Regulering av DeltaFosB stabilitet ved fosforylering (2006)

J Neurosci. 2006 May 10;26(19):5131-42.

Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ.

kilde

Institutt for psykiatri, Senter for grunnleggende nevrovitenskap, Universitetet i Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Texas 75390-9070, USA.

Abstrakt

Transkripsjonsfaktoren DeltaFosB (også referert til som FosB2 eller FosB [short form]) er en viktig mediator av den langsiktige plastisitet indusert i hjernen ved kronisk eksponering for flere typer psykoaktive stimuli, inkludert rusmidler, stress og elektrokonvulsive anfall . Et tydelig trekk ved DeltaFosB er at det, når det blir indusert, vedvarer i hjernen i relativt lange perioder i fravær av ytterligere stimulering. Mekanismene som ligger til grund for denne tilsynelatende stabiliteten, har imidlertid forblitt ukjente. Her demonstrerer vi at DeltaFosB er en relativt stabil transkripsjonsfaktor, med en halveringstid på omtrent 10 h i cellekultur. Videre viser vi at DeltaFosB er et fosfoprotein i hjernen, og at fosforylering av en svært konservert serinrest (Ser27) i DeltaFosB beskytter den mot proteasomal nedbrytning. Vi gir flere linjer med bevis som tyder på at denne fosforyleringen medieres av kasein kinas 2. Disse funnene er det første beviset på at DeltaFosB er fosforylert og demonstrerer at fosforylering bidrar til stabiliteten, som er kjernen i dets evne til å mediere langvarige tilpasninger i hjernen.

Introduksjon

Transkripsjonsfaktoren ΔFosB, også betegnet FosB2 eller FosB [kort form], er en C-terminus-trunkerte spleisvariant av det umiddelbare, tidlige genet fosb (Dobrazanski et al., 1991; Nakabeppu og Nathans, 1991; Yen et al., 1991). I likhet med full lengde FosB har ΔFosB et DNA-bindende grunnleggende domene og en leucin-glidelås gjennom hvilken den dimeriseres med Jun-proteiner for å danne aktiveringsprotein-1 (AP-1) transkripsjonsfaktorkomplekser som regulerer uttrykket av mange gener (Morgan og Curran, 1995; Rylski og Kaczmarek, 2004). Til tross for manglende del av transaktivasjonsdomene funnet i C-terminalen til FosB, fungerer ΔFosB som både en potensiell transkripsjonal aktivator og repressor i dyrkede celler og i hjernen (Dobrazanski et al., 1991; Nakabeppu og Nathans, 1991; Chen et al., 1997; McClung og Nestler, 2003; Kumar et al., 2005).

ΔFosB er indusert til høye nivåer på en regionspesifikk måte i hjernen etter kronisk, men ikke akutt eksponering for en rekke psykoaktive stimuli, inkludert stress, visse lesjoner, antipsykotiske og antidepressiva stoffer, misbruksmidler og naturlige belønninger. (Håpe et al., 1994b; Hiroi og Graybiel, 1996; Moratalla et al., 1996; Bing et al., 1997; Mandelzys et al., 1997; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002; Andersson et al., 2003; Colby et al., 2003; Peakman et al., 2003; Perrotti et al., 2004; Zachariou et al., 2006). Induksjonen av ΔFosB har vært relatert direkte til de funksjonelle effektene av flere av disse stimuliene på hjernen. Vedvarende ΔFosB, selv i fravær av ytterligere stimulering, skiller den fra alle andre Fos-familietransskripsjonsfaktorer, som raskt induseres som respons på akutte stimuli, faller tilbake til basale nivåer innen noen få timer, og viser generelt desensibilisering etter kronisk stimulering (Håper et al., 1992; Daunais et al., 1993; Persico et al., 1993; Hiroi og Graybiel, 1996; Perrotti et al., 2004). Dette gjør ΔFosB til en attraktiv kandidat til å formidle noen av de langvarige endringene i genuttrykk som ligger til grunn for de stabile nevrononale tilpasninger forårsaket av visse kroniske stimuli.

Fordi den langvarige tilstedeværelsen av ΔFosB forekommer i fravær av videre induksjon av dets mRNA (Chen et al., 1995) spekulerte vi at, i motsetning til full lengde FosB og alle andre Fos-familieproteiner, som er iboende ustabile, kan ΔFosB være en uvanlig stabil transkripsjonsfaktor (Håpe et al., 1994b; Chen et al., 1997; Nestler et al., 2001; McClung et al., 2004). Videre antydet immunoblottende analyse av akutt-versus kronisk-stimulert hjernevev at ΔFosB skifter i tilsynelatende M_r (molekylmasse) fra ~33 kDa i akutt tilstand til ~35-37 kDa under kronisk behandling (Håpe et al., 1994a; Chen et al., 1995). Fordi det ikke foreligger bevis for eksistensen av ytterligere mRNA som kan kode for disse forskjellige isoformene, spekulerte vi videre at ΔFosB er posttranslasjonelt modifisert, og det kan kanskje bidra til den uvanlige stabiliteten. Til nå er det imidlertid ikke rapportert om biokjemiske analyser av omsetningen eller posttranslasjonelle modifikasjoner av ΔFosB. Målet med den foreliggende studien var å avgjøre om ΔFosB er et fosfoprotein og om fosforylering spiller en rolle i stabiliteten.

Forrige seksjonNeste seksjon

Materialer og metoder

Mammale cellelinjer og DNA-konstruksjoner.

