder tijd door in de LiCl-gepaarde kamer tijdens de nameting vergeleken met de voormeting (p = 0.037 en 0.045, respectievelijk; Fig 5A). Bovendien was het verschil in tijd doorgebracht in de LiCl-gepaarde kamer na de posttest-versus-pretest identiek in met Meth en saline voorbehandelde groepen (Fig 5B).

Figuur 5.    

Effecten van gelijktijdige paring (geslacht) en meth-voorbehandeling op door LiCl geïnduceerde CPA. A, B, Voorkeurscore (tijd doorgebracht op gepaarde kamer gedeeld door tijd in gepaarde + ongepaarde kamer × 100; A) en CPA-score (verschil in tijd doorgebracht in de gepaarde kamer tijdens de posttest minus pretest; B) in gepaarde mannetjes voorbehandeld met zoutoplossing (Sal; geslacht + zoutoplossing) of Meth (geslacht + Meth). Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. * Aanzienlijke verschillen met de pretest binnen dezelfde experimentele groep (p <0.05).

Geconditioneerde plaatsvoorkeur

experiment 1

Uit zelfrapportageonderzoek blijkt dat het gebruik van meth het seksuele genot verbetert en een primaire motivatie is voor drugsgebruik (Semple et al., 2002; Schilder et al., 2005; Groen en Halkitis, 2006). Deze door Meth veroorzaakte verbetering van seksueel genot is niet getest in het knaagdiermodel. Daarom werd CPP-paradigma gebruikt om te testen of seksueel gedrag met Meth meer lonend is dan paring of alleen Meth-toediening. In overeenstemming met eerdere studies (Agmo en Berenfeld, 1990; Pfaus en Phillips, 1991; Tenk et al., 2009), paring in zoutoplossing-voorbehandelde controle mannetjes resulteerde in CPP-mannetjes bracht meer tijd door in de sex + zoutoplossing-gepaarde kamer dan de zout-gepaarde kamer tijdens de nameting (p = 0.001; Fig 6C,D). Bovendien vormden controlemannen geen voorkeur voor de met geslacht + saline gepaard gaande kamer boven de geslachtsgepaarde kamer, hetgeen aantoont dat een zoutoplossinginjectie vóór paring geen invloed had op seksuele beloning (Fig 6C,D). De resultaten toonden aan dat Meth CPP verhoogde voor seks in vergelijking met ofwel paring ofwel Meth alleen. Mannen brachten meer tijd door in de posttest in de sex + Meth-gepaarde kamer dan in de geslachtsgepaarde kamer (p <0.001; Fig 6C) of de Meth-gepaarde kamer (p = 0.02; Fig 6C), of vergeleken met de controlegroep (p = 0.002 en 0.05, respectievelijk; Fig 6D). Daarom lijkt seksueel gedrag in combinatie met Meth meer lonend te zijn dan seksueel gedrag of Meth alleen bij dieren die gelijktijdig voorbehandeld zijn met seksueel gedrag en Meth.

Figuur 6.    

Effecten van gelijktijdige paring (geslacht) en meth-voorbehandeling op paring- en meth-geïnduceerde CPP (experiment 1). Vier groepen waren inbegrepen. A, Twee groepen kregen geslachts + saline (Sal) -voorbehandeling en de volgende behandeling in de gepaarde / ongepaarde kamer: geslacht + zoutoplossing / geslacht, geslacht + zoutoplossing / zoutoplossing. De eerste groep diende als een negatieve controle, omdat van zoutoplossing niet werd verwacht dat het CPP voor seks zou veranderen. De tweede groep diende als een positieve controle, omdat van geslacht werd verwacht dat het CPP veroorzaakte. B, De andere twee groepen kregen seks + Meth-voorbehandeling en het volgende in de gepaarde / ongepaarde kamers: geslacht + Meth / geslacht of seks + Meth / Meth. De volgorde waarin de dieren werden blootgesteld aan de gepaarde en ongepaarde kamers werd binnen elke experimentele groep gecompenseerd. C, Voorkeurscore (tijd doorgebracht in gepaarde kamer gedeeld door tijd in gepaarde + ongepaarde kamer × 100). Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. * Aanzienlijke verschillen met de pretest binnen dezelfde experimentele groep (p <0.05). DCPP-score (verschil in tijd doorgebracht in de gepaarde kamer tijdens de nameting minus de pretest). Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. * Aanzienlijke verschillen met de seks + zout- / geslachtsgroep (p <0.05).

