PMCID: PMC2820240
NIHMSID: NIHMS174679
Abstrakt
Kokain-induserte endringer i genuttrykk forårsaker forandringer i nevronmorfologi og atferd som kan være til grunn for kokainavhengighet. Vi identifiserte en viktig rolle for histon 3 lysin 9 (H3K9) dimetylering og lysin dimetyltransferase G9a i kokaininducerte strukturelle og atferdsplastisitet. Gjentatt kokainadministrasjon reduserte globale nivåer av H3K9-dimetylering i nucleus accumbens. Thans reduksjon i histon-metylering ble mediert gjennom undertrykkelse av G9a i denne hjerneområdet, som ble regulert av den kokaininducerte transkripsjonsfaktoren ΔFosB. Ved bruk av betinget mutagenese og viral-mediert genoverføring fant vi at G9a downregulering økte dendritisk ryggradsplastisitet av nukleinsystemer og forbedret preferanse for kokain, og derved etablert en avgjørende rolle for histon-metylering i de langsiktige tiltakene av kokain.
Introduksjon
Gjentatt kokaineksponering kjennetegnes av vedvarende endringer i genuttrykk og endret nevronmorfologi innenfor nukleotilførselen (NAc), en nøkkelkomponent i hjernens belønningskretser (1-2). Chromatin remodeling er viktig i avvikende transkripsjonelle endringer i denne hjernen regionen som kan legge til grunn aspekter av kokainavhengighet (3-9). Kokainregulering av kromatinstrukturen i NAc resulterer delvis fra direkte kokaininducerte modifikasjoner av det kromatin-enzymatiske maskineri, hvilket fører til endringer i histon-acetylering og fosforylering (4, 7-9); imidlertid har roller for enzymer som kontrollerer histon-metylering ennå ikke blitt undersøkt.
En nylig genomsøkende promotoranalyse ved anvendelse av kromatinimmunutfelling kombinert med mikroarrays (ChIP-Chip) identifiserte endrede mønstre av repressiv histon H3 lysin 9 (H3K9) og 27 (H3K27) metylering ved spesifikke genpromotorer i NAc etter gjentatt kokainbehandling (6). Vi profilerte derfor mange lysinmetyltransferaser (KMT) og demetylaser (KDMs) som er kjent for å kontrollere H3K9 eller H3K27-metylering (Fig. 1A). Bare to enzymer, G9a og GLP, viste vedvarende transkriptjonsregulering 24 timer etter gjentatt kokainadministrasjon, da uttrykket av begge gener var signifikant nedregulert. Fordi G9a og GLP spesifikt katalyserer dimetyleringen av H3K9 (H3K9me2), er deres downregulering av kokain i samsvar med reduserte globale nivåer av eukromatisk H3K9me2 observert på dette tidspunktet (Fig. 1B). I motsetning til dette forblir globale nivåer av heterochromatisk H3K27-metylering uendret ved gjentatt kokaineksponering (Fig. S1 i å støtte online materiale). På grunn av dens høye nivå av katalytisk aktivitet begge vitro og in vivo (10), satte vi for å undersøke den funksjonelle betydningen av G9a-undertrykkelse etter gjentatt kokaineksponering i NAc. Nivåer av G9a-protein, som nivåer av dets mRNA, ble signifikant redusert 24 timer etter gjentatt kokainadministrasjon (Fig. S2). Selv om G9a-mRNA-ekspresjonen ble redusert med 35% i NAc, avslørte immunhistokjemisk analyse en mer beskjeden 15% reduksjon i G9a proteinnivåer, i samsvar med den observerte 21% reduksjonen i H3K9me2 etter gjentatt kokainadministrasjon (Fig. 1B). G9a-mRNA-ekspresjonen ble også nedregulert i denne hjerneområdet ved 20% etter gjentatt selvadministrasjon av kokain (Fig. S3).
For å identifisere hvorvidt endringer i eukromatisk H3K9me2 korrelerer med genoom-brede endringer i genuttrykk i NAc, anvendte vi mikroarrayanalyser for å undersøke genuttrykksprofiler indusert av en utfordringsdose av kokain hos dyr med eller uten en historie med tidligere kokaineksponering (se supplerende genlister i Tabeller S1-S3). Dyr som hadde fått gjentatt kokain, viste dramatisk økt genuttrykk 1 time etter en kokainutfordring i forhold til akutt behandlede dyr (Fig. 1C). Denne økte genuttrykket oppstod fortsatt som svar på en kokainutfordring gitt etter 1-uka med tilbaketrekking fra gjentatt kokain. I overensstemmelse med tidligere rapporter, viste en liten prosentdel av gener (~ 10%) desensibiliserte transkripsjonssvar etter gjentatt kokainadministrasjon (Fig. 1C; se Tabell S1) (5). For direkte undersøkelse av rollen av G9a nedregulering i det forbedrede genuttrykket observert etter gjentatt kokain, fikk mus intra-NAc injeksjoner av herpes simplex virus (HSV) vektorer som uttrykte enten GFP eller G9a og ble behandlet med saltvann eller gjentatt kokain for å avgjøre om G9a overekspresjon var tilstrekkelig til å blokkere den gjentatte kokaininducerte forbedring av genuttrykk. Fra et sett med 12 tilfeldig utvalgte gener som viste økte ekspressnivåer etter gjentatt kokain, oppdaget vi at G9a reduserte det forsterkede uttrykket av 50% av disse generene betydelig (Tabell S4).
