(HUMAN) Behavioral og strukturelle responser på kronisk kokain Krever en feedforward-løkke som involverer ΔFosB og kalsium / kalmodulinavhengige proteinkinase II i Nucleus Accumbens Shell (2013)

Transkripsjonsfaktoren ΔFosB og den hjerneanrikede kalsium-/kalmodulinavhengige proteinkinase II (CaMKIIα) induseres i nucleus accumbens (NAc) ved kronisk eksponering for kokain eller andre psykostimulerende rusmidler, der de to proteinene medierer sensibiliserte medikamentresponser. Selv om ΔFosB og CaMKIIα begge regulerer AMPA-glutamatreseptoruttrykk og -funksjon i NAc, dannelse av dendrittisk ryggrad på NAc-medium spiny neurons (MSNs) og lokomotorisk sensibilisering for kokain, har ingen direkte kobling mellom disse molekylene blitt utforsket hittil. Her demonstrerer vi at ΔFosB fosforyleres av CaMKIIα ved det proteinstabiliserende Ser27, og at CaMKII er nødvendig for kokainmediert akkumulering av ΔFosB i rotte-NAc.

Motsatt viser vi at ΔFosB er både nødvendig og tilstrekkelig for kokaininduksjon av CaMKIIα-genuttrykk in vivo, en effekt som er selektiv for D1 _- type MSN-er i NAc-skallsubregionen.

Videre er induksjon av dendritiske ryggrader på NAc MSNs og økt atferdsresponsivitet for kokain etter NAc-overuttrykk av ΔFosB begge CaMKII-avhengige.

Det er viktig å merke seg at vi for første gang demonstrerer induksjon av ΔFosB og CaMKII i NAc hos kokainavhengige mennesker , noe som antyder mulige mål for fremtidig terapeutisk intervensjon. Disse dataene fastslår at ΔFosB og CaMKII engasjerer seg i en celletype- og hjerneregionspesifikk positiv feedforward-løkke som en nøkkelmekanisme for å regulere hjernens belønningskretser som respons på kronisk kokain.

Introduksjon

Økende bevis støtter synspunktet om at endringer i genuttrykk bidrar til mekanismer for rusavhengighet ( Robison og Nestler, 2011 ). En viktig mediator av disse endringene er ΔFosB, en transkripsjonsfaktor i Fos-familien ( Nestler, 2008 ). Kronisk administrering av praktisk talt alle rusmidler induserer langvarig akkumulering av ΔFosB i nucleus accumbens (NAc), en limbisk region som er essensiell for belønningsatferd. Slik induksjon ser ut til å være spesifikk for klassen av NAc medium spiny neuron (MSN) som uttrykker D1-dopaminreseptorer. Induserbar overuttrykk av ΔFosB i disse D1-type NAc MSN-ene øker lokomotoriske og belønningsresponser på kokain og morfin ( Kelz et al., 1999 ; Zachariou et al., 2006 ), inkludert økt selvadministrering av kokain ( Colby et al., 2003 ). Videre reduserer genetisk eller viral blokade av ΔFosB transkripsjonsaktivitet de givende effektene av disse legemidlene ( Zachariou et al., 2006 ), noe som indikerer at denne vedvarende induksjonen av ΔFosB er en kritisk mediator av de varige endringene indusert i NAc ved kronisk legemiddeladministrasjon.

Den uvanlige stabiliteten til ΔFosB (i forhold til alle andre Fos-familieproteiner) er både en iboende egenskap ved molekylet, på grunn av avkortningen av degron-domener som finnes i fullengdes FosB ( Carle et al., 2007 ), og en regulert prosess. ΔFosB fosforyleres in vitro og in vivo ved Ser27, og denne reaksjonen stabiliserer ΔFosB ytterligere, ~10 ganger, i cellekultur og NAc in vivo ( Ulery-Reynolds et al., 2009 ). Selv om Ser27-ΔFosB har vist seg å være et substrat for kaseinkinase-2 in vitro ( Ulery et al., 2006 ), er mekanismen for in vivo fosforylering fortsatt ukjent.

Kalsium/kalmodulinavhengig proteinkinase II (CaMKII) er en høyt uttrykt serin/treoninkinase hvis α- og β-isoformer danner dodekameriske homo- og heteroholoenzymer in vivo , og er essensielle for flere former for nevroplastisitet ( Lisman et al., 2002 ; Colbran og Brown, 2004 ). CaMKIIα induseres selektivt i NAc-skallet av kronisk amfetamin ( Loweth et al., 2010 ), og farmakologisk blokade av CaMKII-aktivitet i NAc-skallet reduserer atferdssensibilisering for amfetamin ( Loweth et al., 2008 ) og kokain ( Pierce et al., 1998 ), mens viral overekspresjon av CaMKIIα i denne NAc-subregionen forbedrer lokomotorisk sensibilisering for og selvadministrasjon av amfetamin ( Loweth et al., 2010 ). CaMKIIα kan påvirke belønningsatferd via modulering av AMPA-glutamatreseptor-subenheter ( Pierce et al., 1998 ), ettersom CaMKIIα-aktivitet lenge har vært assosiert med AMPA-reseptorfunksjon og synaptisk målretting i flere former for nevroplastisitet ( Malinow og Malenka, 2002 ).

Denne litteraturen viser flere paralleller mellom ΔFosB og CaMKII: begge er nødvendige og tilstrekkelige for flere atferdseffekter av rusmidler, begge oppregulerer dendrittiske spines i ulike neuronale celletyper in vivo ( Jourdain et al., 2003 ; Maze et al., 2010 ), og begge utøver minst noen av sine atferdseffekter gjennom modulering av AMPA-reseptorer ( Kelz et al., 1999 ; Malinow og Malenka, 2002 ; Vialou et al., 2010 ). Til tross for disse parallellene er ingen funksjonell kobling mellom ΔFosB og CaMKII kjent. Her etablerer vi gjensidig regulering mellom ΔFosB og CaMKII, og demonstrerer at de to proteinene danner en D1-type MSN-spesifikk feed-forward-løkke i NAc-skallet som induseres av kokain og regulerer en rekke kokainresponser in vivo.

Gå til:

Materialer og metoder

Eksperiment 1: iTRAQ proteomisk analyse av NAc-skall og -kjerne etter kokainbehandling ( figur 1A )

Voksne (8 uker) hannrotter fikk administrert 20 mg/kg kokain eller saltvannsbærer intraperitonealt én gang daglig i syv dager. 24 timer etter den siste injeksjonen ble NAc-skall og -kjerne mikrodissekert ( fig. 1A ) og fryst raskt. iTRAQ-analyser ble utført som tidligere beskrevet ( Ross et al., 2004 ; Davalos et al., 2010 ).

Figur 1

Skallspesifikk induksjon av CaMKII i NAc av kokain

Eksperiment 2: Kvantifisering av proteinendringer i rotte-NAc-kjerne og -skall etter kokainbehandling ( fig. 1B–D )

Voksne (8 uker) hannrotter fikk administrert 10 mg/kg kokain eller saltvannsbærer IP én gang daglig i syv dager i lokomotoriske registreringskamre. Lokomotoriske responser på en enkelt injeksjon av kokain (5 mg/kg IP) ble registrert hos de dyrene som tidligere var behandlet med kokain (kalt "kronisk") og en del av de som ble behandlet med saltvann (kalt "akutt"), og lokomotoriske responser på saltvann alene ble registrert hos de gjenværende dyrene som fikk kronisk saltvannsbehandlet (kalt "saltvann"). Lokomotoriske aktivitetsanalyser ble utført som beskrevet ( Hiroi et al., 1997 ). Kort fortalt ble voksne hannrotter plassert i 18” × 24” PAS åpne registreringsbokser (San Diego Instruments) i 30 minutter for å tilvenne seg, fikk en enkelt IP-injeksjon av saltvann og overvåket i ytterligere 30 minutter, og fikk en enkelt IP-injeksjon av 5 mg/kg kokain og overvåket i 30 minutter.

24 timer etter denne siste injeksjonen ble rottene halshugget uten anestesi for å unngå effekten av anestesimidler på nevrale proteinnivåer og fosfotilstander. Hjernene ble serieskåret i en 1.2 mm matrise (Braintree Scientific), og målvevet ble fjernet i fosfatbufret saltvann som inneholdt protease- (Roche) og fosfatase- (Sigma Aldrich)-hemmere ved bruk av en 14 gauge-stempel for NAc-kjernen og en 12 gauge-stempel av det gjenværende vevet for NAc-skallet (se figur 1A ), og umiddelbart frosset på tørris. Prøvene ble homogenisert ved lett sonikering i modifisert RIPA-buffer: 10 mM Tris-base, 150 mM natriumklorid, 1 mM EDTA, 0.1 % natriumdodecylsulfat, 1 % Triton X-100, 1 % natriumdeoksykolat, pH 7.4, protease- og fosfatasehemmere som ovenfor. Etter tilsetning av Laemmli-buffer ble proteinene separert på 4–15 % polyakrylamidgradientgeler (Criterion System, BioRad), og Western blotting ble utført ved bruk av Odyssey-systemet (Li-Cor) i henhold til produsentens protokoller.

Eksperiment 3: Kvantifisering av proteinendringer i rotte-NAc-kjerne og -skall etter kokainabstinens ( figur 1E )

Voksne (8 uker) hannrotter fikk administrert 10 mg/kg kokain eller saltvannsbærer IP én gang daglig i syv dager. 14 dager etter den siste injeksjonen fikk dyr behandlet med saltvann en ny saltvannsinjeksjon (kalt «saltvann»), og dyr behandlet med kokain fikk en ny saltvannsinjeksjon (kalt 14-dagers abstinens eller «14d WD») eller en enkelt injeksjon med kokain (kalt «14d WD Chal» for utfordring). Én time etter den siste injeksjonen ble dyrene halshugget og Western blotting utført som i eksperiment 2.

Eksperiment 4: Kvantifisering av proteinendringer i rotte-NAc-kjerne og -skall etter selvadministrering av kokain ( fig. 2A–C )

Rotter ble trent til å selv administrere 0.5 mg / kg / infusjon av kokain i løpet av en times økt under et fast forhold 1-plan i ni dager. Etter ni basislinjeøkter ble rottene delt i to grupper balansert med kokaininntak på de to siste øktene. En gruppe rotter fikk selvadministrere kokain (0.5 mg / kg / infusjon) i en times økt (kort tilgang, ShA), mens den andre gruppen rotter selv administrerte kokain i seks timers økter (lang tilgang, LgA ) i ti dager til (opptrappingsøkter).

