PLOS One. 2013 Nov 25; 8 (11): e81245. doi: 10.1371 / journal.pone.0081245.
Nishijima T, Kawakami M, Kita I.
kilde
Laboratory of Behavioral Physiology, Graduate School of Human Health Sciences, Tokyo Metropolitan University, Tokyo, Japan.
Abstrakt
Fysisk trening forbedrer flere aspekter av hippocampal funksjon. I tråd med tanken om at nevronaktivitet er nøkkelen til å fremme nevronfunksjoner, har tidligere litteratur konsekvent vist at akutte treningsøvelser fremkaller nevronaktivisering i hippocampus. Gjentatte aktiverende stimuli fører til akkumulering av transkripsjonsfaktoren ΔFosB, som medierer langsiktig neural plastisitet.
I denne studien testet vi hypotesen om at det langsiktige frivillige hjulet kjører induserer ΔFosB-ekspresjon i hippocampus, og undersøkte eventuelle potensielle regionspesifikke effekter innenfor de hippocampale delfeltene langs dorso-ventralaksen. Mann C57BL / 6-mus ble plassert med eller uten løpeskive i 4-uker. Langvarig kjøring med hjul økte signifikant FosB / FosB immunoreaktivitet i alle målte hippocampale områder (dvs. i DG, CA1 og CA3 delfeltene av både dorsal og ventral hippocampus). Resultatene bekreftet at hjulkjører induserte regionspesifikke uttrykk for FosB / FosB immunoreaktivitet i cortex, noe som tyder på at den enhetlige økningen i FosB / FosB i hippocampus ikke er en ikke-spesifikk konsekvens av kjøring. Western blot-data indikerte at den økte hippocampale FosB / FosB immunoreaktiviteten primært skyldtes økt FosB. Disse resultatene tyder på at langsiktig fysisk trening er en potent utløser for ΔFosB induksjon gjennom hele hippocampus, noe som vil forklare hvorfor trening kan forbedre både dorsale og ventrale hippocampusavhengige funksjoner. Interessant fant vi at FosB / ΔFosB-uttrykk i generaldirektoratet var positivt korrelert med antall dobbeltkortinimmunoreaktive (dvs. umodne) neuroner.
Selv om mekanismene som ΔFosB medierer treningsinducert neurogenese fremdeles er usikre, innebærer disse data at treningsinducert neurogenese i det minste er aktivitetsavhengig. Samlet sett tyder våre nåværende resultater på at ΔFosB er et nytt molekylært mål involvert i regulering av treningsinducert hippocampal plasticitet.
Introduksjon
Øvelse gir ulike fordeler på molekylære, strukturelle og funksjonelle aspekter av hippocampus hos gnagere [1,2], hvorav noen ble støttet av menneskelige studier [3,4]. Imidlertid er mekanismene som ligger til grunn for de øvelsesinducerte endringene i hippocampal plasticitet, ikke tilstrekkelig forstått. Tidligere litteratur har konsekvent vist at øvelse fremkaller hippocampal neuronal aktivering hos gnagere. Immunohistokjemiske studier ved bruk av c-Fos, en markør for transient nevonal aktivering, har vist at både tvungen og frivillig kjøring økte c-Fos uttrykk i dentate gyrus (DG), CA1 og CA3 delfeltene av gnagerehippocampus [5-7]. I tillegg har en tidligere studie ved hjelp av laser-Doppler-flowmetri (LDF) vist at mild tredemølle kjører økt regional cerebral blodstrøm (rCBF), en alternativ markør for nevronaktivisering, i CA1-underfeltet i rotte [8]. Immunohistokjemiske studier muliggjør detaljerte regionsspesifikke analyser etter at trening har opphørt, mens LDF muliggjør sanntidsovervåking av rCBF i et lokalisert område under trening. Til tross for fordelene og begrensningene i hver studie viste disse studiene på samme måte en effekt av akutte treningsøvelser på hippocampal nevronaktivitet. Disse resultatene antyder en mekanisme hvorved langsiktig regelmessig mosjon fremmer hippocampal plastisitet ved gjentatte utløsninger av nevronaktivering [9].