For å identifisere oppstrøms transkripsjonelle hendelser som formidler den gjentatte kokaininducerte represjonen av G9a-uttrykk, undersøkte vi en mulig rolle for ΔFosB, et svært stabilt spleisprodukt av det umiddelbare, tidlige genet fosB. ΔFosB akkumulerer i NAc etter gjentatt eksponering mot kokain, der det har vært knyttet til økt kokainbelønning (11). ΔFosB kan virke som enten en transkripsjonaktivator eller repressor avhengig av målgenet som er involvert (3, 5, 6, 12). Bruke bitransgenisk NSE-tTA × tetOP-ΔFosB mus, hvor ΔFosB-ekspresjon kan induceres selektivt i NAc og dorsalstriatum hos voksne dyr (13), undersøkte vi virkningen av ΔFosB uttrykk på kokainregulering av H3K9me2 og KMTs i NAc. ΔFosB overekspresjon var tilstrekkelig til å redusere nivåer av både H3K9me2 (Fig. 1D) og G9a-uttrykk (Fig. 1E), og etterligner virkningen av gjentatt kokain. I motsetning reduserte ΔFosB ikke GLP-ekspresjonen i denne hjerneområdet, og hadde ingen effekt på SUV39H1 og EZH2, de viktigste trimetyleringsenzymer for henholdsvis H3K9 og H3K27 (Fig. S4). For å bekrefte disse dataene ved hjelp av et uavhengig ΔFosB-overekspresjonssystem, mottok voksne voksne mus med bilaterale intra-NAc-injeksjoner av adenoassosierte virus (AAV) vektorer som uttrykte enten GFP eller FosB. Viral-mediert overekspresjon av ΔFosB reduserte nivåer av G9a-ekspresjon i denne hjerneområdet (Fig. 1E).
Slik uttalt og spesifikk regulering av G9a førte oss til å undersøke om endring av G9a-uttrykk spesielt i NAc-neuroner regulerer atferdsresponser mot kokain. Wildtype-mus mottok intra-NAc-injeksjoner av HSV-vektorer som uttrykte GFP eller G9a og ble deretter analysert ved hjelp av et upartisk kokain-betinget stedpreferanseparadigm, som gir et indirekte mål på legemiddelbelønning. Viral overekspresjon av G9a i NAc-neuroner ble bekreftet etter atferdstesting (Fig. 2A). G9a overeksprimering reduserte betydelig preferanse for kokain sammenlignet med dyr som overuttrykk GFP (Fig. 2B) og økte H3K9me2 nivåer i NAc (Fig. 2C). Overekspresjon av en katalytisk død mutant av G9a (G9aH1093K) (14) påvirket ikke kokainpreferansen (Fig. 2B) og hadde ingen innvirkning på H3K9me2 nivåene i denne hjernen regionen (Fig. 2C).
For ytterligere å studere rollen som G9a i de adferdsvirkninger av kokain, og mer spesifikt for å etterligne gjentatt kokaininducert undertrykkelse av G9a-ekspresjon i NAc, er voksen G9afl / fl mus (14) mottatt intra-NAc injeksjoner av AAV vektorer som uttrykker Cre recombinase eller GFP som en kontroll. AAV-Cre knockdown av G9a i NAc, som ble bekreftet immunhistokjemisk (Fig. S5), økte signifikant effekten av kokain i stedet for kondisjoneringsforsøk og redusert H3K9me2 nivåer i NAc (Fig. 2D, E). En kommersielt tilgjengelig farmakologisk inhibitor av G9a og GLP, BIX01294 (15-16), ble brukt til å fastslå om enzyminhibering på lignende måte påvirker atferdsresponser mot kokain. Faktisk økte farmakologisk inhibering av G9a og GLP betydelig preferanse for kokain og redusert H3K9me2 i NAc (Fig. 2F, G).
Gjentatt administrasjon av kokain øker tetthetene av dendritiske spines på NAc medium spiny nevroner (17), en prosess assosiert med funksjonelle endringer ved eksitatoriske glutamatergiske synapser på disse nevronene (18-19) og sensibiliserte atferdsresponser mot stoffet (17, 20). Vi antydet derfor at nedregulering av G9a-aktivitet i NAc ved gjentatt kokain kunne formidle kokain evne til å regulere den dendritiske ryggradens tetthet av NAc-neuroner. Ved å bruke kromatinimmunutfelling (ChIP) med et anti-G9a-antistoff, identifiserte vi flere formodede G9a-genmål i NAc, som hver tidligere har vært involvert i kokaininducert dendritisk plastisitet (Fig. 3A) (20-26). Vi fant at gjentatt kokainadministrasjon signifikant redusert G9a-binding, samt nivåer av H3K9me2, hos disse genpromotorer (Fig. 3B). I motsetning hevdet akutt kokainadministrasjon raskt G9a til noen av disse samme genpromotorer, i samsvar med økt G9a-ekspression observert i NAc 1-timen etter en akutt dose kokain (Fig. S6). Selv om G9a-binding ved bestemte genpromotorer korrelerer med endringer i ekspresjonen, er det fortsatt uklart om slike hendelser medieres av endrede globale nivåer av G9a i NAc og / eller ved forskjeller i G9a-rekruttering etter akutt vs gjentatt kokainadministrasjon.