Hjerneseksjoner ble behandlet for immunhistokjemi som beskrevet ( Perrotti et al., 2004 ). Hjernene ble perfusert 18–24 timer etter siste eksponering for legemiddel, noe som resulterte i nedbrytning av eventuelt gjenværende fulllengde FosB-protein slik at all gjenværende immunreaktivitet reflekterer ΔFosB. Denne nedbrytningen ble bekreftet ved Western blotting, som ikke viste noen signifikant farging med et antistoff rettet mot C-terminalen av fulllengde FosB som ikke gjenkjenner ΔFosB (data ikke vist). Etter oppdeling i 35 µm-seksjoner ble antallet ΔFosB-immunpositive celler kvantifisert av en blindet observatør i to snitt gjennom NAc til hver rotte, og gjennomsnittsverdier per 40×-felt ble deretter beregnet per region for hvert dyr. Hvert dyr ble ansett som en individuell observasjon for statistisk analyse. Regioner av interesse ble identifisert ved hjelp av Paxinos og Watson ( Paxinos og Watson, 2007 ).

Kvantifisering av CaMKIIα-immunreaktivitet ble utført ved bruk av et Licor-system som beskrevet ( Covington et al., 2009 ). Integrerte intensiteter av CaMKII og GAPDH ble bestemt med Odyssey-programvare. Resultatene presenteres som integrerte intensitetsverdier per mm² ^og presenteres som gjennomsnitt ± sem ( n = 4–10 per gruppe). Verdier for GAPDH ble brukt som referanse for å normalisere CaMKII-intensitet for skivetykkelse og forhold.

Figur 2

Induksjon av CaMKII i NAc-skall av selvadministrerende rotter og menneskelige kokainavhengige

Eksperiment 5: Kvantifisering av proteinnivåer hos kokainavhengige mennesker ( figur 2D )

Prosedyre

Obduksjonsprøver av menneskelig hjernevev ble innhentet fra Quebec Suicide Brain Bank (Douglas Mental Health University Institute, Montreal, Quebec, Canada). Konserveringen av vevet foregikk i hovedsak som beskrevet ( Quirion et al., 1987 ). Kort fortalt, etter utvinning plasseres hjernen på våt is i en isoporboks og sendes i all hast til Quebec Suicide Brain Bank-fasilitetene. Hemisfærene separeres umiddelbart med et sagittalt snitt i midten av hjernen, hjernestammen og lillehjernen. Blodkar, pinealkjertelen, årehinneplexus, halve lillehjernen og halve hjernestammen dissekeres vanligvis fra venstre hjernehalvdel, som deretter kuttes koronalt i 1 cm tykke skiver før frysing. Den siste halvdelen av lillehjernen kuttes sagittalt i 1 cm tykke skiver før frysing. Vevet fryses raskt i 2-metylbutan ved −40 °C i ~60 sekunder. Alt frossent vev oppbevares separat i plastposer ved −80 °C for langtidslagring. Spesifikke hjerneområder dissekeres fra frosne koronale skiver på en plate av rustfritt stål med tørris rundt for å kontrollere temperaturen i omgivelsene. Western blotting ble utført som beskrevet i eksperiment 2.

Cohort

Kohorten besto av 37 menn og 3 kvinner, i alderen 15–66 år. Alle forsøkspersonene døde plutselig uten langvarig smertestillende tilstand eller langvarig medisinsk sykdom . I hvert tilfelle ble dødsårsaken fastslått av Quebecs rettsmedisiner, og en toksikologisk screening ble utført med vevsprøver for å innhente informasjon om medisinering og bruk av illegale stoffer på dødstidspunktet. Forsøksgruppen besto av 20 individer som oppfylte SCID-I-kriteriene for kokainavhengighet. Kontrollgruppen besto av 20 forsøkspersoner uten historie med kokainavhengighet og uten større psykiatriske diagnoser. Alle forsøkspersonene døde plutselig av årsaker som ikke hadde direkte innflytelse på hjernevevet. Gruppene ble matchet med hensyn til gjennomsnittlig alder, kjøleforsinkelse og pH. For alle forsøkspersonene ble psykologiske obduksjoner utført som beskrevet tidligere ( Dumais et al., 2005 ), noe som ga oss tilgang til detaljert kasusinformasjon om psykiatrisk og medisinsk historie, samt andre relevante kliniske og sosiodemografiske data. Kort fortalt gjennomførte en trent intervjuer det strukturerte kliniske intervjuet for DSM-IV psykiatriske lidelser (SCID-I) med én eller flere informanter om avdøde. Et panel av klinikere gjennomgikk SCID-I-vurderinger, kasusrapporter, rettsmedisinerens notater og medisinske journaler for å oppnå konsensus om psykiatriske diagnoser.

Eksperiment 6: Kromatinimmunopresipitasjon for rotte-NAc ( fig. 3A–C )

Voksne (8 uker) hannrotter ble administrert 10 mg / kg kokain eller saltvanns-bærerstoff en gang per dag i syv dager. 24 timer etter den siste injeksjonen ble NAc-skallet og kjernen mikro-dissekert. Kromatinimmunutfelling (ChIP) ble utført ved å samle bilaterale NAc-slag av skall eller kjerne fra syv rotter per gruppe i 14 totale grupper (98 dyr totalt, 7 kokainbassenger, 7 saltvannsbassenger). Vev ble tverrbundet, vasket og lagret ved -80 ° C inntil kromatin skjæres ved sonikering. Skjært kromatin ble inkubert over natten med antistoffer som tidligere var bundet til magnetiske perler (Dynabeads M-280, Invitrogen). Ikke-immun IgG ble brukt som kontroll. Etter omvendt tverrbinding og DNA-rensing ble qPCR brukt for å måle nivåer av CaMKIIa promoter DNA. Primere ble designet for å forsterke et område som inneholder en AP-1 konsensus-sekvens lokalisert ~ 450 bp før transkripsjonsstartstedet (Fremover: ACTGACTCAGGAAGAGGGATA; Reverse: TGTGCTCCTCAGAATCCACAA).

Figur 3

Celletype- og regionspesifikk ΔFosB-induksjon av CaMKIIα in vivo

Eksperiment 7: Måling av CaMKII-transkript og proteinuttrykk med celletypespesifikk ΔFosB-overuttrykk ( fig. 3D )

Hannlige bitransgene mus avledet fra NSE-tTA (linje A) × TetOp-ΔfosB (linje 11) og NSE-tTA (linje B) × TetOp-FLAG-ΔfosB (linje 11) mus ( Chen et al., 1998 ; Kelz et al., 1999 ; Werme et al., 2002 ; Zachariou et al., 2006 ) ble unnfanget og oppdratt med 100 µg/ml doksycyklin for å undertrykke ΔFosB-ekspresjon under utvikling. Kullet ble delt ved avvenning: halvparten forble på doksycyklin og halvparten ble byttet til vann, og dyrene ble brukt 8 til 11 uker senere når transkripsjonseffektene av ΔFosB var maksimale ( Kelz et al., 1999 ; McClung og Nestler, 2003 ). For transkripsjonsanalyser ble musene raskt halshugget, og hjernene ble fjernet og plassert på is. Disseksjoner av NAc ble tatt med en 14-gauge nålestikker og raskt frosset på tørris inntil RNA var ekstrahert. RNA-isolering, qPCR og dataanalyse ble utført som tidligere beskrevet ( LaPlant et al., 2009 ). Kort fortalt ble RNA isolert med TriZol-reagens (Invitrogen), ytterligere renset med RNAeasy-mikrosettet fra Qiagen og kvalitetssjekket med Agilents Bioanalyzer. Omvendt transkripsjon ble utført ved hjelp av iScript (BioRad). qPCR ble utført med et Applied Biosystems 7900HT RT PCR-system med følgende syklusparametere: 10 min ved 95 °C; 40 sykluser på 95 °C i 1 min, 60 °C i 30 sek, 72 °C i 30 sek; gradert oppvarming til 95 °C for å generere dissosiasjonskurver for bekreftelse av enkelt-PCR-produkter. Immunhistokjemiske analyser av ΔFosB- og CaMKIIα-proteinuttrykk ble utført som beskrevet i eksperiment 4.

Eksperiment 8: Effekter av intra-NAc D1- og D2-dopaminreseptorantagonister på kokainmedierte proteinendringer ( fig. 3H )

Voksne (8 uker) hannrotter fikk administrert 10 mg/kg kokain eller saltvannsbærer («bærer»-gruppen) IP én gang daglig i syv dager. 30 minutter før hver kokaininjeksjon fikk rottene IP enten D1-reseptorantagonisten SCH 23390 (0.5 mg/kg, «D1 Ant»-gruppen), eller D2-reseptorantagonisten etikloprid (0.5 mg/kg, «D2 Ant»-gruppen), eller en saltvannskontrollinjeksjon («kokain»-gruppen). 24 timer etter den siste injeksjonen ble dyrene halshugget og proteinene kvantifisert ved Western blotting i henhold til eksperiment 2.

Eksperiment 9: Effekter av AAV-mediert ΔFosB-overekspresjon på proteinekspresjon ( fig. 4 A–C )

Stereotaksisk kirurgi ble utført på voksne hannrotter (8 uker) for å injisere AAV-GFP (grønt fluorescerende protein) eller AAV-GFP-ΔFosB ( Maze et al., 2010 ). 33 gauge nåler (Hamilton) ble brukt til alle operasjoner, hvor 0.5 µl renset høytitervirus ble bilateralt infundert over en periode på 5 minutter, etterfulgt av en ytterligere hvileperiode på 5 minutter etter infusjonen. Alle avstander måles i forhold til Bregma: 10° vinkel, AP = +1.7 mm, Lat = 2.5 mm, DV = -6.7 mm. 14 dager etter operasjonen fikk dyrene en enkelt IP-injeksjon av 10 mg/kg kokain i lokomotoriske overvåkingskamre for å vurdere de atferdsmessige effektene av ΔFosB-overekspresjon. 24 timer etter denne siste injeksjonen ble rottene halshugget som i eksperiment 2 , og vevsmikrodisseksjon ble utført under fluorescensmikroskopisk veiledning for å oppnå GFP-positivt NAc-vev. Western blotting ble deretter utført som i eksperiment 2.

Figur 4

ΔFosB er både nødvendig og tilstrekkelig for kokainmediert D1-reseptoravhengig CaMKIIα-induksjon i NAc-skall

Eksperiment 10: Effekter av AAV-mediert ΔJunD-overekspresjon på kokainavhengig proteinekspresjon ( fig. 4 D–F )

Stereotaksisk injeksjon av AAV-GFP eller AAV-GFP-ΔJunD ble utført som i eksperiment 8. 14 dager etter operasjonen fikk dyrene administrert 10 mg/kg kokain eller saltvannsbærer IP én gang daglig i syv dager i lokomotoriske registreringskamre. Lokomotoriske responser på en enkelt injeksjon av kokain (5 mg/kg IP) eller saltvann ble registrert. 24 timer etter denne siste injeksjonen ble rottene halshugget, vevet høstet og Western blots utført som i eksperiment 9.

