Økt aktivitet av cyklinavhengig kinase 5 fører til demping av kokainmediert dopamin-signalering (2005)

Abstrakt

Kokain øker synaptiske dopaminnivåer i striatum og endrer genuttrykk i dopaminceptive nevroner ved å aktivere intracellulære veier som propagerer det opprinnelige signalet fra dopamin D1-reseptoren til kjernen (1). Kronisk eksponering for kokain oppregulerer flere transkripsjonsfaktorer, noe som resulterer i de langsiktige endringene i genuttrykk som antas å underbygge nevrale tilpasninger i kokainavhengighet (2). ΔFosB, identifisert som en slik transkripsjonsfaktor (3), har vist seg å øke adferdsmessig reaksjon hos dyr til kokain (4, 5). Derfor forventes identifisering av målgenene som reguleres av ΔFosB-induksjon, å bidra til en større forståelse av den molekylære mekanismen som ligger til grunn for kokainavhengighet. Nylig har kronisk behandling av dyr med kokain vist seg å regulere uttrykket av syklin-avhengig kinase 5 (Cdk5) og dets aktivator p35 i striatumet gjennom induksjon av ΔFosB (6, 7).

Cdk5 er medlem av Cdk-familien av serin / treoninkinaser. I motsetning til andre Cdks som er store regulatorer av cellecyklusprogresjon, er Cdk5 hovedsakelig involvert i fosforylering av substrater i postmitotiske nevroner (8). Nevnte spesifisering av Cdk5-aktivitet oppnås gjennom forbindelsen med dens aktivatorer, enten p35 eller p39, som overveiende uttrykkes i postmitotiske nevroner (8). I tillegg til den viktige rollen som Cdk5 i hjernens utvikling (9, 10), Jegt har også blitt involvert i dopaminerg transmisjon i postnatal hjerne (11, 12). Inhibering av Cdk5-aktivitet resulterer i økt dopaminfrigivelse i striatum, hvilket indikerer en presynaptisk funksjon av Cdk5 som en negativ regulator for dopaminfrigivelse (11). Videre modulerer Cdk5 effekten av postsynaptisk dopamin-signalering ved fosforylering av dopamin- og cAMP-regulert fosfoprotein, molekylær masse 32 kDa (DARPP-32) ved Thr-75, som omdanner DARPP-32 til en inhibitor av cAMP-avhengig kinase (PKA) (12).

Disse observasjonene antyder at Cdk5 og p35 er nedstrøms regulatorer av langvarig aktivering av dopamin-signalering etter kronisk eksponering for kokain og dermed i kokainavhengighet. For å ytterligere adressere rollen som Cdk5 på striatal dopamin-signalering, genererte vi to transgene muselinjer hvor enten Cdk5 eller p35 ble overuttrykt spesielt i nevroner under kontroll av p35-promotoren. Våre funn indikerte at Cdk5-aktiviteten var oppregulert med økte nivåer av p35-protein, men ikke Cdk5-protein, noe som tyder på at nivået av p35-protein er hastighetsbegrensende for Cdk5-aktivitet. Vi gir deg her in vivo bevis for økt Cdk5 aktivitet, som et resultat av p35 overekspresjon, fører til demping av kokainmediert dopamin-signalering til kjernen gjennom en inhibering av PKA og ekstracellulær signalregulert kinase (ERK) -kaskader.

Materialer og metoder

Antistoffer. Polyklonale antistoffer mot Cdk5 (C-8) og p35 (C-19) ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology. De fosforyleringsavhengige og -hengige antistoffene til ERK-kinase (MEK) 1 / 2, ERK1 / 2 og cAMP-responselement-bindende protein (CREB) ble oppnådd fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Antistoffene til fosfor-Thr-34 DARPP 32 (13), fosfor-Thr-75 DARPP-32 (12), totalt DARPP-32 (12), og c-fos (14) ble brukt som beskrevet. Et antistoff mot actin ble kjøpt fra Sigma.

