Nat Neurosci. 2011 januari; 14 (1): 22-24.
Gepubliceerd online 2010 december 5. doi: 10.1038 / nn.2703
Abstract
Het dorsale striatum speelt een belangrijke rol bij de ontwikkeling van drugsverslaving; echter, een precies begrip van de rollen van striatopallidal (indirect) en striatonigraal (direct) pad neuronen bij het reguleren van gedrag blijft ongrijpbaar.
Met behulp van een nieuwe benadering die berust op de virale gemedieerde expressie van een gemanipuleerde GPCR (hM4D), hebben we aangetoond dat activering van hM4D-receptoren met clozapine-N-oxide (CNO) heeft de prikkelbaarheid van het striatale neuron krachtig verminderd. Wanneer hM4D-receptoren werden selectief tot expressie gebracht in ofwel directe of indirecte pathway-neuronen bij ratten, CNO veranderde de acute locomotorische responsen op amfetamine niet maar veranderde gedragsplasticiteit geassocieerd met herhaalde medicamenteuze behandeling. In het bijzonder, tijdelijk verstoren van striatoplastische neuronale activiteit vergemakkelijkte gedragssensibilisatie, terwijl afnemende excitabiliteit van striatonigrale neuronen de persistentie ervan verminderde. Deze bevindingen suggereren dat acute geneesmiddeleffecten kunnen worden geparseerd uit de gedragsaanpassingen die gepaard gaan met herhaalde blootstelling aan geneesmiddelen en benadrukken het nut van deze aanpak voor het deconstrueren van neuronale pathwaybijdragen aan gedragingen zoals sensitisatie.
Ondanks de overweldigende negatieve gevolgen van drugsverslaving, blijft het gebruik en misbruik van psychostimulant gangbaar. De progressie van initiële blootstelling aan geneesmiddelen tot regelmatig gebruik en uiteindelijk tot compulsief, gewoontegedrag en het verlies van remmende controle omvat een reeks moleculaire aanpassingen in afzonderlijke neurocircuits.1,2,3. Het striatum is geïdentificeerd als een belangrijke plaats voor veel van de gedrags- en neurobiologische aanpassingen waarvan gedacht wordt dat ze de kernprocessen vormen die verslaving mediëren1,2,3. De meerderheid van de neuronen in het striatum (~ 95%) zijn GABAergic medium spiny projection neurons (MSN's) tze verschillen in hun neuropeptide-expressie en vormen twee belangrijke efferente paden4.
- Striatopallidal MSN's bevatten enkephalin (ENK) en vormen de indirecte route
- overwegende dat striatonigrale MSN's dynorfine (DYN) en stof P bevatten en de directe route vormen.
Veel conceptuele modellen veronderstellen dat deze populaties van MSN's zowel mechanistisch als functioneel tegengesteld zijn aan elkaar5,6. Er is echter weinig empirisch bewijs om hun differentiële rol in de controle van gedrag te ondersteunen, omdat deze celpopulaties fysiek vermengd en morfologisch niet van elkaar te onderscheiden zijn, waardoor selectieve manipulatie technisch ongrijpbaar is.
Om de rol van deze striatale celpopulaties in de ontwikkeling van gedragingen die optreden na herhaalde blootstelling aan drugs van misbruik te onderzoeken, hebben we twee nieuwe strategieën gecombineerd: virale vectoren die ofwel de ENK- of DYN-genpromoters gebruiken om transgenexpressie te richten op striatopallidal of striatonigral neuronen respectievelijk een gemanipuleerde GPCR (Gio-gekoppelde menselijke muscarinische M4 DREADD; Designer Receptor exclusief geactiveerd door een designer-medicijn; hM4D)7 die wordt geactiveerd door een anderszins farmacologisch inert ligand, clozapine-Noxide8,9 (CNO; Fig. 1a, h). Na expressie in gekweekte neuronen stimuleert toediening van CNO Giogekoppelde hM4D-receptoren activeren aldus naar binnen gerichte rectificerende kalium 3 (Kir3) kanalen, resulterend in membraanhyperpolarisatie en voorbijgaande neuronale silencing9.
