J Neurosci. 2006 10. mai;26(19):5131–42.
Ulery PG , Rudenko G , Nestler EJ.
Kilde
Institutt for psykiatri, Senter for grunnleggende nevrovitenskap, Universitetet i Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Texas 75390-9070, USA.
Abstrakt
Transkripsjonsfaktoren DeltaFosB (også referert til som FosB2 eller FosB [kortform]) er en viktig mediator av den langsiktige plastisiteten som induseres i hjernen ved kronisk eksponering for flere typer psykoaktive stimuli, inkludert rusmidler, stress og elektrokonvulsive anfall. Et særegent trekk ved DeltaFosB er at det, når det først er indusert, vedvarer i hjernen i relativt lange perioder uten ytterligere stimulering. Mekanismene som ligger til grunn for denne tilsynelatende stabiliteten har imidlertid forblitt ukjente. Her demonstrerer vi at DeltaFosB er en relativt stabil transkripsjonsfaktor, med en halveringstid på omtrent 10 timer i cellekultur. Videre viser vi at DeltaFosB er et fosfoprotein i hjernen, og at fosforylering av en svært konservert serinrest (Ser27) i DeltaFosB beskytter det mot proteasomal nedbrytning. Vi gir flere bevislinjer som tyder på at denne fosforyleringen medieres av kaseinkinase 2. Disse funnene utgjør det første beviset på at DeltaFosB er fosforylert og demonstrerer at fosforylering bidrar til dens stabilitet, som er kjernen i dens evne til å mediere langvarige tilpasninger i hjernen.
Introduksjon
Transkripsjonsfaktoren ΔFosB, også betegnet FosB2 eller FosB[kortform], er en C-terminalt avkortet skjøtevariant av det umiddelbare tidlige genet fosb ( Dobrazanski et al., 1991 ; Nakabeppu og Nathans, 1991 ; Yen et al., 1991 ). I likhet med fullengdes FosB har ΔFosB et DNA-bindende basisk domene og en leucin-glidelås som den dimeriserer med Jun-proteiner gjennom for å danne aktivatorprotein-1 (AP-1) transkripsjonsfaktorkomplekser, som regulerer uttrykket av mange gener ( Morgan og Curran, 1995 ; Rylski og Kaczmarek, 2004 ). Til tross for at det mangler deler av transaktiveringsdomenet som finnes i C-terminalen til FosB, fungerer ΔFosB som både en potent transkripsjonsaktivator og repressor i dyrkede celler og i hjernen ( Dobrazanski et al., 1991 ; Nakabeppu og Nathans, 1991 ; Chen et al., 1997 ; McClung og Nestler, 2003 ; Kumar et al., 2005 ).
ΔFosB er indusert til høye nivåer på en regionspesifikk måte i hjernen etter kronisk, men ikke akutt eksponering for en rekke psykoaktive stimuli, inkludert stress, visse lesjoner, antipsykotiske og antidepressiva stoffer, misbruksmidler og naturlige belønninger. (Håpe et al., 1994b; Hiroi og Graybiel, 1996; Moratalla et al., 1996; Bing et al., 1997; Mandelzys et al., 1997; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002; Andersson et al., 2003; Colby et al., 2003; Peakman et al., 2003; Perrotti et al., 2004; Zachariou et al., 2006). Induksjonen av ΔFosB har vært relatert direkte til de funksjonelle effektene av flere av disse stimuliene på hjernen. Vedvarende ΔFosB, selv i fravær av ytterligere stimulering, skiller den fra alle andre Fos-familietransskripsjonsfaktorer, som raskt induseres som respons på akutte stimuli, faller tilbake til basale nivåer innen noen få timer, og viser generelt desensibilisering etter kronisk stimulering (Håper et al., 1992; Daunais et al., 1993; Persico et al., 1993; Hiroi og Graybiel, 1996; Perrotti et al., 2004). Dette gjør ΔFosB til en attraktiv kandidat til å formidle noen av de langvarige endringene i genuttrykk som ligger til grunn for de stabile nevrononale tilpasninger forårsaket av visse kroniske stimuli.
Fordi den langvarige tilstedeværelsen av ΔFosB forekommer i fravær av ytterligere induksjon av mRNA ( Chen et al., 1995 ), spekulerte vi i at ΔFosB, i motsetning til fullengdes FosB og alle andre Fos-familieproteiner, som er iboende ustabile, kan være en uvanlig stabil transkripsjonsfaktor ( Hope et al., 1994b ; Chen et al., 1997 ; Nestler et al., 2001 ; McClung et al., 2004 ). Dessuten antydet immunoblotting - analyse av akutt versus kronisk stimulert hjernevev at ΔFosB endrer seg i tilsynelatende Mr (molekylmasse) fra ~33 kDa i den akutte tilstanden til ~35–37 kDa under kronisk behandling ( Hope et al., 1994a ; Chen et al., 1995 ). Fordi det ikke finnes bevis for eksistensen av ytterligere mRNA-er som kan kode for disse forskjellige isoformene, spekulerte vi videre i at ΔFosB er posttranslasjonelt modifisert, og at dette kanskje bidrar til dens uvanlige stabilitet. Til dags dato er det imidlertid ikke rapportert om biokjemiske analyser av omsetningen eller posttranslasjonelle modifikasjoner av ΔFosB. Målet med denne studien var å avgjøre om ΔFosB er et fosfoprotein og om fosforylering spiller en rolle i dets stabilitet.
Materialer og metoder
Mammale cellelinjer og DNA-konstruksjoner.
PC12-celler (Clontech, Mountainview, CA) ble dyrket i høyglukose-DMEM som inneholdt l-glutamin (L-Gln) og tilsatt 5 % føtalt bovint serum (FBS), 10 % hesteserum (begge fra Invitrogen, Carlsbad, CA), 100 U/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin (begge fra Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). HeLa-celler (American Type Culture Collection, Manassas, VA) ble dyrket i høyglukose-DMEM som inneholdt L-Gln og tilsatt 10 % FBS, penicillin og streptomycin. Begge cellelinjene ble holdt ved 37 °C i en fuktig 5 % CO2 - atmosfære.
For de transiente transfeksjonene med DNA ble PC12- eller HeLa-celler sådd på seks-brønnsplater (belagt med kollagen I for PC12-celler) for å nå 90–100 % konfluens neste dag, og ble deretter transfektert ved bruk av Lipofectamine 2000 (Invitrogen). I noen eksperimenter (se fig. 1 ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ – 7 ) ble ΔFosB transient uttrykt i PC12-celler via infeksjon med rekombinant herpes simplex-virus (HSV).
ΔFosB- og FosB-cDNA-er ble oppnådd fra våre egne pTetop-konstruksjoner ( Chen et al., 1997 ) og subklonet inn i en pcDNA3.1-vektor (Invitrogen). Disse pcDNA3.1-ΔFosB/FosB-konstruksjonene ble brukt til uttrykk i pattedyrceller og som en mal for stedsrettet mutagenese. Rekombinant HSV-ΔFosB ble fremstilt som tidligere beskrevet ( Neve et al., 1997 ), og preparatet hadde en titer på ~1 × 108 pfu/ml.
Pulse-chase eksperimenter.
Omtrent 24 timer etter infeksjon/transfeksjon ble celler (PC12 eller HeLa) i seksbrønnsplater vasket to til tre ganger med 2 ml PBS og inkubert ved 37 °C i ~1 time i 2 ml Cys/Met-fritt DMEM (Invitrogen) tilsatt 5 % dialysert FBS (Hyclone, Logan, UT) for å tømme intracellulære mengder Met og Cys. På slutten av denne «sulteperioden» ble legemidler (hvis cellene skulle behandles) tilsatt, og cellene ble merket (puls) med 12–25 μCi av 35S Protein Labeling Mix ( PerkinElmer , Wellesley, MA) i ~1 time ved 37 °C for å merke alle nylig syntetiserte proteiner. Radiomerket ble deretter fjernet ved å vaske cellene to til tre ganger med 2 ml PBS, og de 35S -merkede proteinene ble fulgt opp (chase) ved å erstatte mediet med «kaldt» (ikke-radioaktivt) medium tilsatt 5 % FBS og høste cellene på forskjellige tidspunkter. Cellebehandlingene ble opprettholdt gjennom hele chase-prosessen. Alle figurer fra disse eksperimentene viser lignende initiale mengder av de forskjellige proteinene for å optimalisere sammenligninger av deres omsetningshastigheter.
Dyr og kronisk elektrokonvulsiv anfallbehandling.
Voksne Sprague Dawley hannrotter (200–300 g; Charles River Laboratories, Kingston, RI) ble behandlet én gang daglig med elektrokonvulsive anfall (ECS) i 7–9 dager. ECS ble utført som tidligere beskrevet ( Hope et al., 1994a ) ved bruk av en Ugo Basile (Comerio VA, Italia) ECS-enhet med følgende innstillinger: frekvens, 100 pulser/s; puls med 0.5 ms; sjokkvarighet, 1.0 s; og strøm, 75 mA. Simulerte kontrolldyr ble behandlet parallelt ved å påføre øreklipselektrodene uten elektrisk strøm.
32 P metabolisk merking.
For merking av hjerneskiver ble rottene halshugget, hjernene raskt dissekert, og 300 μm frontale kortikale skiver ble preparert med en DSK-mikroslicer (Ted Pella, Redding, CA). Skivene ble inkubert inne i plastrør i 2 ml fosfatfattig kunstig CSF (ACSF) og holdt ved 30 °C under konstant forsiktig bobling med en O2 / CO2 - blanding ( Hemmings et al., 1989 ). Skivene (to skiver per rør) ble merket med 1.3 mCi i 8–10 timer med eller uten okadasyre (100 ng/ml). Ved slutten av denne inkubasjonen ble skivene skylt minst tre ganger med kald ACSF og deretter homogenisert ved sonikering i 250 μl kald radioimmunopresipitasjonsanalyse (RIPA)-buffer [PBS, pH 7.4, 150 mm NaCl, 1 % (v/v) Igepal, 0.5 % (w/v) natriumdeoksykolat, 0.1 % (w/v) SDS, 1 mm EDTA] tilsatt før bruk med SDS opptil 0.6 %, proteasehemmercocktail for pattedyrceller (brukt ved 5 μl/ml; Sigma-Aldrich), fosfatasehemmercocktail I og II (brukt ved 1:100; Sigma-Aldrich), 1 mm PMSF og 2 % glyserol. Homogenatene ble deretter kokt i 15 minutter og klarnet ved sentrifugering ved 15 000 × g i 15 minutter. Proteinkonsentrasjonen i de resulterende supernatantene ble vurdert ved hjelp av BCA-proteinanalysen (Pierce, Holmdel, NJ).
For 32P -merking av dyrkede celler, ~24 timer etter infeksjon/transfeksjon, ble cellene vasket to til tre ganger med fosfatfritt medium og inkubert i dette mediet i ~1 time. Etter denne sulteperioden ble 0.2–0.3 mCi 32P-H3PO4 (PerkinElmer ) tilsatt hver brønn , og cellene ble merket i 4–12 timer avhengig av type eksperiment (se fig. 1–7 for spesifikasjoner). Cellene ble deretter vasket tre ganger med PBS og lysert på is i 15 minutter med 50 μl tilsatt RIPA-buffer. Lysater ble samlet ved skraping og ble ført 10 ganger gjennom en 25 ga nål for å skjære DNA, kokt i 10 minutter og sentrifugert ved 15 000 rpm i 15–30 minutter ved 4 °C. De klare lysatene (supernatantene) ble overført til et nytt rør, og en BCA-proteinanalyse (Pierce) ble utført. Alle figurer fra disse eksperimentene viser lignende mengder av totale villtype (WT) og S27A ΔFosB-proteiner for å optimalisere sammenligninger av deres relative fosforyleringsnivåer.
Kjemikalier og cellekulturbehandlinger.