Eksperimentelle dyr. Vi klonte tidligere musen p35 genet Cdk5r1, som koder for p35-protein, og karakteriserte dets genomiske struktur (15). For å generere den transgene musen med neuronal overekspresjon av p35 (Tgp35), 6-kb EcoRIEcoRI-fragmentet som inneholdt 1.2-kb-promotorområdet ble subklonet inn i en pGEM9Z (-) plasmid, og en 45-bp-tag avledet fra SV40 ble satt inn i KPNJeg stedet nedstrøms for poly (A⁺) signal (Fig. 1A). Merket inneholdt a SpeJeg er lokal for genotyping av dyrene. 6-kb-fragmentet ble skåret fra plasmidet og renset, fulgt av pronukleær injeksjon av transgenet for å generere de transgene musene. For å undersøke transgenes ekspressjonsprofil under regulatorisk kontroll av 1.2-kb p35-promotoren in vivo, ble en dobbelt transgen mus (Tgp35; p35 - / -) videre generert ved bruk av en to-trinns avlsstrategi hvorved Tgp35-musen ble regenerert i en endogen p35-null-bakgrunn. De andre musemodellene som ble benyttet i denne studien, omfattet p35 +/-, p35 - / -, Cdk5 +/- og en transgen mus med neuronal overekspresjon av Cdk5 (TgCdk5) (9, 16, 17). Genotyper av disse musene ble bestemt ved å utføre enten Southern blot-analyse eller PCR på genomisk DNA isolert fra halebiopsiene. Mus ble plassert under en 12-h lys / 12-h mørk syklus. All omsorg ble gitt i samsvar med National Institutes of Health retningslinjer om pleie og bruk av laboratorie- og eksperimentelle dyr.

  

Fig. 1.

Generering av transgen mus med neuronal overekspresjon av p35 regissert av p35-promotoren (Tgp35). (A) Transgenkonstruksjonen er vist med de skjematiske strukturer av villtype og målrettede p35-alleler. Røde stolper indikerer sonden som brukes til genotyping. ...

Southern Blot Analysis. Genomisk DNA ekstrahert fra halebiopsier ble fordøyd med EcoRI og SpeJeg, elektroforesert på en 0.9% agarosegel, og overføres til en nylonmembran. Membranen ble hybridisert med en random-primet ³²P-merket probe ved 42 ° C over natten. 485-bp-sonden for genotyping av p35 knockout (p35 - / -) og Tgp35-mus ble generert ved PCR ved bruk av følgende primere: 5'-ACATCCTGCTGCCACGGTGAC-3 'og 5'-CCACTGTAAAAGCAACAAGA-3'. Den hybridiserte membranen ble vasket to ganger i 2 × SSC / 0.1% SDS ved 42 ° C for 10 min og to ganger i 0.1 × SSC / 0.1% SDS ved 65 ° C for 20 min og eksponert for røntgenfilm.

Narkotikabehandling. Kokain (Sigma) ble oppløst i steril saltløsning. Dyr ble ip-injisert med kokain (15 mg / kg) eller et likeverdig saltoppløsning i en alder av 3 måneder og drept ved avtapping ved forskjellige tidspunkter (15, 30, 60 og 120 min) etter injeksjonen. Hjerner ble raskt fjernet og avkjølt i iskald PBS. Den striata ble deretter dissekert og utsatt for nordlig eller vestlig blottanalyse. For immunohistokjemisk analyse ble striatal seksjoner oppnådd fra mus 2 h etter injeksjonen.

Northern Blot Analysis. Totalt RNA ble ekstrahert fra striata med TRIzol-reagens (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) og underkastet Northern blot-analyse som beskrevet (18). Til påvisning av c-fos mRNA ble et 189-bp-fragment av muse-c-fos-cDNA anvendt som en probe som beskrevet (19). Nivåene av c-fos mRNA ble kvantifisert ved å måle den optiske tettheten til det spesifikke båndet ved å bruke et bildeanalysesystem med nih bildeprogramvare, versjon 1.62.