Om de specificiteit van de celfenotypes van de virale vectoren te testen, gebruikten we tweekoppige immunofluorescentiemicroscopie na dorsale striatum-infusie van virussen (Aanvullende afbeelding 1) die hag met hemagglutinine-tag tot expressie brengen4D-receptoren onder controle van de ENK-promotor (pENK-hM4D) of de DYN-promotor (pDYN-hM4D). We vonden dat pENK-hM4D expressie was voornamelijk in ENK-bevattende MSN's (90% van de hemagglutininecellen waren ENK +, 85 uit 94; 6% van hemagglutininecellen was stof P +, 4 uit 70-cellen; Fig. 1b) overwegende dat pDYN-hM4D expressie was voornamelijk in substantie P-bevattende MSN's (95% van hemagglutininecellen waren stof P +, 109 uit 115-cellen; 5% van hemagglutininecellen waren ENK +, 5 uit 97-cellen; Fig. 1i). Vergelijkbare resultaten werden verkregen na infusie van promoter-specifieke virussen die groen fluorescerend eiwit tot expressie brengen (pENK-GFP en pDYN-GFP; SupplementaryFigs. 2a en 3a).
Aangezien striatopallidal MSN's voornamelijk naar de globus pallidus external (GPe) projecteren en striatonigrale MSN's primair naar de substantia nigra pars reticulata (SNpr) projecteren, hebben we injecties van de retrograde tracer Fluor-Gold in deze hersengebieden gebruikt, gevolgd door fluorescente immunohistochemie met twee labels. om te bevestigen dat de pENK en pDYN virussen leverden pathway-specifieke infectie op. We hebben vastgesteld dat pENK-GFP cellen mede gelokaliseerd met striatale fluor-goud-expressie na infusies in de GPe maar niet de SNpr (Aanvullende afbeelding 2b) overwegende dat pDYN-GFP cellen mede gelokaliseerd met striatale Fluoro-Gold-expressie na infusies in de SNpr maar niet de GPe (Aanvullende afbeelding 3b). Expressie van de virale vectoren veranderde het aantal ENK + of substance P + neuronen in het gebied van virale infectie niet, wat suggereert dat het gebruik van deze promoters voor virale gemedieerde genoverdracht niet interfereerde met endogene neuropeptideniveaus. Al deze resultaten tonen aan dat de pENK en pDYN virale vectoren brengen genen tot expressie in hun op geschikte wijze gescheiden stromingen van striatale cellen.
Hoewel hM4Van op D-receptor gebaseerde technieken is aangetoond dat ze de activiteit van andere neuronale typen moduleren9, hun vermogen om striatale neuronen te beïnvloeden is niet onderzocht. Daarom hebben we striatale medium stekelige neuronen met hM geïnfecteerd4D-receptoren onder controle van een herpes-simplexvirus (HSV) -promotor, bereide coronale plakjes dorsaal striatum twee dagen later en onderzocht hoe hM4D-expressie medium stekelige striatale neuronen reageren op CNO. We hebben waargenomen dat lokale toepassing van CNO (10 μM) een hyperpolarisatie van de membraanpotentiaal induceerde (~ 7 mV, de basismembraanpotentiaal werd aangepast tot -80 mV; Fig. 1c) en verminderde de ingangsweerstand van de neuronen na CNO-toepassing (Fig. 1d, e), wat suggereert dat kaliumgeleiding (dwz Kir3-gemedieerde stroom) wordt geactiveerd door CNO in hM4D receptor tot expressie brengende neuronen. Bovendien verminderde perfusie van CNO het aantal opgewekte actiepotentialen in hM aanzienlijk4D-expresserende neuronen, maar niet in controlecellen, waardoor de functionele output van de viraal geïnfecteerde neuronen effectief wordt geremd. Expressie van hM4D-receptoren alleen veranderden de ingangsresistentie niet (P = 0.84) of actiepotentiaal (P = 0.64). (Fig. 1f, g). Samengenomen suggereren deze gegevens dat, vergelijkbaar met hippocampale neuronen9, de hM4D / CNO-gebaseerde methode kan de prikkelbaarheid van rattenstriatale neuronen effectief verminderen.