experiment 2

Vervolgens werd bepaald of parallelle voorbehandeling van Meth en geslacht-beïnvloede CPP alleen voor Meth vergeleken met zoutoplossing in de ongepaarde kamer. Inderdaad vormden met Meth voorbehandelde mannetjes die gelijktijdig met elke geneesmiddelinjectie gepaard een voorkeur voor de met Meth-gepaarde kamer (p = 0.01; Fig 7). In tegenstelling hiermee vertoonden mannetjes die herhaalde zoutoplossing of Meth-injecties ontvingen zonder de context van paring geen verhoogde voorkeur voor de met Meth-gepaarde kamer tijdens de posttest.

Figuur 7.    

Effecten van gelijktijdige paring (geslacht) en meth-voorbehandeling op Meth-geïnduceerde CPP (Experiment 2). Voorkeurscore (tijd doorgebracht op de gepaarde kamer gedeeld door de tijd in de gepaarde + ongepaarde kamer 100) bij mannen voorbehandeld met zoutoplossing (Sal), Meth of geslacht + Meth. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. * Aanzienlijk verschil met pretest binnen dezelfde experimentele groep (p <0.05).

experiment 3

Ten slotte werd getest of parallelle meth en paringvoorbehandeling de CPP alleen beïnvloedden voor paring. Mannen voorbehandeld met Meth en paring vormde geen voorkeur voor seksueel gedrag, wat blijkt uit een gebrek aan toegenomen tijd doorgebracht in de geslachtsgepaarde kamer. Mannetjes die werden behandeld met zoutoplossing en paring vormden daarentegen een voorkeur voor de geslachtsgepaarde kamer (p = 0.003; Fig 8). Samen suggereren deze gegevens dat de associatie tussen Meth en paring resulteert in verhoogde incentive salience voor Meth in de afwezigheid van paring en voor paring gelijktijdig met Meth, maar verminderde incentive salience voor paring bij afwezigheid van het medicijn.

Figuur 8.    

Effecten van gelijktijdige paring (geslacht) en meth-voorbehandeling op paringsgeïnduceerde CPP (experiment 3). Voorkeurscore (tijd doorgebracht in de gepaarde kamer gedeeld door de tijd in de gepaarde + ongepaarde kamer 100) bij mannen voorbehandeld met sex + saline (Sal) of geslacht + Meth. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM.

Discussie

De huidige studie testte de effecten van herhaalde Meth op seksueel gedrag met specifieke aandacht voor seksuele prestaties, onaangepast of dwangmatig seks zoeken en paring en / of Meth-beloning. TDe belangrijkste bevinding van deze studie was dat Meth-voorbehandeling de expressie van seksueel gedrag niet beïnvloedde, maar in de weken na de voorbehandeling dwangmatig seksueel gedrag veroorzaakte. Dit effect op compulsief seksueel gedrag was afhankelijk van de gelijktijdige ervaring met Meth en paring. Bovendien versterkten gelijktijdige Meth en paring voorbehandelingen de Meth-beloning, maar verminderde seksuele beloning. Samen tonen deze studies aan dat een associatie tussen Meth en paring van cruciaal belang is voor de ontwikkeling of expressie van compulsief seksueel gedrag en veranderingen in seksuele en medicijnbeloning.