Western Blot Analysis. Striatale vev ble sonikert i 1% SDS og kokt for 10 min. Proteinkonsentrasjonen i hver prøve ble bestemt ved BCA-proteinanalyse (Pierce). Like mengder protein ble separert med SDS / PAGE før de ble overført til en nitrocellulosemembran. Membranene ble blokkert i 1 × PBS som inneholdt 5% skummet melk og 0.05% Tween 20 og inkubert med primære antistoffer over natten ved 4 ° C. Inkubasjon med peroksidase-konjugert anti-mus eller kanin-IgG (Sigma) ble utført ved romtemperatur for 60 min. Et signal ble påvist ved forbedret kjemiluminescens (Pierce), og de optiske densiteter av båndene ble kvantifisert som beskrevet ovenfor.

Cdk5 Kinase Assay. Striatallysater ble fremstilt med en lyseringsbuffer bestående av 50 mM Tris · HCl, pH 7.4 / 50 mM NaCl / 5 mM EDTA / 1% Triton X-100 / 1mMDTT / 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid / 1 μg / ml aprotinin / 1 μg / ml leupeptin / fosfataseinhibitorer (fosfataseinhibitorblanding I og II, Sigma). Lysatene ble immunpresipitert med enten anti-Cdk5 (C-8) eller anti-p35 (C-19) antistoffer. Cdk5 immunoprecipitatene ble fremstilt ved inkubering av 300 μl av lysatet (tilsvarende 300 μg protein) med anti-Cdk5 antistoff (3 μg) over natten ved 4 ° C etterfulgt av ytterligere inkubering med 25 μl Protein A-agarose perler (50 % oppslemming i lysisbufferen; Santa Cruz Biotechnology) for 3 h ved 4 ° C. For fremstilling av p35 immunoprecipitater ble 500 μl av lysatet (tilsvarende 1 mg protein) inkubert med anti-p35 antistoff (3 μg) som beskrevet ovenfor. Immunprecipitatene ble vasket to ganger med lyseringsbufferen og to ganger med en kinasebuffer bestående av 50 mM Tris · HC1, pH 7.4 / 5 mM MgCl₂/ 1 mM EDTA / 1 mM EGTA / 1 mM DTT, resuspendert i 60 μl av kinasebufferen. Kinaseaktivitet ble målt ved bruk av histon H1 som substrat (18).

Immunhistokjemi. Mus ble anestetisert av ip-injeksjoner av avertin (250 mg / kg, Fluka) og perfusert transcartielt med 0.1 M natriumfosfatbuffer, pH 7.4, etterfulgt av Streck Tissue Fixative (Streck Laboratories, La Vista, NE), et ikke-kryssbindende fikseringsmiddel. Disseksjonerte hjerner ble ytterligere fikset i samme fikseringsmiddel natten over ved 37 ° C. Derefter ble hjernen innebygd i paraffin, kuttet i 5-μm-tykke koronale seksjoner og utsatt for immunhistokjemi ved bruk av avidin-biotin-peroxidase-kompleksteknikk (Vector Laboratories) med diaminobenzidin som substrat. Seksjonene ble inkubert med et affinitetsrenset polyklonalt antistoff mot c-fos natten over ved 4 ° C. Fargepesifisiteten ble vurdert ved utelatelse av det primære antistoff.