PC12-celler (Clontech, Mountainview, CA) ble dyrket i DMG med høy glukose inneholdende l-glutamin (L-Gln) og supplert med 5% føtalt bovint serum (FBS), 10% hesteserum (både fra Invitrogen, Carlsbad, CA) , 100 U / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin (begge fra Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). HeLa-celler (American Type Culture Collection, Manassas, VA) ble dyrket i høyglukose DMEM som inneholdt L-Gln og supplert med 10% FBS, penicillin og streptomycin. Begge cellelinjer ble opprettholdt ved 37 ° C i en fuktig 5% CO₂ atmosfære.

For transiente transfeksjoner med DNA ble såkalte PC12- eller HeLa-celler podet på 6 brønnplater (belagt med kollagen I for PC12-celler) for å nå 90-100% sammenføyning neste dag og ble så transfektert ved hjelp av Lipofectamine 2000 (Invitrogen). I noen eksperimenter (se Fig. 1â ‡ "â ‡ "â ‡ "â ‡ "â ‡ "-7), ΔFosB ble forbigående uttrykt i PC12-celler via infeksjon med rekombinant herpes simplexvirus (HSV).

ΔFosB- og FosB-cDNA ble oppnådd fra våre egne pTop-konstruksjoner (Chen et al., 1997), og subklonet inn i en pcDNA3.1 vektor (Invitrogen). Disse PCDNA3.1-FFB / FosB-konstruksjonene ble brukt til ekspresjon i pattedyrceller og som en mal for stedsstyrt mutagenese. Rekombinant HSV-FosB ble fremstilt som beskrevet tidligere (Neve et al., 1997), og preparatet hadde en titer av ~1 × 10⁸ pfu / ml.

Pulse-chase eksperimenter.

Ca. 24h etter infeksjon / transfeksjon ble celler (PC12 eller HeLa) i 6-brønnsplater vasket to til tre ganger med 2 ml PBS og inkubert ved 37 ° C for ~1h i 2 ml Cys / Met-fri DMEM (Invitrogen) supplert med 5% dialysert FBS (Hyclone, Logan, UT) for å deplisere intracellulære bassenger av Met and Cys. Ved slutten av denne "sult" -perioden ble legemidler (hvis celler skulle bli behandlet) tilsatt, og celler ble merket (puls) med 12-25 μCi av ³⁵S Protein Mærkning Mix (SPerkinElmer, Wellesley, MA) for ~1 h ved 37 ° C for å merke alle nylig syntetiserte proteiner. Radiomerkeren ble deretter fjernet ved vasking av cellene to til tre ganger med 2 ml PBS, og ³⁵S-merkede proteiner ble fulgt (jakten) ved å erstatte mediet med "kaldt" (ikke-radioaktivt) medium tilsatt 5% FBS og høsting av cellene ved forskjellige tidspunkter. Cellebehandlinger ble opprettholdt gjennom hele jakten. Alle tallene i disse forsøkene viser tilsvarende innledende mengder av de forskjellige proteiner for å optimalisere sammenligninger av deres omsetningsrate.

Dyr og kronisk elektrokonvulsiv anfallbehandling.

Adult Sprague Dawley hanrotter (200-300 g; Charles River Laboratories, Kingston, RI) ble behandlet en gang daglig med elektrokonvulsive anfall (ECS) for 7-9 d. ECS ble utført som beskrevet tidligere (Håpe et al., 1994a) ved hjelp av en Ugo Basile (Comerio VA, Italia) ECS-enhet med følgende innstillinger: frekvens, 100-pulser / s; puls med, 0.5 ms; sjokkvarighet, 1.0 s; og nåværende, 75 mA. Sham kontrolldyr ble behandlet parallelt ved å påføre øreklokkeelektroder uten elektrisk strøm.

³² P metabolisk merking.

For merking av hjerneskiver ble rotter dekapitert, hjernene ble raskt dissekert, og 300 μm frontale kortikale skiver ble fremstilt med en DSK mikrosliper (Ted Pella, Redding, CA). Skivene ble inkubert inn i plastrør i 2 ml fosfat-mangelfull kunstig CSF (ACSF) og holdt ved 30 ° C under konstant forsiktig bobling med en O₂/ CO₂ blanding (Hemmings et al., 1989). Skivene (to skiver per rør) ble merket med 1.3 mCi for 8-10 h i nærvær eller fravær av okadainsyre (100 ng / ml). Ved slutten av denne inkuberingen ble skivene skyllet minst tre ganger med kald ACSF og deretter homogenisert ved sonikering i 250 μl av kald radioimmunprecipitasjonsanalyse (RIPA) buffer [PBS, pH 7.4, 150 mm NaCl, 1% (volum / volum) ) Igepal, 0.5% (w / v) natriumdeoksykolat, 0.1% (vekt / volum) SDS, 1 mm EDTA] suppleres før bruk med SDS opptil 0.6%, proteaseinhibitor cocktail for pattedyrceller (brukt ved 5 μl / ml; Sigma-Aldrich), fosfataseinhibitor cocktails I og II (brukt ved 1: 100; Sigma-Aldrich), 1 mm PMSF og 2% glycerol. Homogenater ble så kokt for 15 min og fjernet ved sentrifugering ved 15,000 × g for 15 min. Proteinkonsentrasjon i de resulterende supernatanter ble vurdert ved bruk av BCA-proteinanalysen (Pierce, Holmdel, NJ).