Okadasyre (OA; Sigma-Aldrich) ble løst opp i etanol og brukt i en sluttkonsentrasjon på 100 ng/ml. 5,6-diklor-1-β-d-ribofuranosyl-benzimidazol (DRB; Biomol, Plymouth Meeting, PA) ble løst opp i dimetylsulfoksid (DMSO; Sigma-Aldrich) og brukt i cellekultur i en sluttkonsentrasjon på 50 μm. Spermin (Sigma-Aldrich) ble løst opp i vann og brukt i en sluttkonsentrasjon på 200 μm. Calphostin-C (Biomol) ble løst opp i DMSO og brukt i 0.2 μm, mens forbol-12-myristat-13-acetat (PMA; Promega, Madison, WI) ble løst opp i DMSO og brukt i 0.1 μm. myristoylert-autocamtide-2-relatert hemmende peptid (m-AIP; Biomol) ble løst opp i vann og brukt i en sluttkonsentrasjon på 1 og 10 μm. De bredspektrede proteinkinasehemmerne H-7 og H-8 (Biomol) ble løst opp i vann og brukt i en sluttkonsentrasjon på henholdsvis 150 og 200 μm. MG132 (Calbiochem, San Diego, CA) og epoxomicin (Peptides International, Louisville, KY) ble begge løst opp i DMSO og brukt i en sluttkonsentrasjon på henholdsvis 12.5 og 7.5 μm. I alle eksperimentene ble DMSO (bærer) tilsatt cellene etter behov for å opprettholde en konstant mengde DMSO på tvers av behandlingene. For 32P -merkingseksperimenter ble legemidlene tilsatt rett før merkingen og oppbevart i resten av merkingsperioden. For puls-chase-eksperimenter ble legemidlene tilsatt på tidspunktet for Cys/Met-"sulting", oppbevart gjennom merkingsperioden og deretter tilsatt tilbake til chase-mediet. Proteasomhemmerne ble tilsatt hver 3.–4. time gjennom hele jakten for å kompensere for den raske omsetningen av disse peptidene.
ΔFosB immunprecipitasjon, immunoblotting og autoradiografi.
For immunutfelling ble lysatene fortynnet 1:5 med ren RIPA for å bringe SDS-konsentrasjonen ned til 0.1 % før immunutfelling (IP) ble utført. For å begrense uspesifikk binding ble lysatene først fjernet ved immunutfelling med ikke-immun IgG og protein G-Sepharose (Sigma-Aldrich) i minst 4 timer. ΔFosB ble deretter immunutfellet fra de fjernede lysatene ved bruk av et polyklonalt geiteantistoff som gjenkjenner en intern epitop som finnes i både FosB og ΔFosB (SC-48G; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) med 0.5–1 μg IgG per 10 μg lysatprotein (50–300 μg totalt protein) i et totalt volum på 0.5 ml. IP-ene ble forsiktig blandet ved 4 °C på en rotor i minst 8 timer, og deretter ble 15 μl protein G-Sepharose tilsatt, og IP-ene ble blandet i minst ytterligere 4 timer. IP-ene ble pelletert ved sentrifugering ved 3000 × g i 3–5 minutter ved 4 °C, vasket tre ganger med 0.5 ml kald, ren RIPA og to ganger med kald PBS som inneholdt 0.1 % Tween 20. IP-ene ble deretter resuspendert i 0.5 ml kald PBS, overført, pelletert i et nytt rør, og immunutfelte proteiner ble deretter eluert ved tilsetning av 15–25 μl 2× reduserende Laemmli-proteinprøvebuffer. Denne IP-protokollen resulterte i spesifikk og effektiv utfelling av praktisk talt all ΔFosB i lysatet. De immunutfelte proteinene ble utsatt for SDS-PAGE ved å laste hele IP-en på en 12.5 % Tris-HCl Criterion-gel (Bio-Rad, Hercules, CA), og deretter overført til PVDF eller nitrocellulose. Etter overføring ble membranen lufttørket, og 32P- og 35S -radiomerkede proteinbånd ble observert ved autoradiografi ved bruk av Kodak (Rochester, NY) autoradiografisk film, samt ved fosforavbildning ved bruk av en Storm (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) PhosphorImager. Total (uposforylert og fosforylert) ΔFosB i cellelysater eller hjernehomogenater ble detektert ved immunoblotting av enten det immunutfelte proteinet (ved bruk av samme membran som ble brukt til å detektere det 32P -merkede proteinet), eller av like mengder lysat/homogenatprotein utsatt for SDS-PAGE og overført til PVDF eller nitrocellulose. Membranen ble først blokkert ved å inkubere den med 1 % (w/v) tørrmelk uten fettinnhold (Bio-Rad) i PBS tilsatt 0.1 % (v/v) Tween 20 (Sigma) i 1 time ved 25 °C. Membranen ble deretter immunoblottet over natten ved 4 °C med vårt eget polyklonale kanin-anti-FosB-antistoff generert mot aminosyrene 1–16 av FosB/ΔFosB (brukt ved 1:10 000). Etter primær inkubasjon ble membranene vasket fire ganger i 5 minutter med blokkeringsbuffer, og deretter inkubert ved 25 °C i ~1 time med et geite-anti-kanin-IgG konjugert til pepperrotperoksidase (brukt ved 1:5000 i blokkeringsbuffer, fra Vector Laboratories, Burlingame, CA). Membranene ble deretter vasket tre ganger i 10 minutter med blokkeringsbuffer og én gang i 5 minutter med PBS. Totale ΔFosB-proteinbånd ble visualisert på Kodak MR-film ved forbedret kjemiluminescens (Pierce) og/eller ved deteksjon av fluorescens ved bruk av ECL-Plus-reagensene (Amersham Biosciences) og Storm PhosphorImager.
Overekspresjon og rensing av rekombinant ΔFosB fra insektceller.
ΔFosB ble overuttrykt i Sf9-insektsceller som et N-terminus-heksa-His-merket protein (N-His (6) ΔFosB) ved hjelp av Bac-to-Bac baculovirus-ekspresjonssystemet (Invitrogen) og i følge produsentens anvisninger. Kort fortalt ble ΔFosB-cDNA (rester 2-237) som ble forhåndsfortalt av den affinitets-N-terminale merken MGHHHHHHAG subklonet i pFASTBacTM1-vektoren, som ble brukt til å generere rekombinant baculovirus. Sf9-celler ble infisert med rekombinant virus, og N-His (6) FFosB ble renset fra cellelysater ved hjelp av flere kromatografiske trinn, inkludert affinitetskromatografi ved anvendelse av en nikkelkolonne (Qiagen, Valencia, CA), anionutveksling ved bruk av en mono Q-kolonne (Amersham Biosciences), og størrelse ekskludering ved hjelp av en gel filtrering kolonne (Amersham Biosciences).
In vitro fosforyleringsstudier.
In vitro -fosforyleringsreaksjoner for tidsforløp og støkiometrianalyse ble utført i et volum på 30 μl som inneholdt 10 μm substrat (N-His(6)ΔFosB eller et positivt kontrollsubstrat), 250 μm ATP og 1 μCi/μl [γ- 32P ]ATP, bufferen levert av kinaseprodusenten, og en av følgende kinaser: CK2 (20 ng/μl; Upstate, Charlottesville, VA), CaMKII (10 ng/μl; Upstate), PKC (1.6 ng/μl; Calbiochem) eller p70S6K (2.5 mU/μl; Upstate). Tidsforløpsreaksjoner ble utført ved å fjerne 5 μl alikvoter fra reaksjonsløsningen på de angitte tidspunktene og tilsette et likt volum av 4× reduserende Laemmli-proteinprøvebuffer. Michaelis-Menten kinetiske parametere for CK2-reaksjonen ble bestemt under empirisk definerte lineære steady-state-betingelser. Disse reaksjonene ble utført i 15 minutter i et volum på 10 μl som inneholdt 2 ng/μl enzym, 250 μm ATP, 1 μCi/μl [γ- 32P ]ATP og N-His(6)ΔFosB-konsentrasjoner i området 2.5–30 μm. Alle reaksjonene ble utført ved 30 °C i et vannbad. Etter SDS-PAGE og farging av gelen med Bio-Safe Coomassie (Bio-Rad) ble gelen tørket, og 32P -fosfatinkorporering ble vurdert ved fosforavbildningsanalyse (se nedenfor, datakvantifisering, beregninger og statistikk).
Tredimensjonal fosforeptidkart og fosfosaminosyreanalyse.
Begge disse analysene ble utført som beskrevet av Ploegh og Dunn (2000) . Kort fortalt ble tørre gelfragmenter som inneholdt 32P -merket ΔFosB (enten fra in vitro -reaksjoner eller fra immunopresipitater av metabolsk merkede celler) fjernet, rehydrert, vasket og utsatt for tryptisk fordøyelse. Supernatanten som inneholdt de tryptiske fordøyelsesproduktene ble frysetørket, og frysetørket ble vasket flere ganger og resuspendert i 10 μl elektroforesebuffer, pH 1.9. Prøven (3 μl) ble plassert på en cellulose-tynnsjiktskromatografi (TLC)-plate (Analtech, Newark, DE) og separert i én dimensjon ved elektroforese og den andre dimensjonen ved stigende TLC. De resulterende fosfopeptidkartene ble visualisert ved autoradiografi og fosforavbildning. For fosfoaminosyreanalyse ble 2 μl av de tryptiske digestene som var blitt resuspendert i elektroforesebuffer, videre spaltet ved HCl-hydrolyse ved 105 °C i 25 minutter i 3 m HCl under en N2- atmosfære . Reaksjonen ble stoppet ved en seksdobbel fortynning i vann, og blandingen ble frysetørket. Lyofilitet ble resuspendert i 5 μl elektroforesebuffer, pH 1.9, og plassert på en cellulose-TLC-plate sammen med fosfo-Ser-, -Thr- og -Tyr-standarder. Elektroforese ble utført over halvparten av lengden på TLC-platen ved bruk av elektroforesebuffer, pH 1.9, og deretter ble platen overført til pH 3.5-bufferen, og elektroforese ble utført til fullføring. Fosfoaminosyrestandardene ble visualisert ved å spraye TLC-platen med en 1 % (v/v) ninhydrinløsning i aceton, og de 32P -merkede aminosyreprøvene ble visualisert ved både autoradiografi og fosforavbildning.
siRNA-indusert CK2α nedslagning.
Vi brukte en RNA-interferensmetode for selektivt å senke nivåene av CK2 ( Di Maira et al., 2005 ). PC12-celler ble sådd på kollagen I-belagte seks-brønnsplater for å nå ~70–80 % konfluens neste dag, da de ble transfektert transient med 20 nm (sluttkonsentrasjon) av enten ikke-målrettet siRNA eller siRNA rettet mot mRNA til den katalytiske α-subenheten til rotte CK2, ved bruk av 5 μl av transfeksjonsmiddelet SilentFectin (Bio-Rad) og i henhold til produsentens instruksjoner. Omtrent 24 timer senere ble cellene transfektert transient med ΔFosB-plasmid, som angitt ovenfor. Omtrent 24 timer senere (∼48 timer etter siRNA-transfeksjon) ble cellene utsatt for enten 32P metabolsk merking eller puls-chase-analyse som beskrevet ovenfor. Følgende fire CK2α siRNA-er ble brukt med lignende resultater: 5′P-CAAACUAUAAUCGUACAUCUU3′, 5′P-UCAAUCAU-GACAUUAUGCGUU3′, 5′P-UAGUCAUAUAAAUCUUCCGUU3′, 5′P-AAAUCCCUG ACAUCAUAUUUU3′ (Dharmacon, Lafayette, CO). Som negativ kontroll brukte vi Silencer negativ kontroll #3 siRNA fra Ambion (Austin, TX). Omfanget av CK2 knockdown ble overvåket ved immunoblotting ved bruk av et polyklonalt anti-CK2-antistoff (katalog #06-873 fra Upstate) over natten ved en fortynning på 1:1000. β-Tubulin ble brukt som lastekontroll og detektert med et monoklonalt antistoff (katalog #05-661 fra Upstate) over natten ved en fortynning på 1:20 000.
Site-directed mutagenese.
Mutasjon av Ser27 til Ala eller Asp ble utført ved bruk av et Quick Change Site-Directed Mutagenesis-sett (Stratagene, La Jolla, CA) og i henhold til produsentens instruksjoner. Følgende mutageneseprimere ble brukt for å introdusere Ser27-mutasjonene i musens ΔFosB-protein. Ser27 til Ala: (revers primer) 5′GCCGAAGGAGTCCACCGA AG C CAGGTACTGAGACTCGGCGGAGGG3′. Ser27 til Asp (forward primer) 5′CCCTCCGCCGAGTCTCAGTACCTG GA T TCGGTGGACTCCTTCGGC3′. De muterte basene er i fet skrift, og Ser27-kodonet er kursivert.
