PSMC5, en 19S Proteasomal ATPase, regulerer kokainhandling i Nucleus Accumbens (2015)

PLOS One. 2015 mai 11; 10 (5): e0126710. doi: 10.1371 / journal.pone.0126710. eCollection 2015.

Ohnishi YH1, Ohnishi YN2, Nakamura T3, Ohno M4, Kennedy PJ5, Yasuyuki O6, Nishi A7, Neve R8, Tsuzuki T4, Nestler EJ5.

Abstrakt

ΔFosB er en stabil transkripsjonsfaktor som akkumuleres i nucleus accumbens (NAc), en viktig del av hjernens belønningskretsløp, som svar på kronisk eksponering for kokain eller andre misbrukende stoffer. Mens ΔFosB er kjent for å heterodimerisere med et Jun-familiemedlem for å danne et aktivt transkripsjonsfaktorkompleks, har det hittil ikke vært en åpen undersøkelse av andre mulige bindingspartnere for ΔFosB i hjernen. Her, ved bruk av gjær-to-hybrid-analyser, identifiserer vi PSMC5-også kjent som SUG1, en ATPase-holdig underenhet av 19S proteasomalt kompleks - som et nytt samspillende protein med ΔFosB. Vi verifiserer slike interaksjoner mellom endogene ΔFosB og PSMC5 i NAc og viser at begge proteiner også danner komplekser med andre kromatinregulerende proteiner assosiert med genaktivering. Vi viser videre at kronisk kokain øker kjernefysiske, men ikke cytoplasmatiske, nivåer av PSMC5 i NAc, og at overekspresjon av PSMC5 i denne hjerneområdet fremmer lokomotoriske responser på kokain. Sammen beskriver disse funnene en ny mekanisme som bidrar til handlingene til ΔFosB og for første gang impliserer PSMC5 i kokainindusert molekylær og atferdsmessig plastisitet.

Sitering: Ohnishi YH, Ohnishi YN, Nakamura T, Ohno M, Kennedy PJ, Yasuyuki O, et al. (2015) PSMC5, en 19S Proteasomal ATPase, regulerer kokainhandling i Nucleus Accumbens. PLOS ONE 10 (5): e0126710. doi: 10.1371 / journal.pone.0126710

Akademisk redaktør: James Edgar McCutcheon, University of Leicester, STORBRITANNIA

Mottatt: Desember 10, 2014; Akseptert: April 7, 2015; Publisert: Kan 11, 2015

Copyright: © 2015 Ohnishi et al. Dette er en åpen tilgangsartikel distribuert under vilkårene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt at den opprinnelige forfatter og kilde er kreditert

Data Tilgjengelighet: Alle relevante data finnes i papiret.

finansiering: Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health, Nasjonalt institutt for narkotikamisbruk, og av Ishibashi Foundation og Japan Society for Promotion of Science (KAKENHI tall: 24591735, 26290064, 25116010). Funders hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeide manuskriptet.

Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.

Introduksjon

ΔFosB, et avkortet produkt av FosB genet, tilhører Fos-familien av transkripsjonsfaktorer, som også inkluderer c-Fos, full lengde FosB, Fra-1 og Fra-2. ΔFosB, som andre Fos-proteiner, heterodimeriseres med en Jun-familieprotein-c-Jun, JunB eller JunD-for å danne et aktivt AP-1 (aktivator protein-1) transkripsjonsfaktorkompleks som inducerer eller undertrykker ekspresjonen av bestemte målgener [1,2].

ΔFosB har vist seg å spille en nøkkelrolle i narkotikamisbruk [2]. Unikt blant Fos-familieproteiner, akkumuleres det i nukleobatterier (NAc) og andre belønningsrelaterte hjerneområder etter gjentatt administrasjon av legemidler på grunn av dets høye stabilitetsnivå [3,4], som er formidlet av mangelen på C-terminale degron-domener og ved fosforylering av flere proteinkinaser [5-7]. Slike induksjon av ΔFosB i NAc medierer økte atferdsresponser mot misbruk. Således øker overekspresjon av ΔFosB i denne hjernegruppen av voksne dyr enten ved bruk av virale vektorer eller inducerbare bitransgene mus, et dyrs følsomhet overfor lokomotoriske aktiverende og givende effekter av kokain og opiater, samt et dyrs motivasjon til selvadministrasjon kokain [7-11]. Omvendt forårsaker overekspresjon av dominerende negative antagonister av ΔFosB de motsatte atferdsfenotyper [10-12].

Vi og andre har tidligere bekreftet, ved hjelp av gelskift-analyser, at JunD og kanskje andre Jun-familieproteiner er de viktigste bindingspartner av FosB i hjernen in vivo [13-15]. Til dags dato har det imidlertid ikke vært en åpen, upartisk vurdering av ΔFosBs bindende partnere i hjernen. Her søkte vi å identifisere nye bindingspartnere for ΔFosB ved bruk av en gjær-to-hybrid-analyse [16,17]. Våre data avslørte at PSMC5, også kjent som SUG1, er en robust partner av ΔFosB både in vitro og i NAc in vivo, der det blir tilknyttet ΔFosB som en del av et kokaininducert transkripsjonsaktiverings-kompleks, som også inneholder CBP (CREB bindende protein ) og p300-begge histon-acetyltransferaser (HAT) - så vel som BRG1 (et kromatinomdannelsesprotein). Vi fortsetter å vise at kronisk eksponering for kokain endrer nukleare nivåer av PSMC5, en ATPase-holdig underenhet av 19S-proteasomalkomplekset, i NAc og at PSMC5 i sin tur styrer adferdsresponsene mot kokain.