Transkripsjonsfaktoren ΔFosB, en avkortet spleisisoform av FosB i full lengde, fremkalles av forskjellige typer gjentatte stimuli i bestemte hjerneområder, hvor den gradvis akkumuleres på grunn av sin unike stabilitet (halveringstid i uker)10-12]. Et voksende bevismateriale viser at økte nivåer av ΔFosB medier langvarig nevral og atferdsplastikk forbundet med bestemte stimuli [11,13]. For eksempel øker kronisk administrasjon av rusmiddelmisbruk som kokain og morfin vanligvis ΔFosB-uttrykk i nukleotilførselen, som representerer en av de molekylære mekanismene som ligger til grunn for økt følsomhet overfor disse legemidlene [11,14,15]. Similarly til andre belønning stimuli, inkludert høyt fett diett og seksuell opplevelse [16,17], lUbegrenset frivillighjul kjører også økt FosB / ΔFosB immunoreaktivitet i rottekjernen accumbens, noe som tyder på at frivillig kjøring er en naturlig belønning for gnagere [18,19]. Så langt vi vet, har ingen litteratur undersøkt om gjentatt eksponering for fysisk trening induserer ΔFosB-uttrykk i hippocampus. Fordi trening utløser nevronaktivisering i hippocampus, antydet vi at langsiktig frivillig hjulkjøring også ville forårsake ΔFosB-uttrykk i hippocampus. Mens de nøyaktige mekanismer som ΔFosB regulerer hippocampal plasticitet forblir usikker, har studier vist at mus mangler fosB gen viser nedsatt hippocampal neurogenese og økt depresjon-lignende atferd [20,21]. Jegtreningen er kjent for å forbedre neurogenese og har antidepressive egenskaper [22-25]. Jegf vår hypotese er riktig, ΔFosB ville være et nytt potensielt molekylært mål formidlende treningsinducert hippocampal plasticitet.
Hippocampus har anatomisk og funksjonell gradient langs sin langsgående (dorso-ventral) akse [26]. Dorsal hippocampus spiller en nøkkelrolle i romlig læring og minne [27,28], mens den ventrale hippocampus er fortrinnsvis involvert i regulering av følelsesmessig atferd [29,30]. Videre har studier vist at fysiologiske stimuli induserer forskjellige mønstre av c-Fos-uttrykk i dorsale og ventrale deler av hippocampus [31-33]. Fordi trening forbedrer både dorsal [34-37] og ventrale hippocampusavhengige funksjoner [24,25,38], er det viktig å undersøke om langsiktig frivillig kjøring forårsaker regionspesifikt uttrykk for ΔFosB i hippocampus.
Den primære hypotesen for denne studien var at langsiktig frivillig hjulkjøring ville indusere ΔFosB-uttrykk i mushippocampus. Denne hypotesen ble undersøkt av FosB / FosB immunhistokjemi i de dorsale og ventrale hippocampale delfeltene, DG, CA1 og CA3, med ytterligere vekt på å identifisere regionsspesifikk induksjon. Resultatene ble bekreftet ved western blotting, som ble brukt til å identifisere isoformen av fosB genprodukter indusert i hippocampus. Vi undersøkte også cortexen for regionspesifikk FosB / ΔFosB induksjon for å utelukke muligheten for at langsiktig øvelse ikke spesifikt økte FosB / FosB immunoreaktivitet i hjernen. Til slutt ble den korrelative foreningen mellom FosB / FFBB-ekspresjon og neurogenese undersøkt som det første trinnet i å søke de funksjonelle implikasjonene av treningsinducert ΔFosB-induksjon i regulering av hippocampal plasticitet.
Materialer og metoder
1: Dyr og etikkerklæring
Tjue mannlige C57BL / 6-mus (8 uker) ble kjøpt fra en kommersiell oppdretter (SLC, Shizuoka, Japan). Ti mus ble brukt til Experiment 1, og de andre ti for Experiment 2. Mus ble plassert under kontrollerte temperaturforhold (22-24 ° C) og lys (12 / 12-h lys / mørk syklus, lys på 0500), og ble gitt mat og vann ad libitum. Alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av dyreforsøkets etikkutvalg i Tokyo Metropolitan University.
I hvert forsøk ble musene randomisert til hverandre ved hjelp av en kontrollgruppe (Control, n = 5) eller en løpende gruppe (Runner, n = 5). I løpet av den første uken ble alle musene plassert i standard plastburar i grupper (5-mus / bur) for initial akklimatisering. Deretter ble Runner-mus overført til et bur utstyrt med et løpeskive (ENV-046, Med Associate Inc., Georgia, VT, USA). Fordi sosial isolasjon er kjent for å undertrykke øvelsesinducert neurogenese i hippocampus [39] Ble Runner-mus plassert som en gruppe (5-mus / bur) i ytterligere 4-uker. Antall hjulrotasjoner ble registrert hver morgen og kroppsvekt (g) ble målt ukentlig.