Bioinformatikk.
Potensielle fosforyleringssteder og kinaser for ΔFosB ble søkt etter ved å sende museproteinsekvensen til spesialiserte databaser, inkludert ProSite ( http://www.expasy.org/prosite/ ), PredictProtein ( Rost et al., 2004 ) og NetPhosK ( Blom et al., 2004 ).
Datakvantifisering, beregninger og statistikk.
Mengden protein som er tilstede i PVDF- eller nitrocellulosemembranen ble kvantifisert ved bruk av en Storm PhosphorImager og den medfølgende ImageQuant-programvaren (Amersham Biosciences / Molecular Dynamics). I cellekultur og hjerneskive fosforyleringsstudier, verdiene som er oppnådd for 32P-merket protein ble deretter delt med verdiene oppnådd for totalt ΔFosB og uttrykt som et forhold. I vitro fosforyleringsstudier, mengden av 32P-merket ΔFosB per mol avFosB (støkiometri) ble beregnet som beskrevet tidligere (Sahin et al., 2004). Alle målinger ble tatt innenfor linearitetsområdet for instrumentet som ble brukt. Kinetiske parametere ble beregnet ved hjelp av Michaelis-Menten-modellen, hvorved V = Vmax[S] / ([S]+KM) Og Vmax = k2[ETotalt]. Halveringstiden (t1/2) av ΔFosB og FosB ble estimert fra pulse-chase-plottene (ved hjelp av den ikke-lineære regresjonen som best monterte datapunktene) og tilsvarer tidspunktet hvor mengden av gjenværende protein er 50% av originalen. I alle tallene er de viste resultatene representative for minst to til tre uavhengige eksperimenter. I alle grafene er dataene vist gjennomsnitt ± SEM (3 ≤ n ≤16). Den statistiske signifikansen av forskjellene ble vurdert ved hjelp av en uparret t test, korrigert for flere sammenligninger, og asteriskene indikerer p ≤ 0.05.
Resultater
ΔFosB er en uvanlig stabil transkripsjonsfaktor
Selv om vi tidligere har spekulert i at ΔFosB er en relativt stabil transkripsjonsfaktor ( Nestler et al., 2001 ), har det ikke blitt utført en direkte analyse av proteinets omsetningsprofil til dags dato. For å besvare dette spørsmålet utførte vi pulsjakteksperimenter med PC12-celler, som har blitt mye brukt som en nevronlignende cellelinje, der ΔFosB ble forbigående uttrykt via infeksjon med et rekombinant herpes simplex-virus (HSV-ΔFosB). Nylig syntetiserte proteiner ble metabolsk merket med 35S -Met/Cys, og nedbrytningsmønsteret til 35S -merket ΔFosB ( 35S -ΔFosB) ble overvåket ved å immunopresipitere det fra cellelysater oppnådd på forskjellige tidspunkter etter fjerning av de radiomerkede aminosyrene. Analyse av immunopresipitatene ved SDS-PAGE og autoradiografi viste at halveringstiden til ΔFosB i PC12-celler er ~10 timer ( fig. 1 ). Disse funnene viser at halveringstiden til ΔFosB er høyere enn for de fleste induserbare transkripsjonsfaktorer (se Diskusjon), inkludert fullengdes FosB, hvis halveringstid i cellekultur har blitt rapportert å være ~90 minutter ( Dobrazanski et al., 1991 ; Carle et al. 2004 ). I tillegg er det verdt å merke seg at nedbrytningen av ΔFosB ikke passer inn i en eksponentiell nedbrytningskurve av første grad, men snarere er tofaset, med en lavere nedbrytningshastighet som starter. Dette antyder eksistensen av mer enn én ΔFosB-art og/eller mer enn én nedbrytningsvei.
Se større versjon:
Figur 1.
ΔFosB er en uvanlig stabil transkripsjonsfaktor. Halveringstiden for ΔFosB er ~ 10h i cellekultur. ΔFosB ble uttrykt i PC12-celler ved enten infeksjon med HSV-FosB eller transient transfeksjon med FFB-holdig plasmid, og celler ble utsatt for pulsjakteksperimenter som beskrevet i Materialer og Metoder. Likeverdige resultater ble oppnådd uavhengig av metoden som ble brukt til å overuttrykke ΔFosB. Figuren viser tidsforløpet (og representativt autoradiogram) av ΔFosB nedbrytning. Dataene som er tegnet er gjennomsnittlig ± SEM på minst 15 individuelle datapunkter hentet fra minst fem uavhengige eksperimenter. Til sammenligning er den rapporterte halveringstid for full lengde FosB angitt.
ΔFosB er et fosfoprotein i hjernen
Vi har antatt at posttranslasjonell modifisering av ΔFosB kan bidra til dens tilsynelatende stabilitet. Fordi fosforylering har vist seg å modulere aktiviteten til transkripsjonsfaktorer på mange måter, inkludert deres stabilitet (for gjennomgang, se Desterro et al., 2000 ; Whitmarsh og Davis, 2000 ), undersøkte vi om ΔFosB er et fosfoprotein. For dette formålet ble ΔFosB-ekspresjon indusert i rottehjerne ved bruk av kronisk ECS, en behandling kjent for å indusere høye nivåer av ΔFosB, spesielt i frontal cortex ( Hope et al., 1994a ). En dag etter den siste ECS-behandlingen, da ΔFosB-nivåene forble høye, ble tynne frontale kortikale skiver fremstilt og metabolsk merket med 32P -ortofosfat. Et parallelt sett med skiver ble ikke radiomerket, og disse ble brukt til å detektere totale ΔFosB-nivåer. Etter immunutfelling med et spesifikt anti-FosB/ΔFosB-antistoff og separasjon av de immunutfellede proteinene ved SDS-PAGE, ble fosforylert 32P -merket ΔFosB detektert ved autoradiografi, mens total ΔFosB ble detektert ved immunoblotting. Denne analysen viste at ΔFosB er fosforylert i hjernen, noe som fremgår av et spesifikt 32P -merket bånd på ~35 kDa tilstede i de kronisk behandlede hjerneprøvene, men er praktisk talt ikke detekterbart i de simulerte kontrollene ( fig. 2 A ). Dette er i samsvar med det faktum at basalnivåene av ΔFosB er svært lave i fravær av kronisk stimulering. Spesifisiteten til immunutfellingsreaksjonen illustreres av mangelen på signal i det ikke-immune IgG-utfellet.
Se større versjon:
Figur 2.
ΔFosB er et fosfoprotein i hjernen. A, ΔFosB er fosforylert i hjernen. Endogen ΔFosB ble indusert i rottehjerne ved kronisk ECS-behandling som beskrevet i Materialer og Metoder. Frontale kortikale skiver ble metabolisk merket med 32PH3PO4 i flere timer. Etter homogenisering av stykkene var ΔFosB immunpresipitert og fosforylert FFosB (32P-ΔFosB) ble påvist ved autoradiografi (topppanel). Totalt ΔFosB i ikke-radioaktive immunoprecipitater ble påvist ved immunoblotting (bunnpanel). Som negative kontroller er immunoprecipitatet av et sham-behandlet dyr og ikke-immun IgG vist. B, Kandidatfosforyleringssteder og kinaser med tilsvarende prediksjonspoeng for musen AFosB proteinsekvens ble oppnådd ved bioinformatisk analyse. Kandidatstedene med de høyere prediksjonspoengene er uthevet i proteinsekvensen og oppført i tabellen. Det DNA-bindende (grunnleggende) domenet og leucin-glidelåsen har fet skrift i proteinsekvensen. C, D, ΔFosB fosforylering økes med Ser / Thr fosfatase inhibitor OA. C, 32P-ΔFosB-nivåer i immunoprecipitater fra frontale kortikale skiver merket i fravær (Ctr) eller nærvær av 100 ng / ml OA (graf og topppanel) ble påvist ved autoradiografi. Bunnpanelet viser totalt ΔFosB detektert i immunoprecipitater fra umerkede skiver ved immunoblotting. D, PC12-celler ble smittet med HSV-FosB eller HSV-LacZ (vektor) og metabolisk merket med 32PH3PO4 i fravær (Ctr) eller nærvær av 100 ng / ml OA. 32P-ΔFosB-nivåer i immunoprecipitater ble påvist ved autoradiografi (graf, topppanel). Bunnpanelet viser totalt ΔFosB detektert i cellelysater ved immunoblotting.
Som et første skritt mot å avklare hvilke kinase(r) og sted(er) som er involvert i ΔFosB-fosforylering, utsatte vi aminosyresekvensen for flere bioinformatiske analyser. Dette viste at selv om ΔFosB ikke inneholder noen Tyr-fosforyleringskandidatsteder, inneholder den flere Ser/Thr-kinase-konsensussteder, inkludert tre CaMKII-steder, tre CK2-steder og to PKC-steder med svært høye fosforyleringsprediksjonsscorer ( fig. 2 B ). Hvis ΔFosB, som forutsagt gjennom bioinformatikk, bare fosforyleres på Ser- eller Thr-rester, bør fosforyleringen moduleres betydelig av aktiviteten til Ser/Thr-fosfataser. For å teste denne hypotesen merket vi frontale kortikale skiver med 32P -ortofosfat i nærvær eller fravær av OA, en Ser/Thr-proteinfosfatasehemmer. Som vist i figur 2 C , forårsaket OA en stor (∼2.5 ganger) økning i 32P -ΔFosB. Det forårsaket også en liten økning i totale ΔFosB-nivåer, noe som er i samsvar med tidligere rapporter som knytter de kreftfremkallende effektene av OA til dens evne til å indusere flere umiddelbare tidlige gener, inkludert Fos-proteiner ( Miller et al., 1998 ; Choe et al., 2004 ). Nettoresultatet er en betydelig samlet økning (∼60 %) i fosforylerte ΔFosB-nivåer.
Vi undersøkte deretter om ΔFosB viste et fosforyleringsmønster som ligner på det man ser i hjernen i PC12-celler, som er mer mottakelige for eksperimentell manipulasjon. Vi uttrykte ΔFosB i PC12-celler via infeksjon med HSV-ΔFosB og merket cellene metabolsk med 32P -ortofosfat i nærvær eller fravær av OA. Den vellykkede ekspresjonen og immunutfellingen av proteinet fra HSV-ΔFosB-infiserte celler vises ved tilstedeværelsen av et ~35 kDa-bånd både i immunoblottet ( fig. 2 D , bunnpanel) og autoradiografen (topppanel), som ikke var i de vektorinfiserte cellene. Som observert i hjernen forårsaket OA en liten økning i totale ΔFosB-nivåer, men en mye høyere (omtrent dobbelt) økning i 32P -ΔFosB, noe som resulterte i en signifikant (∼50 %) nettoøkning i ΔFosB-fosforylering. Videre, i samsvar med de bioinformatiske prediksjonene, resulterte ikke behandling av PC12-celler med en Tyr-fosfatasehemmer i signifikante endringer i 32P -ΔFosB-nivåer (data ikke vist). Samlet sett viste disse funnene at ΔFosB er fosforylert på Ser- og/eller Thr-rester i hjernen og i PC12-celler, og bekreftet at sistnevnte er et godt cellekultursystem for å studere fosforylerings- og nedbrytningsprofilene til ΔFosB videre.