Materiale og metode

Gjær to-hybrid screening

MaV203 gjærceller (Invitrogen Life Technologies) ble samtransfektert med pDBLeu som kjørte forskjellige fragmenter av ΔFosB-proteinet, og et musens hjernebibliotek ble subklonet i pPC86 (Invitrogen Life Technologies). Transformerte celler ble dyrket på SC-medium som manglet leucin, tryptofan og histidin, og inneholdt 10 mM 3-aminotriazol. Binding mellom FosB-fragmenter og en kandidatpartner induserer tre reportergener (His3, Ura3og LacZ), og induksjonen gjør transformanter i stand til å overleve under de anvendte dyrkede forhold. Positive kloner ble testet med friske pDBLeu-FosB-fragmenter ved retransformasjonsanalyser i MaV203-celler.

Cellelinjer

Mus Neuro 2A neuroblastomceller (ATCC) ble opprettholdt i Eagles minimum essensielle medium (EMEM) (ATCC), supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C og 5% CO2. Rat 1A-celler var en gave fra Yusaku Nakabeppu (Fukuoka, Japan) [18] og opprettholdt i Dulbeccos MEM (DMEM) (Life Technologies), supplert med 10% FBS ved 37 ° C og 5% CO2. Transfeksjon av celler med plasmid-DNA ble oppnådd under anvendelse av Effectene (Qiagen) i henhold til produsentens instruksjoner.

PSMC5 og ΔFosB konstruksjoner

Flere mutantformer av PSMC5, hver FLAG-merket ved deres N-terminus, ble generert for bruk i immunpresipitasjon eller virusmedierte genoverføringseksperimenter. Disse inkluderte: PSMC5-K196M, PSMC5-coiled-coil-domene (PSMC5 -ΔCC, manglende aminosyrer 27-68), PSMC5-NT (bestående av det N-terminale fragmentet av proteinet, aminosyrene 1-151) og PSMC5 -CT (bestående av det C-terminale fragmentet av proteinet, 172 aminosyrer) (se fig 1). Vi benyttet også N-terminale MYC-merkede former av wildtype ΔFosB samt ΔFosB med en mutasjon i sitt leucin-zipper-domene (mutasjon av aminosyrer 182 til 205 som er kjent for å utelukke heterodimerisering med Jun-familieproteiner [6].

thumbnail
Fig 1. ΔFosB binder til PSMC5 in vitro.

 

A. Skjematisk av ΔFosB, FosB-LZM hvor leucin-glidelåsdomenet er mutert for å utelukke ΔFosB-heterodimerisering med Jun-proteiner, og Δ2ΔFosB som mangler de første 78-aminosyrene i FFBB-N-terminalen. B. Schematisk av PSMC5, PSMC5-NT som omfatter de første 151-aminosyrene av PSMC5, PSMC5-CT som mangler de første 235-aminosyrene av PSMC5 og PSMC5 -ΔCC som mangler coiled-coil-domenet (aminosyrer 28-68) . AAA-domenet tilsvarer et motiv, ATPaser assosiert med forskjellige cellulære aktiviteter, tilstede i mange ATPaser. C. 2.4 μg pcDNA3.1-FosB (baner 1-4) eller FosB-LZM (lane 5) ble trans-transfektert med 2.4 μg FLAG-merket PSMC5 eller forskjellige deletjonsmutanter i Neuro2a-celler. To dager etter transfeksjon ble celler lysert og utsatt for immunutfelling med et anti-FLAG-antistoff og deretter Western blottet med anti-FosB eller anti-FLAG antistoff. Merk at ΔFosB, men ikke ΔFosB-LZM, binder robust til PSMC5 eller PSMC5-NT, men ikke PSMC5-CT eller PSMC5 -ΔC. Dataene vist i figuren ble replikert i tre eksemplarer i hver av tre separate eksperimenter.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g001

dyr

Nine til 11-uker gamle C57BL / 6J hanmus (The Jackson Laboratory) ble brukt til alle eksperimenter. Dyr ble plassert på en 12-h lysmyk syklus med tilgang til mat og vann ad libitum og ble habituated 1 uke før eksperimentering. To kokainbehandlingsregimer ble brukt. For å studere de biokjemiske effektene av kokain fikk dyrene 7 daglige doser kokain (20 mg / kg) eller saltvann, og ble drept ved avfallsbehandling 24 timer etter siste injeksjon. Dette er en standardprotokoll, som har vist seg å produsere en rekke molekylære og cellulære responser på stoffet [7]. For å studere innflytelsen fra PSMC5 i kjernevirksomhet på adferdsresponser mot kokain brukte vi en subtreshold dose av legemidlet (7.5 mg / kg, se lokaliserende sensibilisering nedenfor) basert på hypotesen om at PSMC5, som ΔFosB, ville øke et dyrs følsomhet overfor kokain [8]. Alle dyreforsøk ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee på Mount Sinai.

Immunpresipitasjon og Western blotting

Neuro 2A-celler ble transfektert med wildtype eller mutantformer av PSMC5. To dager etter transfeksjon ble celler vasket i PBS, lysert i RIPA buffer (50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0.25% natriumdeokoksolat, 10 mM natriumbutyrat, proteaseinhibitor-cocktail) . Lysater ble delt og inkubert med enten ikke-immune IgG (Sigma) eller anti-FLAG-antistoffer (Sigma) for 3 timer ved 4 ° C. Immunutfelling ble utført med Protein G-perler (Invitrogen) som beskrevet [19]. Kort fortalt ble immunoprecipiterte proteiner utsatt for SDS-PAGE og analysert ved Western blotting ved bruk av anti-FosB / FFB B antistoff (Cell Signaling Technology) basert på publiserte protokoller [7]. For in vivo proteinbindingsanalyser brukte vi rensede nukleære fraksjoner fra stansdissektert NAc av mus etter kronisk kokainbehandling (20 mg / kg IP daglig i 7 dager, med mus brukt 24 timer etter siste injeksjon). Co-immunutfelling fra nukleære fraksjoner ble utført ved bruk av Nuclear Complex Co-IP-settet (Active Motif) i henhold til produsentens instruksjoner. Følgende antistoffer ble anvendt: MYC eller ß-actin, Cell Signal Technology (Danvers, MA), PSMC5 og histon H3, Abcam (Cambridge, MA), CBP, p300 og BRG1, Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) og FLAG M2, Sigma.