Basert på G9a's regulering av en rekke plastitetsrelaterte gener i NAc, undersøkte vi direkte om vedlikehold av G9a-ekspresjon i denne hjerneområdet etter gjentatt kokainbehandling var tilstrekkelig til å blokkere kokaininducert dendritisk ryggradsdannelse. Bruk av en kokainbehandlingsprotokoll som tidligere ble demonstrert for å fremme dendritisk ryggradinduksjon i NAc (20), undersøkte vi ryggradens tetthet hos dyr injisert med enten HSV-GFP eller HSV-G9a. I samsvar med tidligere funn observerte vi en signifikant økning i dendritisk ryggradens tetthet i NAc etter kokainbehandling, en effekt som ble blokkert fullstendig ved G9a overekspresjon (Fig. 3C). G9a overekspresjon alene var ikke tilstrekkelig til å redusere NAc dendritisk ryggradens tetthet i fravær av kokain. For å utfylle disse dataene, G9afl / fl mus mottok intra-NAc-injeksjoner av HSV-Cre og ryggradens tetthet ble kvantifisert og sammenlignet med dyr som mottok HSV-GFP i fravær av kokain. Knockdown av G9a-uttrykk økte signifikant ryggradens tetthet på NAc-medium spiny nevroner (Fig. 3C).
Gitt bevis på at G9a nedregulering i NAc etter gjentatt kokain er formidlet av ΔFosB, undersøkte vi neste gang om denne transkripsjonsfaktoren også er involvert i reguleringen av NAc dendritiske spines. Selv om ΔFosB ikke tidligere har vært knyttet kausalt til slik dendritisk plastisitet, har flere av dets mål, inkludert Cdk5 og NFκB-underenheter, blitt så implisert (20-23), og ΔFosBs vedvarende uttrykk i NAc-neuroner korrelerer med økt dendritisk ryggradens tetthet etter gjentatt kokainbehandling (27). Først fant vi at induksjon av ΔFosB i bitransgene mus i fravær av kokain, hvilket nedregulert G9a og H3K9me2-uttrykk (Fig. 1D, E), redusert G9a-binding til mange plastisitetsrelaterte gener, hvorav mange også har vist seg å være direkte mål for ΔFosB selv (Fig. 3D) (3, 6). Vi viste neste gang at viral overekspresjon av ΔFosB i NAc økte betydelig dendritisk ryggradens tetthet under basale forhold, ligner det som observeres etter gjentatt kokainadministrasjon (Fig. 3E). Omvendt blokkeres overekspresjon i NAc av ΔJunD, et dominant negativt mutantprotein som motvirker ΔFosB transkripsjonsaktivitet, muligheten for gjentatt kokain til å øke dendritisk ryggradsdannelse i NAc (Fig. 3C).
Vår observasjon av at ΔFosB regulerer G9a-uttrykk i NAc, og at ΔFosB og G9a regulerer noen av de samme målgenene, førte oss til å undersøke andre interaksjoner mellom ΔFosB og G9a. Etter akutt kokain, da G9a nivåene ble økt, ble bindingen av G9a til fosB genet ble økt, mens etter gjentatt kokain, da G9a-uttrykk ble undertrykt, bindte G9a til fosB genet ble redusert (Fig. 3A). Slike redusert G9a-binding etter gjentatt kokain ble ikke observert for c-fos, hvor binding av G9a økes ved gjentatt kokain (Fig. S7). Dette stemmer overens med det faktum at, i motsetning til fosB, c-fos er undertrykt, ikke indusert, ved kronisk psykostimulant eksponering (5). ΔFosB overekspresjon i bitransgene mus var tilstrekkelig til å redusere G9a-bindingen signifikant til fosb gen (Fig. 3D). Videre var G9a-overekspresjonen tilstrekkelig til å redusere økt FFosB-ekspresjon etter gjentatt kokainadministrasjon (Tabell S4). Disse dataene foreslår en autoregulatorisk løkke hvor G9a initielt begrenser induksjon av ΔFosB ved akutt kokainadministrasjon. Imidlertid, som ΔFosB akkumulerer med gjentatt legemiddeleksponering, undertrykker den G9a og derved potenserer sin egen videreinduksjon.
Som konklusjon har vi vist at histonlysinmetylering i NAc er kritisk involvert i regulering av neuronal genuttrykk som svar på kokain. Undertrykkelse av G9a og H3K9me2 etter gjentatt kokainadministrasjon fremmer kokainpreferanse, delvis, gjennom transkriptjonell aktivering av mange gener kjent for å regulere avvikende former for dendritisk plastisitet. Å få en bedre forståelse for at generene blir regulert gjennom slike mekanismer, vil forbedre kunnskapen om det komplekse biologiske grunnlaget for narkotikamisbruk og kunne hjelpe til med utvikling av mer effektive behandlinger av vanedannende lidelser.
Materialer og metoder
Dyr og behandlinger
Med mindre annet er oppgitt, ble musene plassert fire til fem per bur i en koloni med en 12 time lys / mørk syklus (lys på fra 7: 00 AM til 7: 00 PM) ved konstant temperatur (23 ° C) med ad libitum tilgang til vann og mat. Alle dyreprotokoller ble godkjent av IACUC ved både UT Southwestern Medical Center og Mount Sinai School of Medicine.