For det ³²P-merking av dyrkede celler, ~24h etter infeksjon / transfeksjon, ble celler vasket to til tre ganger med fosfatfritt medium og inkubert i dette medium for ~1 h. Etter denne sultperioden, 0.2-0.3 mCi of ³²PH₃PO₄ (PerkinElmer) ble tilsatt til hver brønn, og celler ble merket for 4-12 h, avhengig av typen eksperiment (se fig. 1-7 for spesifikasjoner). Celler ble deretter vasket tre ganger med PBS og lysert på is for 15 min med 50 pl av supplert RIPA buffer. Lysater ble samlet ved skraping og ble ført 10 ganger gjennom en 25 ga-nål til skjær-DNA, kokt for 10 min, og sentrifugert ved 15,000 rpm for 15-30 min ved 4 ° C. De fjernede lysater (supernatanter) ble overført til et nytt rør og en BCA-proteinanalyse (Pierce) ble utført. Alle tallene i disse forsøkene viser tilsvarende mengder av totalt vildtype (WT) og S27A ΔFosB proteiner for å optimalisere sammenligninger av deres relative fosforyleringsnivåer.

Kjemikalier og cellekulturbehandlinger.

Okadainsyre (OA; Sigma-Aldrich) ble oppløst i etanol og anvendt ved en endelig konsentrasjon på 100 ng / ml. 5,6-Dichlor-1-P-d-ribofuranosylbenzimidazol (DRB, Biomol, Plymouth Meeting, PA) ble oppløst i dimetylsulfoksid (DMSO; Sigma-Aldrich) og anvendt i cellekultur ved en endelig konsentrasjon på 50 μm. Spermin (Sigma-Aldrich) ble oppløst i vann og brukt ved en endelig konsentrasjon av 200 μm. Calphostin-C (Biomol) ble oppløst i DMSO og anvendt ved 0.2 μm, mens phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA; Promega, Madison, WI) ble oppløst i DMSO og anvendt ved 0.1 μm. myristoylert-autocamtide-2-relatert inhibitorisk peptid (m-AIP; Biomol) ble oppløst i vann og anvendt ved en endelig konsentrasjon av 1 og 10 μm. Bredspektret proteinkinaseinhibitorer H-7 og H-8 (Biomol) ble oppløst i vann og anvendt ved en sluttkonsentrasjon henholdsvis 150 og 200 μm. MG132 (Calbiochem, San Diego, CA) og epoxomicin (Peptides International, Louisville, KY) ble begge oppløst i DMSO og anvendt ved en sluttkonsentrasjon av henholdsvis 12.5 og 7.5 μm. I alle forsøk ble DMSO (vehikel) tilsatt til celler som nødvendig for å opprettholde en konstant mengde DMSO over behandlinger. Til ³²P-merkingsforsøk, ble legemidlene tilsatt umiddelbart før etiketten og holdt for de resterende av merkingsperioden. For pulsjakteksperimenter ble det tilsatt narkotika ved tidspunktet for Cys / Met "sult", holdt gjennom merketiden, og deretter tilført tilbake i chase-mediet. Proteasominhibitorene ble spiket hver 3-4 h gjennom hele jakten for å kompensere for den hurtige omsetningen av disse peptidene.

ΔFosB immunprecipitasjon, immunoblotting og autoradiografi.

For immunutfelling ble lysater fortynnet 1: 5 med vanlig RIPA for å bringe SDS-konsentrasjonen ned til 0.1% før de fortsatte med immunutfelling (IP). For å begrense ikke-spesifikk binding ble lysatene først fjernet ved immunpresipitering med ikkeimmun IgG og protein G-Sepharose (Sigma-Aldrich) i minst 4 h. ΔFosB ble deretter immunprecipitert fra de rydde lysatene ved å bruke et geitpolyklonalt antistoff som gjenkjenner en indre epitop tilstede i både FosB ogAFosB (SC-48G; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ved 0.5-1 μg IgG per 10 μg lysatprotein (50-300 μg totalprotein) i et totalt volum 0.5 ml. IP ble forsiktig blandet ved 4 ° C på en rotor i minst 8h, og deretter ble 15 μl protein G-Sepharose tilsatt og IPs ble blandet i minst en annen 4 h. IP-er ble pelletert ved å spinne på 3000 × g for 3-5 min ved 4 ° C, vasket tre ganger med 0.5 ml kaldt ren RIPA og to ganger med kaldt PBS inneholdende 0.1% Tween 20. IPs ble deretter resuspendert i 0.5 ml kald PBS, overført, pelletert i et nytt rør, og immunpresipiterte proteiner ble deretter eluert ved tilsetning av 15-25 μl 2 × reduserende Laemmli protein prøvebuffer. Denne IP-protokollen resulterte i den spesifikke og effektive utfelling av praktisk talt alle ΔFosB i lysatet. De immunoprecipiterte proteiner ble utsatt for SDS-PAGE ved å laste hele IP på en 12.5% Tris-HCI-kriteriumgel (Bio-Rad, Hercules, CA) og deretter overført til PVDF eller nitrocellulose. Etter overføring ble membranen lufttørket og ³²P- og ³⁵S-radiomerkede proteinbånd ble observert ved autoradiografi ved bruk av Kodak (Rochester, NY) autoradiografisk film, samt ved fosforimaging ved bruk av en Storm (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) PhosphorImager. Totalt (ikke-fosforylert og fosforylert) FFosB i cellelysater eller hjernehomogenater ble detektert ved immunoblotting av enten det immunpresipiterte protein (ved bruk av samme membran som ble brukt til å detektere ³²P-merket protein) eller av like mengder lysat / homogenatprotein utsatt for SDS-PAGE og overført til PVDF eller nitrocellulose. Membranen ble først blokkert ved inkubering av den med 1% (w / v) fettfri tørrmelk (Bio-Rad) i PBS supplert med 0.1% (v / v) Tween 20 (Sigma) for 1 h ved 25 ° C. Membranen ble deretter immobilisert natten over ved 4 ° C med vårt eget kanin anti-FosB polyklonalt antistoff generert mot aminosyrer 1-16 av FosB / FosB (brukt ved 1: 10,000). Etter primær inkubering ble membranene vasket fire ganger for 5 min med blokkeringsbuffer og inkubert deretter ved 25 ° C for ~1h med et geit-anti-kanin-IgG konjugert til pepperrotperoksidase (anvendt ved 1: 5000 i blokkeringsbuffer fra Vector Laboratories, Burlingame, CA). Membranene ble deretter vasket tre ganger for 10 min med blokkeringsbuffer og en gang for 5 min med PBS. Totalt ΔFosB proteinbånd ble visualisert på Kodak MR-film ved forbedret kjemiluminescens (Pierce) og / eller ved påvisning av fluorescens ved bruk av ECL-Plus-reagensene (Amersham Biosciences) og Storm PhosphorImager.