2: Eksperiment 1. Immunohistokemisk undersøkelse av FosB / AFosB ekspresjon og hippocampal neurogenese
2.1: Perfusjon og vevbehandling
Morgenen (0900-1100) etter den siste dagen i løpeperioden ble musene sterkt bedøvet med pentobarbitalnatrium og transkartielt perfusjonert med kald saltvann. Hjernen ble raskt fjernet og etterfiksert i 4% paraformaldehyd i 0.1 M fosfatbuffet saltvann (PBS, pH 7.4) over natten. Hjernen ble deretter kryobeskyttet i 30% sukrose i PBS og frosset til videre behandling. Koronale hjerneseksjoner (40 μm) av en halvkule ble oppnådd ved anvendelse av et frysende mikrotom og samlet i PBS med 0.01% natriumazid.
2.2: Immunohistokjemi
En seks sekvens av seksjoner ble tilfeldig valgt for FosB / FosB immunostaining. En tilstøtende serie ble brukt til merking av doublecortin (DCX), en markør av umodne neuroner validert for å vurdere neurogenese [40,41]. Etter slukning av endogen peroksidaseaktivitet med 1% H2O2 I PBS ble frie flytende seksjoner preinkubert med blokkeringsoppløsning inneholdende 10% normalt hesteserum i PBS for 2 h. Etter skyll i PBS ble seksjoner inkubert med kaninpolyklonalt pan-FosB-antistoff (1: 1000, sc-48, Santa Cruz-bioteknologi, Dallas, TX, USA) fortynnet i PBS med 0.5% Triton X-100 og 0.5% BSA -BSA) for 24 h ved 4 ° C. En annen serie av seksjoner ble inkubert med geitpolyklonalt anti-DCX-antistoff (1: 500, sc-8066, Santa Cruz) i PBST-BSA for 48 h ved 4 ° C. Snittene ble ytterligere inkubert med et passende biotinylert sekundært antistoff (anti-kanin-IgG, 1: 1000, AP182B; anti-geit IgG, 1: 1000, AP180B, begge antistoffer fra EMD Millipore, Billerica, MA, USA) i PBST-BSA for 2 h ved romtemperatur. Seksjonene ble deretter behandlet med avidin-biotin-peroksidaskompleks (Vectastain ABC peroxidase kit, Vector Laboratories Inc, Burlingame, CA, USA) for 90 min etter produsentens instruksjoner. Antigenene ble endelig visualisert med 0.02% 3,3-diaminobenzidin (DAB) i 0.1 M Tris-HCl (pH 7.6) inneholdende 0.01% H2O2. For FosB / ΔFosB immunostaining ble reaksjonen intensivert med nikkelammoniumsulfat. For DCX-farging ble cellekjerne motfarget med Nissl-farging. Seksjoner ble montert på gelatinebelagte lysbilder og dekselplater ble plassert.
2.3: Kvantifisering av FosB / ΔFosB immunoreaktivitet ved bruk av billedgrense
Pan-FosB-antistoffet som ble benyttet i denne studien ble hevet mot en intern region delt av FosB og FosB N-terminale regionen, slik at det ikke kan diskriminere mellom de to isoformene. Derfor ble de immunfargede strukturer beskrevet som FosB / AFosB immunoreaktive (FosB / AFosB-ir) kjerner. For en objektiv blindkvantifisering ble lysbildene kodet før analyse. Musens hjerneatlas [42] ble brukt til å identifisere plasseringen av følgende interesseområder (ROI): granulasjonscellelag (GCL) av DG (3-seksjoner), pyramidalcellelag av CA1 (3-seksjoner) og CA3 (2-3-seksjoner) i dorsal hippocampus (lukket for -2.2 mm fra bregma); DG (2 seksjoner), CA1 (2 seksjoner) og CA3 (2 seksjoner) i ventral hippocampus (lukket for -3.4 mm fra bregma) (Figur 4, venstre). Caudale seksjoner inneholder både dorsale og ventrale deler av hippocampus, men den ventrale delen ble målrettet. I DG, ble suprapyramidale (DGsp) og infrapyramidale (DGip) blader analysert separat. Motorcortex (2-3-seksjoner, lukket for -0.6 mm fra bregma), somatosensorisk fatcortex (2-3-seksjoner, lukket for -0.6 mm fra bregmaen), visuell cortex (3-seksjoner, lukket for -2.9 mm fra bregma), auditiv cortex (3-seksjoner, lukket for -2.9 mm fra bregmaen) og olfaktorisk pære (3-seksjoner, lukket til + 4.3 mm fra bregmaen) ble også analysert (Figur 6, venstre).