Resultater

Generering av transgene mus med neuronal overekspresjon av p35. Transgenet som ble brukt for å oppnå økt neuronal ekspresjon av p35, omfattet 6-kb-fragmentet av det klonede mus-p35-genet som inneholdt 1.2-kb-promotoren og hele kodningssekvensen av p35 (Fig. 1 A). Genotypene til mus ble bestemt ved Southern blot-analyse ved bruk av en probe som var designet for å skille p35- / - og Tgp35-mus fra villtype-mus (Fig. 1 A og B). For å undersøke transgenuttrykket under kontroll av 1.2-kb p35-promotoren, genererte vi dobbelt-transgene mus (Tgp35; p35 - / -) hvor p35-uttrykk ble drevet bare fra transgenet. P35-uttrykket i Tgp35; p35 - / - mus ble observert bare i hjernen (Fig. 1C), hvor romlig ekspresjon mønsteret var lik den for wild-type mus (Fig. 1D). Mangel på p35 har vist seg å resultere i unormal lagringsstruktur i hjernebarken og hippocampus av mus (10). Imidlertid viste Tgp35; p35 - / - musene en fullstendig redning av p35 - / - hjernefenotypen (Fig. 1E). Disse data indikerte at 1.2-kb p35-promoteren kontrollerte ekspresjonen av transgenet med en lignende uttrykksprofil som den for p35 fra det endogene p35-genet.

P35 Protein Level er ratebegrensning for oppregulering av Cdk5 aktivitet. Vi undersøkte gendoseffekter av gener som koder for p35 og Cdk5 på proteinuttrykk i striataltrekk fra p35 - / -, p35 +/-, wildtype, Tgp35, Cdk5 +/- og TgCdk5-mus i alderen av 3 måneder. Nivåene av p35 og Cdk5 protein korrelerte godt med henholdsvis gendoseringene (Fig. 2 A og B). Tgp35-mus viste en ≈1.6-foldig økning i p35-proteinnivå sammenlignet med villtype-mus, mens Cdk5-proteinnivåene var upåvirket av de forskjellige nivåer av p35-protein. TgCdk5-mus viste en ≈1.9-foldig økning i Cdk5 proteinnivå sammenlignet med villtype mus, mens p35 proteinnivåene var upåvirket av de forskjellige nivåene av Cdk5 protein. For å undersøke virkningen av forskjellige mengder p35-protein på Cdk5-aktivitet, ble Cdk5 immunpresipitert fra striatalekstrakter med anti-Cdk5-antistoff og kinaseaktivitet ble målt. På samme måte for å undersøke virkningen av forskjellige mengder Cdk5 protein på kinaseaktivitet, ble p35 immunutfellet fra striatalekstrakter med anti-p35-antistoff, og kinaseaktivitet ble målt. Cdk5 aktivitet korrelerte godt med nivået av p35 protein, men ikke med nivået av Cdk5 protein (Fig. 2 C og D). Disse resultatene indikerte at mengden p35-protein er en hastighetsbegrensende faktor for Cdk5-aktivitet. Vi brukte derfor Tgp35-mus for å undersøke effektene av økt Cdk5 aktivitet på striatal dopamin signalering.

  

Fig. 2.

Oppregulering av Cdk5-aktivitet er avgiftsbegrenset av p35-proteinnivået. (A) Western blott viser at proteinnivåene av p35 og Cdk5 korrelerer med gendoseringene av henholdsvis p35 og Cdk5-gener. (B) Relative nivåer av p35 eller Cdk5 protein ...