immunhistokjemi

Immunohistokjemi ble utført i henhold til publiserte prosedyrer [20]. Musene ble bedøvet og perfusert intrakardielt med 4% paraformaldehyd i PBS. Hjernen ble kryobeskyttet med 30% sukrose og deretter frosset og lagret ved -80 ° C til bruk. Koronale seksjoner (40 μm) ble kuttet på en kryostat og behandlet for immunhistokjemi. Frittflytende seksjoner ble forinkubert i en blokkeringsbuffer inneholdende 0.3% Triton og 3% normalt eselserum. ΔFosB ble detektert ved å bruke et geit polyklonalt antistoff hevet mot den N-terminale delen av proteinet (1 / 1000 Santa Cruz Biotechnology). PSMC5 ble påvist ved bruk av et kaninpolyklonalt antistoff (1 / 100 Abcam, Cambridge, MA). Bilder ble tatt med et konfokalt mikroskop (60x forstørrelse; Zeiss).

Lokomotorisk sensibilisering

Alle mus fikk daglig IP-injeksjoner av saltvann i 3-dager for å habituere dem til spenningen ved injeksjonene. Neste dag ble mus injisert IP med saltoppløsning eller en subthreshold dose kokain (7.5 mg / kg, se under Dyr over) og plassert umiddelbart inn i nye lokomotoriske bokser. Den lokomotoriske aktiviteten til musene ble registrert ved bruk av et fotobjelkesystem som ambulerende strålebryter for 30 min. Disse behandlingene ble gjentatt daglig i 3 dager.

Viral-mediert genoverføring

Vi brukte utbredt publiserte metoder for virusmediert genoverføring [7,8,11,19]. Kortfattet ble ekspressionsplasmider for PSMC5 eller for flere av dets mutanter (se PSMC5 og ΔFosB-konstruksjoner ovenfor) subklonet inn i det bicistroniske p1005 (+) HSV-plasmid-uttrykkende GFP under kontroll av CMV-promotoren og PSMC5 eller dets mutanter under den av IE4 / 5-promotor. Under ketamin (100 mg / kg) / xylazin (10 mg / kg) anestesi ble musene plassert i et stereotaksisk instrument med liten dyre, og kranialoverflaten ble eksponert. Trettiseks gauge sprøyte nåler ble brukt til bilateralt infusjon av 0.5 μl av en HSV vektor i NAc ved en 10 ° vinkel (AP + 1.6; ML + 1.5; DV-4.4) med en hastighet på 0.1 μl / min. Dyr som mottok HSV-injeksjoner fikk lov til å gjenvinne i 2 dager etter kirurgi før eksperimentering.

Statistikk

ANOVA og studentens t-tester ble brukt, korrigert for flere sammenligninger, med betydning satt til p <0.05.

Resultater

PSMC5: roman bindingspartner av ΔFosB

Vi utførte foreløpige eksperimenter for å identifisere et passende fragment av ΔFosB som tjente som agn i en gjær-to-hybrid-analyse uten å automatisk aktivere systemet. Holo-AFosB indusert reportergenaktivitet i seg selv, som det N-terminale 1-78-aminosyrefragmentet av proteinet. Imidlertid er en N-terminal avkortet ΔFosB (Fig 1A), kalt Δ2ΔFosB, som mangler de første 78-aminosyrene i proteinet, hadde ikke denne effekten. Derfor brukte vi Δ2ΔFosB som agnprotein.

For å skjerme for potensielle bindende partnere brukte vi et hjernebibliotek i mus subklonet i pPC86. Vi identifiserte 11-kandidater for bindende partnere. Selv om disse proteinene inneholdt ΔFosBs kjente heterodimeriseringspartnere, c-Jun og JunD (Tabell 1), den mest utbredte kandidaten var langt PSMC5. Mens det var overraskende, var dette et interessant funn, siden PSMC5 ble vist i en enkelt rapport for år siden for å binde til c-Fos in vitro [21]. Det er imidlertid ingen tidligere rapporter om PSMC5 involvering i kokainaksjon. Likevel, på grunn av styrken av PSMC5-signalet i gjær-to-hybrid-analysen, satte vi ut for å videre studere mulige ΔFosB-PSMC5-interaksjoner.

thumbnail
Tabell 1. Resultat av gjær-to-hybrid screening med Δ2ΔFosB.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.t001

For det første, for å bekrefte den fysiske samspillet mellom ΔFosB og PSMC5, utførte vi in ​​vitro co-immunpresipitasjonsforsøk. Vi fant at FLAG-merket PSMC5 (Fig. 1B), transfektert inn i Neuro 2A-celler, effektivt trukket ned ΔFosB (Fig. 1C). For det andre, for å identifisere regionen i PSMC5 som er ansvarlig for dens binding til ΔFosB, genererte vi flere FLAG-merkede PSMC5-mutanter (Fig. 1B) og gjentatt co-immunpresipitasjonsforsøket. ΔFosB ble trukket ned effektivt med de N-terminale 151-aminosyrene av PSMC5 (PSMC5-NT), men ikke med det C-terminale 172-aminosyrefragmentet av proteinet (PSMC5-CT) (Fig. 1C). PSMC5 mangler sitt coiled spole domene (PSMC5 -ΔCC) var også ineffektivt ved utfelling av FFB. Disse funnene antyder at PSMC5 binder ΔFosB via sitt coiled-coil-domene (aminosyrer 27-68). Videre utfelt FLAG-merket PSMC5 ikke en mutant form avFosB med et mutert leucin-glidelås-domene (AFosB-LZM) (Fig. 1C), som indikerer at ΔFosB enten binder PSMC5 gjennom dette domenet eller mer sannsynlig at ΔFosB heterodimerisering er nødvendig for PSMC5-binding.