Digitale bilder (2070 × 1548 piksler) av hvert avkastning ble tatt ved hjelp av et optisk mikroskop (BX-51, Olympus, Tokyo, Japan) utstyrt med et CCD-kamera (DP-73, Olympus) og bildeprogramvare (cellSens, Olympus). objektiv forstørrelse var 10 × for hippocampal ROI og 4 × for kortikale ROI. For å identifisere moderat til sterk FosB / AFosB immunoreaktivitet (Figur 1D-G), ved hjelp av flere seksjoner på forhånd, ble både bildeoppkjøpsinnstillinger (lysintensitet, feltstopp, eksponeringstid og hvitbalanse) og terskelnivåer for hver av RGB-komponentene optimalisert for hippocampale og kortikale ROI. Følgende analyse ble deretter utført under de optimaliserte forhold (1). Avkastningene ble valgt av en uregelmessig formet polygon (Figur 1A, B) (2). Bildet ble tersklet, som konverterte FosB / FosB-ir-kjernene til en rød farge (Figur 1C-G) (3). % ROI ble deretter automatisk beregnet som følger:% ROI = (konvertert område (i rødt) / totalt avkastningsområde) × 100.
For å validere denne terskelgrenseanalysen ble 20-regioner tilfeldig valgt ut fra forskjellige hjerneområder med forskjellige regionstørrelser. I tillegg til tærskelkvantifisering av bilde, ble antall FosB / FFB-ir-kjerne i de utvalgte områdene telt manuelt og tettheten av FosB / FFB-ir-kjerner ble oppnådd ved å dividere antall FosB / FosB-ir-kjerner med den målte område (mm2).
2.4: Kvantifisering av DCX-ir umodne neuroner i dentate gyrus
DCX-ir umodne nervene i DG av Runner-mus var rikelig og overlappende, noe som gjør det vanskelig å presis telle det diskrete antallet DCX-ir som ved bruk av et optisk mikroskop. I en tidligere studie viste Sholl-analyse for morfologisk evaluering imidlertid at hver DCX-ir-neuron i gjennomsnitt har en enkelt dendrit når den måles innenfor 40 μm av somaen [43]. Derfor ble følgende originalanalyse utviklet for å muliggjøre regionsspesifikk kvantifisering av DCX-ir-neuroner.
- (1) Et bilde av GCL ble projisert på en dataskjerm ved hjelp av billedprogramvare og en 40 × objektivlins (2). På livebildet ble et linjesegment (150 ± 0.1 μm) trukket langs midten av GCLFigur 2) (3). Endring av fokusdypet, antall ganger linjesegmentet krysset DCX-ir dendrit ble talt (4). Avkastningene (Dorsal DGsp, dDGsp; Dorsal DGip, dDGip; ventral DGsp, vDGsp; ventral DGip, vDGip) korresponderte med områdene hvor FosB / ΔFosB immunoreaktivitet ble analysert (5). I hvert avkastning ble 2-3-linjesegmentene trukket per seksjon, og antall kryssinger ble gjennomsnittlig over 2-3-seksjoner per mus. Fordi tykkelsen av GCL er omtrent 60-80 μm, bør antall kryssinger reflektere antall DCX-ir-neuroner innen analysert begrenset område.
Et representativt bilde av DCX-ir umodne neuroner og et linjesegment (150 ± 0.1 μm) overlaid for å telle antall kryssinger med DCX-ir dendrites.
3. Eksperiment 2. Identifikasjon av FosB / ΔFosB isoformen indusert ved hjulkjøring
3.1: Perfusjon og vevbehandling
En ytterligere kohort av mus ble behandlet som ovenfor i eksperiment 1. Etter 4-ukers løpende intervensjon ble musene transkartielt perfusjonert med kald saltvann under dypbedøvelse. Hippocampus ble raskt spaltet ut og frosset med flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C. Hippokampen fra hver mus ble homogenisert i RIPA-buffer (150 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 7.6, 1% NP-40, 1% natriumdeokoksolat, 0.1% SDS, #8990, Thermo Scientific, IL, USA) inhibitorer (cOmplete Mini, Roche, Manheim, Tyskland). Lysatene ble sentrifugert for 15 min ved 5000 rpm ved 4 ° C og supernatanter ble samlet. Proteinkonsentrasjoner ble målt med et BCA Protein Assay kit (# 23227, Thermo Scientific, IL, USA).
3.2: Western blotting
Like mengder protein (30 μg / lane) ble elektroforesert på en 10% polyakrylamidgel, deretter overført til en PVDF-membran (Immun-Blot, 0.2 μm, Bio-Rad, MD, USA). Ikke-spesifikk binding ble blokkert ved å preinkubere membranen for 1 h i TBST (0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.1% Tween-20) inneholdende 3% BSA. Membranen ble inkubert med Pan-FosB-antistoffet (1: 1000) som ble anvendt ovenfor for immunhistokjemi, oppløst i TBST inneholdende 3% BSA. Etter vasking med TBST ble membranen inkubert med HRP-konjugert anti-kanin-IgG-antistoff (1: 5000 i TBST, NA934, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) for 1 h ved romtemperatur. Etter vasking med TBST ble proteinbånd visualisert ved inkubering med Enhanced Chemiluminescence (Western Lightning Plus-ECL, PerkinElmer, MA, USA) og fanget ved hjelp av en Image Quant LAS 4000 mini (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK). Membranen ble deretter reprodusert med anti-glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) antistoff (#2275, 1: 5000 i TBS-T, Trevigen, MD, USA) som en lastekontroll. Den optiske tetthet av proteinbåndene ble kvantifisert ved å bruke Image-J og normalisert til nivået av GAPDH.