Als aanvullend proof-of-concept hebben we getest of hM4D-receptoren zouden de neurotransmissie blokkeren in een goed gevestigd circuit waar neurale activiteit voorspelbaar wordt opgewekt door gedragsrelevante stimuli. Dienovereenkomstig infecteren we ventrale tegmentale gebied (VTA) neuronen met hM4D-receptoren onder controle van een HSV-promotor, die sterk tot expressie komt in dopamine-neuronen10en gebruikte fast-scan cyclische voltammetrie om veranderingen in dopamine-afgifte in de nucleus accumbens te meten na onverwachte aflevering van een voedselbeloning11. Toediening van CNO significant verzwakte door voedselpellet opgewekte dopamine-afgifte in de nucleus accumbens in vergelijking met vehiculum (Aanvullende afbeelding 4). Ten slotte hebben we getest of de activiteit van specifieke neuronale celtypen in het striatum afneemt in vivo zou het vermogen van amfetamine om Fos-expressie te stimuleren kunnen veranderen. Psychostimulantia, zoals amfetamine, zijn krachtige activatoren van c-fos in het striatum12 en zal c- verhogenfos in zowel striatonigrale als striatopallidal neuronen onder onze experimentele omstandigheden13. Naast het gebruik als een marker van neuronale activiteit, is psychostimulant inductie van c-fos wordt verondersteld een belangrijke rol te spelen bij de initiatie en het onderhoud van de neurale aanpassingen die gepaard gaan met psychomotorische sensitisatie1,14. We vonden dat CNO-gemedieerde activering van pENK-hM4D receptoren verminderden het totale aantal door amfetamine geïnduceerde c-Fos-cellen in het striatum significant (Fig. 1k en Aanvullende afbeelding 5a). Deze verlaging trad op in beide hemagglutinine-positieve neuronen (dwz die die hM tot expressie brengen4D-receptoren) en hemagglutinine-negatieve neuronen (dat wil zeggen, die welke geen HM tot expressie brengen)4D-receptoren; Fig. 1l), wat duidt op een neuraal overspraakeffect tussen hM4D-expresserende neuronen en niet-geïnfecteerde neuronen. Significante afnames in het totale aantal door amfetamine opgewekte c-Fos-cellen en in het aantal hemagglutinine-positieve c-Fos-cellen werden ook gezien wanneer hM4D-receptoren werden geactiveerd in direct pathway neuronen (Fig. 1n, o en Aanvullende afbeelding 5b). Belangrijk is dat deze effecten niet eenvoudig worden veroorzaakt door virale expressie van een nieuwe receptor, omdat expressie van ofwel pENK-hM4D of pDYN-hM4D receptoren in afwezigheid van CNO-behandeling hadden geen effect op het aantal door amfetamine opgewekte Fos-cellen (Aanvullende Fig. 6 en 7). Aldus demonstreren deze bevindingen dat de CNO-gemedieerde activering van hM4D-receptoren kunnen ook leiden tot afname van neuronale activiteit door het verminderen van de afgifte van neurotransmitters en het verzwakken van intracellulaire signalering.
Herhaalde blootstelling aan verslavende middelen kan leiden tot een progressieve en aanhoudende toename van gedragsreactiviteit, vaak aangeduid als gedragssensibilisatie. Belangrijk is dat sensitisatie gepaard gaat met enkele van dezelfde neurale circuits die betrokken zijn bij de ontwikkeling van verslaving aan menselijke drugs3. Hier gebruiken we onze nieuwe tools om het effect van circuitspecifieke demping van striatale neuronactiviteit op de ontwikkeling van amfetamine-sensibilisatie te onderzoeken. We veronderstelden dat directe en indirecte pathway-neuronen tegengestelde rollen hebben waar striatonigrale neuronen sensitisatie bevorderen en striatopallidal neuronen sensibilisatie onderdrukken, consistent met hun conceptueel voorgestelde rollen in respectievelijk gedragsactivering en inhibitie5,6. Dienovereenkomstig testten we of biochemisch afnemende neuronale exciteerbaarheid van striatopallidal neuronen sensibilisatie zou induceren tot een amfetamine-doseringsregime dat een drempelwaarde van sensitisatie opwekt en of een afnemende neuronale exciteerbaarheid van striatonigrale neuronen sensitisatie zou voorkomen in een protocol dat normaal robuuste sensitisatie produceert.