Kokaininducert fosforylering av DARPP-32 ved Thr-34 blir dempet i Tgp35-mus. Funksjonen til DARPP-32 avhenger av dens fosforyleringstilstand på flere steder (20). PKA fosforylerer DARPP-32 ved Thr-34, mens Cdk5 fosforylerer DARPP-32 ved Thr-75. Dermed undersøkte vi fosforyleringstilstanden til DARPP-32 i striatalekstrakter fra villtype og Tgp35-mus. Nivået av fosfor-Thr-75 DARPP-32 var høyere i Tgp35-mus (Fig. 3A; 1.6 ± 0.2-fold over verdien av villtype mus). Vi vurderte følgelig effekten av økt Cdk5 aktivitet på striatal dopamin signalering. Vi undersøkte kokaininducert PKA-aktivering i Tgp35-mus ved å analysere fosforyleringstilstanden for DARPP-32 ved Thr-34. Nivået av fosfor-Thr-34 DARPP-32 ble økt i wild-type mus 15 min etter kokaininjeksjonen (Fig. 3B; 1.8 ± 0.2-fold over basalnivået). Effekten av kokain på Thr-34-fosforylering av DARPP-32 ble imidlertid dempet i Tgp35-mus (1.2 ± 0.3-fold over basalnivået). Disse resultatene indikerte at en økning av Cdk5 aktivitet dempet kokaininducert PKA-aktivering sannsynligvis gjennom DARPP-32-fosforyleringen ved Thr-75 (6, 12). Det er også mulig at en økning i presynaptisk Cdk5-aktivitet fører til redusert dopaminfrigivelse, og at dette bidrar til redusert effekt av kokain. Spesielt påvirket en enkelt injeksjon av kokain ikke nivåene av p35 og Cdk5 protein, så vel som kinaseaktiviteten (Fig. 3 C og D). Dette er i kontrast til en tidligere studie hvor kronisk eksponering for kokain har vist seg å oppregulere uttrykket av p35 og Cdk5 (6).

  

Fig. 3.

Oppregulering av Cdk5-aktivitet øker nivået av fosfor-Thr-75 DARPP-32 og demper kokaininducert PKA-aktivering. (A) Immunoblot som viser økt fosforylering av DARPP-32 ved Thr-75 (P-D32 Thr-75) i striatalekstrakter fra Tgp35-mus. I ...

Oppregulering av Cdk5-aktivitet demper kokein-inducert aktivering av ERK1 / 2. Nylige bevis indikerer at dopaminreceptoraktivering i striatumen også aktiverer andre signaleringskaskader, inkludert ERK-banen (21, 22), som har en viktig rolle i atferdsresponsen mot kokain (23). Vi undersøkte derfor om Cdk5-aktivitet kan påvirke den kokaininducerte aktiveringen av ERK-banen. Aktivering av ERK-banen ble observert etter kokaininjeksjon i striatale ekstrakter fra wild-type mus, som fremgår av økt fosforylering av MEK1 / 2 ved Ser-217 og Ser-221 (1.5 ± 0.2-fold over basalnivået) og av ERK1 / 2 ved Thr-202 og Tyr-204 (ERK2-fosforylering: 1.5 ± 0.2-fold over basalnivået) (Fig. 4 A og B). Den kokaininducerte aktiveringen av MEK1 / 2 (1.2 ± 0.2-fold over basalnivået) og av ERK1 / 2 (ERK2-fosforylering: 1.2 ± 0.2-fold over basalnivået) ble imidlertid dempet i Tgp35-mus (Fig. 4 A og B). Videre var de basale nivåene av fosfor-ERK1 / 2 lavere i Tgp35-mus (0.8 ± 0.2-fold under verdien av wild-type mus), mens denne trenden ikke var statistisk signifikant. Dette sistnevnte resultat kan tilskrives Cdk5-avhengig fosforylering av MEK1 ved Thr-286, noe som resulterer i en reduksjon av den katalytiske aktiviteten (24). For å vurdere denne muligheten, undersøkte vi fosforyleringstilstanden til MEK1 ved Thr-286 og fant at høyere nivåer av fosfon-Thr-286 MEK1 var tilstede i striatalekstrakter fra Tgp35-mus (Fig. 4C; 1.3 ± 0.1-fold over verdien av villtype mus). Videre ble fosforyleringstilstanden for MEK1 ved Thr-286 ikke endret ved en enkelt injeksjon av kokain, i samsvar med funnet at Cdk5-aktivitet ikke var påvirket av behandlingen (Fig. 3D).

  

Fig. 4.

Cdk5-mediert inhibering av MEK1 / 2 fører til demping av kokaininducert aktivering av ERK1 / 2. Striatale ekstrakter ble fremstilt fra villtype (WT) og Tgp35-mus 15 min etter injeksjon av enten kokain eller saltvann og utsatt for immunoblotting ...

