Abstrakt
Psykostimulerende-indusert endring av dendritiske spines på dopaminceptive nevroner i nukleobatterier (NAcc) har blitt hypotetisert som en adaptiv nevronrespons som er knyttet til langvarig vanedannende oppførsel. NAcc består i stor grad av to distinkte subpopulasjoner av mellomstore, spiny nevroner som uttrykker høye nivåer av enten dopamin D1 eller D2 reseptorer. I den foreliggende studien analyserte vi dendritisk ryggradens tetthet etter kronisk kokainbehandling i forskjellige D1- eller D2-reseptorholdige mellomstore, spiny nevroner i NAcc. Disse studiene benyttet seg av transgene mus som uttrykte EGFP under kontroll av enten D1- eller D2-reseptorpromotoren (Drd1-EGFP eller Drd2-EGFP). Etter 28-dager med kokainbehandling og 2-dager med tilbaketrekking, økte ryggradens tetthet i både Drd1-EGFP- og Drd2-EGFP-positive nevroner. Økningen i ryggradens tetthet ble imidlertid opprettholdt bare i Drd1-EGFP-positive nevroner 30 dager etter uttak av legemiddel. Spesielt økte ΔFosB-ekspresjonen også i Drd1-EGFP- og Drd2-EGFP-positive nevroner etter 2-dager med tilbaketrekning av medikament, men bare i Drd1-EGFP-positive nevroner etter 30-dager med tilbaketrekning av medikament. Disse resultatene antyder at den økte ryggradensiteten observert etter kronisk kokainbehandling er stabil bare i D1-reseptorholdige neuroner, og at ΔFosB-ekspresjon er assosiert med dannelsen og / eller vedlikehold av dendritiske spines i D1 samt D2-reseptorholdige neuroner i NAcc.
Den mesolimbiske dopaminergiske banen er sammensatt av nevroner i det ventrale tegmentale området som innerverer nucleus accumbens (NAcc), olfaktorert tuberkel, prefrontal cortex og amygdala (1), mens nigrostriatal dopaminerge neuroner i substantia nigra (pars compacta) gir en stigende projeksjon til dorsalstriatum (2). Psykostimulanter forhøyer synaptiske konsentrasjoner av dopamin i NAcc: kokain, ved å blokkere dopaminopptaket fra det synaptiske spaltet og amfetamin, ved å fremme dopaminfrigivelse fra nerveterminaler (3-5). Gjentatt, intermitterende administrasjon av psykostimulanter resulterer i forsterkede atferdsresponser (sensibilisering) til de akutte stimulerende virkningene av disse legemidlene (6-8). De fleste bevislinjer tyder på at adaptive forandringer i det ventrale tegmentale området-NAcc dopaminerge systemet er sentrale for endringer i den erfaring-avhengige plastisiteten som ligger til grunn for medisin-indusert oppførsel.
I tillegg til dopamin er glutamat kreves for utvikling av atferdsfølsomhet som respons på psykostimulerende midler (9, 10). Mellomstore spiny nevroner (MSNs) i ventral striatum mottar eksitatoriske glutamatergiske fremspring fra prefrontal cortex som synker på hodene til dendritiske spines. MSN er også det viktigste målet for dopaminerge axoner som synaps på rygghalshalsene (1, 11, 12). Derfor representerer dendritiske spines i MSNs det cellulære rom hvor dopaminerg og glutamatergisk overføring først er integrert.
Dopamin virker på to hovedreceptor subfamilier, D1 subfamilien (D1 og D5 subtyper) og D2 subfamilien (D2, D3 og D4 subtyper) (13). I dorsalstriatum har anatomiske studier vist at striatonigral MSN inneholder høye D1-reseptorer (sammen med substans P og dynorfin), mens striatopallidale MSNs overveiende uttrykker D2-reseptorer (sammen med enkefalin) (14-17). Fremskrivningene fra NAcc er mer komplekse enn i dorsal striatum, med skallet og kjernedelen av NAcc som projiserer til forskjellige delregioner av ventral pallidum og til ventral tegmentalområdet og substantia nigra (18). Mens D2-reseptorer og enkefalin er høyt uttrykt i fremskrivninger til ventralpallidum, er D1-reseptorer og substans P funnet like fordelt i fremspring til ventral pallidum og ventral tegmentalområde (19). Studier av agonister og antagonister selektive for D1- eller D2-reseptorer viste at både D1- og D2-reseptorer er nødvendige for psykostimulerende avhengige atferdsendringer (20-25). Men rollene til disse reseptorene synes å være forskjellige. For eksempel demper stimulering av D1-reseptorer kokainsøkende indusert av kokain-priminginjeksjoner og kokainrelaterte miljøveiledninger, mens stimulering av D2-reseptorer letter kokain-indusert gjeninnføring (26-28).