PSMC5-ΔFosB binding i NAc etter kronisk kokainadministrasjon

Basert på disse funnene in vitro, studerte vi om PSMC5-nivåene i NAc endres som respons på kronisk kokainadministrasjon. Vi fant ved subcellulær fraksjonering og Western blotting at kronisk kokain øker nukleare nivåer av PSMC5 i denne hjerneområdet uten endring i cytoplasmatiske nivåer (Fig 2A). Denne effekten ble ikke sett etter single doser kokain (data ikke vist). Vi undersøkte nå lokaliseringen av PSMC5 og ΔFosB i NAc ved konfokal immunfluorescensmikroskopi. Vi analyserte mus 24 timer etter den siste gjentatte dosen kokain, et tidspunkt da ΔFosB er den eneste detekterbare FosB genprodukt (se Nestler 2008). Vi fant sterk PSMC5 immunoreaktivitet i NAc, inkludert et sterkt kjernesignal. ~ 85% av ΔFosB + -kjerner co-farget for PSMC5 (Fig. 2B). I tillegg utførte vi co-immunpresipitasjonseksperimenter på NAc-ekstrakter og fant at, etter kronisk kokainbehandling, ble ΔFosB trukket effektivt ned av et anti-PSMC5-antistoff (anti-PSMCXNUMX-antistoffFig. 2C). I motsetning til dette viste analysen av narkotika-naivt NAc (etter gjentatte saltvannsinjeksjoner) ikke detekterbar ΔFosB-trekk ned (data ikke vist). Disse dataene stemmer overens med våre funn i cellekultur og bekrefter at ΔFosB og PSMC5 interagerer i NAc in vivo.

thumbnail
Fig 2. PSMC5 regulering i mus NAc.

 

A. Western blotting av kjernefysiske og cytosoliske fraksjoner av NAc av mus behandlet daglig med saltvann eller kokain (20 mg / kg) i 7 dager, med dyr analysert 24 timer etter siste injeksjon. Kokain øker kjernefysiske men ikke cytosoliske nivåer av PSMC5. Histon H3 og ß-aktin, som ikke ble påvirket av kokain, ble brukt som lastekontroller. Data er gjennomsnitt ± SEM (n = 8-10 / gruppe, * p <0.05). B. Samlokalisering av endogent PSMC5 (grønt) og ΔFosB (blått) i NAc hos mus behandlet kronisk med kokain som i AC Nukleære lysater av mus NAc etter kronisk kokainbehandling ble utsatt for immunutfelling med anti-PSMC5 antistoff eller IgG fra mus som kontroll og deretter Western blottet med anti-FosB / ΔFosB antistoff. Figuren viser PSMC5-ΔFosB-interaksjoner i NAc in vivo. Data i B og C ble replikert i tre eksemplarer i hvert av de tre separate eksperimentene.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g002

PSMC5 forbedrer ΔFosB-ekspresjon in vitro

Siden PSMC5 er et kjent medlem av proteasomkomplekset, testet vi om det regulerer ΔFosB-nivåer ved hjelp av Rat 1A-celler. PSMC5 overekspresjon hadde ingen effekt på basale nivåer av FFosB, men forårsaket en liten, men signifikant forbedring avFosB-induksjon på serumstimulering av cellene (Fig 3A). En lignende trend ble observert for full lengde FosB, men effekten oppnådde ikke statistisk betydning. Omvendt påvirket undertrykking av endogent PSMC5-ekspresjon i Rat 1A-celler, oppnådd ved bruk av siRNAer som målrettet PSMC5, ikke basale FosB-nivåer, men sterkt hemmet FosB-induksjon ved serumstimulering (Fig. 3B). Lignende effekter ble observert for full lengde FosB. Disse dataene antyder at PSMC5 ikke fremmer proteasomal nedbrytning av ΔFosB, som kan forventes som en kjerneunderenhet av proteasomet, men i stedet kreves for maksimal akkumulering av FosB genprodukter in vitro, kanskje gjennom stabilisering av proteiner.

thumbnail
Fig 3. PSMC5 regulering av FosB / ΔFosB ekspresjon i Rat 1A celler.

 

A. Rotte 1A-celler ble transfektert med 4 ug PSMC5 eller kontroll-DNA. PSMC5-overuttrykk hadde ingen effekt på basale ekspressjonsnivåer av FosB eller ΔFosB-protein som bestemt ved Western-blotting, men produserte en liten, men signifikant økning i induksjonen av ΔFosB ved serumstimulering (F (2,21) = 9.75, p = 0.001). B. Rotte 1A-celler ble transfektert med 5 pmol av en av to siRNAer eller kryptert RNA (kontroll). Begge siRNAene reduserte effektivt PSMC5-proteinnivået sammenlignet med kontrollbetingelser (siRNA # 1, 23 ± 5% av kontrollen; siRNA # 2, 18 ± 6%; p <0.05; n = 4). PSMC5-knockdown hadde ingen effekt på basale nivåer av FosB eller ΔFosB, men dempet induksjonen av både FosB og ΔFosB ved serumstimulering (FosB: F (2,6) = 20.99, p = 0.002; ΔFosB: F (2,6) = 22.83 , p = 0.002).