CK2, men ikke PKC eller CaMKII, fosforylerer ΔFosB vitro
Som beskrevet ovenfor avslørte analysen av ΔFosB-aminosyresekvensen høye prediksjonspoeng for CK2-, PKC- og CaMKII-fosforyleringssteder. For å bestemme hvilken av disse kinaser som kan fosforylere ΔFosB, gjennomførte vi en serie av vitro fosforyleringsreaksjoner ved anvendelse av rensede kinaser og renset rekombinant ΔFosB. Som vist i Figur 3A, av de tre kandidatkinasene, kun CK2 fosforylertAFFosB på en signifikant måte. I tillegg ble flere andre kinaser testet (f.eks. GSK3 og p70S6K), men klarte ikke å fosforylere ΔFosB signifikant (data ikke vist). Ytterligere karakterisering av CK2-reaksjonen ved tidskursanalyse viste at denne kinasen kan katalysere inkorporeringen av ~0.5 mol fosfat per mol avFosB (Fig. 3B). Det faktum at CK2 kan fosforylere ΔFosB vitro til en betydelig støkiometri (~50%) tyder på en fysiologisk relevant reaksjon. Vi studerte kinetikken av denne reaksjonen ved å inkubere CK2 i nærvær av økende mengder av renset FosB, og vi fastslått at CK2 fosforylerer ΔFosB med en Vmax av 5.8 pmol · min-1 · Μg-1 av enzym, a KM av 18.4 μm og a khvordan av 0.2 / s (Fig. 3C). Verdiene som er oppnådd for disse kinetiske parametrene, støtter videre den fysiologiske relevansen av denne reaksjonen. For eksempel, KM av CK2 for DARPP32, en av de mest kjente substratene, er 3.4 μm, og den khvordan er ~ 0.3 / s (Girault et al., 1989); de KM for ATP varierer fra ~ 10-40 μm (Cochet et al., 1983; Silva-Neto et al., 2002), og at for kasein varierer fra ~ 10-50 μm (Meggio et al., 1977; Pyerin et al., 1987). Sammen angir disse data at ΔFosB er et bona fide substrat for CK2 vitro.
Se større versjon:
Figur 3.
CK2, men ikke PKC eller CaMKII, fosforylerer ΔFosB in vitro . Autoradiografen (øverste panel) viser det fosforylerte produktet, og den Coomassie-fargede gelen (nederste panel) viser total ΔFosB tilstede i reaksjonen. A. Renset rekombinant ΔFosB ble utsatt for in vitro -fosforylering av forskjellige kandidatkinaser (hvorav tre er vist). B. Tidsforløp og støkiometriske analyser indikerer at CK2 kan fosforylere ΔFosB in vitro med en støkiometri på ~50 %. C. Kinetisk analyse av CK2-reaksjonen viste at ΔFosB er et bona fide in vitro- substrat. Lineariseringen av reaksjonen er vist i et dobbelt-resiprokalt plott (nederst), men de kinetiske parametrene ble avledet fra Michaelis-Menten-kurven (øverst).
CK2 modulerer fosforyleringen og stabiliteten avFosB i intakte celler
For å vurdere den fysiologiske relevansen av CK2-mediert fosforylering av ΔFosB, utførte vi sammenlignende fosfopeptidkartlegging ved bruk av in vitro fosforylert og PC12-celle-fosforylert ΔFosB. Etter SDS-PAGE og geluering av 32P -ΔFosB (fra in vitro -reaksjonene eller fra immunutfellingen av 32P -merkede celler), ble proteinet spaltet med trypsin, og de resulterende fosfopeptidene ble utsatt for todimensjonal separasjon. Denne analysen viste at hovedfosfopeptidet fra CK2-reaksjonen migrerte med ett av to hovedfosfopeptider fra ΔFosB fosforylert i PC12-celler ( fig. 4A ) , mens fosfopeptidene som resulterte fra PKC- eller CaMKII-reaksjonen (data ikke vist) ikke gjorde det. Det var et andre ΔFosB-fosfopeptid tilstede på kartet fra PC12-celler, men på grunn av manglende evne hos noen av kinasene vi har testet til å generere et lignende fosfopeptid in vitro , vet vi foreløpig ikke om dette andre fosfopeptidet inneholder et fosforyleringssted som er forskjellig fra det andre fosfopeptidet, eller om det representerer et distinkt tryptisk peptid som inneholder det samme fosforyleringsstedet.
Se større versjon:
Figur 4.
CK2 modulerer fosforyleringen og stabiliteten til ΔFosB i intakte celler. A , CK2, men ikke PKC, ser ut til å fosforylere ΔFosB i celler. Todimensjonale fosfopeptidkart av ΔFosB fosforylert av CK2 eller PKC in vitro eller av intakte PC12-celler. Pilene viser komigrasjonen av det CK2-fosforylerte peptidet, men ikke det PKC-fosforylerte, med et av ΔFosB-fosfopeptidene oppnådd fra PC12-celler. B , ΔFosB-fosforylering i PC12-celler økes ved å behandle celler med den potente CK2-aktivatoren spermin (SP) og reduseres ved behandling med CK2-hemmeren DRB. I motsetning til dette ble ikke ΔFosB-fosforylering i PC12-celler påvirket av behandling med verken en PKC-aktivator (PMA) eller den PKC-spesifikke hemmeren calphostin-C (Calph). Et representativt autoradiogram (øverste panel) og immunoblot (nederste panel) er vist. C–F , Effekt av CK2-aktivitet på ΔFosB-stabilitet. Figurene viser tidsforløpet (og representativt autoradiogram) for ΔFosB-nedbrytning. PC12-celler som forbigående uttrykker ΔFosB ble utsatt for pulsjakteksperimenter utført i fravær eller nærvær av CK2-hemmeren DRB ( C ), CK2-aktivatoren spermin ( D ) eller bredspektret kinasehemmer H-8 ( E ), som ble brukt til å kontrollere for de uspesifikke effektene av DRB. F , Effekt av å slå ned den katalytiske underenheten av CK2 på ΔFosB-stabilitet. PC12-celler ble transfektert med enten et ikke-målrettet siRNA (Ctr) eller siRNA rettet mot rotte-CK2α og 24 timer senere transfektert med et ΔFosB-plasmid. Topppanelet viser immunoblott av helcellelysater som viser effekten av CK2 siRNA på CK2- og ΔFosB-proteinnivåer. Den tilsvarende immunoblotten for β-tubulin er vist som en lastekontroll.
For å ytterligere adressere den fysiologiske relevansen av CK2 som en FosB-kinase, behandlet vi FosB-uttrykkende PC12-celler med to legemidler som modulerer CK2-aktivitet. Som vist i Figur 4B, ΔFosB fosforylering ble redusert ved behandling av PC12-celler med den celle-permeable CK2 inhibitor DRB (Meggio et al., 1990; Szyszka et al., 1995), og økte ved behandling med polyaminspermenen, kjent for å være en potent CK2-aktivator (Cochet og Chambaz, 1983; Meggio et al., 1983). I motsetning til dette, behandles PC12-celler med PKC-hemmeren calphostin-C (Kobayashi et al., 1989; Tamaoki et al., 1990) eller PKC-aktivatoren PMA (Schmidt og Hecker, 1975; Beh et al., 1989) resulterte ikke i signifikante endringer i ΔFosB-fosforylering. I tilfelle PMA er den svake (og ikke signifikante) økningen i 32P-ΔFosB kunne regnes med en økning i totalt ΔFosB nivåer forårsaket av dette stoffet; Faktisk har det blitt rapportert at phorbolestere induserer uttrykk for flere Fos-familieproteiner, inkludert FosB (Yoza et al., 1992; Suh et al., 2004). Videre behandles celler med den spesifikke celle-permeable CaMKII-inhibitoren m-AIP (Ishida og Fujisawa, 1995; Stevens et al., 1999) resulterte heller ikke i redusert ΔFosB fosforylering (data ikke vist). Sammen er disse resultatene i samsvar med vårt vitro funn og indikerer at i intakte celler ΔFosB sannsynligvis er fosforylert av CK2, men ikke PKC eller CaMKII. Det faktum at CK2-inhibering ikke helt forhindrer ΔFosB-fosforylering indikerer eksistensen av ytterligere fosforyleringssteder i proteinet.
Vi undersøkte deretter om CK2 spiller en rolle i omsetningen av ΔFosB og dermed i dens stabilitet. For dette formålet utførte vi puls-chase-eksperimenter med ΔFosB-uttrykkende PC12-celler behandlet med enten CK2-hemmeren eller CK2-aktivatoren som ble brukt i fosforyleringsstudien. Som vist i figur 4 C , hadde behandling av celler med CK2-hemmeren DRB en signifikant effekt på omsetningshastigheten til ΔFosB, noe som fremgår av endringen i formen på nedbrytningskurven, fra tofaset til en kurve som er nærmere den for et eksponentielt forfall. Omvendt forårsaket tilstedeværelsen av CK2-aktivatoren spermin en betydelig reduksjon i nedbrytningshastigheten til ΔFosB, noe som førte til akkumulering av proteinet i løpet av de første timene av chase-eksperimentet ( figur 4 D ).
Som tilfellet er med mange kinaseaktivatorer og -hemmere, kan spermin og DRB ha metabolske effekter utenfor moduleringen av CK2-aktivitet. Faktisk har DRB vist seg å hemme transkripsjonsfaktor IIH (TFIIH)-assosiert kinase ( Yankulov et al., 1995 ), noe som resulterer i hemming av RNA polymerase II-mediert transkripsjon. Fordi denne effekten muligens kan påvirke stabiliteten til ΔFosB, analyserte vi effekten av bredspektret kinasehemmer H-8 ( Hidaka og Kobayashi, 1992 ) på ΔFosB-omsetning ved en konsentrasjon (200 μm) som er kjent for å hemme TFIIH-assosiert kinase, men ikke CK2 ( Yankulov et al., 1995 ). Som vist i figur 4E , påvirket ikke behandling med H-8 omsetningshastigheten til ΔFosB. Lignende resultater ble oppnådd med H-7, en annen bredspektret kinasehemmer, brukt ved en konsentrasjon som hemmer TFIIH-assosiert kinase, men ikke CK2 (data ikke vist). Disse dataene støtter ytterligere tolkningen av at reduksjonen i ΔFosB-stabilitet forårsaket av DRB mest sannsynlig kan tilskrives hemming av CK2.
For å ytterligere fastslå rollen til CK2 i ΔFosB-omsetningen, undersøkte vi konsekvensene av å dempe CK2 via siRNA. Vi utførte disse eksperimentene ved hjelp av PC12-celler som først ble transfektert med kontroll (ikke-målrettet) siRNA eller et siRNA som er rettet mot mRNA til den katalytiske subenheten til rotte-CK2 (CK2α) og 24 timer senere transfektert med ΔFosB. Som vist i figur 4F , dempet transfeksjon med CK2α siRNA effektivt og spesifikt CK2α-proteinnivåene uten å påvirke ΔFosB-nivåene (øverste panel). Puls-chase-analyse viste at nedbrytning av CK2 resulterte i en betydelig økning i ΔFosB-omsetningshastigheten, noe som fremgår av den raskere nedbrytningen av proteinet. Det faktum at hemming av CK2-aktivitet (enten via DRB-behandling eller siRNA) øker omsetningen av ΔFosB og resulterer i at den langsomme komponenten av den bifasiske kurven forsvinner, mens CK2-aktivering forsterker den langsomme fasen av kurven, gir sterk støtte til ideen om at CK2 spiller en rolle i å regulere ΔFosB-stabilitet.
CK2 fosforylerer ΔFosB på Ser27
For å begynne å identifisere stedet(e) på ΔFosB fosforylert av CK2, utførte vi fosfo-aminosyreanalyse av rekombinant ΔFosB fosforylert av CK2 in vitro og av ΔFosB fosforylert i PC12-celler. Disse eksperimentene viste at i begge tilfeller var den eneste fosfo-aminosyren som ble detektert fosfo-Ser ( fig. 5 A ). Dette funnet, sammen med støkiometrien oppnådd for CK2 in vitro fosforyleringsreaksjon (∼50 %) ( fig. 3 B ) og tilstedeværelsen av bare én signifikant flekk på CK2 fosfopeptidkartet ( fig. 4 A ), antyder at CK2-fosforylering av ΔFosB sannsynligvis er begrenset til en enkelt serinrest. Denne konklusjonen er i samsvar med fosforyleringskonsensusstedanalysen ( fig. 2 B ), som bare forutså én kandidatserin, dvs. Ser27, for CK2. Taksonomisk analyse viste at Ser27 er svært konservert gjennom evolusjon blant Fos-familiemedlemmer ( fig. 5B ) , noe som tyder på at den kan ha en viktig fysiologisk funksjon.
Se større versjon:
Figur 5.