Adferdsavvikene knyttet til psykostimulerende avhengighet er ekstremt langlivede. Derfor har det vært betydelig interesse for å identifisere langvarige stoffinduserte forandringer på molekylært og strukturelt nivå i nevrale kretser regulert av dopamin og glutamat (29-32). Langsiktig eksponering for kokain eller amfetamin har blitt funnet å øke antall dendritiske grenpunkter og spines av MSN i NAcc (33-35). Disse strukturelle endringene har vist seg å vedvare i opptil ≈1-3.5 måneder etter siste legemiddeleksponering (30, 35) og har blitt foreslått å underbygge langvarige endringer i synaptisk plastisitet forbundet med psykostimulant eksponering.
Målet med den foreliggende studien var å undersøke kokaininducerte strukturelle endringer av dendritiske spines i subpopulasjoner av accumbal MSN som uttrykker enten D1 eller D2 reseptorer. I disse studiene har vi brukt bakterielle kunstige kromosom (BAC) transgene mus som uttrykker EGFP under kontroll av enten D1 (Drd1-EGFP) eller D2 (Drd2-EGFP) dopaminreceptorpromotoren (36). Resultatene indikerer at selv om økt ryggradensitet først oppstår i D1-reseptor-inneholdende MSN og D2-reseptorholdige MSN, er den endrede ryggradens tetthet stabil bare i D1-reseptorholdige neuroner. Videre finner vi liknende endringer i uttrykket for transkripsjonsfaktoren ΔFosB, noe som tyder på at ΔFosB kan være involvert i dannelsen og / eller vedlikehold av dendritiske spines i D1 samt D2-reseptorholdige nevroner i NAcc.
Resultater
Analyse av MSN i Drd1-EGFP og Drd2-EGFP BAC Transgenic Mus.
Projeksjonsmønsteret av MSN fra dorsal og ventral striatum i Drd1-EGFP eller Drd2-EGFP BAC transgene mus er karakterisert ved analyse av GFP-ekspresjon (36). Differensialuttrykket av GFP i MSNs av dorsalstriatum tilsvarer generelt den for henholdsvis endogene D1- eller D2-reseptorer (36). Vi analyserte videre differensial ekspresjon av GFP i NAcc i Drd1-EGFP eller Drd2-EGFP-mus (Fig. 1a og b). Selv om ≈58% av nevroner i NAcc uttrykte GFP i Drd1-EGFP-mus (Fig. 1a), ≈48% av nevroner i NAcc uttrykt GFP i Drd-2-EGFP-mus (Fig. 1b). MSN representerer 90-95% av alle nevroner i NAcc (12, 37). D1-reseptorer uttrykkes kun i MSN, og D2-reseptorer uttrykkes i MSN og i kolinergiske interneuroner, som representerer 1-3% av striatalneuroner (37). Ved å ta hensyn til disse faktorene, antyder resultatene at minimalt ≈10-15% av MSNs i NAcc sannsynligvis vil uttrykke både D1- og D2-reseptorer.
Analyse av dendritiske spines i Drd1-EGFP og Drd2-EGFP-mus.
GFP-ekspresjon i Drd1-EGFP- og Drd2-EGFP-musene var nyttig for å plette neuronale cellekroppar. GFP-signalet i dendritter og dendritiske spines var imidlertid for svakt for å tillate deres analyse etter immunfarging med anti-GFP-antistoffer. Partikkel-mediert ballistisk tilførsel av fluorescerende fargestoffer har nylig vært brukt til å merke nervepopulationer på en rask og effektiv måte (38). Hele nevroner kan merkes med denne teknikken, og metoden ser ut til å være sammenlignbar med Golgi-Cox-farging. For å analysere den dendritiske morfologien til nevroner i NAcc, ble faste akkumulale skiver merket med den lipofile fluorescensfargen 1,1'-diotadecyl-3,3,3 ', 3'-tetrametylindokarbocyaninperklorat (DiI) ved bruk av en genpistol. Et eksempel på et DiI-farget MSN er vist i Fig. 1c. Under de anvendte forholdene observert vi generelt merkede nevroner uten overlappende dendritter fra andre merkede nevroner. Ved høyere forstørrelse kunne detaljert dendritisk morfologi, inkludert dendritiske spines, observeres (Fig. 1d).