Meth-voorbehandeling, wanneer deze samenging met paring, had lange-termijneffecten op het vermogen van het geconditioneerde seksaversie-paradigma om seksueel gedrag te remmen. Dit effect kan niet gemakkelijk worden verklaard door een tekort aan leren of geheugen, omdat meth-voorbehandelde mannen geen enkel bewijs vertoonden van verminderd leren tijdens CPP of LiCl-geïnduceerde seksaversieparadigma's. Bovendien is het onwaarschijnlijk dat herhaalde toediening van de lage dosis meth de cognitieve stoornissen en neurotoxiciteit veroorzaakte die doorgaans worden waargenomen na chronische blootstelling aan hoge doses meth in ratten (Walsh en Wagner, 1992; Friedman et al., 1998; Chapman et al., 2001; Schröder et al., 2003) en mensen (Ornstein et al., 2000; Simon et al., 2002; Kalechstein et al., 2003), als Meth-bingeing-paradigma's van een dag met dezelfde dosis als het huidige onderzoek het leren van objectherkenning niet nadelig beïnvloedden en niet tot neurotoxiciteit leidden (Marshall et al., 2007). Een andere alternatieve verklaring voor de verminderde verwerving of expressie van geconditioneerde seksaversie is een verlies van gevoeligheid voor LiCl. Echter, dieren waren evengoed in staat om een ​​geconditioneerde aversie te verkrijgen voor een kamer die eerder gepaard was met LiCl. Vandaar dat meth-voorbehandelde mannen geen verminderd associatief geheugen of verminderde gevoeligheid voor door LiCl of LiCl geïnduceerde ziekte hadden. Het lijkt erop dat meth-voorbehandeling onaangepast of dwangmatig seksueel zoeken veroorzaakte, ondanks de geleerde negatieve gevolgen, die in overeenstemming zijn met menselijke rapporten (Frosch et al., 1996; Halkitis et al., 2001; McKirnan et al., 2001; Rawson et al., 2002; Somlai et al., 2003; Groen en Halkitis, 2006; Springer et al., 2007).

Bovendien wordt het effect van Meth en paring van voorbehandeling op verminderde remming van onaangepast seksueel gedrag niet gemakkelijk verklaard door een verbeterde beloning die gepaard gaat met paring. Daarentegen was bij dieren die tegelijkertijd meth en paring ontvingen, het zoeken naar beloning in verband met paring verminderd. Daarom moet een andere verklaring worden voorgesteld voor de effecten van gelijktijdige Meth en paring van voorbehandeling op de expressie van onaangepast seksueel gedrag. Een recente neuroanatomische studie van ons laboratorium identificeerde hersengebieden waar Meth effecten op seksueel gedrag kan mediëren (Frohmader et al., 2010c). Hier werd neurale activering geïnduceerd door paring of Meth onderzocht met behulp van markers voor neurale activiteit zoals Fos of fosforylatie van MAPK. Meth en paring co-geactiveerde neuronen in de nucleus accumbens, basolaterale amygdala en het anterieure cingulate gebied van de mediale prefrontale cortex (Frohmader et al., 2010c) en in de orbitofrontale cortex (Frohmader en Coolen, 2010). De prefrontale en orbitofrontale cortex zijn van bijzonder belang omdat ze bijdragen aan verslavend gedrag (Kalivas en Volkow, 2005; Kalivas et al., 2005; Lasseter et al., 2010; Winstanley et al., 2010). Bovendien is de hypoactiviteit van deze hersengebieden gecorreleerd met verschillende psychiatrische condities die gepaard gaan met verlies van remmende controle (Graybiel en Rauch, 2000; Taylor et al., 2002; London et al., 2005). Deze onderzoekslijnen suggereren dat Meth in deze frontale cortex kan werken om op de lange termijn veranderingen te veroorzaken die op hun beurt dwangmatig seksueel gedrag mediëren. In overeenstemming hiermee is gebleken dat hoge incidentie van dwangmatig seksueel gedrag overlapt met andere psychiatrische aandoeningen, waaronder drugsverslaving, angst en stemmingsstoornissen (Bancroft, 2008). Ook wordt van drugsgeïnduceerde disfunctie van de mediale prefrontale en orbitofrontale cortex verondersteld dat ze verantwoordelijk zijn voor verminderde impulscontrole (Brewer en Potenza, 2008; Fineberg et al., 2010) en toegenomen seksegerelateerd gedrag dat bij veel verslaafden wordt waargenomen (Jentsch en Taylor, 1999; Bancroft, 2008). Ikn overeenkomst hiermee, laesies van de mediale prefrontale cortex bij mannelijke ratten resulteerden in dwangmatig sekszoekgedrag in het geconditioneerde seksaversie-paradigma dat in de huidige onderzoeken werd gebruikt (Davis et al., 2010).