Overekspresjon og rensing av rekombinant ΔFosB fra insektceller.

ΔFosB ble overuttrykt i Sf9-insektsceller som et N-terminus-heksa-His-merket protein (N-His (6) ΔFosB) ved hjelp av Bac-to-Bac baculovirus-ekspresjonssystemet (Invitrogen) og i følge produsentens anvisninger. Kort fortalt ble ΔFosB-cDNA (rester 2-237) som ble forhåndsfortalt av den affinitets-N-terminale merken MGHHHHHHAG subklonet i pFASTBacTM1-vektoren, som ble brukt til å generere rekombinant baculovirus. Sf9-celler ble infisert med rekombinant virus, og N-His (6) FFosB ble renset fra cellelysater ved hjelp av flere kromatografiske trinn, inkludert affinitetskromatografi ved anvendelse av en nikkelkolonne (Qiagen, Valencia, CA), anionutveksling ved bruk av en mono Q-kolonne (Amersham Biosciences), og størrelse ekskludering ved hjelp av en gel filtrering kolonne (Amersham Biosciences).

In vitro fosforyleringsstudier.

In vitro fosforyleringsreaksjoner for tidskurs og støkiometrianalyse ble utført i et volum 30iI inneholdende 10 μm substrat (N-His (6) FFosB eller et positivt kontrollsubstrat), 250 μm ATP og 1 μCi / μl [y-³²P] ATP, bufferen tilført av kinaseprodusenten og en av følgende kinaser: CK2 (20 ng / μl; Upstate, Charlottesville, VA), CaMKII (10 ng / μl; Upstate), PKC (1.6 ng / μl; Calbiochem) eller p70S6K (2.5 mU / μl; Upstate). Tidskursreaksjoner ble utført ved å fjerne 5-ul-alikvoter fra reaksjonsløsningen ved de angitte tidspunkter og tilsettes et like stort volum 4 x reduserende Laemmli proteinprøvebuffer. Michaelis-Menten kinetiske parametere for CK2-reaksjonen ble bestemt under empirisk definerte lineære, steady-state betingelser. Disse reaksjonene ble utført for 15 min i et volum 10 μl inneholdende 2 ng / μl enzym, 250 μm ATP, 1 μCi / μl [y-³²P] ATP og N-His (6) FFosB-konsentrasjoner som strekker seg fra 2.5-30 μm. Alle reaksjoner ble utført ved 30 ° C i et vannbad. Etter SDS-PAGE og farging av gelen med Bio-Safe Coomassie (Bio-Rad) ble gelen tørket og ³²P-fosfatinkorporering ble vurdert ved fosforimaginganalyse (se nedenfor, Datakvantifisering, beregninger og statistikk).

Tredimensjonal fosforeptidkart og fosfosaminosyreanalyse.

Begge disse analysene ble utført som beskrevet av Ploegh og Dunn (2000). Kort fortalt, tørre gelfragmenter som inneholder ³²P-merket ΔFosB (enten fra vitro reaksjoner eller fra immunoprecipitater av metabolisk merkede celler) ble skåret ut, rehydrert, vasket og utsatt for tryptisk fordøyelse. Supernatanten inneholdende de tryptiske fordøyelsesprodukter ble lyofilisert og lyofilatet vasket flere ganger og resuspendert i 10 μl elektroforesebuffer, pH 1.9. Prøve (3 μl) ble oppdaget på en cellulose tynnsjiktskromatografi (TLC) plate (Analtech, Newark, DE) og separert i en dimensjon ved elektroforese og den andre dimensjon ved stigende TLC. De resulterende fosfopeptidkartene ble visualisert ved autoradiografi og fosforimaging. For fosforaminosyreanalyse ble 2 μl av de tryptiske fordøyelsene som hadde blitt resuspendert i elektroforesebuffer, spaltet ytterligere ved hydrolysering av HCl ved 105 ° C for 25 min i 3 m HCI under en N₂ atmosfære. Reaksjonen ble stoppet ved en seks ganger fortynning i vann, og blandingen ble lyofilisert. Lyofilatet ble resuspendert i 5 μl elektroforese buffer, pH 1.9 og oppdaget på en cellulose TLC plate sammen med fosfor-Ser, -Thr og -Tyr standarder. Elektroforese ble utført over halvparten av lengden av TLC-platen ved anvendelse av elektroforesebuffer, pH 1.9, og deretter ble platen overført til pH 3.5-bufferen, og elektroforese ble utført for å fullføre. Fosforaminosyrestandardene ble visualisert ved å sprøyte TLC-platen med en 1% (volum / volum) ninhydrinoppløsning i aceton, og ³²P-merkede aminosyreprøver ble visualisert ved både autoradiografi og fosforimaging.

siRNA-indusert CK2α nedslagning.