For kokaineksperimenter (immunhistokemitri, western blotting, kvantitativ PCR (qPCR), mikroarrayanalyse og kromatinimmunutfelling (ChIP)] ble 8- til 10-uker gamle mannlige C57BL / 6J-mus brukt. Dyr mottok daglige injeksjoner av enten saltvann (7-behandlinger saltvann, ip), akutt kokain (6-behandlinger saltvann + en behandling 20 mg / kg kokain-HC1, ip) eller 'gjentatt' kokain (7-behandlinger 20 mg / kg kokain-HCI, ip). Mus ble ofret ved enten 1 time eller 24 timer etter den endelige behandlingen. For mikroarray studier ble dyr behandlet daglig med enten "saltvann" (15-behandlinger saltvann, ip), "akutt" kokain (14-behandlinger saltvann + 1 behandling 20 mg / kg kokain-HC1, ip), 'gjentatt + akutt' kokain 7-behandlinger saltvann + 8-behandlinger 20 mg / kg kokain-HCl, ip) eller 'gjentatt tilbaketrekning + akutt' kokain (7-behandlinger 20 mg / kg kokain-HCl + 7-behandlinger saltvann + 1-utfordringsbehandling 20 mg / kg kokain-HCl, ip) og ble ofret 1 time etter den endelige behandlingen. I oppførselseksperimenter ble mus enkelt plassert etter operasjonen og ble behandlet med 10 mg / kg kokain-HC1, ip som beskrevet nedenfor. For dendritisk ryggradsanalyse og validering av mikroarray etter HSV-GFP og HSV-G9a-GFP infeksjon ble mus behandlet med "saltvann" (5-behandlinger saltvann, ip) eller "gjentatt kokain" (5-behandlinger 20 mg / kg kokain-HCl, ip ) i løpet av 3-dager, da denne injeksjonsprotokollen tidligere har blitt demonstrert for å øke ryggradens tetthet på nuklear accumbens (NAc) nevroner innenfor tidsrammen for herpes simplexvirus (HSV) transgenuttrykk (Supplerende ref S1). Mus brukt til dendritisk ryggradsanalyse ble avlivet 4 timer etter siste behandling.
For å inducere lokal deletjon av G9a-transkripsjonen begrenset til NAc-neuroner, brukte vi mutantmus homozygote til en flokset G9a-allel, som er blitt beskrevet i detalj andre steder (S2). Cre-indusert rekombinasjon produserer exon 22 til 25 ut-of-frame spleising som fører til nonsens-mediert forfall av det muterte transkripsjon. Vi brukte G9a floxed mus som var helt tilbakekrysset til C57BL / 6J mus. Mus ble sterotaksisk injisert i NAc med adenoassosierte virus (AAV) vektorer (serotype 2) som uttrykte GFP eller Cre-GFP mellom alderen av 7 og 10 uker. Immunohistokemisk analyse ble brukt for å verifisere effektiviteten av Cre-mediert rekombination (se Supplerende Fig. S5). Vi brukte AAV injiserte dyr 21 dager etter operasjonen fordi rekombinasjon i G9a floxed mus var stabil og maksimal på dette tidspunktet, i samsvar med publiserte rapporter (S3-S4). G9a og ΔJunD overekspresjon eksperimenter ble utført på samme måte under anvendelse av HSV virusvektorer som uttrykker enten GFP, wildtype G9a-GFP, katalytisk død G9aH1093K-GFP eller ΔJunD-GFP (se S2 for detaljer om utvikling av G9a konstruksjoner). HSV overuttrykkende mus ble brukt 3 dager etter kirurgi siden overekspresjon var maksimal ved dette tidspunktet, som observert via immunhistokjemi. På grunn av den transiente karakteren av HSV-uttrykk, og den betydelig mer stabile karakteren av AAV-ekspresjon, ble HSV-vektorer anvendt i eksperimenter som krever hurtig, kortvarig transgenekspression, mens AAV-vektorer ble brukt i eksperimenter som krever forlengede perioder med transgenekspressjon. Begge vektorer har blitt vist, i omfattende tidligere studier, å infisere bare neuronale cellelegemer innenfor det injiserte hjerneområdet, uten noen infeksjon av afferente eller efferente nevroner.
For atferdseksperimenter ved bruk av den farmakologiske G9a / GLP-inhibitoren, BIX01294 (25 ng / μl), ble musene sterotaksisk implantert med to subkutane minipumper, samt bilaterale guidekanyler, inn i NAc. Mini-pumper ble aktivert 12 timer før implantasjon initierte kontinuerlig tilførsel (0.25 μl / time) av begge kjøretøyer (5 hydroxypropyl β-cyklodextrin) eller medikament for 14 dager, i løpet av hvilket tidspunkt atferdsevalueringer ble utført.