Vi brukte da en kombinasjon av DiI-merking og immunhistokjemi for GFP i enten Drd1-EGFP eller Drd2-EGFP transgene mus, som ble gjort mulig ved bruk av en lav konsentrasjon av vaskemiddel for vevspermeabilisering (se Metoder). Gjennom forsiktig sammenligning av DiI-flekken og GFP-ekspresjonen i cellene av MSN, kunne vi identifisere DiI- og GFP-positive eller DiI-positive og GFP-negative neuroner i Drd1-EGFP (Fig. 2a) eller Drd2-EGFP (Fig. 2b) mus. For følgende studier analyserte vi dendritisk morfologi i bare DiI- og GFP-positive nevroner fra Drd1-EGFP eller Drd2-EGFP-mus.
Kronisk kokainbehandling resulterer i økt ryggradens tetthet i akkumulerte MSN-er som uttrykker enten Drd1-EGFP eller Drd2-EGFP.
Drd1-EGFP eller Drd2-EGFP-mus ble injisert gjentatte ganger med kokain (30 mg / kg) eller saltløsning i fire påfølgende uker (se Metoder). To dager (2WD) eller 30 dager (30WD) etter den siste behandlingen ble hjerner behandlet for DiI-merking og immunhistokjemi som beskrevet ovenfor. En tidligere studie rapporterte at kronisk behandling med amfetamin økte ryggradens tetthet på distale, men ikke proksimale dendritter av MSN i NAcc (35). Vi begrenset derfor vår analyse til distale dendriter (dvs. de med andre- eller tredje-ordinære grener), inkludert terminalregioner. Når det ble analysert ved 2WD, ble ryggradens tetthet funnet å øke i Drd1-EGFP-positive MSNs (128% saltvannsgruppe) (Fig. 3a og c) og i mindre grad i Drd2-EGFP-positive nevroner (115% saltvannsgruppe) (Fig. 3 b og d). Etter 30WD ble økt ryggradens tetthet opprettholdt i Drd1-EGFP-positive nevroner (118% av saltoppløsning) (Fig. 3 a og c), men ikke i Drd2-EGFP-positive nevroner (Fig. 3 b og d).
Dendritiske spines morfologi er variabel i forhold til lengden og bredden av rygghodet. Vi klassifiserte derfor dendritiske fremspring i fire ryggradsklasser (stubby, sopp, tynn og filopodi) ved 2WD fra kokain (data ikke vist). Tettheten av sopp-type (119.7 ± 4.0%, P <0.01) og tynne spines (120.0 ± 3.4%, P <0.01) ble økt med kokainbehandling i Drd1-EGFP-positive MSN, mens tettheten av stubbete (182.4 ± 21.6%, P <0.05) og soppdyr (122.5 ± 5.0%, P <0.01) ble økt i Drd2-EGFP-positive MSN. Det var ingen signifikant økning i stubbe pigger i Drd1-EGFP-positive nevroner eller av tynne pigger i Drd2-EGFP-positive nevroner.
Kronisk kokain inducerer ΔFosB-ekspresjon i Drd1-EGFP- eller Drd2-EGFP-positiv MSN i NAcc.
ΔFosB er medlem av Fos-familien av transkripsjonsfaktorer. Mens akutt administrasjon av kokain induserer en rask og forbigående induksjon av flere Fos-isoformer i NAcc, øker gjentatt eksponering for kokain nivået av ΔFosB. Videre fortsetter økningen i ΔFosB-ekspresjon i NAcc i uker til måneder etter seponering av legemiddeleksponering og har blitt antydet å være involvert i langvarig regulering av genuttrykk, selv etter at stoffet opphører (29, 39, 40).