Eksperiment 11: In vitro proteinkinaseanalyser ( fig. 5A–D )

Rekombinant CaMKIIα og ΔFosB ble renset fra insektceller ( Brickey et al., 1990 ; Jorissen et al., 2007 ), og proteinkinaseanalyser ble utført ( Colbran, 1993 ), som tidligere beskrevet. Kort fortalt ble CaMKII preinkubert på is med 2.5 µM (eller angitt konsentrasjon) av ΔFosB, 1 mM Ca2 ⁺ , 40 mM Mg2 ⁺ , 15 µM calmodulin og 200 mM HEPES pH 7.5. Fosforylering ble initiert ved tilsetning av 200 µM ATP med eller uten [γ- ^32P ]ATP og fikk fortsette i 10 minutter ved romtemperatur ( fig. 5A og B ) eller 2 minutter på is ( fig. 5C og D ). Produktene ble separert ved Western blotting ( fig. 5A og B ) eller ved autoradiogram og scintillasjonstelling (fig. B–D).

Figur 5

ΔFosB er et potent underlag for CaMKIIα

Eksperiment 12: Identifisering av Ser27 ΔFosB fosforylering ( figur 5E )

In vitro -kinaseanalyser ble utført som i eksperiment 11 , proteiner ble separert ved SDS-PAGE, og bånd som korresponderer med ΔFosB ble kuttet ut og utsatt for tandemmassespektrometri. M/z-tildelingene til de tilsvarende ionfragmentene i alle panelene er merket oppå ionetoppene. Ikke alle fragmentioner er merket på grunn av plassbegrensninger. Vanligvis er teksten for fragmentionmerkene farget i svart, bortsett fra når de direkte bekrefter eller legger til bevis for tilstedeværelsen av fosforyleringsstedene av interesse, i hvilket tilfelle de er merket med rødt. Bevis for ryggradsfragmenteringsprodukter presenteres i sekvensavlesningen av fosfopeptidet med det detekterte stedet for fosforyleringsrest angitt i rødt med en enkelt aminosyrebokstavbetegnelse. Den numeriske beskrivelsen av de observerte fragmentionene er også merket på peptidsekvensen som b- og y-ioner. Zoomfaktorene for seksjonene av m/z-aksen for å vise fragmentionene med lavere intensitet er merket øverst i hvert fragmentmassespekter. Fragmentionene vist i panel H bekrefter imidlertid tilstedeværelsen av fosforylert Ser27-isoform i en blanding av andre fosforylerte isoformer på stedene Ser28, Ser31, Ser34 og Thr37. Tilstedeværelsen av pa5-, pa5-P-, pb5- og pb5-P-ioner bekrefter unikt fosforyleringen av Ser27-resten.

Eksperiment 13: Kvantifisering av Ser27-fosforylering ( figur 5F )

Standard peptider ble designet for å etterligne fosfo- og ikke-fosforformene av Ser27 ΔFosB. Etter syntese og rensing ble hvert "tungt" idiotypisk peptid oppløst i en 50 / 50 acetonitril / vannbuffer og sendt for aminosyreanalyse for å bestemme absolutt konsentrasjon på den syntetiske peptid-stamoppløsningen. Hvert "tungt" peptid ble deretter direkte tilført 4000 QTRAP massespektrometer (MS) for å bestemme den beste kollisjonsenergien for MS / MS fragmentering og to til fire MRM overganger. Deretter ble de pene "tunge" peptidene utsatt for LCMS på 4000 QTRAP for å sikre peptidseparasjon. Instrumentet ble kjørt i triple quadrupole-modus, med Q1 satt på den spesifikke forløperen m / z-verdi (Q1 er ikke skanning), og Q3 satt til den spesifikke m / z-verdien som tilsvarer et spesifikt fragment av det peptidet. I MRM-modus ble en serie enkeltreaksjoner (forløper / fragmentionoverganger der kollisjonsenergien er innstilt for å optimalisere intensiteten til fragmentionene av interesse) målt sekvensielt, og syklusen (typisk 1 – 2 sek) ble loopet gjennom hele tiden for HPLC-separasjonen. MRM-overganger ble bestemt fra MS / MS-spektra for eksisterende peptider. To overganger per peptid, tilsvarende fragmentioner med høy intensitet, ble deretter valgt og kollisjonsenergien optimalisert for å maksimere signalstyrken til MRM-overganger ved bruk av automatiseringsprogramvare. Topper som stammet fra standard peptider og ΔFosB-prøver eksponert for CaMKII eller kontroll ble deretter sammenlignet for å bestemme den absolutte mengden av hver peptidform i reaksjonen. Dataanalyse på LC-MRM data utføres ved bruk av AB Multiquant 1.1 programvare.

Eksperiment 14: Induksjon av ΔFosB i CaMKII-overuttrykkende mus ( fig. 5G og H )

Transgene mus som overuttrykker T286D CaMKII ( Mayford et al., 1996 ; Kourrich et al., 2012 ) og villtype-kullmus ble oppdrettet i fravær av doksycyklin for å tillate transgenekspresjon. Voksne mus fikk administrert 20 mg/kg kokain eller saltvann IP én gang daglig i 14 dager. 24 timer etter den siste injeksjonen ble dyrene halshugget, og immunhistokjemi og kvantifisering av ΔFosB-ekspresjon ble utført som i eksperiment 4.

Eksperiment 15: Effekter av HSV-mediert ΔFosB-overekspresjon og CaMKII-hemming på NAc-dendrittiske spiner ( fig. 6A–E )

Voksne hannmus (8 uker) ble stereotaktisk injisert i NAc med HSV-GFP, HSV-GFP-ΔFosB ( Olausson et al., 2006 ), HSV-GFPAC3I eller HSV-GFPAC3I-ΔFosB. I disse konstruksjonene er AC3I, en peptidbasert hemmer av CaMKII-aktivitet, fusjonert til C-terminalen av GFP. GFPAC3I ble klonet ved PCR ved bruk av pMM400-vektoren som inneholdt GFPAC3I som mal med følgende primere: GFP-AC3I-F: 5' CC GCTAGC GCCGCCACC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT 3' (clampNheIKozakmet); GFP-AC3I-R: 5' CC TCCGGA TTACAGGCAGTCCACGGCCT 3' (clampBspEIstop). Det resulterende PCR-produktet ble satt inn i p1005+- og p1005+-ΔFosB-vektorene ved bruk av NheI- og BspEI-steder. Konstruksjonen ble validert ved sekvensering. Stereotaksiske koordinater var: 10° vinkel, AP = +1.6 mm, Lat = +1.5 mm, DV = −4.4 mm (Barrot et al., 2002). Perfusjon og hjerneseksjonering ble utført i henhold til eksperiment 4.

Ryggradens analyse ble utført som beskrevet ( Christoffel et al., 2011 ). Kort fortalt ble dendrittiske segmenter 50–150 µm unna somaet tilfeldig valgt fra HSV-infiserte celler som uttrykker GFP. Bilder ble tatt på en konfokal LSM 710 (Carl Zeiss) for morfologisk analyse ved bruk av NeuronStudio med rayburst-algoritmen. NeuronStudio klassifiserer ryggrader som tynne, sopplignende eller korte basert på følgende verdier: (1) sideforhold, (2) forhold mellom hode og hals og (3) hodediameter. Rygggrader med hals kan klassifiseres som enten tynne eller sopplignende, og de uten betydelig hals klassifiseres som korte. Rygggrader med hals merkes som tynne eller sopplignende basert på hodediameter.

Figur 6

Blokkering av CaMKII-aktivitet forhindrer de morfologiske og atferdsmessige effektene av ΔFosB i NAc

Eksperiment 16: Effekter av HSV-mediert ΔFosB-overekspresjon og CaMKII-hemming på kokainresponser ( fig. 6F )

Voksne hannmus ble injisert med virus som i eksperiment 15 , og bevegelsesresponser på en enkelt injeksjon på 5 mg/kg kokain ble målt som i eksperiment 9. Bevegelsesdata uttrykkes som totale strålebrudd over 30 minutter etter kokaininjeksjon.

Tilleggsinformasjon

Dyrehjem

Hannrotter av typen Sprague Dawley (250–275 g; Charles River Laboratories) ble holdt i par. Åtte uker gamle hannmus av typen C57BL/6J (The Jackson Laboratory) ble holdt i grupper med maksimalt fem dyr per bur. Alle dyrene ble vant til dyreanlegget i ≥1 uke før eksperimentelle manipulasjoner og holdt i klimakontrollerte rom (23–25 °C) i en 12-timers lys/mørke-syklus (lysene tennes kl. 07.00) med tilgang til fôr og vann ad libitum . Eksperimentene ble utført i samsvar med retningslinjene fra Society for Neuroscience og den institusjonelle komiteen for dyrepleie og -bruk (IACUC) ved Mount Sinai.

Narkotika

Legemidler ble administrert IP og oppløst i sterilt saltvann, inkludert kokain (5 – 20 mg / kg per 10 ul for mus, per 1 ml for rotter, NIDA) og SCH 23390 eller etiklopridhydroklorid (0.5 mg / kg per 1 ml, Tocris) . For stereotaksisk kirurgi ble mus bedøvd med en "cocktail" av ketamin (100 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) (Henry Schein) i sterilt saltvann.

antistoffer

CaMKIIα (totalt): Upstate 05 – 532, 1: 5,000

CaMKII fosfo-Thr286: Promega V111A, 1: 1,000

ΔFosB (totalt): Cell Signaling 5G4, 1: 250

ΔFosB fosfo-Ser27: Fosfosolusjoner, 1: 500

GluA1 (totalt): Abcam, Ab31232, 1: 1,000

GluA1 fosfo-Ser831: Millipore N453, 1: 1,000

GluA1 fosfo-Ser845: Chemicon Ab5849, 1: 2,000

GluA2: Millipore 07 – 598, 1: 2,000

NR2A: Sigma HPA004692, 1: 2,500

NR2B: Millipore Ab1557P, 1: 1,000

Statistiske analyser

Alle statistiske analyser ble utført ved bruk av Prism 6 programvarepakke (GraphPad). Studentens t-tester ble brukt til alle parvise sammenligninger (angitt i Resultater hvor t-verdi er gitt), og enveis ANOVA-er ble brukt for alle flere sammenligninger (angitt i resultatseksjonen der F-verdi er gitt).