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g003

ΔFosB og PSMC5 formkomplekser med CBP, p300 og BRG1 i NAc

For bedre å forstå transkripsjonsmekanismer som PSMC5 kan påvirke ΔFosB-funksjonen, undersøkte vi mulige ytterligere bindingspartnere for de to proteinene i NAc under kroniske kokainbehandlede forhold. Det er en rapport som PSMC5 binder til CBP-a HAT-og øker histon H3-acetylering ved den proximale MHC-II-promotoren i HeLa-celler [22]. Videre viser mus som er mangelfull i CBP redusert atferdsfølsomhet for kokain, samt redusert histonacetylering ved FosB promotor [23]. Vi testet dermed om PSMC5 kan binde med ΔFosB som en del av komplekser som også inneholder CBP og kanskje andre transkripsjonelle aktivatorer.

Vi demonstrerte først at ΔFosB effektivt trukket ned både CBP og p300, en relatert HAT, i Neuro2A-celler (Fig 4A). I motsetning til dette viste leucin-glidelåsmutantformen avFosB, som forventet, ikke denne aktiviteten. På samme måte trakk PSMC5 effektivt CBP og p300 (Fig. 4B). Interessant, denne effekten ble også sett for PSMC5 -ΔC, som ikke trakk ned ΔFosB, noe som indikerte at PSMC5 interagerer med CBP og p300 via andre domener av proteinet og uavhengig av bindingen til FosB.

thumbnail
Fig 4. ΔFosB og PSMC5 interagerer med CBP, p300 og BRG1 in vitro og in vivo.

 

A. Neuro2A-celler ble transfektert med 2.4 μg MYC-merket ΔFosB eller MYC-merket FosB-LZM. Celleekstrakter ble immunpresipitert med anti-CBP- eller anti-p300-antistoff, og utfelling ble Western blottet med det samme antistoff eller med anti-MYC antistoff. Både CBP og p300 virker sammen med ΔFosB, og slike interaksjoner krever en intakt leucin glidelås. B. Neuro2A-celler ble transfektert med 2.4 μg FLAG-merket PSMC5 eller FLAG-merket PSMC5 -ΔCC. Celleekstrakter ble immunpresipitert med anti-CBP eller anti-p300-antistoff, og utfellingen ble vestlig blottet med det samme antistoff eller med anti-FLAG-antistoff. Både CBP og p300 interagerer med PSMC5, og slike interaksjoner krever ikke CC-domenet. C. Kjernelysater av mus NAc etter kronisk kokainbehandling ble utsatt for immunutfelling med anti-CBP eller anti-p300-antistoff. Etterfølgende Western blotting av resulterende utfelter med anti-FosB / FFB B antistoff viste endogene vekselvirkninger mellom ΔFosB og CBP / p300. D. Alikvoter av de samme nukleære lysater ble utsatt for immunutfelling med anti-BRG1 eller anti-PSMC5 antistoff, fulgt av Western blotting av utfelter med anti-FosB / FFB eller anti-BRG1 antistoff. Resultatene viser endogene samspill mellom ΔFosB og BRG1, og BRG1 og PSMC5. E. Skjematisk illustrasjon av transkripsjonal aktiveringskompleks sammensatt av FFosB: JunD heterodimerer som interagerer med CBP / p300, BRG1 og PSMC5.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g004

For å bekrefte at disse interaksjonene også forekommer in vivo, administrerte vi kokain kronisk for å indusere ΔFosB og nukleær PSMC5 nivåer, deretter immunutfellede NAc-ekstrakter med anti-CBP eller anti-p300 antistoffer. I overensstemmelse med våre cellekulturdata, ble immunpresipitasjon av CBP eller p300 trukket effektivt ned avFosB (Fig. 4C). Vi testet om BRG1, en kjerneunderenhet av SWI-SNF-kromatin-remodelingskomplekset, også kan binde til ΔFosB og PSMC5, basert på vår tidligere konstatering av at BRG1 rekrutteres til bestemte ΔFosB målgener i samspill med deres aktivering i NAc etter kronisk kokain [24]. Vi fant at immunutfelling av BRG1 trakk ned ΔFosB i NAc-ekstrakter, og at immunutfelling av PSMC5 på samme måte utfelt endogen BRG1 (Fig 4D). Samlet sett antyder disse resultatene at ΔFosB-PSMC5 danner komplekser i NAc som også inkluderer CBP / p300 og BRG1 (Fig 4E).

PSMC5 overekspresjon øker lokomotoriske responser på kokain

Den fremtredende bindingen av PSMC5 med ΔFosB i NAc ba oss undersøke om økende PSMC5 nivåer i denne hjernegruppen regulerer atferdsresponser mot kokain. Vi genererte en herpes Simplex Virus (HSV) vektor som overuttrykker enten wildtype PSMC5 eller en av dens mutanter og validert vektorer i NAc in vivo (Fig 5A). Viral-mediert uttrykk for PSMC5 dominerer i cellekjernen (Fig. 5B). Mus overuttrykkende wild-type PSMC5 viste ikke endrede responser på innledende doser kokain, men viste økt lokomotorisk aktivering som respons på gjentatte kokaindoser sammenlignet med GFP-uttrykkende kontrollmus. I motsetning til dette viser mus som overuttrykker en mutant form av PSMC5 som mangler sitt coiled-coil-domene (PSMC5 -ΔCC) ikke denne effekten (Fig. 5B). Interessant er overekspresjon av PSMC5-K196M, som mangler ATPase-aktiviteten til wildtype-proteinet, også potensialert kokainens lokomotoriske responser.

thumbnail
Fig 5. PSMC5 overeksprimering i NAc øker lokomotoriske responser på kokain.