Vi brukte en RNA interferens metode for å selektivt slå ned nivåene av CK2 (Di Maira et al., 2005). PC12-celler ble podet på kollagen-I-belagte platene med 6 brønner for å nå ~70-80% sammenflytelse neste dag, da de ble transientvis transfektert med 20 nm (sluttkonsentrasjon) av enten ikke-målrettet siRNA eller siRNA rettet mot mRNA av katalytisk a-underenhet av rotte CK2, ved bruk av 5 μl av transfeksjonsmiddelet SilentFectin (Bio-Rad) og følg produsentens anvisninger. Ca. 24 h senere ble celler transientt transfektert med AFosB plasmid, som angitt ovenfor. Omtrent 24 h senere (~48 h etter siRNA transfeksjon) ble celler utsatt for enten ³²P metabolisk merking eller pulse-chase analyse som beskrevet ovenfor. De følgende fire CK2a siRNA ble brukt med lignende resultater: 5'P-CAAACUAUAAUCGUACAUCUU3 ', 5'P-UCAAUCAU-GACAUUAUGCGUU3', 5'P-UAGUCAUAUAAAUCUUCCGUU3 ', 5'P-AAAUCCCUG ACAUCAUAUUUU3' (Dharmacon, Lafayette, CO). Som en negativ kontroll brukte vi Silencer negativ kontroll #3 siRNA fra Ambion (Austin, TX). Omfanget av CK2-nedslag ble overvåket ved immunoblotting ved bruk av et anti-CK2 polyklonalt antistoff (katalog # 06-873 fra Upstate) over natten ved en 1: 1000 fortynning. P-Tubulin ble brukt som en lastekontroll og detektert med et monoklonalt antistoff (katalog # 05-661 fra Upstate) over natten ved en 1: 20,000 fortynning.

Site-directed mutagenese.

Mutasjon av Ser27 til Ala eller til Asp ble oppnådd ved bruk av et Quick Change Site-Directed Mutagenesis kit (Stratagene, La Jolla, CA) og følge produsentens anvisninger. For å introdusere Ser27-mutasjonene i musaFosB-proteinet ble følgende mutageneseprimere anvendt. Ser27 til Ala: (revers primer) 5'GCCGAAGGAGTCCACCGAAGCCAGGTACTGAGACTCGGCGGAGGG3 '. Ser27 til Asp (fremre primer) 5'CCCTCCGCCGAGTCTCAGTACCTGGATTCGGTGGACTCCTTCGGC3 '. De muterte basene er i fet skrift, og ser27-kodonet er kursiv.

Bioinformatikk.

Potensielle fosforyleringssteder og kinaser forΔFosB ble søkt ved å sende musproteinsekvensen til spesialiserte databaser, inkludert ProSite (http://www.expasy.org/prosite/), PredictProtein (Rost et al., 2004), og NetPhosK (Blom et al., 2004).

Datakvantifisering, beregninger og statistikk.

Mengden protein som er tilstede i PVDF- eller nitrocellulosemembranen ble kvantifisert ved bruk av en Storm PhosphorImager og den medfølgende ImageQuant-programvaren (Amersham Biosciences / Molecular Dynamics). I cellekultur og hjerneskive fosforyleringsstudier, verdiene som er oppnådd for ³²P-merket protein ble deretter delt med verdiene oppnådd for totalt ΔFosB og uttrykt som et forhold. I vitro fosforyleringsstudier, mengden av ³²P-merket ΔFosB per mol avFosB (støkiometri) ble beregnet som beskrevet tidligere (Sahin et al., 2004). Alle målinger ble tatt innenfor linearitetsområdet for instrumentet som ble brukt. Kinetiske parametere ble beregnet ved hjelp av Michaelis-Menten-modellen, hvorved V = V_max[S] / ([S]+K_M) Og V_max = k₂[E_Totalt]. Halveringstiden (t_1/2) av ΔFosB og FosB ble estimert fra pulse-chase-plottene (ved hjelp av den ikke-lineære regresjonen som best monterte datapunktene) og tilsvarer tidspunktet hvor mengden av gjenværende protein er 50% av originalen. I alle tallene er de viste resultatene representative for minst to til tre uavhengige eksperimenter. I alle grafene er dataene vist gjennomsnitt ± SEM (3 ≤ n ≤16). Den statistiske signifikansen av forskjellene ble vurdert ved hjelp av en uparret t test, korrigert for flere sammenligninger, og asteriskene indikerer p ≤ 0.05.

Forrige seksjonNeste seksjon

Resultater

ΔFosB er en uvanlig stabil transkripsjonsfaktor

Selv om vi tidligere har spekulert at ΔFosB er en relativt stabil transkripsjonsfaktor (Nestler et al., 2001), har en direkte analyse av proteinets omsetningsprofil hittil ikke blitt utført. For å løse dette spørsmålet, gjennomførte vi pulse-chase-eksperimenter ved bruk av PC12-celler, som i stor grad ble brukt som en neuronlignende cellelinje, hvor ΔFosB ble forbigående uttrykt via infeksjon med et rekombinant herpes simplexvirus (HSV-ΔFosB). Nysyntetiserte proteiner ble metabolisk merket med ³⁵S-Met / Cys, og nedbrytningsmønsteret av ³⁵S-merket FFosB (³⁵S-ΔFosB) ble overvåket ved immunprecipitering av det fra cellelysater oppnådd ved forskjellige tidspunkter etter fjerning av de radiomerkede aminosyrene. Analyse av immunpresipitatene ved SDS-PAGE og autoradiografi viste at halveringstiden for ΔFosB i PC12-celler er ~ 10 h (Fig. 1). Disse funnene viser at halveringstiden til ΔFosB er høyere enn for de fleste inducerbare transkripsjonsfaktorer (se Diskusjon), inkludert full lengde FosB, hvis halveringstid i cellekultur er rapportert å være ~ 90 min (Dobrazanski et al., 1991; Carle et al. 2004). I tillegg er det verdt å merke seg at nedbrytningen av ΔFosB ikke passer til en eksponentiell forfallskurve i første grad, men det er snarere bifasisk, og starter med en langsommere nedbrytningshastighet. Dette antyder eksistensen av mer enn en ΔFosB-art og / eller mer enn en nedbrytningsvei.