For ΔFosB overekspresjonsforsøk [western blotting, qPCR og ChIP], mannlig bitransgen NSE-tTA × tetOP-ΔFosB mus ble brukt (10 uker), hvorved i fravær av tetracyklinderivatet doxycyklin (8 uker utenfor doxycyklin) viste dyr robust striatalbegrenset konstitutiv ekspresjon avAFFB (S5). ΔFosB overekspresjon i disse musene ble bekreftet via qPCR. For å bekrefte funn ved bruk av NSE-tTA × tetOP-ΔFosB mus, wildtype 8 uker gamle C57BL / 6J hannmus var sterotaksisk injisert intra-NAc med AAV vektorer som uttrykte enten GFP eller FosB-GFP. AAV vektorer ble brukt, i dette tilfellet, for å sikre maksimal ΔFosB-ekspresjon ved 8 uker etter kirurgi, noe som muliggjør en direkte sammenligning mellom virusinfiserte og bitransgene ΔFosB-overuttrykkende mus. Viral overekspresjon ble bekreftet ved bruk av qPCR ved 8 uker etter kirurgi (15-gauge NAc slag ble dissekert under injeksjonsstedet). AAV-GFP og AAV-AFosB-GFP-overuttrykkende mus som ikke ble brukt til qPCR ble behandlet med saltvann (14-behandlinger saltvann, ip) eller gjentatt kokain (14-behandlinger 30 mg / kg kokain-HC1, ip) som begynte ved 6 uker etter- kirurgi. 4 dager etter den endelige behandlingen ble hjernen fikset med 4% paraformaldehyd, delt på et vibratom og brukt for dendritisk ryggradsanalyse.
Western blot analyse
14-gauge NAc-slag ble tatt fra 1 mm koronalseksjoner oppnådd ved bruk av en hjernematriks av rustfritt stål, og ble sonikert i 1 M HEPES lysisbuffer (1% SDS) som inneholdt protease- og fosfataseinhibitorer. 10-30 μg prøver av totalt protein ble elektroforesert på 18% SDS geler. Proteiner ble overført til PVDF-membraner og inkubert med enten anti-H3K9me2 (musemonoklonal, 1: 500), anti-p-tubulin (musmonoklonal, 1: 60,000), anti-total histon H3 (kaninpolyklonal, 1: 5,000), anti-GFP (brukt til verifikasjon av like viral ekspresjon i stanset vev) (kaninpolyklonal, 1: 1000), anti-H3K27me3 (kaninpolyklonal, 1: 500) eller anti-actin antistoffer (musmonoklonal, 1: 60,000) 4 ° C (alle membraner ble blokkert i 5% melk eller 5% bovint serumalbumin). Membranene ble deretter inkubert med peroksidasemerkede sekundære antistoffer (1: 15,000-1: 60,000 avhengig av det primære antistoffet som ble brukt) og bånd ble visualisert ved bruk av SuperSignal West Dura substrat. Bånd ble kvantifisert med NIH Image J-programvare og H3K9me2-bånd ble normalisert til enten actin eller β-tubulin og til totalt histon H3 for å kontrollere likestilling. Gjentatt kokain hadde ingen effekt på nivåer av aktin (Fig. S8) eller totalt histon 3 (Fig. S1) i NAc. Videre hadde HSV-G9a-GFP og HSV-G9aH1093K-GFP-infeksjon ingen effekt på totale nivåer av β-tubulin i NAc (Fig. S8).
immunhistokjemi
Mus ble sedert med en dødelig dose klorhydrat og perfusjonert med 4% paraformaldehyd før de ble analysert ved enkelt eller dobbelt immunhistokjemi som tidligere beskrevet (S6). Kort fortalt ble post-fast hjerner inkubert ved romtemperatur over natten i 30% sukrose før de ble delt på 35 μm (hjerner som ble brukt for dendritisk ryggradsanalyse ble snittet på et vibratom ved 100 μm seksjoner i fravær av 30% sukrose). Frittflytende NAc-seksjoner ble vasket med 1X PBS, blokkert (3% normalt eselserum, 0.1% tritonX, 1X PBS) og senere inkubert med anti-GFP (kyllingpolyklonalt, 1: 8000) og / eller anti-G9a (kaninpolyklonalt , 1: 500) antistoffer i blokkeringsløsning. Seksjoner analysert for dendritiske spines ble inkubert med et kaninpolyklonalt anti-GFP-antistoff ved 1: 200. Etter inkubering over natten ble NAc-seksjoner skyllet 3 ganger i 10 minutter med 1X PBS, etterfulgt av inkubering med Cy2 og / eller Cy3 fluorescens-koblede sekundære antistoffer i 1X PBS blokkeringsløsning i 2 timer. Seksjoner anvendt for morfologistudier ble inkubert i sekundært antistoff natten over ved romtemperatur. Kjernefysisk farging ble oppnådd ved inkubering av seksjoner i 1X PBS inneholdende DAPI (1: 50,000) i 10 minutter. Seksjoner ble igjen vasket, etterfulgt av etanol dehydrering og montering med DPX. Alle seksjoner ble avbildet ved hjelp av konfokal mikroskopi.
RNA isolasjon og qPCR
Bilaterale 14-gauge NAc-slag ble homogenisert i Trizol og behandlet i henhold til produsentens instruksjoner. RNA ble renset med RNAesy Micro-kolonner og spektroskopi bekreftet at RNA 260/280 og 260/230-rasjonene var> 1.8. RNA ble deretter omskrevet med et Bio-Rad iScript-sett. cDNA ble kvantifisert ved qPCR ved bruk av SYBR Green. Hver reaksjon ble kjørt i duplikat eller triplikat og analysert etter ΔΔCt-metoden som tidligere beskrevet ved bruk av glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenase (GAPDH) som en normaliseringskontroll (S7). Se supplerende tabell S5 for mRNA-primersekvenser.