Forplantning av dopamin-signalering til nucleuset blir dempet av økt Cdk5-aktivitet. Kokaininducert aktivering av multiple signaleringskaskader involverende PKA og ERK fører til påfølgende aktivering av transkripsjonsfaktoren CREB i kjernen gjennom dens fosforylering ved Ser-133 (22, 25). For å undersøke om Cdk5-medierte hemmende effekter på PKA- og ERK-aktiveringskaskader kan konvergere på CREB-fosforylering i kjernen, undersøkte vi fosforyleringstilstanden til CREB ved Ser-133 i striatalekstrakter fra villtype og Tgp35-mus. Det basale nivået av fosfor-CREB var lavere i Tgp35-mus (0.7 ± 0.1-fold av verdien av villtype-mus) (Fig. 5). Som svar på injeksjon av kokain økte nivået av fosfor-CREB i striatum av wild-type mus (1.5 ± 0.1-fold over basalnivået), men dette svaret på kokain ble dempet i Tgp35-mus (1.2 ± 0.1- brett over basalnivået) (Fig. 5).

  

Fig. 5.

Oppregulering av Cdk5-aktivitet resulterer i redusert fosforylering av CREB ved Ser-133 hos mus med injeksjon av enten saltvann eller kokain. Striatale ekstrakter ble fremstilt fra wild-type (WT) og Tgp35-mus 30 min etter injeksjon og utsatt for immunoblotting ...

Fosforylering av CREB ved Ser-133 forsterker sin transkripsjonsaktivitet via et cAMP-responselement i promoterregionen av visse gener, inkludert c-fos-genet (26). Vi undersøkte derfor induksjon av c-fos i striatum av villtype og Tgp35-mus etter kokaininjeksjon. I vildtype-mus økte nivået av c-fos mRNA til en toppverdi (1.8 ± 0.2-fold over basalnivået) 30 min etter injeksjon av kokain, og deretter returnert til basal nivå av 120 min etter injeksjonen (Fig. 6 A og B). Imidlertid var nivåene av c-fos mRNA ≈30% lavere i Tgp35-mus enn i villtype mus til 30 min etter injeksjonen (Fig. 6 A og B). Den mindre induksjon av c-fos i Tgp35-mus ble ytterligere bekreftet ved immunhistokjemi (Fig. 6 C-F). Kokainadministrasjon økte c-fos immunoreaktivitet, sterkt i dorsomedial-dorsocentrale deler av striatum og svakt i sidedelene, i både wild-type og Tgp35-mus. Den kokaininducerte økningen i antall c-fosimmunopositive celler ble imidlertid spesielt dempet i striatumet av Tgp35-mus (Fig. 6G). Sammen viste disse resultatene at kokainmediert forsterkning av striataldopamin-signalering til kjernen ble hemmet i Tgp35-mus, et sannsynlig resultat av økt Cdk5-aktivitet.

  

Fig. 6.

Oppregulering av Cdk5-aktivitet resulterer i en reduksjon av striatal c-fos-ekspresjon og mindre induksjon etter kokainadministrasjon. (A) Northern blot viser tidsforløpet av c-fos-induksjon i wild-type (WT) og Tgp35 (Tg) -mus etter kokaininjeksjon. ...

Diskusjon

Cdk5 og dets aktivator p35 er identifisert som målgener som er oppregulert av kronisk eksponering for kokain (6). Vi rapporterer her bevis på at økt Cdk5 aktivitet, som et resultat av p35 oppregulering fremfor Cdk5 oppregulering, fører til demping av kokainmediert dopamin-signalering i striatalneuroner. For å undersøke konsekvensene av det oppregulerte uttrykket av enten Cdk5 eller p35 på striatal dopamin-signalering, ble to transgene muselinjer, TgCdk5 og Tgp35-mus analysert. Vi fant at Cdk5-aktiviteten var oppregulert i forhold til et økt nivå av p35-protein, men ble ikke påvirket av et økt nivå av Cdk5 protein. Vår tidligere rapport har også vist at Cdk5 aktivitet i TgCdk5 mus hjernen var lavere enn i wild-type mushjerne når aktiviteten ble målt ved bruk av Cdk5 immunoprecipitater (17), noe som tyder på at Cdk5 overekspresjon resulterer i et økt nivå av monomer Cdk5 dersom p35-nivået ikke økes. Disse resultatene indikerte at nivået av p35-protein er en hastighetsbegrensende faktor for Cdk5-aktivitet.