4: Statistisk analyse
Endringer i musens kroppsvekt ble analysert ved toveis gjentatte tiltak ANOVA (gruppe × tid). En uparget t-test ble brukt til å bestemme statistiske forskjeller mellom grupper (Control vs Runner). Pearsons korrelasjonsanalyse ble brukt til å validere FosB / ΔFosB immunoreaktivitetsanalysen (manuell telling mot bildegrenseverdier) og å undersøke sammenhengen mellom nivået av FosB / ΔFosB-uttrykk og antall DCX-kryssinger i generaldirektoratet. Data ble presentert som gjennomsnittlig ± SEM. Terskelen for statistisk signifikans ble satt til P < 0.05.
Resultater
1: Kroppsvekt og kjøreavstand i eksperimenter 1 og 2
Endringer i kroppsvekt for både Control and Runner-mus i eksperimenter 1 og 2 blir samlet og vist i Figur 3. Toveis gjentatte tiltak ANOVA indikerte en signifikant interaksjon (gruppe × tid, F(4, 72) = 13.6, P <0.001) og hovedeffekt av gruppen F(1, 18) = 6.07, P <0.05), noe som indikerer en betydelig lavere kroppsvekt hos Runner-mus. Løpeavstanden per bur er vist i Tabell 1. Selv om den nøyaktige kjøreavstanden til hver mus var usikker fordi musene ble plassert sammen, bekreftet regelmessig observasjon at alle mus ofte utførte hjulet. Runner-musene i eksperiment 2 kjørte lenger enn de i eksperiment 1, men gjennomsnittlig kjøreavstand (m / dag / bur) var konsekvent gjennom hvert eksperiment.
2: Validering av FosB / ΔFosB immunoreaktivitetskvantifisering ved bruk av billedgrense
Det var en signifikant korrelasjon mellom FosB / ΔFosB-ir-området oppnådd ved bildetærskel og tetthet av FosB / FosB-ir-kjerner oppnådd ved manuell telling (r = 0.941, P <00001, Figur 4).
3: FosB / FosB immunoreaktivitet i hippocampus
Representative bilder av FosB / ΔFosB immunostaining i de dorsale og ventrale hippocampale delfeltene ble vist i Figur 5. I alle analyserte avkastningene ble FosB / FosB immunoreaktivitet i Runner-mus (Figur 5, høyre) var kvalitativt høyere enn det i Control-mus (Figur 5, senter). I Runner-mus viste kvantitativ analyse en signifikant økning i FosB / FosB-ir-området i både dorsal (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.01; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05) og de ventrale hippocampale delfeltene (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.05; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05; Figur 6).
4: FosB / ΔFosB immunoreaktivitet i cortex
Representative bilder av FosB / ΔFosB immunostaining i de kortikale ROIene er vist i Figur 7. Kvantitativ analyse avdekket regionavhengige endringer i FosB / FosB immunoreaktivitet med langsiktig løp (Figur 8). I Runner-mus var FosB / ΔFosB-ir-området betydelig høyere i motorcortexen (P <0.05) og den somatosensoriske fatbarken (P <0.05), men ikke i den visuelle hjernebarken (P = 0.662) eller olfaktorisk pære (P = 0.523). I den hørbare cortexen, FosB / ΔFosB-ir området tendens mot en økning i Runner mus (P = 0.105).
5: Neurogenese
Representative bilder av DCX immunostaining er vist i Figur 9. I dorsal hippocampus, DCX immunoreaktivitet i Runner-mus (Figur 9, høyre) var kvalitativt høyere sammenlignet med kontrollmus (Figur 9, venstre). Sammenlignet med dorsal hippocampus var DCX immunoreaktivitet i ventral hippocampus svakere i både Control and Runner-mus. I Runner-mus var antallet kryssinger betydelig høyere i dDGsp (P <0.01) og dDGip (P <0.01; Figur 10). I ventral hippocampus var antall kryssinger i Runner-mus tendens til å øke, men det var ingen signifikante forskjeller mellom grupper (vDGsp, P = 0.101; vDGip, P = 0.257; Figur 10).