CK2 fosforylerer ΔFosB på Ser27. A , Fosfoaminosyreanalyse av CK2-fosforylert ( in vitro ) og PC12-cellefosforylert ΔFosB som viser at i begge tilfeller er den viktigste fosforylerte resten serin. B , Kryssartsanalyse av FosB/ΔFosB aminosyresekvens avdekket høy konservering av Ser27 blant Fos-familiemedlemmer fra menneske til sebrafisk (mørk markering). Imidlertid er den sure resten i posisjon +3, som er nødvendig for CK2-konsensusstedet, ikke konservert (lys markering). C , HeLa-celler ble transfektert forbigående med enten villtype ΔFosB (WT) eller ΔFosB som inneholder en punktmutasjon for å erstatte Ser27 med Ala (S27A). Cellene ble metabolsk merket med 32P - H3PO4 og behandlet med vehikkel eller med spermin (SP) for å aktivere CK2. Et representativt autoradiogram (øverste panel ) og immunoblot (nedre panel) av de oppnådde ΔFosB-immunpresipitatene er vist. Immunutfellingen av mock-transfekterte celler (vektor) er vist.
For å avgjøre om Ser27 er fosforylert i ΔFosB, muterte vi denne resten til Ala, og analyserte konsekvensene på proteinets fosforyleringsstatus. For dette formålet brukte vi HeLa-celler (som kan transfekteres med høyere effektivitet) for å transient uttrykke enten WT- eller S27A-mutant ΔFosB. Omtrent 24 timer etter transfeksjon ble cellene metabolsk merket med 32P -ortofosfat, og helcellelysater ble fremstilt. Etter immunutfelling og SDS-PAGE ble 32P -ΔFosB detektert ved autoradiografi og total ΔFosB ved immunoblotting. Som vist i figur 5 C (nederste panel), ble ikke ΔFosB detektert i de vektortransfekterte cellene, mens celler transfektert med enten WT- eller S27A-mutant ΔFosB uttrykte proteinet med hell. Vi fant at S27A-mutasjonen forårsaket en signifikant (∼30 %) reduksjon i 32P -ΔFosB-nivåene ( fig. 5 C, topppanel og graf), noe som indikerer at ΔFosB fosforyleres på Ser27 i levende celler. I et forsøk på å fastslå om Ser27 faktisk fosforyleres av CK2 i cellene, sammenlignet vi evnen til CK2-aktivatoren spermin til å modulere fosforyleringen av WT og S27A ΔFosB. Som vi tidligere hadde observert i PC12-celler ( fig. 4 B ), økte behandling av HeLa-celler med spermin fosforyleringen av WT-proteinet betydelig. Det faktum at denne effekten ble betydelig redusert av S27A-mutasjonen ( fig. 5 C ) støtter tolkningen av at Ser27 i ΔFosB er et fysiologisk substrat for CK2.
Fosforylering av Ser27 regulerer stabiliteten av ΔFosB
Etter å ha slått fast at stabiliteten til ΔFosB reduseres når CK2 hemmes og forsterkes når CK2 aktiveres ( fig. 4 ), og at CK2 fosforylerer ΔFosB på Ser27 ( fig. 5 ), forutså vi at det å forhindre fosforylering av dette stedet burde destabilisere proteinet. Pulsjakteksperimenter utført med HeLa-celler som forbigående uttrykker enten WT- eller S27A-mutant ΔFosB, viste at, som forutsagt, resulterte S27A-mutasjonen i en betydelig økning i nedbrytningshastigheten til ΔFosB, og en samtidig reduksjon i proteinets halveringstid ( fig. 6 A ). Vi undersøkte deretter om denne reguleringsmekanismen også forekommer i den mer nevronlignende PC12-cellelinjen. Disse eksperimentene viste at, som vi hadde observert i HeLa-celler, forårsaker S27A-punktmutasjonen en dramatisk reduksjon i halveringstiden til ΔFosB i PC12-celler (fra ~11 til ~4 timer) ( fig. 6 B ). Det faktum at denne destabiliseringen ligner på den som er forårsaket av CK2-hemming eller knockdown ( fig. 4 ), gir ytterligere støtte til ideen om at CK2-mediert fosforylering av Ser27 regulerer stabiliteten til ΔFosB. Ytterligere bevis for den regulatoriske rollen til Ser27-fosforylering på ΔFosB-proteinomsetning ble oppnådd ved bruk av en fosfomimetisk Ser27 til Asp-mutasjon (S27D). S27D-mutasjonen anses som fosfomimetisk fordi den plasserer en stor negativt ladet (karboksyl) gruppe ved aminosyre 27 og dermed delvis etterligner fosforyleringen av Ser27. Som vist i figur 6 C , forårsaket S27D-mutasjonen den motsatte effekten av S27A-mutasjonen og resulterte i et protein som var betydelig mer stabilt enn WT-proteinet. I likhet med effekten oppnådd etter CK2-aktivering ( fig. 4 D ), resulterte S27D-mutasjonen i akkumulering og dermed økte ΔFosB-nivåer i løpet av de første timene av chase.
Se større versjon:
Figur 6.
Fosforylering av Ser27 regulerer stabiliteten til ΔFosB. A , C , Puls-chase-analyse som viser effekten av Ser27-fosforylering på omsetningshastigheten til ΔFosB. Nedbrytningsprofilen og estimerte halveringstider for villtype ΔFosB (WT), Ser27 til Ala-mutanten (S27A) og den fosfomimetiske Ser27 til Asp-mutanten (S27D) er vist. De samme funnene ble oppnådd i HeLa-celler ( A ) og PC12-celler ( B , C ).
Ser27 fosforylering stabiliserer ΔFosB ved å hindre dets proteasomale nedbrytning
For å begynne å belyse mekanismen som fosforylering av Ser27 stabiliserer ΔFosB med, undersøkte vi evnen til proteasominhibitorene MG132 ( Palombella et al., 1994 ; Tsubuki et al., 1996 ) og epoxomicin ( Hanada et al., 1992 ; Kim et al., 1999 ) til å modulere nedbrytningshastigheten til WT og S27A-mutant ΔFosB. Puls-chase-eksperimenter ble utført ved bruk av PC12-celler infisert med en rekombinant HSV som uttrykker enten WT eller S27A ΔFosB og behandlet med enten DMSO eller en av de to proteasominhibitorene. Disse eksperimentene viste at selv om nedbrytningshastigheten til WT-proteinet er relativt ufølsom for tilstedeværelsen av en av de to proteasominhibitorene ( fig. 7 A ), er nedbrytningshastigheten til S27A-mutanten følsom for disse legemidlene ( fig. 7 B ). Dette indikerer at S27A-mutanten, i motsetning til WT-proteinet, er et mål for proteasomal nedbrytning. Behandling av celler med enten MG132 eller epoksomicin reverserte faktisk fullstendig effekten av S27A-mutasjonen på nedbrytningshastigheten til ΔFosB, noe som fremgår av en økning i halveringstiden til S27A-mutanten fra ~4 til ~9 timer for MG132 og til ~12 timer for epoksomicin ( fig. 7B ) . Sammen indikerer disse funnene at fosforylering av ΔFosB på Ser27 beskytter proteinet mot proteasomal nedbrytning og derfor er essensielt for dets uvanlige stabilitet.
Se større versjon:
Figur 7.
Fosforylering av Ser27 stabiliserer ΔFosB ved å forhindre proteasomal nedbrytning. A , B , Puls-chase-analyse med HSV-infiserte PC12-celler som viser nedbrytningsprofilen og estimerte halveringstider for villtype ΔFosB ( A ) eller S27A ΔFosB ( B ) i fravær eller nærvær av en av to proteasomhemmere [MG132 og epoxomicin (Epoxo)]. Merk at ingen av legemidlene har en signifikant effekt på omsetningen av villtype ΔFosB, mens behandling av celler med en av proteasomhemmerne resulterte i stabilisering av S27A ΔFosB. C , En modell for rollen til Ser27-fosforylering i ΔFosBs evne til å mediere langsiktig hjerneplastisitet. Når den er indusert, stabiliseres en del av ΔFosB i hjernen av CK2-mediert fosforylering av S27. Dette resulterer i akkumulering, som igjen resulterer i langvarige endringer i genuttrykk. Disse stabile endringene i genuttrykk bidrar til stabile atferdstilpasninger. Motsatt resulterer defosforylering av S27 av Ser/Thr-fosfatasene PP1 og/eller PP2A i destabilisering av proteinet og dets prosessering av det proteasomale maskineriet.
Diskusjon
I denne studien viser vi at ΔFosB har en halveringstid på ~10 timer i cellekultur, noe som gjør det stabilt sammenlignet med fullengdes FosB og de fleste andre induserbare transkripsjonsfaktorer, hvis halveringstider i cellekultur kan være så korte som noen få minutter og sjelden overstige 3 timer ( Hann og Eisenman, 1984 ; Dobrazanski et al., 1991 ; Roberts og Whitelaw, 1999 ; Ferrara et al., 2003 ; Hirata et al., 2004 ). I tillegg finner vi at ΔFosB fosforyleres i hjernen og at fosforyleringen er følsom for PP1/PP2A-hemmeren okadasyre. Våre cellekulturstudier viser at stabiliteten til ΔFosB moduleres av CK2, med høyere CK2-aktivitet som stabiliserer proteinet. Til slutt tyder funnene våre på at CK2 fosforylerer ΔFosB på et svært konservert N-terminalt serin (S27) og viser at fosforylering av S27 beskytter ΔFosB mot proteasomal nedbrytning. Vi foreslår derfor en modell der fosforylering av ΔFosB på S27 av CK2 er en kritisk reguleringsmekanisme for omsetning av ΔFosB ( fig. 7 C ). Slik fosforyleringsmediert stabilisering av ΔFosB er funksjonelt viktig, fordi økte nivåer av ΔFosB i bestemte hjerneområder har vist seg å direkte regulere en rekke nevronale gener in vivo og å utøve potente atferdseffekter i dyremodeller av flere nevropsykiatriske lidelser (se innledning).
Selv om fosforylering er en rask og reversibel måte å regulere transkripsjonsaktiviteten til visse transkripsjonsfaktorer på, som CREB (cAMP response element binding protein) ( Bohmann, 1990 ), gir modulering av nedbrytningen av transkripsjonsfaktorer en enda kraftigere (mindre lett reversibel) form for regulering ( Desterro et al., 2000 ). Transkripsjonsfaktorer hvis funksjonelle aktivitet reguleres på nedbrytningsnivået inkluderer blant annet NFκB ( Desterro et al., 2000 ), c-Myc ( Sears et al., 1999 ) og c-Fos ( Ferrara et al., 2003 ). I mange tilfeller er fosforylering en nøkkelregulator for stabiliteten til en transkripsjonsfaktor, slik det har blitt vist for c-Fos ( Okazaki og Sagata, 1995 ; Tsurumi et al., 1995 ), Fos-relatert antigen-1 (Fra-1) ( Vial og Marshall, 2003 ), Fra-2 ( Manabe et al., 2001 ), c-Jun ( Fuchs et al., 1996 ), JunB ( Fuchs et al., 1997 ), ATF2 ( Fuchs et al., 2000 ) og p53 ( Buschmann et al., 2001 ). Våre studier legger dermed ΔFosB til denne listen over transkripsjonsfaktorer hvis funksjonelle aktivitet reguleres gjennom dens fosforyleringsavhengige stabilitet.
CK2 er en allestedsnærværende og konstitutivt aktiv Ser / Thr-kinase som har> 300 påståtte substrater hittil identifisert og er implisert i flere biologiske prosesser, inkludert celledød og overlevelse (Litchfield, 2003; Unger et al., 2004), cellulære stressresponser (Yanagawa et al., 1997; Kato et al., 2003), og DNA reparasjon og kromatin remodeling (Barz et al., 2003; Krohn et al., 2003). Mer enn en tredjedel av de antatte substratene til CK2 er proteiner involvert i reguleringen av genuttrykk (Meggio og Pinna, 2003). Faktisk har CK2 vist seg å være en fremtredende kjernekinase (Krek et al., 1992) (for gjennomgang, se Yu et al., 2001) og å samhandle med bZIP-domenene til flere transkripsjonsfaktorer (Yamaguchi et al., 1998). CK2-mediert fosforylering har også vist seg å modulere nedbrytningen (enten å øke eller redusere den) av mange proteiner, inkludert IkB (Schwarz et al., 1996), PTEN (Torres og Pulido, 2001), linse connexin (Yin et al., 2000), kromatinassosiert protein HMG1 (Wisniewski et al., 1999), og flere transkripsjonsfaktorer som HMGB (Stemmer et al., 2002), Myf-5 (Winter et al., 1997), og c-Myc (Channavajhala og Seldin, 2002). CK2 er mest rikelig i hjernen (Alcazar et al., 1988; Girault et al., 1990), og dens aktivitet har blitt involvert i mange aspekter av hjernefunksjon, inkludert nevrononal overlevelse (Boehning et al., 2003), differensiering (Nuthall et al., 2004), ionkanalfunksjon (Jones og Yakel, 2003; Bildl et al., 2004), og langsiktig potensiering og neuronal plastisitet (Diaz-Nido et al., 1992; Lieberman og Mody, 1999; Reikhardt et al., 2003).