DNA mikroarray analyse
Fire grupper (3 uavhengige biologiske replikater per gruppe) ble benyttet for mikroarray-studien, totalt 12-mikroarrays. 1 time etter den siste kokaininjeksjonen ble dyrene raskt dekapitert og hjernene ble fjernet og plassert på is. Disseksjoner av NAc ble tatt ved bruk av en 15-måler nålestempel og ble raskt frosset på tøris til RNA ble ekstrahert. Bilaterale slag ble samlet fra fire dyr per replikat, totalt 12-mus per gruppe. RNA-isolasjon, mikroarraybehandling og dataanalyse ble utført som tidligere beskrevet (S8). Kort fortalt ble RNA isolert og renset som beskrevet ovenfor og ble sjekket for kvalitet ved bruk av Agilent's Bioanalyzer. Omvendt transkripsjon, forsterkning, merking og hybridisering til Illumina MouseWG-6 v2.0-matriser ble utført ved bruk av standardprosedyrer av UT Southwesters microarray-kjerne. Rå data ble trukket fra bakgrunnen og normalisert kvantil ved hjelp av Beadstudio-programvaren. Normaliserte data ble analysert ved hjelp av GeneSpring-programvare, og genelister ble generert ved bruk av signifikansekriterier for en 1.3 ganger endringsavskjæring kombinert med en ikke-streng p-verdisnittav p <0.05.
Vi opprettholder en høy grad av tillit til disse dataene av flere grunner. Først ble alle dyrene behandlet, behandlet og drept samtidig, under de samme forholdene. I tillegg ble alle RNA- og arraybehandling utført samtidig. For det andre utførte vi trippelmatriser og samlet flere dyr per prøveprøve, og derved minimerte forskjeller på grunn av individuell variabilitet og økende statistisk effekt (S9). For det tredje anbefales dataanalysekriteriene som brukes for studien av MicroArray Quality Control-prosjektet, da disse kriteriene er validert for å gi en høy grad av reproduksjonsbarhet mellom intersite og inter-og intraplatform-reproduserbarhet (S10-S11).
Konstruksjon av virusvektorer
På grunn av størrelsesbegrensninger for virusvektorer ble kodende sekvenser for enten wildtype G9a (G9a) eller katalytisk død G9a (G9aH1093K) subklonet inn i det bicistroniske p1005 + HSV-plasmid-uttrykkende GFP under kontroll av den humane umiddelbare, tidlige cytomegaloviruspromotoren (CMV) (G9a innsatsstørrelsen var ~ 3.96 kb, som overskrider maksimal innsatsstørrelse for AAV-2 vektorer). IE4 / 5-promotoren driver G9a-uttrykk. Fragmenter ble subklonet inn i det bikistroniske p1005 + HSV-plasmidet via stumpende ligeringer med Klenow-behandlet PmeI- og EcoRI-fordøyet G9a (fra pcDNA3.1) og CIP-behandlet p1005 + etter EcoRI-fordøyelse. For produksjon av HSV-AJunD-GFP ble den kodende sekvens av AJunD flankert av EcoRI-restriksjonssteder generert ved PCR ved bruk av primeroligonukleotider inneholdende EcoRI-stedet. PCR-produktet ble deretter ligert inn i EcoRI-stedet av p1005 + -vektoren. Lokalt uttrykk for Cre rekombinase i NAc-neuroner ble oppnådd ved virusmediert genavgivelse ved bruk av en AAV-vektor som beskrevet (S12). GFP eller en N-terminal fusjon av GFP til Cre ble subklonet inn i en rekombinant AAV-2-vektor inneholdende en CMV-promotor med en spleisdonor-acceptorsekvens og polyadenyleringssignal. Alle vektorinnsetninger ble bekreftet ved dideoxy-sekvensering. Virale vektorer ble produsert ved hjelp av en trippeltransfeksjon, hjelpefri metode, som tidligere beskrevet (S13). Renset virus ble lagret ved -80 ° C. Viralkvalitet ble vurdert ved infeksjonstiter evaluert i HEK293-celler. AAV-AFosB-GFP-virus ble på lignende måte fremstilt. For HSV-Cre ble Cre-uttrykk drevet av en IRES-promotor, i motsetning til IE4 / 5-promotoren, for å minimere Cre-ekspresjon og forhindre nevronaltoksisitet (se S14 for viral konstruksjon). I alle tilfeller ble viral overekspresjon validert, begge vitro og in vivo, via qPCR, og virus ble immunohistokemisk bekreftet for å vise NAc-begrenset ekspresjon etter kirurgi.