For å undersøke induksjonen av ΔFosB i NAcc fra Drd1-EGFP eller Drd2-EGFP-mus etter kokainbehandling, analyserte vi FosB og GFP-uttrykk ved dobbel merking (Fig. 4 og Tabell 1) Anti-FosB-antistoffet gjenkjenner alle former for FosB, men vi antar at det økte immunostainet representerer ΔFosB (se Metoder for videre diskusjon). I saltvannbehandlede mus uttrykte 16% av Drd1-EGFP-positive nevroner og 15% av Drd2-EGFP-positive nevroner FosB-immunoreaktivitet med relativt svak intensitet (Fig. 4 a og b og Tabell 1). Gjentatt kokainbehandling fulgt av 2WD resulterte i en signifikant økning i antall Drd1-EGFP-positive nevroner som coexpressed ΔFosB (55% av GFP-positive nevroner) (Fig. 4c og Tabell 1). En mindre, men fortsatt signifikant økning i ΔFosB-ekspresjon ble funnet i Drd2-EGFP-positive nevroner (25% av GFP-positive nevroner) (Fig. 4d og Tabell 1). Som med endringene i ryggradens tetthet ble det økte uttrykket av ΔFosB opprettholdt i Drd1-EGFP-positive nevroner (46% av GFP-positive nevroner), men ikke i Drd2-EGFP-positive nevroner (15% av GFP-positive neuroner) etter 30WD (Fig. 4 e og f og Tabell 1). Legg merke til at det økte ΔFosB-uttrykket observert i Fig. 4f er tilstede i Drd2-EGFP-negative neuroner.
Diskusjon
Langvarige tilpasninger i dopaminerge nevrotransmisjoner antas å ligge til grunn for vanedannende atferd assosiert med psykostimulerende legemidler. Spesielt har psykostimulerende induserte økninger i dendritisk ryggradens tetthet av MSN i NAcc blitt hypotetisert for å være knyttet til omorganisering av synaptisk tilkobling (30). NAcc består i stor grad av to distinkte subpopulasjoner av MSN som uttrykker høye nivåer av enten D1 eller D2 dopaminreseptorer. I den foreliggende studien har vi analysert ryggradens tetthet i forskjellige D1- eller D2-reseptorholdige MSN i NAcc etter kronisk kokainbehandling. Resultatene som er oppnådd viser at selv om økt ryggradensitet først opptrer i D1-reseptor-inneholdende MSN og D2-reseptor-inneholdende MSN, er endret ryggradensitet bare stabil i D1-reseptorholdige neuroner. Videre finner vi et lignende mønster av endringer i uttrykket av transkripsjonsfaktoren ΔFosB i D1 og D2 reseptor-inneholdende MSN.
Disse studiene benyttet BAC-transgene mus som uttrykker GFP i spesifikke subpopulasjoner av MSN under kontroll av enten D1 eller D2 reseptorpromotoren. Videre utviklet vi en dobbelt merking metode som kombinerte immunhistokjemi for GFP med ballistisk merking av nevroner ved hjelp av DiI. Tidligere studier har brukt Golgi-Cox-metoden for å analysere effekten av psykostimulerende midler på ryggradens tetthet (34), og DiI-metoden som brukes her ga resultater som var kvantitativt sammenlignbare. Vi utviklet dobbeltmerkingsmetoden fordi Golgi-farging ikke er kompatibel med immunhistokjemi. Immunostaining krever vanligvis vevspermeabilisering med vaskemidler, en prosess som vanligvis fører til oppløsning av lipofile farger fra membranen (38). Imidlertid i våre nåværende studier, krever ikke GFP immunostaining en høy konsentrasjon av vaskemiddel for vevspermeabilisering og kan således brukes i forbindelse med lipofil fargemerking. Vår dobbelt merking metode bør være generelt nyttig for studier av strukturelle endringer i dendritiske spines, for eksempel når det brukes til analyse av BAC transgene mus linjer hvor GFP uttrykkes i bestemte populasjoner av neuroner i cortex (36).