Se større versjon:

• På denne siden
• I et nytt vindu

• Last ned som PowerPoint Slide

Figur 1.

ΔFosB er en uvanlig stabil transkripsjonsfaktor. Halveringstiden for ΔFosB er ~ 10h i cellekultur. ΔFosB ble uttrykt i PC12-celler ved enten infeksjon med HSV-FosB eller transient transfeksjon med FFB-holdig plasmid, og celler ble utsatt for pulsjakteksperimenter som beskrevet i Materialer og Metoder. Likeverdige resultater ble oppnådd uavhengig av metoden som ble brukt til å overuttrykke ΔFosB. Figuren viser tidsforløpet (og representativt autoradiogram) av ΔFosB nedbrytning. Dataene som er tegnet er gjennomsnittlig ± SEM på minst 15 individuelle datapunkter hentet fra minst fem uavhengige eksperimenter. Til sammenligning er den rapporterte halveringstid for full lengde FosB angitt.

ΔFosB er et fosfoprotein i hjernen

Vi har antydet at posttranslasjonell modifisering av ΔFosB kan bidra til sin tilsynelatende stabilitet. Fordi fosforylering har vist seg å modulere aktiviteten til transkripsjonsfaktorer på mange måter, inkludert stabiliteten deres (for gjennomgang, se Desterro et al., 2000; Whitmarsh og Davis, 2000), undersøkte vi om ΔFosB er et fosfoprotein. For dette formål ble ΔFosB-ekspresjon indusert i rottehjerne ved bruk av kronisk ECS, en behandling kjent for å indusere høye nivåer avFosB, spesielt i frontal cortex (Håpe et al., 1994a). En dag etter den siste ECS-behandlingen, når ΔFosB-nivåene forblir høye, ble tynne frontale kortikale skiver forberedt og metabolisk merket med ³²P-ortofosfat. Et parallelt sett med skiver ble ikke radiomerket, og disse ble brukt til å detektere totalt ΔFosB nivåer. Etter immunutfelling med et spesifikt anti-FosB / AFosB antistoff og separering av de immunprecipiterte proteiner med SDS-PAGE, fosforylert ³²P-merket ΔFosB ble påvist ved autoradiografi, mens totalt FFosB ble påvist ved immunoblotting. Denne analysen viste at ΔFosB er fosforylert i hjernen, som vist av en spesifikk ³²P-merket bånd av ~35 kDa tilstede i kronisk behandlede hjerneprøver, men er praktisk talt uoppdagelig i de shambehandlede kontrollene (Fig. 2A). Dette stemmer overens med det faktum at basale nivåer av ΔFosB, i fravær av kronisk stimulering, er svært lave. Spesifikiteten av immunpresipiteringsreaksjonen er illustrert ved mangel på signal i det ikke-immune IgG-bunnfallet.

Se større versjon:

• På denne siden
• I et nytt vindu

• Last ned som PowerPoint Slide

Figur 2.

ΔFosB er et fosfoprotein i hjernen. A, ΔFosB er fosforylert i hjernen. Endogen ΔFosB ble indusert i rottehjerne ved kronisk ECS-behandling som beskrevet i Materialer og Metoder. Frontale kortikale skiver ble metabolisk merket med ³²PH₃PO₄ i flere timer. Etter homogenisering av stykkene var ΔFosB immunpresipitert og fosforylert FFosB (³²P-ΔFosB) ble påvist ved autoradiografi (topppanel). Totalt ΔFosB i ikke-radioaktive immunoprecipitater ble påvist ved immunoblotting (bunnpanel). Som negative kontroller er immunoprecipitatet av et sham-behandlet dyr og ikke-immun IgG vist. B, Kandidatfosforyleringssteder og kinaser med tilsvarende prediksjonspoeng for musen AFosB proteinsekvens ble oppnådd ved bioinformatisk analyse. Kandidatstedene med de høyere prediksjonspoengene er uthevet i proteinsekvensen og oppført i tabellen. Det DNA-bindende (grunnleggende) domenet og leucin-glidelåsen har fet skrift i proteinsekvensen. C, D, ΔFosB fosforylering økes med Ser / Thr fosfatase inhibitor OA. C, ³²P-ΔFosB-nivåer i immunoprecipitater fra frontale kortikale skiver merket i fravær (Ctr) eller nærvær av 100 ng / ml OA (graf og topppanel) ble påvist ved autoradiografi. Bunnpanelet viser totalt ΔFosB detektert i immunoprecipitater fra umerkede skiver ved immunoblotting. D, PC12-celler ble smittet med HSV-FosB eller HSV-LacZ (vektor) og metabolisk merket med ³²PH₃PO₄ i fravær (Ctr) eller nærvær av 100 ng / ml OA. ³²P-ΔFosB-nivåer i immunoprecipitater ble påvist ved autoradiografi (graf, topppanel). Bunnpanelet viser totalt ΔFosB detektert i cellelysater ved immunoblotting.