Stereotaksisk kirurgi
Under ketamin (100 mg / kg) / xylazin (10 mg / kg) anestesi ble musene plassert i et stereotaksisk instrument med liten dyre, og kranialoverflaten ble eksponert. Trettiseks gauge sprøyte nåler ble brukt til bilateralt infusjon av 0.5 μl virus i NAc ved en 10 ° vinkel (AP + 1.6; ML + 1.5; DV - 4.4) med en hastighet på 0.1 μl / min. Dyr som mottok HSV-injeksjoner fikk lov til å gjenvinne i 2 dager etter operasjonen, mens mus brukt til atferdstesting som mottok AAV vektorer, fikk lov til å gjenvinne i 20 dager før de ble utsatt for plassering. Disse tider er konsistente med perioder med maksimal viral-mediert transgenuttrykk for de to vektorene. For BIX01294-infusjoner ble hver av to minipumper plassert subkutant på musens rygg. Kanelplasseringer ble oppnådd ved å bore to små kranialhull over NAc, og ved levering av kanylen fra bregma (AP + 1.5; ML + 1.0; DV - 5.4). Mus fikk lov til å gjenopprette fra kirurgi for 4 til 5 dager før påbegynnelse av stedkondisjoneringsprosedyren til kokain som beskrevet nedenfor.
Foretrukket plasspreferanse
Stedkondisjoneringsprosedyren ble utført som tidligere beskrevet, med de følgende modifikasjoner (S7). Kort sagt, 3 dager etter intra-NAc-infusjoner av HSV-G9a-GFP, HSV-G9aH1093K-GFP eller HSV-GFP, ble mus plassert i kondisjonskamrene, som består av tre forskjellige miljøer. Mus som viste betydelig preferanse for en av de to kondisjonskamrene, ble ekskludert fra studien (<10% av alle dyr). Konditioneringsgrupper ble deretter balansert for å justere for eventuelle kammerforstyrrelser som fortsatt kan eksistere. På påfølgende dager ble dyr injisert med saltvann og begrenset til ett kammer om ettermiddagen i 30 minutter og deretter injisert med kokain (10 mg / kg, ip) og begrenset i 30 minutter til det andre kammeret om kvelden i 2 dager (to saltvann og to kokainparringer). På testdagen ble musene plassert tilbake i apparatet uten behandling i 20 minutter og testet for å evaluere hvilken side de foretrakk. Lokomotoriske responser på kokain ble vurdert via strålebrudd i de kokainparede kamrene for å sikre effektiviteten av medikamentell behandling. For AAV- og BIX01294 CPP-eksperimenter ble det brukt en litt modifisert protokoll. Dyr ble igjen injisert med enten saltvann eller kokain (10 mg / kg, ip) og begrenset til spesifikke kamre i 30 minutters økter, men ble i stedet bare kondisjonert en gang daglig i 4 dager, etterfulgt av testen på dag 5 (dyr ble kondisjonert om kvelden og behandlingsbehandlinger ble vekslet). For alle grupper ble bevegelsesbevegelse som respons på saltvann vurdert for å sikre at bevegelse ikke ble påvirket av virus- eller hemmerbehandling.
Intravenøs kokain selvadministrasjon
Mannlige ungdommer Long Evans-rotter, veier 230-250 g i begynnelsen av forsøket ble oppnådd. De ble plassert i et fuktighets- og temperaturstyrt miljø på en omvendt 12-time lys / mørk syklus (lyser ved 9: 00 am) med ad libitum tilgang til mat og vann. Rotter fikk lov til å akklimatisere i sitt nye miljø og ble håndtert daglig i 1-uken før eksperimentets start. Alle prosedyrer ble utført i samsvar med Helseinstituttets veiledning for pleie og bruk av laboratoriedyr og ble godkjent av Mount Sinai's Animal Care and Use Committee. Utstyret med selvadministrasjon var utstyrt med infrarøde bjelker for å måle lokomotorisk oppførsel. Selvadministrasjon ble utført som tidligere beskrevet (S15-S16) med katetere implantert i høyre halsven under isofluran (2.4–2.7%) anestesi. Katetre ble spylt med 0.1 ml saltoppløsning inneholdende 10 U heparin og ampicillin (50 mg / kg). Etter en ukes restitusjon fra operasjonen begynte selvadministrasjonstrening i den mørke fasen av lys / mørk syklus. Dyr fikk 3-timers daglig tilgang til kokain (0.75 mg / kg / infusjon) under et fast forhold-1 (FR1) forsterkningsplan, hvor en aktiv spakpress resulterte i en enkelt infusjon av medikament. Rotter stabiliserte kokaininntaket etter 1 dager (<6% variasjon i responsrate over 15 påfølgende dager, med minst 3% som reagerte på den forsterkede spaken). 75 timer etter den siste selvadministrasjonsøkten ble rotene raskt halshogd, hjernen ble raskt fjernet og behandlet for RNA-isolasjon og qPCR.