Gå til:

Resultater

Kronisk kokain induserer CaMKII i NAc-skallet

Mange studier har indikert at MSN-er i NAc-skallet og -kjernen har forskjellige biokjemiske og fysiologiske responser på kronisk eksponering for rusmidler ( Kourrich og Thomas, 2009 ; Loweth et al., 2010 ), og at de to underregionene regulerer rusmiddelsøkende atferd ulikt ( Ito et al., 2004 ). For å bestemme de differensielle effektene av kokain på proteinbestanddelene i NAc-skallet vs. kjernen, brukte vi Multiplexed Isobaric Tagging (iTRAQ) og tandem massespektroskopi (MS/MS). Voksne hannrotter ble injisert IP med kokain (20 mg/kg) eller saltvann daglig i 7 dager; 24 timer etter den siste injeksjonen ble NAc-skallet og -kjernen mikrodissekert ( fig. 1A ) og hurtigfryst. Proteiner i disse prøvene ble deretter kvantifisert ved hjelp av iTRAQ. Alle fire CaMKII-isoformene viste store økninger i uttrykk etter kokainbehandling som var spesifikke for NAc-skallet sammenlignet med kjernen. Flere proteinfosfataser, inkludert PP1 katalytiske og regulatoriske subenheter og PP2A, som tidligere har vært assosiert med ulike CaMKII-substrater i andre systemer ( Colbran, 2004 ), fulgte et lignende mønster. Disse funnene ga nye, objektive bevis på at CaMKII-signalveien er fremtredende regulert av kokain i NAc på en skallspesifikk måte.

For å validere dette funnet mer kvantitativt, behandlet vi rotter som ovenfor med kokain (i varierende doser) eller saltvann og målte lokomotoriske responser på en kokain- (5 mg/kg) eller saltvannsutfordringsdose. Gjentatt eksponering for 10 mg/kg kokain resulterte i det typiske mønsteret for lokomotorisk sensibilisering ( figur 1B ). Videre studier med dette doseringsregimet viste, ved bruk av Western blotting, at gjentatt kokain induserer CaMKIIα selektivt i NAc-skall 24 timer etter den siste injeksjonen av kokain ( figur 1C og D ; p=0.0019; F=7.943; df=29). I tillegg var fosforylering av det kanoniske CaMKII-substratet Ser831 av GluA1-subenheten til AMPA-reseptoren signifikant økt i NAc-skallet og ikke kjernen (p=0.0261; F=4.208; df=28), mens CaMKIIα Thr286-autofosforylering hadde en sterk, men ikke signifikant trend mot induksjon kun i skallet ( figur 1D ). Flere andre glutamatreseptorer var upåvirket. I motsetning til disse målingene av CaMKII, viste de samme vevsprøvene induksjon av ΔFosB i både skallet (p=0.0260; F=4.189; df=29) og kjernen (p=0.0350; F=3.807; df=29) av NAc ( fig. 1C og D ), i samsvar med tidligere funn ( Perrotti et al., 2008 ).

Siden flere tidligere studier av kokainregulering av AMPA-reseptorer analyserte dyr etter ~14 dager med abstinens fra kronisk kokain (se Diskusjon), gjentok vi disse biokjemiske analysene på dette tidspunktet. Vi fant at 14 dager etter den siste injeksjonen av kokain forblir ΔFosB forhøyet i NAc (p = 0.0288; F = 4.258; df = 22), mens verken CaMKII eller fosforylering av GluA1 Ser831 forblir økt ( Fig 1E ). Imidlertid, 1 time etter en enkelt dose på 10 mg/kg kokain, er nivåene av total CaMKII (p = 0.0330; F = 3.947; df = 26) og av GluA1 Ser831 (p = 0.0213; F = 4.509; df = 27) fosforylering begge forhøyet i en grad som ligner på den som ble funnet etter initial kronisk kokaineksponering ( Fig 1E ). Disse dataene indikerer at NAc-skallnevroner er primet for CaMKII-induksjon i lengre perioder med avholdenhet, kanskje via direkte priming av CaMKII-genpromotoren (se Diskusjon). Dessuten antyder det faktum at ΔFosB-induksjon er mer vedvarende enn CaMKII-induksjon eksistensen av ytterligere mekanismer, enten kromatinbaserte eller andre, som utøver en "brems" på CaMKII-regulering, som dekket i Diskusjonen.

For å styrke disse observasjonene ytterligere, utforsket vi modeller for selvadministrasjon av kokain, som involverer frivillig inntak av stoffet. Voksne hannrotter fikk enten kort eller lang tilgang til kokain; som forventet ( Ahmed og Koob, 1998 ) var det bare lange tilgangsbetingelser som førte til økende selvadministrasjon av stoffet ( fig. 2A ). ΔFosB ble i større grad indusert av lang kontra kort tilgang til kokain i både NAc-skallet (p=0.0011; F=11.12; df=17) og kjernen (p=0.0004; F=13.86; df=17). I motsetning til dette ble CaMKIIα kun indusert i NAc-skallet av lang tilgang til kokain ( fig. 2B og C ; p=0.0236; F=4.957; df=16). Det er interessant å sammenligne det gjennomsnittlige daglige kokaininntaket hos dyr med kort tilgang (~12 mg/kg IV), dyr med lang tilgang (~70 mg/kg IV) og dyr som får stoffet administrert av forsøksledere (10 mg/kg), og spørre hvorfor sistnevnte fremkaller robust induksjon av ΔFosB og CaMKII, mens dyr med kort tilgang ikke gjør det. Denne avviken skyldes sannsynligvis forskjeller i toppkokainnivåer (kokain administrert av forsøksleder gis som en enkelt bolus IP, mens kokain administrert av forsøksledere leveres via flere IV-doser), eller forskjeller i lengden på stoffeksponeringen (7 dager for forsøkslederadministrering, 19 dager for selvadministrering).

Til tross for den store mengden litteratur om ΔFosB og CaMKII i kokainvirkning, finnes det ingen studier av disse proteinene hos mennesker som bruker kokain. Her presenterer vi de første bevisene på at nivåene av både ΔFosB (p=0.0316; t=1.921; df=34) og CaMKII (p=0.0444; t=1.755; df=32) er økt i NAc hos kokainavhengige mennesker ( fig. 2D , tabell 1 ). Disse dataene indikerer at vår undersøkelse av ΔFosB- og CaMKII-induksjon av kokain i gnager-NAc er klinisk relevant for menneskers kokainavhengighet.

Tabell 1

Karakterisering av prøver fra menneskelige kokainavhengige og matchet kontrollgruppe

ΔFosB regulerer CaMKII-transkripsjon selektivt i D1-type MSNer av NAc Shell

Funnet om at både CaMKII og ΔFosB er oppregulert av kokain i gnagerens NAc, førte til at vi bestemte om ΔFosB kunne regulere transkripsjonen av CaMKII-genet. Vi hadde tidligere rapportert CaMKIIα som et mulig mål for ΔFosB i en objektiv mikroarray-analyse av NAc ( McClung og Nestler, 2003 ), men dette funnet ble ikke ytterligere validert i den studien. Vi brukte først kvantitativ ChIP (qChIP—ChIP etterfulgt av kvantitativ PCR) for å bestemme om ΔFosB binder seg til CaMKIIα-genpromotoren i NAc hos voksne hannrotter, og fant påfallende nok at denne bindingen økes betydelig ved kronisk kokainadministrasjon i skallet (p=0.0133; t=2.901; df=12), men ikke i kjerne-subregionen ( fig. 3A ). For å forstå mekanismene knyttet til denne subregionspesifikke forskjellen i ΔFosB-binding til CaMKIIα-promotoren ytterligere, brukte vi qChIP til å karakterisere tilstanden til histonmodifikasjoner i denne genomiske regionen. Tidligere studier viste kokaininduksjon av H3-acetylering ved CaMKIIα-promotoren i total mus-NAc ( Wang et al., 2010 ). I motsetning til dette fant vi at kokain reduserer H3-acetylering ved CaMKIIα-promotoren selektivt i NAc-kjernen ( fig. 3B ; p=0.0213; t=2.726; df=10), uten noen synlig endring i skallet, i samsvar med subregionspesifikke kromatinendringer utover ΔFosB-binding. qChIP for det repressive merket, dimetylert H3-lysin 9 (H3K9me2), avdekket trender for reduksjoner i både skall- og kjerne-subregionene ( fig. 3C ).

For å avgjøre om ΔFosB regulerer CaMKIIα-transkripsjon in vivo , benyttet vi to bitransgene muselinjer som induserbart overuttrykker ΔFosB spesifikt i D1- vs. D2-type MSN-er på en måte kontrollert av doksycyklin-administrasjon i drikkevann ( Chen et al., 1998 ; Kelz et al., 1999 ; Werme et al., 2002 ). Voksne hannmus som overuttrykte ΔFosB utelukkende i D1-type MSN-er hadde signifikant økte nivåer av CaMKIIα mRNA i NAc (p = 0.0337; t = 1.996; df = 13), en effekt som ikke sees hos mus som overuttrykte ΔFosB hovedsakelig i D2-type MSN-er ( fig. 3D ). Økningen i CaMKIIα mRNA, indusert av ΔFosB-ekspresjon i D1-type MSN-er, ble ledsaget av en samtidig økning i CaMKIIα-protein i både NAc-skallet (p = 0.0030; t = 3.578; df = 14) og kjernen (p = 0.0392; t = 2.275; df = 14; Fig. 3E og F ). Disse dataene viser at ΔFosB er i stand til å drive CaMKIIα-genekspresjon i D1-type MSN-er i begge underregioner, selv om figur 3B antyder at kokainmedierte kromatinendringer ved CaMKIIα-promotoren (f.eks. redusert acetylering) forhindrer ΔFosB i å oppregulere CaMKII i kjerne-subregionen etter kokain.

Fordi våre transgene musedata indikerte at ΔFosB-induksjon av CaMKII-genuttrykk er spesifikk for D1-type MSN-er i NAc, forsøkte vi deretter å bestemme om kokainavhengig oppregulering av CaMKII krever aktivering av D1-dopaminreseptoren. Voksne hannrotter fikk administrert kronisk kokain eller saltvann som før, men 30 minutter før hver injeksjon fikk rotter i kokaingruppen IP-injeksjon av saltvann, D1-antagonisten SCH 23390 (0.5 mg/kg) eller D2-reseptorantagonisten etikloprid (0.5 mg/kg). Dyrene ble analysert 24 timer etter den siste injeksjonen av kokain. Western blotting viste at D1-, men ikke D2-, antagonisten fullstendig blokkerte den kokainmedierte økningen i ΔFosB (p < 0.0001; F = 18.96; df = 18), som tidligere rapportert ( Nye et al., 1995 ), så vel som i CaMKII (p = 0.0005; F = 10.99; df = 18; Fig. 3G og H ). Disse dataene støtter hypotesen om at kokain engasjerer en ΔFosB-mediert økning i CaMKII-genuttrykk spesifikt i D1-type MSN-er i NAc-skallet. Det ville være viktig i fremtidige studier å demonstrere direkte denne celletypespesifikke effekten av kokain på CaMKII-uttrykk i denne hjerneregionen.