Som et første skritt mot å klargjøre hvilken kinase (er) og sted (er) som er involvert i fosfB-fosforylering, utsatte vi aminosyresekvensen for flere bioinformatiske analyser. Dette viste at, selv om ΔFosB ikke inneholder noen Tyr-fosforyleringskandidatsteder, inneholder den flere Ser / Thr-kinase-konsensussteder, inkludert tre CaMKII-steder, tre CK2-steder og to PKC-steder med meget høye fosforyleringsprediksjonspoeng (Fig. 2B). Hvis, som forutsiget gjennom bioinformatikk, ΔFosB bare fosforyleres på Ser- eller Thr-rester, bør dets fosforylering være signifikant modulert av aktiviteten av Ser / Thr fosfataser. For å teste denne hypotesen merket vi frontale kortikale skiver med ³²P-ortofosfat i nærvær eller fravær av OA, en Ser / Thr-proteinfosfataseinhibitor. Som vist i Figur 2C, Forårsaket OA en stor (~2.5-fold) økning i ³²P-ΔFosB. Det forårsaket også en liten økning i totale ΔFosB nivåer, som er i overensstemmelse med tidligere rapporter som knytter de kreftfremkallende effektene av OA til evnen til å indusere flere umiddelbare tidlige gener, inkludert Fos-proteiner (Miller et al., 1998; Choe et al., 2004). Nettoresultatet er en betydelig samlet økning (~60%) i fosforylerte FosB-nivåer.

Vi undersøkte da om, i PC12-celler, som er mer mottagelige for eksperimentell manipulasjon, viste ΔFosB et fosforyleringsmønster som ligner det som er sett i hjernen. Vi uttrykte ΔFosB i PC12-celler via infeksjon med HSV-FosB og metaboliserte cellene med ³²P-ortofosfat i nærvær eller fravær av OA. Det vellykkede uttrykket og immunutfellingen av proteinet fra HSV-FFBB-infiserte celler er vist ved tilstedeværelsen både i immunblottet (Fig. 2D, bunnpanel) og autoradiografen (topppanelet) av et ~ 35 kDa-bånd, fraværende i de vektorinfiserte cellene. Som observert i hjernen forårsaket OA en liten økning i totalt ΔFosB-nivå, men en mye høyere (omtrent to ganger) økning i ³²P-ΔFosB, noe som resulterte i en betydelig (~50%) nettoøkning iFosB-fosforylering. Videre resulterte behandling av PC12-celler med en Tyr-fosfataseinhibitor ikke i vesentlige endringer i ³²P-ΔFosB nivåer (data ikke vist). Sammen oppdaget disse funnene at ΔFosB fosforyleres på Ser og / eller Thr rester i hjernen og i PC12-celler og bekreftet at sistnevnte er et godt cellekultursystem der det videre skal studeres fosforylerings- og nedbrytingsprofiler avΔFosB.

CK2, men ikke PKC eller CaMKII, fosforylerer ΔFosB vitro

Som beskrevet ovenfor avslørte analysen av ΔFosB-aminosyresekvensen høye prediksjonspoeng for CK2-, PKC- og CaMKII-fosforyleringssteder. For å bestemme hvilken av disse kinaser som kan fosforylere ΔFosB, gjennomførte vi en serie av vitro fosforyleringsreaksjoner ved anvendelse av rensede kinaser og renset rekombinant ΔFosB. Som vist i Figur 3A, av de tre kandidatkinasene, kun CK2 fosforylertAFFosB på en signifikant måte. I tillegg ble flere andre kinaser testet (f.eks. GSK3 og p70S6K), men klarte ikke å fosforylere ΔFosB signifikant (data ikke vist). Ytterligere karakterisering av CK2-reaksjonen ved tidskursanalyse viste at denne kinasen kan katalysere inkorporeringen av ~0.5 mol fosfat per mol avFosB (Fig. 3B). Det faktum at CK2 kan fosforylere ΔFosB vitro til en betydelig støkiometri (~50%) tyder på en fysiologisk relevant reaksjon. Vi studerte kinetikken av denne reaksjonen ved å inkubere CK2 i nærvær av økende mengder av renset FosB, og vi fastslått at CK2 fosforylerer ΔFosB med en V_max av 5.8 pmol · min^-1 · Μg^-1 av enzym, a K_M av 18.4 μm og a k_hvordan av 0.2 / s (Fig. 3C). Verdiene som er oppnådd for disse kinetiske parametrene, støtter videre den fysiologiske relevansen av denne reaksjonen. For eksempel, K_M av CK2 for DARPP32, en av de mest kjente substratene, er 3.4 μm, og den k_hvordan er ~ 0.3 / s (Girault et al., 1989); de K_M for ATP varierer fra ~ 10-40 μm (Cochet et al., 1983; Silva-Neto et al., 2002), og at for kasein varierer fra ~ 10-50 μm (Meggio et al., 1977; Pyerin et al., 1987). Sammen angir disse data at ΔFosB er et bona fide substrat for CK2 vitro.

Se større versjon:

• På denne siden
• I et nytt vindu

• Last ned som PowerPoint Slide

Figur 3.

CK2, men ikke PKC eller CaMKII, fosforylerer ΔFosB vitro. Autoradiografen (topppanelet) viser det fosforylerte produktet, og Coomassie-farget gel (bunnpanel) viser totalt ΔFosB tilstede i reaksjonen. A, Ble renset rekombinant ΔFosB underkastet vitro fosforylering av forskjellige kandidatkinaser (hvorav tre er vist). B, Tidskurs og støkiometriske analyser indikerer at CK2 kan fosforylere ΔFosB vitro med en støkiometri på ~50%. CKinetisk analyse av CK2-reaksjonen viste at ΔFosB er en bona fide vitro substrat. Linjering av reaksjonen er vist i en dobbelt-reciprocal plot (bunn), men de kinetiske parametrene ble avledet fra Michaelis-Menten-kurven (topp).