Eerder onderzoek heeft aangetoond dat herhaalde toediening aan psychostimulantia of opiaten de door drugs geïnduceerde beloning, zoals gemeten met CPP, verbetert.Lett, 1989; Shippenberg en Heidbreder, 1995; Shippenberg et al., 1996). Bovendien veroorzaakte seksuele ervaring daaropvolgende sensibilisatie van d-amfetamine-beloning (Pitchers et al., 2010). In de huidige studie werden de effecten van Meth en / of seksuele ervaring op Meth CPP getest onder omstandigheden waarvan niet werd verwacht dat ze in medicatie-CPP resulteerden: lage dosis Meth, een enkele conditietest en testen tijdens de donkere fase van de dag in tijden van laagste CPP (Webb et al., 2009a,b). De sensibiliserende regimes van herhaald Meth of seksuele ervaring die in de huidige studie werden gebruikt, veroorzaakten geen verbeterde Meth CPP. Meth-voorbehandeling gelijktijdig met paring versterkte echter de Meth-beloning, wat aangeeft dat deze associatie tussen Meth en paring een verbetering veroorzaakte in het zoeken naar een bel op Meth. Deze resultaten lijken in overeenstemming te zijn met de rapporten van de mens dat een verhoogd meth-gehalte het seksuele genot tijdens het innemen identificeert als een primaire drijfveer voor drugsgebruik (Semple et al., 2002; Schilder et al., 2005; Groen en Halkitis, 2006). Het is momenteel onduidelijk welke componenten van seksueel gedrag cruciaal zijn voor de associatie tussen Meth en paring. In de huidige studie, alle mannetjes gekoppeld aan ejaculatie. Onze eerdere bevindingen suggereren echter dat sociale interacties voldoende kunnen zijn om onaangepast sekszoekgedrag te veroorzaken (Frohmader et al., 2010a).

Neurale substraten die de versterkende effecten van gelijktijdige Meth en paringsvoorbehandeling op Meth-beloning kunnen mediëren, omvatten de nucleus accumbens en basolaterale amygdala. Langdurige veranderingen in de dichtheid en morfologie van dendritische wervelkolom in de accumbens zijn het gevolg van herhaalde toediening van geneesmiddelen (Bruin en Kolb, 2001; Robinson et al., 2002; Li et al., 2003; Robinson en Kolb, 2004) of seksuele ervaring (Meisel en Mullins, 2006; Pitchers et al., 2010), en wordt verondersteld dat het geneesmiddel-geïnduceerde locomotorische en beloningsensibilisatie veroorzaakt (Pierce en Kalivas, 1997; Vanderschuren en Kalivas, 2000; Li et al., 2004). De basolaterale amygdala is van cruciaal belang voor het geheugen van geconditioneerde stimuli die samenhangen met medicijnstimuli (Grace en Rosenkranz, 2002; Laviolette en Grace, 2006) en betrokken bij beloningsgevoeligheid en versterking (Everitt et al., 1999; Cardinal et al., 2002; Zie 2002). Laesies of inactivaties van de basolaterale amygdala blokkeren de acquisitie (Whitelaw et al., 1996) en expressie (Grimm en Zie, 2000) van geconditioneerde cagedoseherstel. Bovendien resulteren basolaterale amygdala-laesies in een verminderde respons op geconditioneerde stimuli in combinatie met voedsel (Everitt et al., 1989) of seksuele versterking (Everitt et al., 1989; Everitt, 1990) bij ratten. Daarom is het mogelijk dat psychostimulant- en paring-geïnduceerde veranderingen in accumbens en basolaterale amygdala resulteren in een versterkte beloningssucces van Meth.