ΔFosB er både nødvendig og tilstrekkelig for kokaininduksjon av CaMKII i NAc Shell

For å utfylle bruken av bitransgene mus, studerte vi deretter rollen til ΔFosB i å mediere kokaininduksjon av CaMKIIα ved bruk av virusmediert genoverføring hos rotter. Vi injiserte bilateralt adeno-assosierte viruspartikler (AAV) i NAc-skallet til voksne hannrotter (der skallet kan målrettes selektivt) for å overuttrykke ΔFosB pluss GFP eller GFP alene. Dyrene fikk deretter en enkelt IP-injeksjon på 10 mg/kg kokain. Dyrene som overuttrykte ΔFosB/GFP viste en økt lokomotorisk respons sammenlignet med dyr som overuttrykte GFP alene ( fig. 4A ). 24 timer etter den enkle kokaininjeksjonen ble GFP-positivt NAc-vev fjernet fra disse dyrene ved disseksjon under en fluorescerende lyskilde. Western blotting av dette vevet ( fig. 4B og C ) viste sterk ΔFosB-overekspresjon samt en signifikant økning i totalt CaMKIIα-protein sammenlignet med GFP-dyr (p=0.0070; t=2.894; df=30), tilsvarende induksjonen sett ved kronisk kokainadministrasjon. I tillegg ble CaMKIIα-autofosforylering ved Thr286 (indikerer enzymaktivering) økt ved ΔFosB-overekspresjon (p=0.0330; t=2.243; df=28), i likhet med fosforylering av CaMKII-substratet, Ser831 av GluA1 (p=0.0540; t=2.012; df=28), som igjen etterligner virkningene av kronisk kokain ( fig. 1C og D ). Samlet sett gir disse dataene ytterligere bevis på at ΔFosB-ekspresjon i NAc-skallet er tilstrekkelig for lokomotorisk sensibilisering for kokain og for CaMKII-induksjon og -aktivering i denne subregionen.

Vi brukte en lignende tilnærming for å avgjøre om ΔFosB også er nødvendig for kokainmediert induksjon av CaMKIIα i NAc-skallet. AAV ble brukt til å overuttrykke et avkortet JunD-protein, kalt ΔJunD, som er en negativ regulator av ΔFosB transkripsjonsaktivering ( Winstanley et al., 2007 ) pluss GFP eller GFP alene. To uker senere, når transgenekspresjon er maksimal, fikk dyrene kokain (10 mg/kg) eller saltvann daglig i 7 dager, og testet for lokomotoriske responser på en kokainutfordring (5 mg/kg) 24 timer etter den siste kroniske injeksjonen ( fig. 4D ). ΔJunD-overekspresjon forhindret lokomotorisk sensibilisering for kokain, og forhindret også CaMKIIα-induksjon og -aktivering i NAc-skallet ( fig. 4E og F ; p=0.0437; F=2.997; total df=38), noe som indikerer at ΔFosB transkripsjonsaktivitet er nødvendig for kokainmediert induksjon av CaMKIIα i denne underregionen. Interessant nok fant vi at ΔJunD reduserte nivåene av ΔFosB under både saltvanns- og kokainbehandlede forhold (p = 0.0004; F = 8.110; df = 35), noe som øker den nye muligheten for at ΔFosB er avhengig av AP-1-aktivitet for sine egne uttrykknivåer.

CaMKII fosforylater ΔFosB ved Ser27

Ved hjelp av vitro proteinkinaseanalyser, bestemte vi at renset ΔFosB er et robust underlag for CaMKIIα. Inkubasjon av Hans₆-ΔFosB med CaMKIIα og ATP forårsaket en oppadgående forskyvning i elektroforetisk mobilitet av ΔFosB (Fig 5A); de flere resulterende bånd antydet flere fosforylasjonsseter. Lignende vitro kinaseanalyser ved bruk av [y-³²P] ATP viste inkorporering av radiomerket fosfat i de forskjøvede osFosB-båndene (Fig. 5B), som viser direkte fosforylering av proteinet. Vi genererte et fosfospesifikt antistoff mot den tidligere karakteriserte Ser27 av ΔFosB (Ulery et al., 2006). Selv om dette antistoffet ikke produserer et signal mot hjerneekstrakter som inneholder Ser27-fosforylerte ΔFosB (data ikke vist), var vi i stand til å oppdage Ser27 fosforylering i vitro kinase-analyse ved bruk av CaMKII (Fig. 5B). Kinetiske analyser av CaMKII fosforylering av ΔFosB indikerer at det er et potent underlag for kinasen (Fig. 5C), med en tilsynelatende K_M av 5.7 ± 2.0µM og K_CAT av 2.3 ± 0.3min^-1. Disse resultatene kan sammenlignes med mange godt karakteriserte in vivo underlag av CaMKII (Colbran og Brown, 2004). I tillegg bestemte vi at CaMKII fosforylater ΔFosB med en støkiometri på 2.27 ± 0.07 mol / mol (Fig 5D), noe som indikerer at det er minst tre steder med CaMKII-fosforylering i His₆-ΔFosB-protein, i avtale med Fig 5A.

For å undersøke individuelle fosforyleringssteder, brukte vi MS-analyser av prøver fra våre in vitro -kinaseanalyser. Figur 5E demonstrerer ΔFosB-fosforylering ved det tidligere karakteriserte Ser27 og ved flere tilleggssteder (data ikke vist). Gitt den tidligere funksjonelle karakteriseringen av Ser27, fokuserte vi på dette stedet ved å generere merkede syntetiske peptider som etterligner fosfo- og ikke-fosfotilstandene til Ser27, og deretter brukte vi kjente mengder av disse peptidene som standarder i MRM-analyser av ΔFosB før og etter in vitro -fosforylering av CaMKII. Etterfølgende kvantifisering ( figur 5F ) bekrefter at Ser27 er et potent substrat for CaMKII. Disse resultatene indikerer at blant flere fosforylerte rester i ΔFosB, er Ser27 et spesielt effektivt substrat for CaMKII.

CaMKII mekler kokainakkumulering av ΔFosB i NAc-skallet

Siden CaMKII kan fosforylere ΔFosB in vitro på et sted som dramatisk forbedrer stabiliteten in vitro og in vivo ( Ulery et al., 2006 ; Ulery-Reynolds et al., 2009 ), bestemte vi om CaMKII-aktivitet kontrollerer ΔFosB-nivåene i NAc in vivo . For å besvare dette spørsmålet brukte vi først en muselinje som overuttrykte en kalsiumuavhengig mutant av CaMKIIα (T286D) i flere hjerneområder, inkludert NAc ( Mayford et al., 1996 ; Kourrich et al., 2012 ). Vi injiserte aldersmatchede voksne hannmutanter og villtype-kullsøsken med 20 mg/kg kokain eller saltvann én gang daglig i 14 dager, og analyserte deretter dyrene én dag etter den siste injeksjonen. Vi fant at basalnivåene av ΔFosB var økt hos mutantdyrene i NAc-skall (p=0.0001; F=9.207; df=37), men ikke kjernen ( fig. 5G og H ). Overraskende nok ble kokainavhengig induksjon av ΔFosB blokkert i de mutante dyrene i både skall og kjerne, noe som tyder på at selv om CaMKII direkte kan regulere ΔFosB-stabilitet i NAc-skallet, kan det også ligge oppstrøms for ΔFosB i kokainaktiverte veier i begge NAc-underregionene.

CaMKII-aktivitet er påkrevd for ΔFosB-mediert strukturell og atferdsplastisitet

Kokaininduksjon av dendrittiske spines på NAc MSN-er er en av de best etablerte medikamentinduserte tilpasningene i denne hjerneregionen, og slik ryggradsinduksjon har vært korrelert med sensibiliserte atferdsresponser på stoffet ( Robinson og Kolb, 2004 ; Russo et al., 2010 ) og rapportert å være selektiv for D1-type MSN-er ( Lee et al., 2006 ). Vi har nylig vist at kokaininduksjon av dendrittiske spines i NAc er avhengig av ΔFosB og dens nedstrøms transkripsjonsprogram ( Maze et al., 2010 ). Selv om det finnes omfattende litteratur om involvering av CaMKII i dendrittiske spines morfologi og induksjon i andre hjerneregioner og eksperimentelle systemer ( Jourdain et al., 2003 ; Penzes et al., 2008 ; Okamoto et al., 2009 ), har dens rolle i NAc MSN-ryggradsdannelse ikke blitt studert. Derfor bestemte vi om CaMKII-aktivitet er nødvendig for ΔFosB-mediert induksjon av MSN-dendrittiske ryggradssøyler ved å bruke HSV-mediert overekspresjon av CaMKII-hemmerpeptidet AC3I fusjonert til GFP, en konstruksjon som tidligere har vist seg å hemme CaMKII-aktivitet in vivo ( Zhang et al., 2005 ; Klug et al., 2012 ). Viral overekspresjon av ΔFosB i NAc-skallet til voksne mus induserte en signifikant økning i MSN-dendrittisk ryggradstetthet (p < 0.0001; F = 8.558; df = 59; Fig. 6A og B ) som tidligere rapportert ( Maze et al., 2010 ), og denne økningen ble primært drevet av tynne (p = 0.0027; F = 5.319; df = 59) og korte (p = 0.0378; F = 2.988; df = 59) ryggradstyper (begge antatt å være umodne ryggradssøyler) ( Fig. 6C–E ). Ingen effekt ble observert på mer modne, soppformede pigger. Men når GFP-AC3I ble kouttrykt, ble ΔFosB-induksjon av pigger fullstendig opphevet ( fig. 6A–E ), noe som indikerer at CaMKII-aktivitet er nødvendig for ΔFosB-induksjon av dendrittiske pigger i NAc-skallet.