Selv om det fortsatt er noe kontroversielt, antas det at D1- og D2-reseptorer i stor grad er anatomisk segregerte til henholdsvis direkte (striatonigral) og indirekte (striatopallidale) striatalprojeksjonsneuroner (17, 41). Første karakterisering av lokaliseringen av GFP i Drd1-EGFP og Drd2-EGFP-musene var i samsvar med denne konklusjonen (36). Videre er vår analyse av antall GFP-positive nevroner i NAcc fra Drd1-EGFP og Drd2-EGFP-mus konsistent med konklusjonen at ≈50% av MSN uttrykker bare D1-reseptorer, at ≈35-40% uttrykker kun D2-reseptorer, og at ≈10-15% coexpresser både D1 og D2 reseptorer. Denne verdien av koexpresjon ligner den som ble underforstått av studier av dorsalstriatum som kombinerte patch-clamp analyse av enkeltstriatale neuroner med RT-PCR teknikker for å isolere og amplifisere mRNAer (≈17% coexpresjon av enkefalin og substans P) (42). Det skal bemerkes at våre nåværende studier ikke omhandler spørsmålet om uttrykk for D3-, D4- og D5-reseptorer, og de tar heller ikke opp spørsmålet om lave nivåer av ekspresjon av D1-reseptorer i MSN som uttrykker høye nivåer av D2-reseptorer eller vice versa.
Flere tidligere studier har undersøkt neuronal lokalisering av psykostimulerende-indusert Fos-ekspresjon og rollen til D1 og D2-reseptorer (43-45). Disse studiene støttet konklusjonen om at Fos og ΔFosB induksjon medieres ved aktivering av D1 reseptorer. Imidlertid påvirkes den cellulære lokaliseringen av Fos-uttrykk av miljøkonsekvensen der psykostimulerende legemidler administreres (46, 47). For eksempel induserer amfetamin eller kokain gitt i hjemmekaret umiddelbare tidlige gener (inkludert Fos) fortrinnsvis i substans-P-positive celler som koexpresserer D1-reseptorer. I motsetning kan disse legemidlene indusere Fos-ekspresjon i både D1- og D2-reseptorholdige MSN når de administreres i et nytt miljø. Protokollen som brukes i våre nåværende studier, inkluderte ikke parring av legemiddelinnsprøytning med eksponering for et nytt miljø. Vi kan imidlertid ikke utelukke noen form for kontekstavhengig stress som er ansvarlig for ΔFosB-uttrykk i D2-reseptorholdige MSN.
Et bemerkelsesverdig trekk ved de nåværende resultatene var det parallelle mønsteret av økt ryggradens tetthet og ΔFosB-ekspresjon. Økt ryggradens tetthet og ΔFosB-uttrykk oppstod først i MSN som uttrykte Drd1-EGFP og Drd2-EGFP. Imidlertid var disse endringene bare stabile i D1-reseptor-inneholdende nevroner. En mulig forklaring på observasjonen om at økt ryggradens tetthet og ΔFosB-ekspresjon var forbigående funnet i D2-reseptorholdige nevroner, er at dette skjedde i den lille delen av MSN som coexpresser både D1 og D2 dopaminreceptorer. Den transiente karakteren av disse økningen kan således være forbundet med antagonistiske virkninger av D2-reseptoraktivering på D1-avhengige signalveier (48). Det er av interesse at endringene i ryggradens tetthet og ΔFosB-uttrykk var reversible, noe som kan reflektere muligheten for D2-reseptor-avhengige signalveier for å påvirke stabiliteten avFosB.
Observasjonen om at det er parallelle endringer i uttrykket av ΔFosB og ryggradens tetthet er i tråd med ideen om at ΔFosB er involvert i opprinnelig formasjon og etterfølgende vedlikehold av dendritiske spines i D1-reseptorholdige nevroner i NAcc. Ekspresjon av ΔFosB styres av D1 / DARPP-32 / PP1-avhengig signalvei i MSN (49). Flere studier har vist at ΔFosB spiller en viktig rolle i de givende og lokomotoriske aktiviserende tiltakene av psykostimulerende midler (39), sannsynligvis ved å påvirke uttrykket av flere gener som inkluderer nevrotransmitterreseptorer, signaleringsproteiner og proteiner involvert i regulering av nevronmorfologi (50). Imidlertid er de spesifikke molekylære mekanismer involvert i kronisk kokaininducert ryggradsdannelse for tiden ikke kjent. Våre tidligere studier har vist at intraaccumbal infusjon av Cdk5 inhibitor roscovitin redusert kokain-indusert økning i ryggradens tetthet (51). Videre er Cdk5 et nedstrøms målgen for ΔFosB og har blitt involvert i kompenserende adaptive endringer knyttet til kronisk kokainbehandling (52). Derfor er endring i Cdk5-avhengig fosforylering en plausibel mekanisme som ligger til grunn for kokaininducert ryggradsdannelse og / eller ryggstabilitet. PAK (53), β-catenin (54), PSD-95 (55), og spinofilin (56) er substrater for Cdk5 og er alle involvert i regulering av ryggradsmorfogenese (57-60). Ytterligere karakterisering av disse og andre Cdk5-substratene i spines vil forhåpentligvis kaste lys over mekanismene som er involvert i regulering av ryggradsdannelse av psykostimulerende midler.