Voor de eerste studie gebruikten we een behandelingsregime dat een drempelniveau van voortbewegingsgevoeligheid induceert in GFP-controles (vier blootstelling aan geneesmiddelen). Na een wachttijd werd een matige dosis amfetamine (2 mg / kg) toegediend in afwezigheid van CNO-geïnduceerde verzwakking van de neuronale activiteit om te bepalen of de sensitisatie persistent was. CNO-gemedieerde activering van pENK-hM4D receptoren tijdens de amfetaminebehandeling veranderden de reactie van het acute locomotief op amfetamine niet (Fig. 2a). Door CNO gemedieerde verstoring van neuronale activiteit in neuronen met indirecte routes vergemakkelijkte echter de ontwikkeling van een aanzienlijk meer robuuste sensibilisatie vergeleken met GFP-controles (Fig. 2b). Deze verhoging van de sensitisatie werd gehandhaafd op de uitdaging met amfetamine, die een week later werd uitgevoerd in afwezigheid van een CNO-behandeling (Fig. 2c, d). Deze effecten kunnen worden toegeschreven aan een CNO-afhankelijke vermindering van de activiteit van striatopallidal neuronen door hM4D-receptoren omdat hM4D-receptorexpressie zonder CNO-behandeling produceert geen locomotorische sensitisatie voor dit milde doseringsregime van amfetamine (Aanvullende afbeelding 6).
Om te bepalen of striatonigrale neuronen de responsiviteit van geneesmiddelen op een tegengestelde manier kunnen reguleren, hebben we vervolgens het effect getest van biochemisch verminderde excitabiliteit van striatonigrale neuronen in het dorsomediale striatum tijdens een behandelingsregime voor amfetamine dat robuuste sensitisatie produceert in GFP-controles (zes blootstelling aan geneesmiddelen ) evenals tijdens een lage dosis van de uitdaging van amfetamine (0.5 mg / kg) in de afwezigheid van receptor-gemedieerde verstoring van neuronale activiteit. Net als bij indirecte pathway-demping, veranderde CNO-gemedieerde afname van de prikkelbaarheid van direct pathway-neuronen tijdens de amfetaminebehandeling de acute reactie van het locomotoriek op amfetamine niet (Fig. 2e). Hoewel de ontwikkeling van sensitisatie leek op de GFP-controles na CNO-geïnduceerde activering van pDYN-hM4D receptoren tijdens de behandelingsfase (Fig. 2f), overgevoeligheid bleef niet bestaan in de pDYN-hM4D groep maar werd nog steeds robuust onderhouden in de GFP-besturingselementen (Fig. 2g, h). Deze effecten kunnen ook worden toegeschreven aan een CNO-afhankelijke afname van de activiteit van striatonigrale neuronen door hM4D-receptoren omdat hM4D-receptorexpressie in afwezigheid van CNO-behandeling blokkeerde de ontwikkeling van locomotorisibilisatie niet, aangezien sensibilisatie werd waargenomen tijdens de behandelingsfase en de drugsproblemen (Aanvullende afbeelding 7). Deze gegevens suggereren dat striatonigrale neuronen met name belangrijk kunnen zijn voor het reguleren van gedragsaanpassingen op de lange termijn die een gevolg zijn van herhaald drugsgebruik.
Samenvattend, deze gegevens leveren het eerste bewijs voor de kritische en tegengestelde rollen van striatopallidal en striatonigral neuronen in de regulatie van drugservaring-afhankelijke gedragsplasticiteit. Bovendien levert het gebrek aan effect van neuronale remming op de acute locomotorische respons op amfetamine verder bewijs dat de mechanismen die acute reacties op geneesmiddelen reguleren, verschillen van die mechanismen die de blijvende aanpassingen modelleren die optreden bij herhaalde blootstelling aan geneesmiddelen. Tenslotte biedt het koppelen van fenotypisch specifieke virale vectoren met ontwerperreceptoren die in staat zijn tot het veranderen van neuronale activiteit zonder de celfunctie permanent te verstoren, een nieuwe en krachtige benadering voor het deconstrueren van de moleculaire basis van verslaving.
Dankwoord
Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies K99 DA024762 (SMF), T32 GM07266 en T32 GM07108 (DE), T32 AA009455 en F32 DA026273 (MJW), R21 DA021793 (PEMP), R01 DA023206 (YD), U19MH82441 en NIMH-PDSP (BLR ), en R21 DA021273 (JFN), een Achievement Rewards voor College Scientists (DE) en een NARSAD Distinguished Investigator Award (BLR)
voetnoten
Concurrerende belangenverklaring
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Referenties
;