Het is bewezen dat het regelt dat seksueel gedrag wordt bevorderd door regimes die gevoelig zijn voor het roken. Sensibiliserende voorbehandelingen van d-amfetamine (10 dagelijkse injecties van 1.5 mg / kg) bevorderen seksueel gedrag (Fiorino en Phillips, 1999a,b) en het gedrag van seksuele prikkels (Nocjar en Panksepp, 2002). Studies met vrouwelijke ratten voorbehandeld met Meth (drie dagelijkse injecties van 5 mg / kg) resulteerden in toegenomen receptief gedrag (Holder et al., 2010). In tegenstelling hiermee liet de huidige studie geen effecten van een sensibiliserend regiment van Meth-behandeling op seksueel gedrag zien. Mogelijke verklaringen voor dit verschil zijn de lagere medicatiedosering die in de huidige studie wordt gebruikt, verschillende beoordelingen van seksuele motivatie en sekseverschillen (Becker en Hu, 2008).

Studies naar knaagdiermodellen van meth-verslaving hebben zich onlangs toegespitst op paradigma's van drugsverslaving om meth-geïnduceerde gedragsstoornissen te onderzoeken (Belcher et al., 2008; Izquierdo et al., 2010; O'Dell et al., 2011), neuroplastische veranderingen (Brennan et al., 2010) en neurotoxiciteit (Moszczynska et al., 1998; Kuczenski et al., 2007; Graham et al., 2008). Het hoofddoel van deze onderzoeken was het bereiken van plasmageneesmiddelen in de rat in de buurt van die in menselijke meth-verslaafden. In tegenstelling hiermee toonde de huidige studie aan dat eenmaal daagse passieve toediening van een lage dosis Meth voldoende was om langdurig dwangmatig seksueel gedrag te veroorzaken. Een Meth bingeing-paradigma werd om praktische redenen niet gebruikt: hoge doses Meth verslechteren seksueel gedrag (Frohmader et al., 2010a) en menselijke gebruikers gebruiken vaak seksuele prestatieverbeterende geneesmiddelen om hun seksuele functie te behouden (Semple et al., 2009). De focus van de huidige sets van studies was om seksuele beloning en dwangmatige paring bij dieren te onderzoeken met ongeschonden paargedrag. De resultaten tonen aan dat dwangmatig seksueel gedrag en veranderde drugs- en seksuele beloningen kunnen worden veroorzaakt door een zeer lage blootstelling aan geneesmiddelen eenmaal samen met seksuele ervaring en zijn niet afhankelijk van het induceren van eetbuien van Meth in de hersenen.

Samen vormen de huidige reeks onderzoeken een belangrijke stap naar een beter begrip van de effecten van Meth op compulsief seksueel gedrag en associaties tussen drugs en seksuele beloning. Bovendien lopen deze gegevens parallel met die gerapporteerd in menselijke verslaafden; zo kan het mannelijke rattenmodel verder worden gebruikt om moleculaire en structurele mechanismen van meth-effecten op seksueel gedrag te onderzoeken en mogelijk bij te dragen aan toekomstige therapieën voor drugsverslaving.

voetnoten

    • Ontvangen Augustus 4, 2011.
    • Revisie ontvangen September 8, 2011.
    • Aanvaard September 23, 2011.
  • Dit werk werd ondersteund door de Canadian Institutes of Health Research Grant RN 014705 aan LMC

  • De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

  • Correspondentie moet worden gericht aan Lique M. Coolen, University of Michigan, Afdeling Moleculaire en Integratieve Fysiologie, Medische Wetenschappen II, Kamer 7732B, 1137 E. Catherine Street, Ann Arbor, MI 48109-5663. [e-mail beveiligd]
Vorige     

Referenties