Metoder
Dyr.
Mus som bærer en EGFP-transgen under kontroll av enten D1- eller D2-dopaminreceptorene ble generert av Gensat BAC-transgene prosjektet (36). De transgene musene som ble brukt i denne studien var 4-5 uker gamle og var på en Swiss-Webster-bakgrunn. Mus ble opprettholdt i en 12: 12-h lys / mørk syklus og plassert i grupper av 2-5 med mat og vann tilgjengelig ad libitum. Alle dyreprotokoller var i samsvar med National Institutes of Health Guide for pleie og bruk av laboratoriedyr og ble godkjent av Rockefeller University Institutional Animal Care and Use Committee.
Narkotikabehandling.
Kronisk kokainbehandling (30 mg / kg, daglig) ble rapportert å gi en robust økning i ryggradens tetthet av MSN i både kjerne og skall av NAcc fra rotte, men en lavere dose (15 mg / kg) økte bare ryggradens tetthet skallet (61). Vi brukte derfor den høyere dosen kokain for å indusere strukturell modifikasjon i begge deler av NAcc. Mus fikk en injeksjon (ip) på 30 mg / kg kokain-HCl (eller saltløsning) hver dag i 5 sammenhengende dager, etterfulgt av 2 injeksjonsfrie dager, og denne prosedyren ble gjentatt i 4 sammenhengende uker. Injeksjoner ble utført i hjemmeburen. 2WD eller 30WD ble musens hjerner behandlet for DiI-merking og / eller immunhistokjemi.
Ballistisk merking med Fluorescent Dye DiI.
Musene ble anestetisert med 80 mg / kg natriumpentobarbital og perfusert transcartielt med 5 ml PBS, etterfulgt av hurtig perfusjon med 40 ml 4% paraformaldehyd i PBS (20 ml / min). Hjerner ble raskt fjernet fra skallen og etterfikset i 4% paraformaldehyd for 10 min. Hjernesnitt (100 μm) ble merket ved ballistisk tilførsel av fluorescerende fargestoff DiI (Molecular Probes) som beskrevet i ref. 38. En kombinert DiI-merking-immunhistokjemi-metode ble utviklet med en lav konsentrasjon av vaskemiddel. DiI-merkede seksjoner ble permeabilisert med 0.01% Triton X-100 i PBS for 15 min og deretter inkubert i 0.01% Triton X-100 og 10% normalt geerserum i PBS for 1 h for å minimere ikke-spesifikk merking. Vevseksjoner ble deretter inkubert med 1% normalt geitserum / 0.01% Triton X-100 og anti-GFP antistoff (Abcam, Cambridge, MA) for 2 h ved romtemperatur, vasket og inkubert i en 1: 1,000 fortynning av FITC- konjugert sekundært antistoff (Molecular Probes). Seksjoner ble plassert på mikroskopdyser og dekslet med monteringsmedium. Den ballistiske merkemetoden tillot detaljert analyse av dendritisk ryggradsstruktur, og de oppnådde resultatene var kvalitativt og kvantitativt sammenlignbare med tidligere studier ved bruk av Golgi-Cox-impregneringsmetoden i rottehjerne skiver (34). I motsetning til tidligere studier observerte vi sjelden tohodede spines i DiI-fargede neuroner. Denne forskjellen kan være forårsaket av fargemetoder eller variabilitet av mus (denne studien) mot rottevev (34).
Immunhistokjemi.