6: Korrelasjon mellom FosB / ΔFosB ekspresjon og neurogenese
En korrelasjonsanalyse ble utført mellom FosB / ΔFosB-ir-området og antall DCX-kryssinger (Figur 11). Fordi hvert datasett (f.eks. Dorsal DGsp i Control-mus) består av bare 5-par, ble analysen først utført med alle 40-par. Interessant var det en signifikant korrelasjon mellom FosB / ΔFosB-ir området og antall DCX kryssinger (r = 0.885, P <0.0001). I tillegg ble det også identifisert en signifikant sammenheng når rygg-DG (r = 0.762, P <0.05) og den ventrale DG (r = 0.816, P <0.01) ble analysert separat.
7: Identifikasjon av FosB / FosB isoformen indusert ved langsiktig drift
Til slutt, for å identifisere isoformen til fosB genprodukter indusert i hippocampus som respons på langvarig kjøring, ble hippokampen fra en ytterligere kohort av mus utsatt for western blotting ved bruk av det samme pan-FosB antistoff. Flere bånd av 35-37 kDa, som representerer modifiserte isoformer av ΔFosB [44], ble signifikant økt i Runner versus Control-mus (Figur 12, P <0.01). På den annen side var FosB-isoformen på 48 kDa ikke påvisbar i begge gruppene. Et annet bånd svakt synlig over 25 kDa representerer sannsynligvis Δ2ΔFosB-isoformen (27 kDa). Det var to andre bånd, over 50 kDa og 37 kDa, som mest sannsynlig var på grunn av uspesifikk binding. Når det ble kvantifisert, ble det ikke funnet noen forskjeller i disse ikke-ΔFosB-båndene mellom gruppene (data ikke vist).
Diskusjon
I sammendraget utførte den foreliggende studien først en immunhistokemisk analyse for å undersøke 1) hvorvidt det langsiktige frivillige hjulet kjører induserer FosB / ΔFosB-uttrykk i hippocampuset; og 2) om en regionsspesifikk respons eksisterer langs sin dorso-ventrale akse.
Fire uker med frivillig hjulkjøring førte til en signifikant økning i FosB / ΔFosB immunoreaktivitet i alle de analyserte hippocampale områdene (dvs. DG, CA1 og CA3-underfeltene av både dorsale og ventrale deler av hippocampus). Vi bekreftet at 35-37kDa ΔFosB isoformen var den største fosB genprodukt som akkumuleres som respons på langsiktig drift. Disse resultatene støtter klart hypotesen om at langsiktig regelmessig trening er en kraftig utløser for ΔFosB-induksjon gjennom hippocampus, og at dets induksjon kan være en ny molekylær mekanisme som påvirker ulike typer dorsale og / eller ventrale hippokampusavhengige funksjoner.
1: Validering og begrensninger for kvantifisering av FosB / FOSB immunoreaktivitet ved bruk av billedgrense
En terskelteknikk for bilder, som ble brukt i immunhistokjemiske studier for å telle antall målceller og for å evaluere cellemorfologi, ble vedtatt i denne studien for regionsspesifikke kvantifisering av FosB / AFosB immunoreaktivitet [15,45,46]. En signifikant korrelasjon mellom nivåene av FosB / AFosB immunoreaktivitet kvantifisert ved bildetærskel og ved manuell telling ble påvist (Figur 4). Men fordi tetthet og overlapping forhindret telling av antall FosB / ΔFosB-ir-kjerner i svært tette områder, innebærer den demonstrerte korrelasjonen bare nøyaktighet av bildeterskelmetoden når FosB / ΔFosB-ir-områdene representerer <~ 40% av den totale avkastningen område. Derfor er nøye tolkning nødvendig for FosB / ΔFosB-ir-områder> 40% av det totale ROI-området.
Spesielt i DG av Runner-mus (Figur 4), FosB / ΔFosB-uttrykk ble sterkt indusert ved å kjøre på hjul og de fleste FosB / FosB-ir-kjernene overlappes. I disse områdene fører økt induksjon av FosB / ΔFosB-uttrykk til en større undervurdering av ekspressjonsnivået, uansett hvilken kvantifiseringsmetode som brukes (billedgrense eller manuell telling). Til tross for risikoen for undervurdering er det imidlertid viktig å merke seg at den foreliggende studien med suksess demonstrerte betydelige økninger i FosB / ΔFosB-ir-området i DG av Runner-mus. Dette antyder at metodologiske begrensninger ikke bringer våre funn i fare. I stedet øker potensiell underestimering påliteligheten av funnene om at langsiktig drift økte FosB / FosB immunoreaktivitet i hippocampus.