Deretter brukte vi de samme virale verktøyene for å bestemme om CaMKII-aktivitet er nødvendig for ΔFosBs effekter på atferdsfølsomhet for kokain. 72 timer etter viral injeksjon i NAc-skallet fikk dyrene en enkelt injeksjon på 5 mg/kg kokain, og deres lokomotoriske aktivitet ble registrert. Som tidligere vist med mer utvidet AAV-overekspresjon av ΔFosB ( fig. 4A ), økte HSV-mediert overekspresjon av ΔFosB den lokomotoriske følsomheten for kokain (p = 0.0002; F = 8.823; df = 37; fig. 6F ). Som med induksjon av dendrittiske spines, blokkerte hemming av CaMKII-aktivitet ved koekspresjon av GFP-AC3I fullstendig den ΔFosB-medierte økningen i kokainfølsomhet, noe som indikerer at CaMKII-aktivitet er nødvendig for ΔFosB-induserte endringer i kokains atferdseffekter.

Gå til:

Diskusjon

Denne studien skisserer en ny feed-forward-mekanisme der kokain induserer ΔFosB i NAc, noe som oppregulerer transkripsjonen av CaMKIIα-genet selektivt i NAc-skallet . CaMKIIα fosforylerer og stabiliserer deretter ΔFosB, noe som fører til større ΔFosB-akkumulering og ytterligere CaMKIIα-induksjon ( fig. 6G ). De samtidig økende nivåene av de to proteinene under kronisk eksponering for kokain bidrar deretter på essensielle måter til sensibiliserte atferdsresponser på stoffet. Dette er en spesielt tiltalende hypotese, ettersom både ΔFosB og CaMKII tidligere har blitt vist å være nødvendige for økte atferdsresponser på kokain ( Pierce et al., 1998 ; Peakman et al., 2003 ), og vi replikerer dette funnet for ΔFosB i NAc-skall spesifikt ved å bruke en viral tilnærming ( fig. 4 og 66 ).

Selv om transgen ΔFosB-overekspresjon i D1-type MSN-er kan drive CaMKII-induksjon i både NAc-skallet og kjernen hos kokain-naive dyr, driver akkumulering av endogent ΔFosB, som forekommer i begge underregionene, induksjon av CaMKII spesifikt i NAc-skallet i kokainsammenheng. Denne forskjellen kan relateres til de høyere nivåene av ΔFosB indusert i vår bitransgene modell, men den kan også gjenspeile kokainets evne til å endre CaMKIIα-promotoren i skall vs. kjerne-MSN-er differensielt for enten å fremme ΔFosB-binding i førstnevnte eller ekskludere den i sistnevnte underregion. Faktisk støtter våre ChIP-data, som avslører en kokainmediert deacetylering av histoner ved CaMKIIα-genpromotoren kun i NAc-kjernen, den mulige involveringen av en kromatinmekanisme. I tråd med denne hypotesen var ΔFosB-overekspresjon i D1-type MSN-er i stand til å drive CaMKIIα-induksjon i NAc-kjernen i fravær av kokain ( fig. 3F ), noe som tyder på at det finnes aktive modifikasjoner av CaMKIIα-promotoren som forhindrer denne induksjonen under kronisk kokaineksponering. Regulering av kromatinlandskapet ved CaMKII-promotoren kan også forklare hvorfor CaMKII induseres av en utfordringsdose kokain i NAc-skallet til rotter som kronisk abstinerer kokain ( fig. 1E ), men ikke hos medikamentnaive dyr ( fig. 1D ). Dette kan representere en epigenetisk "genpriming"-effekt av ΔFosB ( Robison og Nestler, 2011 ), og kan dermed være en molekylær mekanisme for inkubasjon av kokaintrang ( Pickens et al., 2011 ). For at denne kromatinendringen skal være årsakssammenhengende med inkubasjon av trangen, må den imidlertid øke over tid. Det vil være interessant å avgjøre om dette er tilfelle, og å studere om andre gener viser ΔFosB-avhengig, subregionspesifikk regulering av kokain. Det er også viktig å merke seg at feed-forward-sløyfen vi beskriver ikke fører til en endeløs akkumulering av CaMKII eller ΔFosB ( fig. 1E ); å avdekke den molekylære «bremsen» som er ansvarlig for dette er et viktig mål for fremtidige studier.

De kjente funksjonene til BFosB og CaMKII i flere eksperimentelle systemer og hjerneområder konvergerer på mange nivåer (Fig 6F). Begge molekylene er intimt knyttet til dendritisk ryggvekst: CaMKII interagerer med actincytoskjelettet (Okamoto et al., 2009), regulerer størrelsen på ryggraden (Matsuzaki et al., 2004), og er både nødvendig og tilstrekkelig for plastisitetsinduserte økninger i filopodia og synapsetall i hippocampal organotype skivekulturer (Jourdain et al., 2003), wHil ΔFosB er både nødvendig og tilstrekkelig for kokainindusert dendritisk ryggraddannelse i NAc MSNs (Maze et al., 2010). I tillegg har begge molekylene blitt assosiert med regulering av AMPA-glutamatreseptorer. CaMKII regulerer ikke totale nivåer av AMPA reseptor underenheter, men driver innsetting av AMPA reseptorer i synapser og øker AMPA kanal ledelse ved å fosforylere GluA1 ved Ser831 i hippocampal pyramidale nevroner i kultur og in vivo (gjennomgått i (Malinow og Malenka, 2002; Colbran og Brown, 2004)). Slik økt handel med GluA1 til synapsen har også vært involvert i kronisk kokainhandling (Boudreau og Wolf, 2005). Videre forbedres atferdsresponsene til AMPA-reseptoraktivering i NAc ved CaMKIIa-overuttrykk på en D1 dopaminreseptoravhengig måte (Singer et al., 2010). Det er vist at langsiktig D1-spesifikk overuttrykk av ΔFosB induserer GluA2-transkripsjon i NAc (Kelz et al., 1999), som demper AMPA-svar formidlet via GluA1, mens vi her viser at kortsiktig ΔFosB-overuttrykk — så vel som kortere-tids kokaineksponering - ikke har noen effekt på denne underenheten (fig 1). Likevel har vi funnet den siste tiden at kortsiktig ΔFosB-overuttrykk likevel reduserer AMPA-svar i D1-type MSN-er i NAc (Grueter et al., 2013). Disse dataene antyder midlertidig forskjellige mekanismer som kan utgjøre en tidsavhengig serie av nevroadaptasjoner til kokain som ligger til grunn for forskjellige aspekter av avhengighetsprogresjon som ennå ikke er godt forstått. På atferdsnivå er både CaMKII og ΔFosB påkrevd for lokomotorisk sensibilisering for kokain (se ovenfor), og begge er nødvendige for vedvarende selvadministrasjon av kokain i gnagere (Colby et al., 2003; Wang et al., 2010), noe som antyder at de to proteinene er viktige for både kortsiktige og langvarige atferdstilpasninger til medisineksponering, om enn via delvis distinkte underliggende mekanismer. Antagelig regulerer osFosB og CaMKII slike komplekse atferdstilpasninger gjennom endringer i NAc synaptisk funksjon, selv om det trengs mye ytterligere arbeid for direkte å koble synaptiske fenomener til atferdsendring.

CaMKII-holoenzymet samhandler samtidig med en rekke synapseassosierte proteiner ( Robison et al., 2005 ) som antas å regulere målretting mot postsynaptisk tetthet (PSD), et fenomen som antydes å være viktig for synaptisk plastisitet. Spesielt ble det nylig vist at interaksjonen mellom CaMKII og GluN2B-subenheten til NMDA-type glutamatreseptor regulerer både synaptisk plastisitet og læring ( Halt et al., 2012 ). Mens AC3I-peptidet etterligner det autoinhibitoriske domenet til CaMKII, og dermed hemmer enzymkatalytisk aktivitet, blokkerer det også flere protein-protein-interaksjoner ( Strack et al., 2000 ; Robison et al., 2005 ). Dermed kan de atferdsmessige og morfologiske effektene av HSV-GFP-AC3I som rapporteres her, oppstå gjennom redusert fosforylering av CaMKII-målproteiner, endringer i CaMKII-målretting eller en endring i CaMKIIs foreslåtte strukturelle rolle ved synapser ( Lisman et al., 2002 ).

Begrensningen av den foreslåtte ΔFosB-CaMKII-løkken til NAc-skallet er av spesiell betydning, ettersom nyere arbeid har vist flere fysiologiske forskjeller mellom NAc-skallet og kjernen som respons på kokainadministrasjon, en antagelse bekreftet av våre objektive iTRAQ-data (tabell S1). MSN-er i NAc-skallet viser en depresjon i avfyringskapasitet etter kronisk kokain som vedvarer i flere uker, mens kjerne-MSN-er fra de samme dyrene viser en forbigående (1–3 dager) økning i avfyringskapasitet som går tilbake til basale nivåer innen 2 uker ( Kourrich og Thomas, 2009 ). I tillegg er en rekke synaptiske proteiner differensielt regulert i NAc-skallet vs. kjernen hos dyr utsatt for kronisk kokain, inkludert GluA2 ( Knackstedt et al., 2010 ). Ettersom kronisk amfetamin induserer CaMKIIα spesifikt i NAc-skallet ( Loweth et al., 2010 ), er det ikke overraskende at vi finner en lignende effekt med kokain. Men ettersom ΔFosB induseres i både NAc-skallet og kjernen av kronisk kokain ( Perrotti et al., 2008 ), og siden vi viser at CaMKIIα-induksjon i skallet er ΔFosB-avhengig, gir funnene våre nye bevis for distinkte transkripsjonsmekanismer ved CaMKIIα-promotoren mellom disse to underregionene, som er ansvarlige for den selektive induksjonen av CaMKIIα i skallet.

Mye nyere arbeid har fokusert på å avgrense forskjeller mellom D1- og D2-type NAc MSN-er. Selv om både D1- og D2-reseptorer er involvert i de givende effektene av kokain ( Self, 2010 ), viser nyere arbeid at optogenetisk aktivering av D1-type MSN-er øker atferdsresponser på kokain, mens D2-type MSN-aktivering har motsatt effekt ( Lobo et al., 2010 ). I tråd med disse funnene har D1-reseptor knockout-mus mangelfulle evner til å tilegne seg kokain selvadministrasjon ( Caine et al., 2007 ), mens D2 knockouts ikke er det ( Caine et al., 2002 ). D1-agonistadministrasjon direkte inn i NAc utløser kokainsøkende atferd i gjeninnsettelsesparadigmer ( Self, 2010 ). Interessant nok krever denne effekten D1-reseptoravhengige økninger i CaMKII-aktivitet i NAc-skallet, men ikke kjernen ( Anderson et al., 2008 ), et resultat som stemmer godt overens med den D1- og skallspesifikke ΔFosB-CaMKII-løkken som foreslås her.