Til tross for dette økende beviset for CK2s rolle i reguleringen av nevronfunksjon, er det lite kjent om hva som kontrollerer aktiviteten. CK2 antas å være konstitutivt aktiv, og reguleringen av dens evne til å fosforylere spesifikke substrater er hovedsakelig avhengig av endringer i dens intracellulære lokalisering (f.eks. cytosol vs. kjerne) ( Ahmed og Tawfic, 1994 ; Yu et al., 1999 ). Denne informasjonen reiser et viktig spørsmål angående hvilke signaler som kreves for å indusere ΔFosB-akkumulering i hjernen etter kronisk stimulering ( fig. 7 C ). Ett krav er gjentatt aktivering av fosB- genet og induksjon av ΔFosB mRNA ( Chen et al., 1995 ). Våre data indikerer at CK2-fosforylering av ΔFosB er kritisk for dens stabilitet, noe som tyder på at et andre signal kan være nødvendig for de langsiktige effektene av ΔFosB på genuttrykk, nemlig et signal som stimulerer fosforyleringen av protein av CK2. Dette kan involvere aktivering av CK2 via en ukjent mekanisme eller translokasjon til kjernen. Alternativt kan CK2-fosforylering av ΔFosB være konstitutiv, slik at når ΔFosB-protein oversettes som respons på hver stimulus, blir en del av det fosforylert og dermed stabilisert, slik at det ved gjentatt stimulering akkumuleres til høye nivåer i berørte nevroner.
Våre funn viser at CK2 og S27 sannsynligvis ikke er den eneste kinasen og setet som er ansvarlig for ΔFosB-fosforylering, fordi verken hemming av CK2 eller S27A-mutasjonen var i stand til å forhindre ΔFosB-fosforylering fullstendig. På samme måte argumenterer det faktum at S27A-mutasjonen resulterer i en 30 % reduksjon i fosfo-ΔFosB for at S27 er et viktig fosforyleringssete på proteinet. Vi undersøker likevel andre antatte kinaser og fosforyleringsseter på ΔFosB. Til syvende og sist vil det også være viktig å analysere fosforyleringen av S27 og eventuelle andre fosforyleringsseter i ΔFosB i hjernen in vivo etter ulike typer kronisk stimulering, for eksempel ved bruk av massespektrometri eller fosfospesifikke antistoffer.
Som nevnt ovenfor er S27 i ΔFosB svært konservert gjennom evolusjonen og blant andre Fos-familieproteiner. Konsensusstedet for CK2 er imidlertid ikke det: som vist i figur 5 B , er det bare FosB/ΔFosB (og sebrafisk-xenologen), men ikke c-Fos eller Fra-2, som har en sur rest ved +3, en nøkkeldeterminant for CK2-fosforylering ( Marin et al., 1986 ; Meggio et al., 1994 ). Mangelen på CK2-fosforylering på S27 kan dermed forklare hvorfor andre FosB-familieproteiner ikke er like stabile som ΔFosB. Dette forklarer imidlertid ikke hvorfor fullengde FosB, som har samme CK2-konsensussted som ΔFosB, ikke er stabilisert på samme måte. Vi vet ikke om fullengde FosB fosforyleres av CK2 på denne konserverte resten. De eneste rapportene om fosforylering av FosB ( Skinner et al., 1997 ) og c-Fos ( Okazaki og Sagata, 1995 ; Chen et al., 1996 ) beskriver steder i C-terminalregionen til disse proteinene, som er fraværende i ΔFosB. Den potensielle fosforyleringen av FosB i full lengde og andre Fos-familieproteiner av CK2 krever direkte undersøkelse. Selv om de er fosforylert, er det imidlertid kjent at de andre Fos-familieproteinene inneholder motiver ved sine C-terminaler som retter seg mot proteinene for rask nedbrytning ( Papavassiliou et al., 1992 ; Jariel-Encontre et al., 1997 ; Acquaviva et al., 2002 ). For eksempel har det blitt vist at en strekning på ~21 rester som er tilstede i C-terminalen til alle Fos-familieproteiner, men fraværende i ΔFosB, fungerer som et destabiliserende domene for c-Fos ( Acquaviva et al., 2001 ). Vi fant at selv om denne sekvensen på lignende måte destabiliserer fullengdes FosB ( Carle et al., 2004 ), forklarer ikke fraværet av dette domenet i ΔFosB fullt ut stabiliseringen. Snarere ser kombinasjonen av fraværet av dette C-terminale domenet og Ser27-fosforylering ut til å fullt ut forklare den omtrent femdoble forskjellen i stabilitet mellom ΔFosB og FosB.
Selv om nedbrytningen av Fos-familieproteiner er kompleks og ikke fullt ut forstått, ser det ut til at proteasomal nedbrytning er den viktigste veien involvert ( Salvat et al., 1999 ; Acquaviva et al., 2002 ; Ferrara et al., 2003 ). Data presentert her, der proteasomale hemmere ikke signifikant endrer hastigheten på ΔFosB-nedbrytning, argumenterer for at, i motsetning til andre Fos-familieproteiner, unngår ΔFosB 26S-proteasomet, og dette spiller en sentral rolle i stabiliseringen. Vi foreslår derfor en ordning der den forbedrede stabiliteten til ΔFosB kan tilskrives kombinasjonen av to hovedfaktorer: (1) fraværet av et C-terminalt destabiliserende domene og (2) fosforyleringen av S27 av CK2.
Oppsummert gir denne studien mekanistisk innsikt i hvorfor ΔFosB, et produkt av det umiddelbare tidlige genet fosB , i motsetning til alle andre medlemmer av Fos-familien, er et relativt langlivet protein. Selv om andre Fos-familieproteiner antas å mediere rask, men forbigående stimulus-transkripsjonskobling ( Morgan og Curran, 1995 ), gir den relative stabiliteten til ΔFosB det evnen til å mediere mer langvarige transkripsjonelle endringer indusert av kronisk stimulering. Dette støtter synspunktet om at ΔFosB fungerer som en vedvarende molekylær bryter i hjernen, som gradvis omdanner akutte responser til kroniske tilpasninger. Identifisering av Ser27-fosforylering som en sentral mekanisme for stabiliteten til ΔFosB åpner nye veier for utvikling av metoder for å regulere funksjonen til ΔFosB og dermed modulere dens langsiktige effekter på nevral og atferdsmessig plastisitet.
Fotnoter
- Mottatt November 21, 2005.
- Revisjon mottok februar 21, 2006.
- Godkjent April 2, 2006.
- Dette arbeidet ble støttet av en National Alliance for forskning om skizofreni og depresjon Young Investigator Award til PGU, et National Institute for Drug Abuse (NIDA) National Research Service Award til PGU, og tilskudd fra National Institute of Mental Health og NIDA til EJN We takk Dr. James Bibb for hans hjelp med vitro fosforyleringsanalyser, Dr. Ming-Hu Han for hans hjelp med utarbeidelsen av hjerneskiver som brukes til metabolsk merking, og Dr. Rachael Neve for hennes hjelp med emballering av rekombinante HSVs.
- G. Rudenkos nåværende adresse: Life Sciences Institute og Department of Pharmacology, University of Michigan, 210 Washtenaw Avenue # 3163A, Ann Arbor, MI 48109-2216.
- Korrespondanse skal rettes til Eric J. Nestler, 5323 Harry Hines Boulevard, Dallas, TX 75390-9070. e-post: [e-postbeskyttet]
Referanser
Acquaviva C, Brockly F, Ferrara P, Bossis G, Salvat C, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2001) Identifisering av et C-terminalt tripeptidmotiv involvert i kontrollen av rask proteasomal nedbrytning av c-Fos proto-onkoprotein under G(0)-til-S faseovergang. Oncogene 20 : 7563–7572.
Acquaviva C, Bossis G, Ferrara P, Brockly F, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2002) Flere nedbrytningsveier for Fos-familieproteiner. Ann NY Acad Sci 973 : 426–434.
Ahmed K, Tawfic S (1994) Mekanisme for intracellulær regulering av proteinkinase CK2: rollen til stimulusmediert subnukleær assosiasjon. Cell Mol Biol Res 40 : 539–545.
Alcazar A, Martin E, Lopez-Fando J, Salinas M (1988) En forbedret renseprosedyre og egenskaper til kaseinkinase II fra hjernen. Neurochem Res 13 : 829–836.
Andersson M, Westin JE, Cenci MA (2003) Tidsforløp for striatal DeltaFosB-lignende immunreaktivitet og prodynorfin mRNA-nivåer etter seponering av kronisk dopaminomimetisk behandling. Eur J Neurosci 17 : 661–666.
Barz T, Ackermann K, Dubois G, Eils R, Pyerin W (2003) Genomomfattende ekspresjonsscreeninger indikerer en global rolle for proteinkinase CK2 i kromatinombygging. J Cell Sci 116 : 1563–1577.
Beh I, Schmidt R, Hecker E (1989) To isozymer av PKC funnet i HL-60-celler viser en forskjell i aktivering av forbolesteren TPA. FEBS Lett 249 : 264–266.
Bildl W, Strassmaier T, Thurm H, Andersen J, Eble S, Oliver D, Knipper M, Mann M, Schulte U, Adelman JP, Fakler B (2004) Proteinkinase CK2 er koassemblert med Ca(2+)-aktiverte K+-kanaler med lav konduktans og regulerer kanalporting. Neuron 43 : 847–858.
Bing G, Wang W, Qi Q, Feng Z, Hudson P, Jin L, Zhang W, Bing R, Hong JS (1997) Langtidsekspresjon av Fos-relatert antigen og forbigående ekspresjon av delta FosB assosiert med anfall i rottehippocampus og striatum. J Neurochem 68 : 272–279.
Blom N, Sicheritz-Ponten T, Gupta R, Gammeltoft S, Brunak S (2004) Prediksjon av posttranslasjonell glykosylering og fosforylering av proteiner fra aminosyresekvensen. Proteomics 4 : 1633–1649.
Boehning D, Moon C, Sharma S, Hurt KJ, Hester LD, Ronnett GV, Shugar D, Snyder SH (2003) Karbonmonoksid-nevrotransmisjon aktivert av CK2-fosforylering av hemoksygenase-2. Neuron 40 : 129–137.
Bohmann D (1990) Fosforylering av transkripsjonsfaktor: en kobling mellom signaltransduksjon og regulering av genuttrykk. Cancer Cells 2 : 337–344.
Buschmann T, Potapova O, Bar-Shira A, Ivanov VN, Fuchs SY, Henderson S, Fried VA, Minamoto T, Alarcon-Vargas D, Pincus MR, Gaarde WA, Holbrook NJ, Shiloh Y, Ronai Z (2001) Jun NH2-terminal kinasefosforylering av p53 på Thr-81 er viktig for p53-stabilisering og transkripsjonsaktiviteter som respons på stress. Mol Cell Biol 21 : 2743–2754.
Carle TL, Ulery PG, Nestler EJ (2004) Fravær av et konservert C-terminalt domene i Fos-familien bidrar til deltaFosBs unike stabilitet. Soc Neurosci Abstr 30 : 692.2.
Channavajhala P, Seldin DC (2002) Funksjonell interaksjon mellom proteinkinase CK2 og c-Myc i lymfomagenese. Oncogene 21 : 5280–5288.
Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, Hope BT, Nestler EJ (1995) Regulering av delta FosB og FosB-lignende proteiner ved elektrokonvulsive anfall og kokainbehandlinger. Mol Pharmacol 48 : 880-889.