 

A. Representant HSV-mediert transgenekspresjon i medial NAc. AC, fremre kommisjon. NAc kjerne- og skjellregioner er notert på figuren. B. Representative høyere forstørrelser (60x) av immunhistokjemisk farging av PSMC5 i NAc-neuroner etter HSV-PSMC5-injeksjon, som viser at proteinet er overveiende kjernefysisk som markert av DAPI-farging. C. Mus mottok bilaterale HSV-injeksjoner i NAc etterfulgt av daglige IP-injeksjoner av subthreshold-doser kokain (7.5 mg / kg). Lokomotoriske responser vises som respons på den første og siste av 3 daglige doser av stoffet. Overekspresjon av PSMC5 eller PSMC5-K196M øker lokomotoriske responser på gjentatt kokain, en effekt som ikke sees med PSMC5-ACC. Det var ingen signifikant effekt av transgenene på lokomotorisk respons på innledende kokaindoser. ANOVA F (3,125) = 4.163, * p <0.05 ved Dunnetts posthoc-test.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g005

Diskusjon

Resultatene fra den foreliggende studien avslører en ny mekanisme som ΔFosB medierer sine effekter på hjernen og en ny mekanisme involvert i kokainhandling. Ved bruk av en upartisk tilnærming, en gjær-to-hybrid-analyse, identifiserte vi PSMC5 som en ny bindingspartner for ΔFosB. Vi validerte dette funnet både i dyrkede celler in vitro og i NAc in vivo ved å demonstrere robust PSMC5-FosB binding. Viktig er at nukleare nivåer av PSMC5 er indusert i NAc ved kronisk kokainadministrasjon. Vi viste videre at PSMC5-FosB-binding skjer i samspill med flere andre transkriptionelle aktivatorproteiner, nemlig CBP og p300 (to HAT) og BRG1 (en nøkkelbestanddel av SWI-SNF-kromatin-remodelingskomplekser). Sammen støtter våre funn hypotesen om at PSMC5 er en del av det transkripsjonelle aktiveringskomplekset som rekrutteres til i det minste bestemte ΔFosB-induserte gener i løpet av kronisk kokainadministrasjon (Fig 4E). I samsvar med denne hypotesen er det ytterligere funnet at overekspresjon av PSMC5 i NAc, som overekspresjonen av FosB selv, fremmer adferdsresponser mot kokain. Det ville være interessant i fremtidige studier for å følge opp disse in vivo observasjonene med karakterisering av PSMC5-FFBB-HAT-BRG1-interaksjoner ved bruk av in vitro reporter-analyser.

Innsatsen av PSMC5 i kokainhandling er helt ny. Identifisert først som medlem av en stor familie av ATPaser som omfatter proteasomet, har PSMC5 vist seg gjennom årene for å interagere med flere transkripsjonsfaktorer, inkludert c-Fos, p53, nukleære hormonreceptorer og bestanddeler i det basale transkripsjonskomplekset [25], men få funksjonsstudier har blitt utført gjennom årene [26]. Den best etablerte handlingen er å fremme aktiviteten til MYC transkripsjonsfaktorer i dyrkede celler [27]. Implikasjonen av PSMC5 i transkripsjonsmekanismer har antydet en potensiell rolle for ubiquitinasjons-proteasomal aktivitet i reguleringen av gentranskripsjon, men involveringen av PSMC5 i slik regulering forblir nesten uprøvd til dags dato [28,29].

Meget lite er kjent om PSMC5-funksjonen i hjernen. En tidligere studie viste utbredt uttrykk for PSMC5 mRNA gjennom hjernen [30], men dens funksjonelle aktivitet har forblitt ustudiet. Våre funn oppfordrer nå videre undersøkelser av dette interessante proteinet for bedre å forstå sin rolle i regulering av gentranskripsjon og dens forhold til ubiquitinations-proteasomalfunksjon i hjernen. Bindingen av PSMC5 til ΔFosB er formidlet av PSMC5s coiled-coil-domene. Videre krever ikke PSMC5s evne til å fremme lokomotoriske responser på kokain, mens det kreves det coiled-coil-domenet, ikke ATPase-aktiviteten som er iboende for proteinet. Disse resultatene øker muligheten for at hovedaktiviteten til PSMC5, i hvert fall i vårt system, kan formidles gjennom sin binding til ΔFosB og andre transkripsjonelle regulatoriske proteiner og ikke gjennom dens proteasomal-relaterte aktivitet i seg selv. Ytterligere arbeid er nødvendig for å teste disse og alternative muligheter direkte. Hypotesen om at viralmediert overekspresjon av PSMC5 økte lokomotoriske responser på kokain via interaksjoner med ΔFosB er troverdig, til tross for bruk av en 3-dag kokainbehandlingsregime, fordi det er kjent at vesentlige nivåer av ΔFosB akkumulerer i hjernen innenfor denne tidsrammen [3].

De foreliggende funnene underbygger videre bruken av å anvende objektive, åpenbare eksperimentelle tilnærminger ved å studere molekylære grunnlaget for hjerneforskriften. Vår opprinnelige oppmerksomhet til PSMC5 var basert utelukkende på sin fremtredende binding til ΔFosB i en gjær-to-hybrid-analyse, men det ser ut til å være en viktig komponent i transkriptjonsendringer som rekrutteres i NAc ved gjentatt kokainadministrasjon. En bedre forståelse av de detaljerte mekanismer ved hvilke kjernefysiske nivåer av PSMC5 er indusert av kokain og, i sin tur, hvorav PSMC5 bidrar deretter til kokaininducerte transkriptionelle aktiveringskomplekser, er fokus for dagens undersøkelser. I mellomtiden avslørte våre gjær-to-hybrid-analyser flere flere formodede bindingspartnere av ΔFosB (Tabell 1) som også nå garanterer direkte undersøkelse i kokainmodeller. Sammen bidrar dette arbeidet til en økende forståelse av de komplekse molekylære mekanismene gjennom hvilke kokain forandrer NAc-funksjonen.