2: Ensartet induksjon av ΔFosB i hippocampus ved langvarig kjøring
Hippocampus har anatomiske og funksjonelle gradienter langs sin langsgående akse [26], så for den foreliggende studien ble FosB / ΔFosB immunoreaktivitet i de dorsale og ventrale delene av hippocampus analysert separat. Dataene viste at langsiktig løping jevnt økt FosB / ΔFosB ekspresjon i alle hippocampale ROI målt. Denne ensartede induksjon av FosB / FosB immunoreaktivitet kan være ikke-spesifikt forårsaket av systemiske metabolske forandringer assosiert med langsiktig løping. Det er imidlertid viktig å merke seg at det var regionsspesifikke økninger av FosB / FOSB immunoreaktivitet i cortexen. Dette resultatet støttes av nylige funn som viser at en akutt runde tredemølle kjører økt regional cerebral blodstrøm i hippocampus, men ikke i olfaktorisk pære [8]. Videre, Rhodes et al. (2003) viste at 7-dager med frivillig hjulkjøring forårsaket c-Fos-uttrykk i DG og CA2 / 3 av hippocampus (CA1 ble ikke målt) og i sensorisk cortex, men ikke i synscortexen [47]. Samlet sett tyder disse studiene på at ensartet induksjon av FosB / FosB-ekspresjon i hippocampus ikke er en ikke-spesifikk konsekvens av langvarig kjøring. Interessant, Hawley et al. nylig rapportert at kronisk uforutsigbar stress økte FosB / ΔFosB ekspresjon i dorsal, men ikke i ventral, DG av rottehippocampus [48]. Ved videre undersøkelse vil de distinkte mønstrene av FosB / ΔFosB induksjon som de som fremkalt av trening eller stress gi fortsatt innsikt i stimulusavhengige påvirkninger på hippocampus.
Det primære pan-FosB antistoffet som brukes i denne studien, er kjent for å gjenkjenne alle isoformer av FosB proteiner. Ved western blotting analyse fant vi ut at de eneste isoformene som økte i hippocampus etter langvarig løp var de modifiserte isoformene av ΔFosB (35-37 kDa), de eneste stabile isoformene blant Fos-familieproteiner [11]. Dette funnet er i samsvar med tidligere arbeid ved bruk av pan-Fos-antistoff for å demonstrere at 35-37 kDa ΔFosB er det overvektige Fos-familieproteinet indusert i den frontale cortex ved kronisk stress [44]. Derfor øker økningen av hippocampal FosB / FFBB immunoreaktivitet her ved langvarig kjøring, som mest sannsynlig reflekterer nivået av ΔFosB.
Mindre er kjent om regionspesifikke effekter av mosjon på molekylære og strukturelle aspekter av hippocampus. Imidlertid viser mange adferdsstudier et stort potensial for treningsinducerte forbedringer i både dorsale og ventrale hippocampale funksjoner. Trening har blitt demonstrert for å forbedre romlig læring og minne [34-38] og romlig og kontekstuell behandling avhenger hovedsakelig av dorsal hippocampus [27,28]. I motsetning er trening også kjent for å utøve anxiolytiske og antidepressive egenskaper [24,25,38] og disse følelsesmessige responsene er hovedsakelig regulert av ventral hippocampus [29,30]. Den ensartede induksjon av ΔFosB ved langvarig kjøring sett i denne studien antyder at noen form for nevroloplastiske endringer skjedde over hele hippocampus. Dette vil forklare hvorfor trening kan påvirke både dorsale og ventrale hippocampusavhengige funksjoner.
3: Regionsspesifikk analyse av treningsinducert neurogenese
En funksjonell dissosiasjon av neurogenese mellom dorsal og ventral hippocampus har også fått økende oppmerksomhet [49]. I denne studien utnytter de morfologiske egenskapene til DCX-ir umodne neuroner [43], teller vi antall kryss mellom DCX-ir dendrites og et linjesegment trukket langs midten av GCL. Denne måling ga ikke totalt antall DCX-ir-neuroner i generaldirektoratet, men det muliggjorde regionsspesifikk kvantifisering som var nødvendig for å utføre en korrelasjonsanalyse med FosB / ΔFosB ekspresjonsdata (se nedenfor). Etter langvarig løping økte antall DCX-ir-neuroner betydelig i dorsal, men ikke ventral, DG. Dette antyder at trening kan stimulere neurogenese mer påfallende i dorsal sammenlignet med den ventrale delen av generaldirektoratet. Tidligere studier har imidlertid rapportert motstridende resultater der hjulet kjører økt neurogenese i både dorsal og ventral DG [50,51]. I den foreliggende studien hadde antall DCX-ir-kryssinger i det ventrale DG en tendens til å øke med løping, selv om den lille prøven størrelse (5-mus per gruppe) kanskje har begrenset muligheten til å oppdage en statistisk signifikant forskjell mellom grupper. Derfor er det sannsynligvis for tidlig å utelukke muligheten for at frivillig kjøring kan stimulere ventral hippocampal neurogenese. Videre detaljerte studier er nødvendige for å forstå regionspesifikasjonen av treningsinducert neurogenese angående multistepprosessen (celleproliferasjon, differensiering, migrasjon og overlevelse).