Chen J, Kelz MB, Hope BT, Nakabeppu Y, Nestler EJ (1997) Kroniske Fos-relaterte antigener: stabile varianter av ΔFosB indusert i hjernen ved kroniske behandlinger. J Neurosci 17 : 4933-4941.
Chen RH, Juo PC, Curran T, Blenis J (1996) Fosforylering av c-Fos ved C-terminalen forsterker dens transformerende aktivitet. Oncogene 12 : 1493–1502.
Choe ES, Parelkar NK, Kim JY, Cho HW, Kang HS, Mao L, Wang JQ (2004) Proteinfosfatase 1/2A-hemmeren okadainsyre øker CREB- og Elk-1-fosforylering og c-fos-uttrykk i rottestriatum in vivo. J Neurochem 89 : 383-390.
Cochet C, Chambaz EM (1983) Polyaminmedierte proteinfosforyleringer: et mulig mål for intracellulær polyaminvirkning. Mol Cell Endocrinol 30 : 247–266.
Cochet C, Feige JJ, Chambaz EM (1983) Katalytiske og molekylære egenskaper til en høyrenset G-type kaseinkinase fra bovint lungevev. Biochim Biophys Acta 743 : 1–12.
Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW (2003) Striatal celletypespesifikk overekspresjon av DeltaFosB øker insentivet for kokain. J Neurosci 23 : 2488–2493.
Daunais JB, Roberts DC, McGinty JF (1993) Selvadministrasjon av kokain øker preprodynorfin, men ikke c-fos, mRNA i rottestriatum. NeuroReport 4 : 543–546.
Desterro JM, Rodriguez MS, Hay RT (2000) Regulering av transkripsjonsfaktorer ved proteinnedbrytning. Cell Mol Life Sci 57 : 1207–1219.
Diaz-Nido J, Armas-Portela R, Avila J (1992) Økning i cytoplasmatisk kaseinkinase II-type aktivitet følger med neurittutvekst etter DNA-syntesehemming i NIA-103 nevroblastomceller. J Neurochem 58 : 1820–1828.
Di Maira G, Salvi M, Arrigoni G, Marin O, Sarno S, Brustolon F, Pinna LA, Ruzzene M (2005) Proteinkinase CK2 fosforylerer og oppregulerer Akt/PKB. Celledød Differ 12 : 668 –677.
Dobrazanski P, Noguchi T, Kovary K, Rizzo CA, Lazo PS, Bravo R (1991) Begge produktene av fosB-genet, FosB og dets korte form, FosB/SF, er transkripsjonsaktivatorer i fibroblaster. Mol Cell Biol 11 : 5470–5478.
Ferrara P, Andermarcher E, Bossis G, Acquaviva C, Brockly F, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2003) De strukturelle determinantene som er ansvarlige for nedbrytning av c-Fos-protein i proteasoma varierer i henhold til uttrykksbetingelsene. Oncogene 22 : 1461–1474.
Fuchs SY, Dolan L, Davis RJ, Ronai Z (1996) Fosforyleringsavhengig målretting av c-Jun ubiquitinering av Jun N-kinase. Oncogene 13 : 1531–1535.
Fuchs SY, Xie B, Adler V, Fried VA, Davis RJ, Ronai Z (1997) c-Jun NH2-terminale kinaser retter seg mot ubiquitinering av deres assosierte transkripsjonsfaktorer. J Biol Chem 272 : 32163–32168.
Fuchs SY, Tappin I, Ronai Z (2000) Stabiliteten til ATF2-transkripsjonsfaktoren reguleres av fosforylering og defosforylering. J Biol Chem 275 : 12560–12564.
Girault JA, Hemmings HC Jr, Williams KR, Nairn AC, Greengard P (1989) Fosforylering av DARPP-32, et dopamin- og cAMP-regulert fosfoprotein, ved kaseinkinase II. J Biol Chem 264 : 21748–21759.
Girault JA, Hemmings HC Jr, Zorn SH, Gustafson EL, Greengard P (1990) Karakterisering i pattedyrhjernen av en DARPP-32 serinkinase identisk med kaseinkinase II. J Neurochem 55 : 1772–1783.
Hanada M, Sugawara K, Kaneta K, Toda S, Nishiyama Y, Tomita K, Yamamoto H, Konishi M, Oki T (1992) Epoxomicin, et nytt antitumormiddel av mikrobiell opprinnelse. J Antibiot (Tokyo) 45 : 1746-1752.
Hann SR, Eisenman RN (1984) Proteiner kodet av det humane c-myc-onkogenet: differensiell uttrykk i neoplastiske celler. Mol Cell Biol 4 : 2486–2497.
Hemmings HC Jr, Girault JA, Williams KR, LoPresti MB, Greengard P (1989) ARPP-21, et syklisk AMP-regulert fosfoprotein (Mr = 21 000) beriket med dopamin-innerverte hjerneområder. Aminosyresekvens for stedet fosforylert av syklisk AMP i intakte celler og kinetiske studier av dets fosforylering in vitro. J Biol Chem 264 : 7726–7733.
Hidaka H, Kobayashi R (1992) Farmakologi av proteinkinasehemmere. Annu Rev Pharmacol Toxicol 32 : 377–397.
Hirata H, Bessho Y, Kokubu H, Masamizu Y, Yamada S, Lewis J, Kageyama R (2004) Ustabiliteten til Hes7-proteinet er avgjørende for somittsegmenteringsklokken. Nat Genet 36 : 750–754.
Hiroi N, Graybiel AM (1996) Atypiske og typiske nevroleptiske behandlinger induserer distinkte programmer for transkripsjonsfaktoruttrykk i striatum. J Comp Neurol 374 : 70–83.
Hope B, Kosofsky B, Hyman SE, Nestler EJ (1992) Regulering av umiddelbar tidlig genuttrykk og AP-1-binding i rottekjernen accumbens av kronisk kokain. Proc Natl Acad Sci USA 89 : 5764–5768.
Hope BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ (1994a) Behandling av kroniske elektrokonvulsive anfall (ECS) resulterer i uttrykk av et langvarig AP-1-kompleks i hjernen med endret sammensetning og egenskaper. J Neurosci 14 : 4318–4328.
Hope BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ (1994b) Induksjon av et langvarig AP-1-kompleks bestående av endrede Fos-lignende proteiner i hjernen ved kronisk kokain og andre kroniske behandlinger. Neuron 13 : 1235–1244.
Ishida A, Fujisawa H (1995) Stabilisering av kalmodulinavhengig proteinkinase II gjennom det autoinhibitoriske domenet. J Biol Chem 270 : 2163–2170.
Jariel-Encontre I, Salvat C, Steff AM, Pariat M, Acquaviva C, Furstoss O, Piechaczyk M (1997) Komplekse mekanismer for nedbrytning av c-fos og c-jun. Mol Biol Rep 24 : 51–56.
Jones S, Yakel JL (2003) Kaseinkinase ii (proteinkinase ck2) regulerer serotonin 5-ht(3)-reseptorkanalfunksjonen i ng108–15-celler. Neuroscience 119 : 629–634.
Kato T Jr, Delhase M, Hoffmann A, Karin M (2003) CK2 er en C-terminal IkappaB-kinase som er ansvarlig for NF-kappaB-aktivering under UV-responsen. Mol Cell 12 : 829–839.
Kelz MB, Chen J, Carlezon WA Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ (1999) Ekspresjon av transkripsjonsfaktoren deltaFosB i hjernen kontrollerer følsomhet for kokain. Nature 401 : 272–276.
Kim KB, Myung J, Sin N, Crews CM (1999) Proteasomhemming av naturproduktene epoxomicin og dihydroeponemycin: innsikt i spesifisitet og potens. Bioorg Med Chem Lett 9 : 3335–3340.
Kobayashi E, Nakano H, Morimoto M, Tamaoki T (1989) Calphostin C (UCN-1028C), en ny mikrobiell forbindelse, er en svært potent og spesifikk hemmer av proteinkinase C. Biochem Biophys Res Commun 159 : 548–553.
Krek W, Maridor G, Nigg EA (1992) Kaseinkinase II er et hovedsakelig kjerneenzym. J Cell Biol 116 : 43–55.
Krohn NM, Stemmer C, Fojan P, Grimm R, Grasser KD (2003) Proteinkinase CK2 fosforylerer gruppedomeneproteinet SSRP1 med høy mobilitet, noe som induserer gjenkjenning av UV-skadet DNA. J Biol Chem 278 : 12710–12715.
Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DEH, Truong HT, Russo SJ, LaPlant Q, Whistler K, Neve RL, Self DW, Nestler EJ (2005) Kromatinombygging er en nøkkelmekanisme som ligger til grunn for kokainindusert plastisitet i striatum. Neuron 48 : 303–314.
Lieberman DN, Mody I (1999) Kasein kinase-II regulerer NMDA-kanalfunksjon i hippocampusneuroner. Nat Neurosci 2 : 125–132.
Litchfield DW (2003) Proteinkinase CK2: struktur, regulering og rolle i cellulære avgjørelser om liv og død. Biochem J 369 : 1–15.
Manabe T, Kuramoto N, Nakamichi N, Aramachi K, Baba K, Hirai T, Yoneyama M, Yoneda Y (2001) Nedbrytning av c-Fos-protein uttrykt av N-metyl- d- asparaginsyre i kjernefraksjoner av murin hippocampus. Brain Res 905 : 34–43.
Mandelzys A, Gruda MA, Bravo R, Morgan JI (1997) Fravær av et vedvarende forhøyet 37 kDa fos-relatert antigen og AP-1-lignende DNA-bindende aktivitet i hjernen til kainsyrebehandlede fosB-nullmus. J Neurosci 17 : 5407–5415.
Marin O, Meggio F, Marchiori F, Borin G, Pinna LA (1986) Stedsspesifisitet for kaseinkinase-2 (TS) fra rottelevercytosol. En studie med modellpeptidsubstrater. Eur J Biochem 160 : 239–244.
McClung CA, Nestler EJ (2003) Regulering av genuttrykk og kokainbelønning av CREB og DeltaFosB. Nat Neurosci 6 : 1208–1215.
McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ (2004) DeltaFosB: en molekylær bryter for langsiktig tilpasning i hjernen. Brain Res Mol Brain Res 132 : 146–154.
Meggio F, Pinna LA (2003) Ett tusen og ett substrat av proteinkinase CK2? FASEB J 17 : 349–368.
Meggio F, Donella-Deana A, Pinna LA, Moret V (1977) Fosforylering av kaseinfraksjoner av rottelever 'fosvitinkinase.'. FEBS Lett 75 : 192 –196.
Meggio F, Brunati AM, Pinna LA (1983) Autofosforylering av type 2 kaseinkinase TS ved både alfa- og beta-subenheter. Påvirkning av forskjellige effektorer. FEBS Lett 160 : 203–208.
Meggio F, Shugar D, Pinna LA (1990) Ribofuranosyl-benzimidazolderivater som hemmere av kasein kinase-2 og kasein kinase-1. Eur J Biochem 187 : 89–94.
Meggio F, Marin O, Pinna LA (1994) Substratspesifisitet av proteinkinase CK2. Cell Mol Biol Res 40 : 401–409.
Miller C, Zhang M, He Y, Zhao J, Pelletier JP, Martel-Pelletier J, Di Battista JA (1998) Transkripsjonell induksjon av cyklooksygenase-2-genet ved okadasyrehemming av fosfataseaktivitet i humane kondrocytter: kostimulering av AP-1 og CRE kjernebindende proteiner. J Cell Biochem 69 : 392–413.
Moratalla R, Elibol B, Vallejo M, Graybiel AM (1996) Endringer på nettverksnivå i uttrykk av induserbare Fos-Jun-proteiner i striatum under kronisk kokainbehandling og abstinenser. Neuron 17 : 147–156.
Morgan JI, Curran T (1995) Umiddelbart-tidlige gener: ti år senere. Trends Neurosci 18 : 66–67.
Nakabeppu Y, Nathans D (1991) En naturlig forekommende avkortet form av FosB som hemmer Fos/Jun-transkripsjonsaktivitet. Cell 64 : 751–759.
Nestler EJ, Barrot M, Self DW (2001) Delta FosB: en vedvarende molekylær bryter for avhengighet. Proc Natl Acad Sci USA 98 : 11042–11046.