Erkjennelsene

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Nasjonalt institutt for narkotikamisbruk, og av Ishibashi-stiftelsen og Japans samfunn for fremme av vitenskap (KAKENHI-tall: 24591735, 26290064, 25116010).

Forfatterbidrag

Utviklet og designet eksperimenter: YHO YNO EJN. Utførte forsøkene: YHO YNO PJK RN. Analyserte dataene: YHO YNO EJN. Bidragede reagenser / materialer / analyseverktøy: TN MO OY AN RN TT. Skrev papiret: YHO EJN.

Referanser

  1. 1. Morgan JI, Curran T (1995) Umiddelbare tidlige gener: ti år på. Trender Neurosci 18: 66-67. pmid: 7537412 doi: 10.1016 / 0166-2236 (95) 80022-t
  2. 2. Nestler EJ (2008) Transkripsjonsmekanismer av avhengighet: deltaFosB-rolle. Philos Trans R Soc London B Biol Sci 363: 3245-3255. doi: 10.1098 / rstb.2008.0067. PMID: 18640924
  3. Se artikkelen
  4. PubMed / NCBI
  5. Google Scholar
  6. Se artikkelen
  7. PubMed / NCBI
  8. Google Scholar
  9. Se artikkelen
  10. PubMed / NCBI
  11. Google Scholar
  12. Se artikkelen
  13. PubMed / NCBI
  14. Google Scholar
  15. Se artikkelen
  16. PubMed / NCBI
  17. Google Scholar
  18. Se artikkelen
  19. PubMed / NCBI
  20. Google Scholar
  21. Se artikkelen
  22. PubMed / NCBI
  23. Google Scholar
  24. Se artikkelen
  25. PubMed / NCBI
  26. Google Scholar
  27. Se artikkelen
  28. PubMed / NCBI
  29. Google Scholar
  30. Se artikkelen
  31. PubMed / NCBI
  32. Google Scholar
  33. Se artikkelen
  34. PubMed / NCBI
  35. Google Scholar
  36. Se artikkelen
  37. PubMed / NCBI
  38. Google Scholar
  39. Se artikkelen
  40. PubMed / NCBI
  41. Google Scholar
  42. Se artikkelen
  43. PubMed / NCBI
  44. Google Scholar
  45. Se artikkelen
  46. PubMed / NCBI
  47. Google Scholar
  48. Se artikkelen
  49. PubMed / NCBI
  50. Google Scholar
  51. Se artikkelen
  52. PubMed / NCBI
  53. Google Scholar
  54. Se artikkelen
  55. PubMed / NCBI
  56. Google Scholar
  57. Se artikkelen
  58. PubMed / NCBI
  59. Google Scholar
  60. Se artikkelen
  61. PubMed / NCBI
  62. Google Scholar
  63. Se artikkelen
  64. PubMed / NCBI
  65. Google Scholar
  66. Se artikkelen
  67. PubMed / NCBI
  68. Google Scholar
  69. Se artikkelen
  70. PubMed / NCBI
  71. Google Scholar
  72. Se artikkelen
  73. PubMed / NCBI
  74. Google Scholar
  75. Se artikkelen
  76. PubMed / NCBI
  77. Google Scholar
  78. Se artikkelen
  79. PubMed / NCBI
  80. Google Scholar
  81. Se artikkelen
  82. PubMed / NCBI
  83. Google Scholar
  84. Se artikkelen
  85. PubMed / NCBI
  86. Google Scholar
  87. Se artikkelen
  88. PubMed / NCBI
  89. Google Scholar
  90. 3. Håper BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, et al. (1994) Induksjon av et langvarig AP-1-kompleks bestående av endrede Fos-lignende proteiner i hjernen ved kronisk kokain og andre kroniske behandlinger. Neuron 13: 1235-1244. pmid: 7946359 doi: 10.1016 / 0896-6273 (94) 90061-2
  91. 4. Hiroi N, Brown J, Haile C, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ (1997) FosB-mutante mus: Tap av kronisk kokaininduksjon av Fos-relaterte proteiner og økt følsomhet for kokainens psykomotoriske og givende effekter. Proc Natl Acad Sci USA 94: 10397–10402. pmid: 9294222 doi: 10.1073 / pnas.94.19.10397
  92. 5. Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ (2006) Regulering av ΔFosB stabilitet ved fosforylering. J Neurosci 26: 5131-5142. pmid: 16687504 doi: 10.1523 / jneurosci.4970-05.2006
  93. 6. Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A, et al. (2007) Fravær av konservert C-terminal degron-domene bidrar til ΔFosBs unike stabilitet. Eur J Neurosci 25: 3009-3019. PMID: 17561814
  94. 7. Robison AJ, Vialou V, Mazei-Robison M, Feng J, Kourrich S, Collins M, et al. (2013) Behavioral og strukturelle responser på kronisk kokain krever en feed-forward-sløyfe som involverer ΔFosB og CaMKII i nucleus accumbens skallet. J Neurosci 33: 4295-4307 doi: 10.1523 / JNEUROSCI.5192-12.2013. PMID: 23467346
  95. 8. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, et al. (1999) Ekspresjon av transkripsjonsfaktoren ΔFosB i hjernen styrer følsomheten for kokain. Natur 401: 272-276. PMID: 10499584
  96. 9. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW (2003) ΔFosB forbedrer incitamentet til kokain. J Neurosci 23: 2488-2493. PMID: 12657709
  97. 10. McClung CA, Nestler EJ (2003) Regulering av genuttrykk og kokainbelønning av CREB og DFosB. Nat Neurosci 11: 1208-1215. pmid: 14566342 doi: 10.1038 / nn1143