4: Funksjonelle implikasjoner av treningsinducert ΔFosB-induksjon for regulering av hippocampal plasticitet
Endelig, som det første trinnet i å gjenkjenne de funksjonelle implikasjonene av treningsinducert ΔFosB-induksjon i hippocampus, undersøkte vi forholdet mellom FosB / FosB immunoreaktivitet og DCX-ir-kryssinger i både dorsal og ventral-DG og fant en signifikant, positiv korrelasjon mellom de to variablene. Selv om de nøyaktige mekanismer som ΔFosB regulerer treningsinducert neurogenese forblir usikre, viste en nylig studie at fosB-nullmus, som mangler FosB, ΔFosB og Δ2ΔFosB (alle fosB produkter), viste underskudd i basal hippocampal neurogenese, inkludert redusert proliferasjon av neuronal progenitorceller, økt ektopisk migrasjon av nyfødte neuroner og unormale DG-strukturer [20]. Imidlertid ble disse endringene ikke observert i fosB(d / d) mus, som mangler FosB, men ikke ΔFosB / Δ2ΔFosB. Interessant, i fosB-nullmus, uttrykk for noen nevrogeneselaterte gener, inkludert VGF (VGF nerve vekstfaktor inducerbar) og gal (Galanin prepropeptid) ble nedregulert [20]. Siden VGF og GAL er sekretoriske molekyler, vurderer et forslag som inneholder løfte at nevroner som uttrykker ΔFosB, kan regulere neurogenese gjennom autokrin / parakrin aktivitet [20].
I tillegg skal det bemerkes at regionen der ΔFosB er indusert ved å løpe romlig overlapper med regionen der nevogen aktivitet er høy. Dette funnet antyder at treningsinducert neurogenese er minst aktivitetsavhengig. Neuronal aktivering er nøkkelen til å opprettholde og forbedre funksjonen i sentralnervesystemet [9], gjennom mekanismer som inkluderer ekspresjon og frigjøring av hjerneavledet nevrotrofisk faktor (BDNF) [52,53], opptak av seruminsulinlignende vekstfaktor-1 (IGF-1) gjennom blod-hjernebarrieren [54,55], undertrykkelse av apoptose [56] og regulering av mitokondriell motilitet [57]. Derfor foreslår den foreliggende studien at langsiktig trening utløste gjentatt nevronaktivering, tydelig i det økte ΔFosB-uttrykket, som bidrar til å øke hippocampal plasticitet, potensielt gjennom disse multiple mekanismene beskrevet ovenfor.
Den foreliggende studien vurderte bare treningsinducert neurogenese og dens tilknytning til FosB / ΔFosB-uttrykk i generaldirektoratet. Imidlertid ble FosB / AFosB immunoreaktivitet også indusert i CA1- og CA3-underfeltene. Mens det er behov for ytterligere studier for å få mer forståelse av funksjonelle roller av treningsinducert ΔFosB-uttrykk innenfor disse delfeltene, gir tidligere litteratur en lovende mulighet. Guan et al. (2011) viste at spesifikk ablasjon av den syklin-avhengige kinasen 5 (Cdk5) i CA1- eller CA3-pyramidale nevronene svekket hukommelseskonsolidering eller -henting, henholdsvis [58]. Interessant er Cdk5 det nedstrøms målet for ΔFosB [59] og er involvert i regulering av synaptisk plastisitet [60]. Derfor kan treningsinducert ΔFosB-ekspresjon være involvert i regulering av synaptisk plastisitet gjennom Cdk5-aktivering i CA1- og CA3-underfeltene.
konklusjonen
Mens akutte treningsøvelser var kjent for å indusere uttrykket av umiddelbare, tidlige genproteiner i hippocampus, gir den foreliggende studien det første beviset på at langsiktig regelmessig mosjon signifikant induserer ΔFosB-ekspresjon i hele hippocampus. ther ensartet induksjon av ΔFosB støtter den nåværende forståelsen at trening er en effektiv ikke-farmakologisk inngrep som kan forbedre flere hippocampale funksjoner. Sammen med den signifikante korrelasjonen mellom FosB / ΔFosB-ekspresjon og neurogenese, er disse dataene provoserende og indikerer et behov for videre studier som avgrenser rollen avFosB ved å formidle effekten av trening på hippocampalfunksjonen, inkludert neurogenese.
Finansieringserklæring
Referanser
;