Vi har tidligere rapportert at Ser27 i ΔFosB kan fosforyleres av kasein kinase-2 ( Ulery et al., 2006 ). Vi slår imidlertid fast her at CaMKII fosforylerer ΔFosB på dette og andre steder med langt større kinetikk og støkiometri, og kan replikere den høyere tilsynelatende Mr _observert for ΔFosB ( fig. 5A ) ved kokaineksponering in vivo ( Nestler, 2008 ). Vi vet allerede at Ser27-fosforylering øker ΔFosB-stabilitet og transkripsjonsaktivitet ( Ulery et al., 2006 ; Ulery og Nestler, 2007 ; Ulery-Reynolds et al., 2009 ). Fremtidig arbeid vil nå fokusere på identifisering og de funksjonelle konsekvensene av nye steder for ΔFosB-fosforylering indikert av denne studien.

Den fremoverrettede løkken som beskrives her, gir en plausibel ny mekanisme der gjentatt administrering av kokain driver progressive abnormaliteter i NAc. Som sådan kan denne biokjemiske banen gi et viktig mål for fremtidig terapeutisk intervensjon i avhengighetslidelser. Fordi CaMKII er allestedsnærværende og nødvendig for mange basale nevrale og atferdsmessige funksjoner, har direkte bruk av CaMKII-hemmere blitt unngått som en avhengighetsbehandling. Våre data tyder på at mer subtil målretting av mekanismen for CaMKII-induksjon, som er spesifikk for en individuell celletype og subregion av hjernens belønningskretser, kan gi et terapeutisk mål som ville unngå komplikasjonene ved systemisk CaMKII-hemming.

Gå til:

Takk til

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institute on Drug Abuse (EJN), NIDA-Yale Proteomics Center DA018343 (AJR and EJN), og Hartwell Foundation (AJR). Forfatterne vil takke Gabby Rundenko for den generøse gaven til renset ΔFosB og Roger Colbran for den sjenerøse gaven til renset CaMKIIα.

Gå til:

Referanser

1. Ahmed SH, Koob GF. Overgang fra moderat til overdreven legemiddelinntak: endring i hedonisk settpunkt. Vitenskap. 1998, 282: 298-300. [PubMed]
2. Anderson SM, Famous KR, Sadri-Vakili G, Kumaresan V, Schmidt HD, Bass CE, Terwilliger EF, Cha JH, Pierce RC. CaMKII: en biokjemisk bro som kobler sammen dopamin og glutamatsystemer i kokain. Nat Neurosci. 2008, 11: 344-353. [PubMed]
3. Boudreau AC, Wolf ME. Atferdssensibilisering for kokain er assosiert med økt ytelse av AMPA reseptoroverflate i nucleus accumbens. J Neurosci. 2005, 25: 9144-9151. [PubMed]
4. Brickey DA, Colbran RJ, Fong YL, Soderling TR. Ekspresjon og karakterisering av alfa-underenheten til Ca2 + / calmodulin-avhengig proteinkinase II ved bruk av ekspresjonssystemet baculovirus. Biochem Biophys Res Commun. 1990, 173: 578-584. [PubMed]
5. Caine SB, Negus SS, Mello NK, Patel S, Bristow L, Kulagowski J, Vallone D, Saiardi A, Borrelli E. Rollen til dopamin D2-lignende reseptorer i selvadministrasjon av kokain: studier med D2-reseptmutante mus og nye D2-reseptorer antagonister. J Neurosci. 2002, 22: 2977-2988. [PubMed]
6. Caine SB, Thomsen M, Gabriel KI, Berkowitz JS, Gold LH, Koob GF, Tonegawa S, Zhang J, Xu M. Manglende selvadministrering av kokain i dopamin D1 reseptor knock-out mus. J Neurosci. 2007, 27: 13140-13150. [PMC gratis artikkel] [PubMed]
7. Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A, Nestler EJ. Proteasomavhengige og uavhengige mekanismer for FosB destabilisering: identifisering av FosB degron domener og implikasjoner for DeltaFosB stabilitet. Eur J Neurosci. 2007, 25: 3009-3019. [PubMed]
8. Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Transgene dyr med induktivt, målrettet genuttrykk i hjernen. Mol Pharmacol. 1998, 54: 495-503. [PubMed]
9. Christoffel DJ, Golden SA, Dumitriu D, Robison AJ, Janssen WG, Ahn HF, Krishnan V, Reyes CM, Han MH, Ables JL, Eisch AJ, Dietz DM, Ferguson D, Neve RL, Greengard P, Kim Y, Morrison JH , Russo SJ. IkappaB kinase regulerer sosialt nederlag stressindusert synaptisk og atferdsplastisitet. J Neurosci. 2011, 31: 314-321. [PMC gratis artikkel] [PubMed]
10. Colbran RJ. Inaktivering av Ca2 + / calmodulin-avhengig proteinkinase II ved basal autofosforylering. J Biol Chem. 1993, 268: 7163-7170. [PubMed]
11. Colbran RJ. Proteinfosfataser og kalsium / kalmodulinavhengig proteinkinase II-avhengig synaptisk plastisitet. J Neurosci. 2004, 24: 8404-8409. [PubMed]
12. Colbran RJ, Brown AM. Kalsium / calmodulin-avhengig proteinkinase II og synaptisk plastisitet. Curr Opin Neurobiol. 2004, 14: 318-327. [PubMed]
13. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW. Striatal celletype-spesifikk overekspresjon av DeltaFosB øker incitamentet til kokain. J Neurosci. 2003, 23: 2488-2493. [PubMed]
14. Covington HE, 3rd, Maze I, LaPlant QC, Vialou VF, Ohnishi YN, Berton O, Fass DM, Renthal W, Rush AJ, 3rd, Wu EY, Ghose S, Krishnan V, Russo SJ, Tamminga C, Haggarty SJ, Nestler EJ. Antidepressiva virkninger av histondeacetylasehemmere. J Neurosci. 2009, 29: 11451-11460. [PMC gratis artikkel] [PubMed]
15. Davalos A, Fernandez-Hernando C, Sowa G, Derakhshan B, Lin MI, Lee JY, Zhao H, Luo R, Colangelo C, Sessa WC. Kvantitativ proteomikk av caveolin-1-regulerte proteiner: karakterisering av polymerase i og transkript frigjøringsfaktor / CAVIN-1 IN endotelceller. Mol Cell Proteomics. 2010, 9: 2109-2124. [PMC gratis artikkel] [PubMed]
16. Dumais A, Lesage AD, Alda M, Rouleau G, Dumont M, Chawky N, Roy M, Mann JJ, Benkelfat C, Turecki G. Risikofaktorer for selvmords fullføring ved større depresjoner: en case-control studie av impulsiv og aggressiv atferd i menn. Am J Psykiatri. 2005, 162: 2116-2124. [PubMed]
17. Grueter BA, Robison AJ, Neve RL, Nestler EJ, Malenka RC. ΔFB modulerer differensielt kjernen accumbens direkte og indirekte veifunksjon. Proc Natl Acad Sci USA. 2013 i trykk. [PMC gratis artikkel] [PubMed]
18. Halt AR, Dallapiazza RF, Zhou Y, Stein IS, Qian H, Juntti S, Wojcik S, Brose N, Silva AJ, Hell JW. CaMKII-binding til GluN2B er kritisk under minnekonsolidering. EMBO J. 2012; 31: 1203 – 1216. [PMC gratis artikkel] [PubMed]
19. Hiroi N, Brown JR, Haile CN, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ. FosB-mutante mus: tap av kronisk kokaininduksjon av Fos-relaterte proteiner og økt følsomhet for kokainens psykomotoriske og givende effekter. Proc Natl Acad Sci US A. 1997; 94: 10397–10402. [PMC gratis artikkel] [PubMed]
20. Ito R, Robbins TW, Everitt BJ. Differensiell kontroll over kokain-søker atferd av nucleus accumbens kjerne og skall. Nat Neurosci. 2004, 7: 389-397. [PubMed]
21. Jorissen HJ, Ulery PG, Henry L, Gourneni S, Nestler EJ, Rudenko G. Dimerisering og DNA-bindende egenskaper av transkripsjonsfaktoren DeltaFosB. Biokjemi. 2007, 46: 8360-8372. [PubMed]
22. Jourdain P, Fukunaga K, Muller D. Kalsium / kalmodulinavhengig proteinkinase II bidrar til aktivitetsavhengig filopodiavekst og ryggdannelse. J Neurosci. 2003, 23: 10645-10649. [PubMed]
23. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ. Ekspresjon av transkripsjonsfaktoren deltaFosB i hjernen styrer følsomheten for kokain. Natur. 1999, 401: 272-276. [PubMed]
24. Klug JR, Mathur BN, Kash TL, Wang HD, Matthews RT, Robison AJ, Anderson ME, Deutch AY, Lovinger DM, Colbran RJ, Winder DG. Genetisk hemming av CaMKII i ryggstriatal medium spiny nevroner reduserer funksjonelle eksitatoriske synapser og forbedrer den intrinsiske eksitabiliteten. PLoS One. 2012, 7: e45323. [PMC gratis artikkel] [PubMed]
25. Knackstedt LA, Moussawi K, Lalumiere R, Schwendt M, Klugmann M, Kalivas PW. Ekstinasjonstrening etter selvadministrasjon av kokain induserer glutamatergisk plastisitet til å hemme kokain. J Neurosci. 2010, 30: 7984-7992. [PMC gratis artikkel] [PubMed]
26. Kourrich S, Thomas MJ. Tilsvarende nevroner, motsatte tilpasninger: psykostimulerende opplevelse endrer differensialt skyteegenskaper i accumbens kjerne kontra skall. J Neurosci. 2009, 29: 12275-12283. [PMC gratis artikkel] [PubMed]
27. Kourrich S, Klug JR, Mayford M, Thomas MJ. AMPAR-uavhengig effekt av Striatal alphaCaMKII fremmer sensibilisering av kokainbelønning. J Neurosci. 2012, 32: 6578-6586. [PMC gratis artikkel] [PubMed]
28. LaPlant Q, Chakravarty S, Vialou V, Mukherjee S, Koo JW, Kalahasti G, Bradbury KR, Taylor SV, Maze I, Kumar A, Graham A, Birnbaum SG, Krishnan V, Truong HT, Neve RL, Nestler EJ, Russo SJ . Rollen av nukleær faktor kappaB i eggstokkhormon-mediert stressoverfølsomhet hos hunnmus. Biol Psykiatri. 2009, 65: 874-880. [PMC gratis artikkel] [PubMed]
29. Lee KW, Kim Y, Kim AM, Helmin K, Nairn AC, Greengard P. Kokain-indusert dendritisk ryggradsdannelse i D1 og D2 dopaminreseptorholdige mellomstore, spiny nevroner i nukleobatterier. Proc Natl Acad Sci USA A. 2006; 103: 3399-3404. [PMC gratis artikkel] [PubMed]
30. Lisman J, Schulman H, Cline H. Det molekylære grunnlaget for CaMKII fungerer i synaptisk og atferdsminne. Nat Rev Neurosci. 2002, 3: 175-190. [PubMed]
31. Lobo MK, Covington HE, 3rd, Chaudhury D, Friedman AK, Sun H, Damez-Werno D, Dietz DM, Zaman S, Koo JW, Kennedy PJ, Mouzon E, Mogri M, Neve RL, Deisseroth K, Han MH, Nestler EJ. Celletypespesifikt tap av BDNF-signalering etterligner optogenetisk kontroll av kokainbelønning. Vitenskap. 2010, 330: 385-390. [PMC gratis artikkel] [PubMed]
32. Loweth JA, Baker LK, Guptaa T, Guillory AM, Vezina P. Inhibering av CaMKII i nucleus accumbens skall reduserer forbedret amfetamininntak hos sensibiliserte rotter. Neurosci Lett. 2008, 444: 157-160. [PMC gratis artikkel] [PubMed]
33. Loweth JA, Singer BF, Baker LK, Wilke G, Inamine H, Bubula N, Alexander JK, Carlezon WA, Jr, Neve RL, Vezina P. Forbigående overuttrykk av alpha-Ca2 + / calmodulin-avhengig proteinkinase II i kjernens accumbens-skall forbedrer atferdsmessige reaksjoner på amfetamin. J Neurosci. 2010, 30: 939-949. [PMC gratis artikkel] [PubMed]
34. Malinow R, Malenka RC. AMPA-resepthandel og synaptisk plastisitet. Annu Rev Neurosci. 2002, 25: 103-126. [PubMed]
35. Matsuzaki M, Honkura N, Ellis-Davies GC, Kasai H. Strukturell basis for langvarig forsterkning i single dendritic spines. Natur. 2004, 429: 761-766. [PubMed]
36. Mayford M, Bach ME, Huang YY, Wang L, Hawkins RD, Kandel ER. Kontroll av minnedannelse gjennom regulert ekspresjon av et CaMKII-transgen. Vitenskap. 1996, 274: 1678-1683. [PubMed]
37. Maze I, Covington HE, 3rd, Dietz DM, LaPlant Q, Renthal W, Russo SJ, Mekaniker M, Mouzon E, Neve RL, Haggarty SJ, Ren Y, Sampath SC, Hurd YL, Greengard P, Tarakhovsky A, Schaefer A, Nestler EJ. Viktig rolle av histon-metyltransferasen G9a i kokaininducert plastisitet. Vitenskap. 2010, 327: 213-216. [PMC gratis artikkel] [PubMed]
38. McClung CA, Nestler EJ. Regulering av genuttrykk og kokainbelønning av CREB og DeltaFosB. Nat Neurosci. 2003, 6: 1208-1215. [PubMed]
39. Nestler EJ. Anmeldelse. Transkripsjonelle avhengighetsmekanismer: DeltaFosBs rolle. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008, 363: 3245-3255. [PMC gratis artikkel] [PubMed]
40. Nye HE, Håper BT, Kelz MB, Iadarola M, Nestler EJ. Farmakologiske studier av regulering av kronisk FOS-relatert antigeninduksjon av kokain i striatum og nucleus accumbens. J Pharmacol Exp Ther. 1995, 275: 1671-1680. [PubMed]
41. Okamoto K, Bosch M, Hayashi Y. Rollene til CaMKII og F-actin i strukturell plastisitet av dendritiske ryggrader: en potensiell molekylær identitet av en synaptisk tagg? Fysiologi (Bethesda) 2009; 24: 357 – 366. [PubMed]
42. Olausson P, Jentsch JD, Tronson N, Neve RL, Nestler EJ, Taylor JR. DeltaFosB i kjernen accumbens regulerer matforsterket instrumentell oppførsel og motivasjon. J Neurosci. 2006, 26: 9196-9204. [PubMed]
43. Paxinos G, Watson C. Rottehjernen i stereotaksiske koordinater. 6th utgave. Amsterdam; Boston: Academic Press / Elsevier; 2007.
44. Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E. Inducible, hjernegionspesifikke uttrykk for en dominant negativ mutant av c-Jun i transgene mus reduserer følsomheten for kokain. Brain Res. 2003, 970: 73-86. [PubMed]
45. Penzes P, Cahill ME, Jones KA, Srivastava DP. Konvergente CaMK- og RacGEF-signaler styrer dendritisk struktur og funksjon. Trender Cell Biol. 2008, 18: 405-413. [PubMed]
46. Perrotti LI, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ. Induksjon av deltaFosB i belønningsrelaterte hjernestrukturer etter kronisk stress. J Neurosci. 2004, 24: 10594-10602. [PubMed]
47. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. Distinkte mønstre av DeltaFosB induksjon i hjernen av misbruk. Synapse. 2008, 62: 358-369. [PMC gratis artikkel] [PubMed]
48. Pickens CL, Airavaara M, Theberge F, Fanous S, Hope BT, Shaham Y. Neurobiology of incubation of drug craving. Trender Neurosci. 2011, 34: 411-420. [PMC gratis artikkel] [PubMed]
49. Pierce RC, Quick EA, Reeder DC, Morgan ZR, Kalivas PW. Kalsiumformidlede andre budbringere modulerer uttrykket av atferdsfølsomhet for kokain. J Pharmacol Exp Ther. 1998, 286: 1171-1176. [PubMed]
50. Quirion R, Robitaille Y, Martial J, Chabot JG, Lemoine P, Pilapil C, Dalpe M. Autoradiografi på hjernreseptor ved bruk av hele halvkule-seksjoner: en generell metode som minimerer vevsgjenstander. Synapse. 1987, 1: 446-454. [PubMed]
51. Robinson TE, Kolb B. Strukturell plastisitet forbundet med eksponering for rusmidler. Neuropharmacology. 2004; 47 (Suppl 1): 33-46. [PubMed]
52. Robison AJ, Nestler EJ. Transkripsjonelle og epigenetiske avhengighetsmekanismer. Nat Rev Neurosci. 2011, 12: 623-637. [PMC gratis artikkel] [PubMed]
53. Robison AJ, Bass MA, Jiao Y, MacMillan LB, Carmody LC, Bartlett RK, Colbran RJ. Multivalente interaksjoner av kalsium / calmodulin-avhengig proteinkinase II med de postsynaptiske tetthetsproteinene NR2B, densin-180 og alpha-actinin-2. J Biol Chem. 2005, 280: 35329-35336. [PubMed]
54. Ross PL, Huang YN, Marchese JN, Williamson B, Parker K, Hattan S, Khainovski N, Pillai S, Dey S, Daniels S, Purkayastha S, Juhasz P, Martin S, Bartlet-Jones M, He F, Jacobson A, Pappin DJ. Multipleksert proteinkvantifisering i Saccharomyces cerevisiae ved bruk av amin-reaktive isobariske merkingsreagenser. Mol Cell Proteomics. 2004, 3: 1154-1169. [PubMed]
55. Russo SJ, Dietz DM, Dumitriu D, Morrison JH, Malenka RC, Nestler EJ. Den avhengige synaps: mekanismer av synaptisk og strukturell plastisitet i kjernen accumbens. Trender Neurosci. 2010, 33: 267-276. [PMC gratis artikkel] [PubMed]
56. Selv DW. I: Dopaminreseptorene. Neve KA, redaktør. New York: Humana Press; 2010. s. 479 – 524.
57. Singer BF, Loweth JA, Neve RL, Vezina P. Forbigående viral-mediert overuttrykk av alfa-kalsium / calmodulin-avhengig proteinkinase II i nucleus accumbens skall fører til langvarig funksjonell oppregulering av alfa-amino-3-hydroxyl-5 -metyl-4-isoksazol-propionatreseptorer: dopamin-type-1-reseptor og proteinkinase A-avhengighet. Eur J Neurosci. 2010, 31: 1243-1251. [PMC gratis artikkel] [PubMed]
58. Strack S, McNeill RB, Colbran RJ. Mekanisme og regulering av kalsium / calmodulin-avhengig proteinkinase II målrettet mot NR2B-underenheten til N-metyl-D-aspartat reseptoren. J Biol Chem. 2000, 275: 23798-23806. [PubMed]
59. Ulery-Reynolds PG, Castillo MA, Vialou V, Russo SJ, Nestler EJ. Fosforylering av DeltaFosB formidler stabiliteten in vivo. Neuroscience. 2009, 158: 369-372. [PMC gratis artikkel] [PubMed]
60. Ulery PG, Nestler EJ. Regulering av DeltaFosB transkripsjonell aktivitet ved Ser27 fosforylering. Eur J Neurosci. 2007, 25: 224-230. [PubMed]
61. Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ. Regulering av DeltaFosB stabilitet ved fosforylering. J Neurosci. 2006, 26: 5131-5142. [PubMed]
62. Vialou V, et al. DeltaFosB i hjernebelønningskretser formidler motstandskraft mot stress og antidepressiva responser. Nat Neurosci. 2010, 13: 745-752. [PMC gratis artikkel] [PubMed]
63. Wang L, Lv Z, Hu Z, Sheng J, Hui B, Sun J, Ma L. Kronisk kokain-indusert H3-acetylering og transkripsjonell aktivering av CaMKIIalpha i nucleus accumbens er avgjørende for motivasjon for medikamentell forsterkning. Neuropsychopharmacology. 2010, 35: 913-928. [PMC gratis artikkel] [PubMed]
64. Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S. Delta FosB regulerer hjulkjøring. J Neurosci. 2002, 22: 8133-8138. [PubMed]
65. Winstanley CA, LaPlant Q, Theobald DE, Green TA, Bachtell RK, Perrotti LI, DiLeone RJ, Russo SJ, Garth WJ, Self DW, Nestler EJ. DeltaFosB-induksjon i orbitofrontal cortex medierer toleranse mot kokain-indusert kognitiv dysfunksjon. J Neurosci. 2007, 27: 10497-10507. [PubMed]
66. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchman T, Berton O, Sim-Selley LJ, Dileone RJ, Kumar A, Nestler EJ. En viktig rolle for DeltaFosB i kjernen accumbens i morfin handling. Nat Neurosci. 2006, 9: 205-211. [PubMed]
67. Zhang R, Khoo MS, Wu Y, Yang Y, Grueter CE, Ni G, Price EE, Jr, Thiel W, Guatimosim S, Song LS, Madu EC, Shah AN, Vishnivetskaya TA, Atkinson JB, Gurevich VV, Salama G, Lederer WJ, Colbran RJ, Anderson ME. Calmodulin kinase II-hemming beskytter mot strukturell hjertesykdom. Nat Med. 2005, 11: 409-417. [PubMed]