Kromatinimmunutfelling (ChIP)
Friske NAc slag var formaldehyd kryssbundet og forberedt for ChIP som tidligere beskrevet (S17-S18) med mindre endringer. Kort fortalt ble 4 14-gauge NAc slag per dyr (5 dyr samlet i prøve) samlet, kryssbundet med 1% formaldehyd og slukket med 2 M glycin før frysing ved -80 ° C. 1-dagen før prøvernes sonikering ble sau-anti-kanin / mus (avhengig av utfellingsantistoff) IgG-magnetiske perler fremstilt ved inkubering av passende magnetiske perler med enten anti-G9a (kaninpolyklonal ChIP-klasse) eller anti-H3K9me2 (musmonoklonal ChIP-klasse) antistoffer over natten ved 4 ° C under konstant rotasjon i blokkløsning. Tissue sonication og chromatin skjæring ble utført som tidligere beskrevet (S17). Etter sonikering ble like konsentrasjoner av kromatin overført til nye rør og ~ 5% av sluttproduktene ble lagret for å tjene som 'input'-kontroller. Etter grundig vask og resuspendering av de konjugerte perle / antistoffblandingene ble like mengder av antistoff / perleblandinger (~ 7.5 μg antistoff / prøve) tilsatt til hver kromatinprøve og inkubert i ~ 16 timer under konstant rotasjon ved 4 ° C. Prøver ble ytterligere vasket og reversert kryssbundet ved 65 ° C over natten før DNA-rensing ved anvendelse av et PCR-rensingssett. Etter DNA-rensing ble prøver utsatt for qPCR og ble normalisert til deres passende "input" kontroller som tidligere beskrevet (S17). Normale mus-IgG-immunpresipitasjoner ved bruk av et polyklonalt anti-IgG-antistoff av mus ble også utført for å kontrollere for passende anrikning av signalforsterkning. Adenin fosforibosyltransferase (APRT) ble brukt som en negativ kontroll for kokain og ΔFosB overekspresjonsforsøk. Se Supplerende tabell S5 for promotor-primer-sekvenser.
Dendritisk ryggradsanalyse
For å studere rollen som G9a i reguleringen av nevronmorfologi in vivo, brukte vi metoder tidligere beskrevet med følgende modifikasjoner (S1). Tre dager etter injeksjon av HSV-GFP, HSV-G9a-GFP, HSV-AJunD-GFP (alle virusene ble brukt i wildtype C57Bl / 6J-mus) eller HSV-Cre-GFP (brukt i G9afl / fl mus), da virusuttrykk var maksimalt, ble musene perfusert, hjernene ble kryobeskyttet og senere delt på 100 μm på et vibratom. Seksjoner ble deretter immunfargede ved bruk av et antistoff mot GFP som beskrevet ovenfor (se immunhistokjemi). For å vurdere virkningene av G9a-overekspresjon og knockout på ryggraden, samt effekten av ΔJunD-overekspresjon, måler vi antall spines på ca. 1-2-neuritter per neuron som tilsvarer minst 299 μm av sekundære dendritter fra GFP-uttrykkende NAc-medium spiny nevroner (MSNs). Gitt at MSN er morfologisk forskjellig fra andre nevronpopulasjoner i NAc, samt tidligere rapporter som indikerer at HSV primært infiserer DARPP-32-uttrykkende nevroner i denne hjernegionen (S19), er vi sikre på at MSNs ble utelukkende vurdert i disse studiene. For hvert dyr undersøkte vi ~ 6-8-neuroner i 3-4 dyr per gruppe (7-grupper), hvoretter en gjennomsnittlig verdi ble oppnådd for hvert dyr for statistisk analyse. Eksperimenter designet for å undersøke effekten av ΔFosB-overekspresjon på NAc-ryggradens tetthet ble båret likt det som er beskrevet ovenfor, med unntak av at AAV-vektorer ble brukt til å uttrykke GFP eller AFosB-GFP i lengre tidsperioder (8 uker). Alle HSV-bilder ble fanget ved hjelp av et konfokalmikroskop med et 100X-oljemålsmål (AAV-bilder ble tatt med et 63X-oljeduserende mål). Bilder ble ervervet med pinhole-settet på 1 vilkårlig enhet og en 1024 × 1024-rammestørrelse. Dendritisk lengde ble målt ved hjelp av NIH Image J-programvaren, og ryggtalene ble talt blinde av den primære eksperimentøren, da lysbildene ble kodet før eksperimentell skanning. Gjennomsnittlig antall spines per 10 μm dendrite ble beregnet.
Statistisk analyse
En- og toveis-ANOVA ble utført for å bestemme betydning for konditionert stedpreferanse og dendritisk ryggradsanalyse med større enn to grupper. Studentens t-tester ble brukt til andre sammenligninger, inkludert qPCR, western blotting, dendritisk ryggradsanalyse som sammenlignet HSV-GFP med HSV-Cre i G9afl / fl mus, mikroarrayanalyser (se ovenfor) og kromatinimmunutfellingsforsøk. Planlagte studenters t-tester ble brukt etter toveis ANOVA-analyse av dendritisk ryggradstetthet etter ΔFosB-overekspresjon med bekreftelse på signifikante hovedeffekter av medikamentell behandling og virus. Alle verdiene som er inkludert i figurlegendene representerer gjennomsnitt ± SEM (* p ≤ 0.05; ** p <0.001). Detaljerte statistiske analyser for Fig. 1-3 i hovedteksten er gitt i: Detaljert figurlegenden inkludert statistikk.
Fotnoter
Jeg bekrefter at ingen av materialene som er inkludert i manuskriptet med tittelen Viktig rolle av histonmetyltransferasen G9a i kokain-indusert plastisitet har tidligere blitt publisert eller er under behandling andre steder, inkludert på Internett.
Alt arbeid som involverte bruk av dyr ble utført i samsvar med institusjonelle og IACUC retningslinjer ved både University of Texas Southwestern Medical Center og Mount Sinai School of Medicine.
Referanser og notater
;