Tgp35-mus viste en mindre induksjon av både CREB-fosforylering og c-fos i striatum etter akutt injeksjon av kokain, noe som tyder på at striatal responsen på kokain ble hemmet av økt Cdk5 aktivitet. Dempingen av kokainmediert dopamin-signalering i Tgp35-mus ble sannsynligvis oppnådd gjennom Cdk5-mediert inhibering av multiple signaleringskaskader involverende DARPP-32, PKA og ERK. Kokainadministrasjon økte PKA-fosforylering av DARPP-32 ved Thr-34 hos wild-type mus, mens dette responset ble dempet i Tgp35-mus. PKA-fosforylering av DARPP-32 ved Thr-34 har vist seg å hemme aktiviteten av proteinfosfatase 1 (PP1), enzymet som er ansvarlig for de fosforylering av Ser-133 av CREB (27). Således ville PP1-aktivitet ikke bli antagonisert via DARPP-32 / PP1-banen i Tgp35-mus.

Kokaininducert aktivering av ERK1 / 2 ble også dempet i Tgp35-mus. Det er flere forskjellige mekanismer ved hvilke Cdk5 kan hemme den kokaininducerte aktiveringen av ERK1 / 2. For det første kan Cdk5-avhengig fosforylering av DARPP-32 ved Thr-75 hemme PKA, hvilket fører til etterfølgende inhibering av PKA-mediert MEK1 / 2-aktivering som kreves for ERK1 / 2-aktivering. En nylig studie har også funnet at fosforylering av DARPP-32 ved Thr-34 er nødvendig for kokainmediert aktivering av ERK1 / 2 ved flere veier som involverer indirekte regulering av MEK-aktivering, samt involvering av regulering av striatal-anriket fosfatase, en tyrosin fosfatase som virker direkte på ERK1 / 2 (28). Støtte for denne muligheten er foreslått av funnet at kokaininducert fosforylering av MEK1 / 2 ved Ser-217 og Ser-221 ble avskaffet i Tgp35-mus. En annen sannsynlig vei er via Cdk5-avhengig fosforylering av MEK1 ved Thr-286, noe som vil resultere i en reduksjon i sin katalytiske aktivitet og føre til inhibering av ERK1 / 2-aktivitet (24).

Inhibering av Cdk5 aktivitet i striatum har vist seg å potensere atferdsmessige effekter av kronisk kokainbehandling hos dyr (6). I samsvar med hypotesen om at oppregulering av Cdk5-aktivitet kan bidra til nevronal adaptasjon for å motvirke effekten av gjentatt kokainadministrasjon (6), fant vi at Cdk5-mediert fosforylering av DARPP-32 og MEK1 bidro til demping av kokaininducert aktivering av ERK1 / 2, noe som resulterte i mindre induksjon av CREB-fosforylering og c-fos i striatumet. Våre funn støtter ideen om at økt Cdk5 aktivitet, som følge av p35 oppregulering, kan endre genuttrykk i striatum etter kronisk eksponering for kokain. Dette kan oppstå ved endringer i aktivitetene til transkripsjonsfaktorene som CREB og c-fos. Dermed kan Cdk5-aktivatoren p35, på grunn av sin hastighetsbegrensende virkning på Cdk5-aktivitet, bidra til langvarige endringer i nevronfunksjon underliggende kokainavhengighet.

Erkjennelsene

Merknader

Referanser