  98. 11. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, et al. (2006) ΔFosB: En viktig rolle for ΔFosB i nucleus accumbens i morfinvirkning. Nature Neurosci 9: 205-211. pmid: 16415864 doi: 10.1038 / nn1636
  99. 12. Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, et al. (2003) Induktivt hjernegruppespesifikt uttrykk for en dominant negativ mutant av c-Jun i transgene mus reduserer følsomheten for kokain. Brain Res 970: 73-86. pmid: 12706249 doi: 10.1016 / s0006-8993 (03) 02230-3
  100. 13. Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, et al. (1995) Regulering av delta FosB og FosB-lignende proteiner ved elektrokonvulsiv anfall og kokainbehandling. Mol Pharmacol 48: 880-889. PMID: 7476919
  101. 14. Hiroi N, Marek GJ, Brown J, Ye H, Saudou F, Vaidya VA, et al. (1998) Vesentlig rolle fosB-genet i molekylære, cellulære og adferdshandlinger av elektrokonvulsive anfall. J Neurosci 18: 6952-6962. PMID: 9712664
  102. 15. Perez-Otano I, Mandelzys A, Morgan JI (1998) MPTP Parkinsonisme ledsages av vedvarende ekspresjon av et D-FosB-lignende protein i dopaminerge veier. Mol Brain Res 53: 41-52. pmid: 9473580 doi: 10.1016 / s0169-328x (97) 00269-6
  103. 16. Ma J, Ptashne M (1988) Konvertering av en eukaryotisk transkripsjonshemmende til en aktivator. Cell 55: 443-446. pmid: 3180218 doi: 10.1016 / 0092-8674 (88) 90030-x
  104. 17. Chien CT, Bartel PL, Sternglanz R, Fields S (1991) Det to-hybrid-systemet: en metode for å identifisere og klone gener for proteiner som interagerer med et protein av interesse. Proc Natl Acad Sci USA 88: 9578-9582. pmid: 1946372 doi: 10.1073 / pnas.88.21.9578
  105. 18. Nakabeppu Y 1, Oda S, Sekiguchi M (1993) Proliferativ aktivering av hvile Rat-1A-celler ved delta FosB. Mol Cell Biol 13: 4157-4166. PMID: 8321220
  106. 19. Scobie KN, Damez-Werno D, Sol H, Shao N, Gancarz A, Panganiban CH, et al. (2014) Vesentlig rolle av poly (ADP-ribosyl) ation i kokainvirkning. Proc Natl Acad Sci USA 111: 2005-2010. doi: 10.1073 / pnas.1319703111. PMID: 24449909
  107. 20. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, et al. (2008) Distinkte mønstre av ΔFosB induksjon i hjernen av misbruk. Synapse 62: 358-369. doi: 10.1002 / syn.20500. PMID: 18293355
  108. 21. Wang WL, Chevray PM, Nathans D (1996) Mammalian Sug1 og c-Fos i det nukleare 26S proteasomet. Proc Natl Acad Sci USA 93: 8236-8240. pmid: 8710853 doi: 10.1073 / pnas.93.16.8236
  109. 22. Koues OI 1, Dudley RK, Truax AD, Gerhardt D, Bhat KP, McNeal S et al. (2008) Regulering av acetylering ved den store histokompatibilitetskomplekset klasse II proksimal promotor av 19S proteasomal ATPase Sug1. Mol Cell Biol 28: 5837-5850. doi: 10.1128 / MCB.00535-08. PMID: 18662994
  110. 23. Levine AA, Guan Z, Barco A, Xu S, Kandel ER, Schwartz JH (2005) CREB-bindende protein styrer respons på kokain ved acetylering av histoner ved fosB-promotoren i musstriatumet. Proc Natl Acad Sci USA 102: 19186-19191. pmid: 16380431 doi: 10.1073 / pnas.0509735102
  111. 24. Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DEH, Truong HT, et al. (2005) Chromatin remodeling er en nøkkelmekanisme som ligger til grunn for kokaininducert plastisitet i striatum. Neuron 48: 303-314. pmid: 16242410 doi: 10.1016 / j.neuron.2005.09.023
  112. 25. St-Arnaud R (1999) To funksjoner for transkripsjonsregulatorer: myte eller virkelighet. J Cell Biochem Suppl 32/33: 32–40. doi: 10.1002 / (sici) 1097-4644 (1999) 75: 32+ <32 :: aid-jcb5> 3.0.co; 2-x
  113. 26. Ferrell K, Wilkinson CRM, Dubiel W, Gordon C (2000) Regulerende subunit-interaksjoner av 26S proteasomet, et komplekst problem. Trender Biochem Sci 25: 83-88. pmid: 10664589 doi: 10.1016 / s0968-0004 (99) 01529-7
  114. 27. von der Lehr N, Johansson S, Larson LG (2003) Implikasjon av ubiquitin / proteasomsystemet i myc-regulert transkripsjon. Celle Cycle 2-5: 403-407. doi: 10.4161 / cc.2.5.484
  115. 28. Geng FQ, Wenzel S, Tansey WP (2012) Ubiquitin og proteasomer i transkripsjon. Annu Rev Biochem 81: 177-201. doi: 10.1146 / annurev-biochem-052110-120012. PMID: 22404630
  116. 29. Collins GA, Tansey WP (2006) Proteasomet: et verktøy for transkripsjon? Curr Op Genet Dev 16: 197-202. PMID: 16503126
  117. 30. Sun DH, Swaffield JC, Johnston SA, Milligan CE, Zoeller RT, Schwartz LM (1997) Identifikasjon av et fylogenetisk konservert Sug1 CAD-familiemedlem som uttrykkes differensielt i musens nervesystem. Dev Neurobiol 33: 877–890. doi: 10.1002 / (sici) 1097-4695 (199712) 33: 7 <877 :: aid-neu2> 3.0.co; 2-5