Dyr ble bedøvet og perfusjonert som beskrevet ovenfor. Hjerner ble fjernet og lagret over natten i 4% paraformaldehyd ved 4 ° C. Hjerner ble overført til 30% sukrose i PBS-løsning for kryobeskyttelse. Koronale seksjoner (12 μm) ble kuttet på et frysende mikrotom (Leica) og deretter behandlet for immunhistokjemi. Hjerneseksjoner ble deretter permeabilisert i 0.3% Triton X-100 i PBS for 15 min og skylles to ganger i PBS. Seksjonene ble preinkubert i 10% normal geatserum i PBS for 1 h ved 37 ° C, eksponert for primære antistoffer (fortynnet i 1% normal geatserum i PBS) over natten ved 4 ° C og deretter skyllet i PBS og inkubert med sekundær antistoffer for 1 h ved 37 ° C. Følgende antistoffer ble brukt: kanin anti-pan-FosB (SC-48, 1: 500; Santa Cruz-bioteknologi), mus anti-NeuN (Chemicon), kanin anti-GFP, FITC-konjugert anti-kanin IgG og rhodamin- konjugert anti-mus IgG (Molecular Probes). For triple-merking (ΔFosB, NeuN og GFP) ble hjerneseksjoner først immunfargede med anti-pan FosB antistoff og anti-NeuN antistoff og deretter inkubert med sekundære antistoffer (rhodamin-konjugert anti-kanin IgG og cyan-konjugert anti-mus IgG ). Dobbeltfargede hjerneseksjoner ble videre behandlet for GFP immunostaining ved bruk av Zenon-merkingsteknologi (Zenon Alexa Fluor 488, Molecular Probes). Anti-pan-FosB-antistoffet ble økt til N-terminalen til FosB og gjenkjenner ΔFosB og full lengde FosB (62). Basert på tidligere studier som viste at ΔFosB, men ikke FosB eller andre Fos-relaterte antigener, er stabilt uttrykt etter kronisk kokainbehandling, antar vi at de langvarige økninger i immunoreaktivitet representerer stabilt uttrykk for ΔFosB. Imidlertid er identiteten til det immunoreaktive FosB-signalet observert i saltvannbehandlede mus ukjent. Statistisk analyse i Tabell 1 brukte studentens t test.
Dendritisk ryggradsanalyse.
Individuelle MSN i NAcc ble valgt for ryggradsanalyse basert på flere kriterier. (i) Det var minimal eller ingen overlapping med andre merkede celler for å sikre at prosesser fra forskjellige celler ikke ville bli forvirret. (ii) Minst tre primære dendriter måtte være synlige for at celler skal brukes til analyse. (iii) Distale dendritter (terminal dendritter eller nær terminal dendritt) ble undersøkt. Dendritter fra begge MSN i kjernen og skallet av NAcc ble analysert. Selv om vi observerte tynt spined MSN (spiny type II), analyserte vi bare tett spined MSN (spiny type I). For å beregne ryggradstetthet ble en lengde på dendritt (> 20 mikrometer lang) sporet ved hjelp av et konfokalmikroskop (Zeiss LSM 510) med en oljedyplinse (× 40). Alle bilder av dendritter ble tatt på forskjellige måter z nivåer (0.5-1 μm dybdeintervaller) for å undersøke morfologien til dendritiske spines. Alle målinger ble laget med metamorf bildeanalyseprogramvare (Universal Imaging, Downingtown, PA). Statistisk analyse brukte Kolmogorov-Smirnov-testen.
Fremspring fra dendriter ble klassifisert i fire typer basert på deres lengde som beskrevet i refs. 63 og 64. Klasse 1-fremspring, også kalt stubbe fremspring, var <0.5 mikrometer i lengde, manglet et stort rygghode og så ikke ut til å ha nakke; klasse 2, eller soppformede pigger, var mellom 0.5 og 1.25 μm lange og var preget av en kort nakke og et stort rygghode; klasse 3, eller tynne spines, varierte mellom 1.25 og 3.0 μm og hadde langstrakte ryggradshalser med små hoder; klasse 4, eller filopodial extensions, var lange filamentøse fremspring som manglet et synlig rygghode.
Erkjennelsene
Dette arbeidet ble støttet av United States Public Health Service Grant DA10044 (til PG og ACN) og av The Simons Foundation, Peter J. Sharp Foundation, Picower Foundation, og FM Kirby Foundation.
Forkortelser
- NAcc
- kjernen accumbens
- MSN
- mellomstor, spiny neuron
- BAC
- bakteriell kunstig kromosom
- Drd1
- dopaminreseptor D1-promotor-drevet
- Drd2
- dopaminreseptor D2-promotor-drevet
- DII
- 1,1'-diotadecyl-3,3,3 ', 3'-tetrametylindokarbocyaninperklorat
- 2WD
- 2 dager etter siste medisinbehandling
- 30WD
- 30 dager etter siste medisinbehandling.
Referanser
;