Neve RL, Howe JR, Hong S, Kalb RG (1997) Introduksjon av glutamatreseptor-subenhet 1 i motoriske nevroner in vitro og in vivo ved bruk av et rekombinant herpes simplex-virus. Neuroscience 79 : 435–447.
Nuthall HN, Joachim K, Stifani S (2004) Fosforylering av serin 239 i Groucho/TLE1 av proteinkinase CK2 er viktig for hemming av nevronal differensiering. Mol Cell Biol 24 : 8395–8407.
Okazaki K, Sagata N (1995) Mos/MAP-kinaseveien stabiliserer c-Fos ved fosforylering og forsterker dens transformerende aktivitet i NIH 3T3-celler. EMBO J 14 : 5048–5059.
Palombella VJ, Rando OJ, Goldberg AL, Maniatis T (1994) Ubiquitin-proteasom-signalveien er nødvendig for prosessering av NF-kappa B1-forløperproteinet og aktivering av NF-kappa B. Cell 78 : 773–785.
Papavassiliou AG, Treier M, Chavrier C, Bohmann D (1992) Målrettet nedbrytning av c-Fos, men ikke v-Fos, ved et fosforyleringsavhengig signal på c-Jun. Science 258 : 1941–1944.
Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ, Schaeffer E (2003) Induserbar, hjerneregionspesifikk ekspresjon av en dominant negativ mutant av c-Jun hos transgene mus reduserer følsomheten for kokain. Brain Res 970 : 73–86.
Perrotti LI, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ (2004) Induksjon av DeltaFosB i belønningsrelaterte hjernestrukturer etter kronisk stress. J Neurosci 24 : 10594-10602.
Persico AM, Schindler CW, O'Hara BF, Brannock MT, Uhl GR (1993) Uttrykk av hjernetranskripsjonsfaktor: effekter av akutt og kronisk amfetamin og injeksjonsstress. Brain Res Mol Brain Res 20 : 91–100.
Ploegh HL, Dunn BM (2000) Posttranslasjonell modifikasjon: fosforylering og fosfataser. I: Current protocols in protein science (Dunn BM, red.) s. 13.01–13.02 . New York: Wiley and Sons.
Pyerin W, Burow E, Michaely K, Kubler D, Kinzel V (1987) Katalytiske og molekylære egenskaper til høyrenset fosvitin/kaseinkinase type II fra humane epitelceller i kultur (HeLa) og forhold til ektoproteinkinase. Biol Chem Hoppe Seyler 368 : 215–227.
Reikhardt BA, Kulikova OG, Borisova GY, Aleksandrova IY, Sapronov NS (2003) Status for «proteinkinase CK2-HMG14»-systemet ved aldersrelatert hukommelsestap hos rotter. Neurosci Behav Physiol 33 : 799–804.
Roberts BJ, Whitelaw ML (1999) Nedbrytning av den grunnleggende helix-loop-helix/Per-ARNT-Sim homologidomenet dioksinreseptor via ubiquitin/proteasom-veien. J Biol Chem 274 : 36351–36356.
Rost B, Yachdav G, Liu J (2004) PredictProtein-serveren. Nucleic Acids Res 32 : W321 –W326.
Rylski M, Kaczmarek L (2004) Ap-1-mål i hjernen. Front Biosci 9 : 8–23.
Sahin B, Kansy JW, Nairn AC, Spychala J, Ealick SE, Fienberg AA, Greene RW, Bibb JA (2004) Molekylær karakterisering av rekombinant museadenosinkinase og evaluering som et mål for proteinfosforylering. Eur J Biochem 271 : 3547–3555.
Salvat C, Aquaviva C, Jariel-Encontre I, Ferrara P, Pariat M, Steff AM, Carillo S, Piechaczyk M (1999) Finnes det flere proteolytiske veier som bidrar til nedbrytning av c-Fos, c-Jun og p53 protein in vivo? Mol Biol Rep 26 : 45–51.
Schmidt R, Hecker E (1975) Autooksidasjon av forbolestere under normale lagringsforhold. Cancer Res 35 : 1375–1377.
Schwarz EM, Van Antwerp D, Verma IM (1996) Konstitutiv fosforylering av IkappaBalpha av kaseinkinase II skjer fortrinnsvis ved serin 293: krav for nedbrytning av fri IkappaBalpha. Mol Cell Biol 16 : 3554–3559.
Sears R, Leone G, DeGregori J, Nevins JR (1999) Ras forbedrer Myc-proteinstabilitet. Mol Cell 3 : 169–179.
Silva-Neto MA, Fialho E, Paes MC, Oliveira PL, Masuda H (2002) Syklisk nukleotid-uavhengig fosforylering av vitellin ved kasein kinase II renset fra Rhodnius prolixus oocytter. Insect Biochem Mol Biol 32 : 847–857.
Skinner M, Qu S, Moore C, Wisdom R (1997) Transkripsjonell aktivering og transformasjon av FosB-protein krever fosforylering av det karboksylterminale aktiveringsdomenet. Mol Cell Biol 17 : 2372–2380.
Stemmer C, Schwander A, Bauw G, Fojan P, Grasser KD (2002) Proteinkinase CK2 fosforylerer differensielt mais kromosomale høymobilitetsgruppe B (HMGB) proteiner, og modulerer deres stabilitet og DNA-interaksjoner. J Biol Chem 277 : 1092–1098.
Stevens I, Derua R, Rondelez E, Waelkens E, Merlevede W, Goris J (1999) Identifisering av cyk, en cyklin B2-kinase, som en ny kalsium/calmodulin-avhengig proteinkinase II og dens rolle under modning av Xenopus laevis-oocytter. Exp Cell Res 252 : 303–318.
Suh HW, Choi SS, Lee JK, Lee HK, Han EJ, Lee J (2004) Regulering av c-fos og c-jun genuttrykk av lipopolysakkarid og cytokiner i primært dyrkede astrocytter: effekt av PKA- og PKC-veier. Arch Pharm Res 27 : 396–401.
Szyszka R, Boguszewska A, Grankowski N, Ballesta JP (1995) Differensiell fosforylering av ribosomale sure proteiner fra gjærceller av to endogene proteinkinaser: kaseinkinase-2 og 60S-kinase. Acta Biochim Pol 42 : 357–362.
Tamaoki T, Takahashi I, Kobayashi E, Nakano H, Akinaga S, Suzuki K (1990) Calphostin (UCN1028) og calphostin-relaterte forbindelser, en ny klasse spesifikke og potente hemmere av proteinkinase C. Adv Second Messenger Phosphoprotein Res 24 : 497–501.
Torres J, Pulido R (2001) Tumorsuppressoren PTEN fosforyleres av proteinkinasen CK2 ved C-terminalen. Implikasjoner for PTEN-stabilitet for proteasommediert nedbrytning. J Biol Chem 276 : 993–998.
Tsubuki S, Saito Y, Tomioka M, Ito H, Kawashima S (1996) Differensiell inhibering av calpain- og proteasomaktiviteter av peptidylaldehyder av di-leucin og tri-leucin. J Biochem (Tokyo) 119 : 572–576.
Tsurumi C, Ishida N, Tamura T, Kakizuka A, Nishida E, Okumura E, Kishimoto T, Inagaki M, Okazaki K, Sagata N (1995) Nedbrytning av c-Fos av 26S-proteasomet akselereres av c-Jun og flere proteinkinaser. Mol Cell Biol 15 : 5682-5687.
Unger GM, Davis AT, Slaton JW, Ahmed K (2004) Proteinkinase CK2 som regulator av celleoverlevelse: implikasjoner for kreftbehandling. Curr Cancer Drug Targets 4 : 77–84.
Vial E, Marshall CJ (2003) Forhøyet ERK-MAP-kinaseaktivitet beskytter FOS-familiemedlemmet FRA-1 mot proteasomal nedbrytning i kolonkarsinomceller. J Cell Sci 116 : 4957–4963.
Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S (2002) ΔFosB regulerer hjulkjøring. J Neurosci 22 : 8133-8138.
Whitmarsh AJ, Davis RJ (2000) Regulering av transkripsjonsfaktorfunksjon ved fosforylering. Cell Mol Life Sci 57 : 1172–1183.
Winter B, Kautzner I, Issinger OG, Arnold HH (1997) To antatte proteinkinase CK2-fosforyleringssteder er viktige for Myf-5-aktivitet. Biol Chem 378 : 1445–1456.
Wisniewski JR, Szewczuk Z, Petry I, Schwanbeck R, Renner U (1999) Konstitutiv fosforylering av de sure halene til gruppe 1-proteinene med høy mobilitet ved kaseinkinase II endrer deres konformasjon, stabilitet og DNA-bindingsspesifisitet. J Biol Chem 274 : 20116–20122.
Yamaguchi Y, Wada T, Suzuki F, Takagi T, Hasegawa J, Handa H (1998) Kaseinkinase II interagerer med bZIP-domenene til flere transkripsjonsfaktorer. Nucleic Acids Res 26 : 3854–3861.
Yanagawa T, Yuki K, Yoshida H, Bannai S, Ishii T (1997) Fosforylering av A170 stressprotein ved kasein kinase II-lignende aktivitet i makrofager. Biochem Biophys Res Commun 241 : 157–163.
Yankulov K, Yamashita K, Roy R, Egly JM, Bentley DL (1995) Transkripsjonell elongasjonshemmer 5,6-diklor-1-beta- d- ribofuranosylbenzimidazol hemmer transkripsjonsfaktor IIH-assosiert proteinkinase. J Biol Chem 270 : 23922–23925.
Yen J, Wisdom RM, Tratner I, Verma IM (1991) En alternativ spleiset form av FosB er en negativ regulator av transkripsjonell aktivering og transformasjon av Fos-proteiner. Proc Natl Acad Sci USA 88 : 5077–5081.
Yin X, Jedrzejewski PT, Jiang JX (2000) Kaseinkinase II fosforylerer linsekonneksin 45.6 og er involvert i nedbrytningen av dette. J Biol Chem 275 : 6850–6856.
Yoza BK, Brooks JW, Mizel SB (1992) Induksjon av AP-1 transkripsjonsfaktorkomponenter under T-celleaktivering av interleukin 1 og forbolestere. Cell Growth Differ 3 : 677–684.
Yu S, Wang H, Davis A, Ahmed K (2001) Konsekvenser av CK2-signalering til kjernematrisen. Mol Cell Biochem 227 : 67–71.
Yu S, Davis AT, Guo C, Green JE, Ahmed K (1999) Differensiell målretting av proteinkinase CK2 til kjernematrisen ved forbigående overekspresjon av dens underenheter. J Cell Biochem 74 : 127–134.
Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton O, Sim-Selley LJ, DiLeone RJ, Kumar A, Nestler EJ (2006) ΔFosB: en essensiell rolle for ΔFosB i kjerneaktiviteten i morfinaksjonen. Nat Neurosci 9 : 205-211.
Artikler som refererer til denne artikkelen
- Behavioral og strukturelle responser på kronisk kokain Krever en feedforward Loop som involverer {Delta} FosB og Calcium / Calmodulin-Dependent Protein Kinase II i Nucleus Accumbens Shell Journal of Neuroscience, 6 Mars 2013, 33(10):4295-4307
- Striatal Overekspresjon av {Delta} FosB gjengir kronisk levodopa-inducerte ufrivillige bevegelser Journal of Neuroscience, 26 kan 2010, 30(21):7335-7343
- Abstrakt
- Full tekst
- Fulltekst (PDF)
- Abstrakt
- Full tekst
- Fulltekst (PDF)
- Abstrakt
- Full tekst
- Fulltekst (PDF)
- Abstrakt
- Full tekst
- Fulltekst (PDF)
- Transkripsjonsmekanismer av avhengighet: rolle av {Delta} FosB Filosofiske transaksjoner av Royal Society B: Biological Sciences, 12 oktober 2008, 363(1507):3245-3255
- Vedvarende sårbarhet for gjeninnføring av metamfetamin-søkeradferdighet i glialcellelinje-avledede nevrotrofiske faktor mutante mus FASEB Journal, 1 juli 2007, 21(9):1994-2004
- Aktivatorprotein-1-transkripsjonsfaktoren i respiratorisk epitelkarsinogenese Molekylær Kreftforskning, 1 februar 2007, 5(2):109-120