CK2 modulerer fosforyleringen og stabiliteten avFosB i intakte celler

For å vurdere den fysiologiske relevansen av CK2-mediert fosforylering av FosB, utførte vi sammenlignende fosfopeptid-kartlegging ved å bruke vitro fosforylert og PC12-cellefosforylert FFosB. Etter SDS-PAGE og geleluering av ³²P-ΔFosB (fra vitro reaksjoner eller fra immunprecipitatet av ³²P-merkede celler) ble proteinet fordøyd med trypsin, og de resulterende fosfopeptider ble utsatt for todimensjonal separasjon. Denne analysen viste at det viktigste fosfopeptidet fra CK2-reaksjonen kom med en av to store fosfopeptider fra ΔFosB fosforylert i PC12-celler (Fig. 4A), mens fosforeptidene som resulterte fra PKC eller CaMKII (data ikke vist) reaksjonen ikke gjorde det. Det var et andre ΔFosB fosfopeptid tilstede i kartet fra PC12-celler, men på grunn av manglende evne til noen av kinaser vi har testet for å generere et lignende fosfopeptid vitro, vet vi ikke for øyeblikket om dette andre fosfopeptidet inneholder et fosforyleringssted forskjellig fra det andre fosfopeptidet eller om det representerer et tydelig tryptisk peptid som inneholder det samme fosforyleringsstedet.

Se større versjon:

• På denne siden
• I et nytt vindu

• Last ned som PowerPoint Slide

Figur 4.

CK2 modulerer fosforyleringen og stabiliteten avFosB i intakte celler. A, CK2, men ikke PKC, synes å fosforylere ΔFosB i celler. To-dimensjonale fosfopeptidkart over FFosB fosforylert av CK2 eller PKC vitro eller ved intakte PC12-celler. Pilene viser komigrasjonen av CK2-fosforylert peptid, men ikke den PKC-fosforylerte en med en av fosfB-fosfopeptider oppnådd fra PC12-celler. B, ΔFosB-fosforylering i PC12-celler økes ved å behandle celler med den potente CK2-aktivitetsspermin (SP) og reduseres ved behandling med CK2-inhibitor DRB. I motsetning hertil ble ΔFosB-fosforylering i PC12-celler ikke påvirket av behandling med enten en PKC-aktivator (PMA) eller den PKC-spesifikke inhibitor calphostin-C (Calph). Et representativt autoradiogram (topppanel) og immunblot (nederst panel) er vist. C-FEffekt av CK2-aktivitet på ΔFosB-stabilitet. Tallene viser tidsforløpet (og representativt autoradiogram) av ΔFosB nedbrytning. PC12-celler som transient uttrykker ΔFosB ble utsatt for puls-chase-eksperimenter utført i fravær eller nærvær av CK2-inhibitor DRB (C), CK2 aktivator spermin (D), eller bredspektret kinaseinhibitoren H-8 (E), som ble brukt til å kontrollere for de uspesifikke effektene av DRB. FEffekt av å slå ned den katalytiske underenheten av CK2 på ΔFosB stabilitet. PC12-celler ble transfektert med enten en ikke-målrettet siRNA (Ctr) eller siRNA-målrottning CK2a og 24 h transfektert med et AFosB-plasmid. Topppanelet viser immoblot av helcellelysater som viser effekten av CK2 siRNA på CK2 og FosB protein nivåer. Den tilsvarende immunoblot for p-tubulin er vist som en lastekontroll.

For å ytterligere adressere den fysiologiske relevansen av CK2 som en FosB-kinase, behandlet vi FosB-uttrykkende PC12-celler med to legemidler som modulerer CK2-aktivitet. Som vist i Figur 4B, ΔFosB fosforylering ble redusert ved behandling av PC12-celler med den celle-permeable CK2 inhibitor DRB (Meggio et al., 1990; Szyszka et al., 1995), og økte ved behandling med polyaminspermenen, kjent for å være en potent CK2-aktivator (Cochet og Chambaz, 1983; Meggio et al., 1983). I motsetning til dette, behandles PC12-celler med PKC-hemmeren calphostin-C (Kobayashi et al., 1989; Tamaoki et al., 1990) eller PKC-aktivatoren PMA (Schmidt og Hecker, 1975; Beh et al., 1989) resulterte ikke i signifikante endringer i ΔFosB-fosforylering. I tilfelle PMA er den svake (og ikke signifikante) økningen i ³²P-ΔFosB kunne regnes med en økning i totalt ΔFosB nivåer forårsaket av dette stoffet; Faktisk har det blitt rapportert at phorbolestere induserer uttrykk for flere Fos-familieproteiner, inkludert FosB (Yoza et al., 1992; Suh et al., 2004). Videre behandles celler med den spesifikke celle-permeable CaMKII-inhibitoren m-AIP (Ishida og Fujisawa, 1995; Stevens et al., 1999) resulterte heller ikke i redusert ΔFosB fosforylering (data ikke vist). Sammen er disse resultatene i samsvar med vårt vitro funn og indikerer at i intakte celler ΔFosB sannsynligvis er fosforylert av CK2, men ikke PKC eller CaMKII. Det faktum at CK2-inhibering ikke helt forhindrer ΔFosB-fosforylering indikerer eksistensen av ytterligere fosforyleringssteder i proteinet.

Vi undersøkte nå om CK2 spiller en rolle i omsetningen av ΔFosB og dermed stabiliteten. Til dette formål gjennomførte vi pulse-chase-eksperimenter ved bruk av FosB-uttrykkende PC12-celler behandlet med enten CK2-inhibitoren eller CK2-aktivatoren anvendt i fosforyleringsstudien. Som vist i Figur 4Cbehandling av celler med CK2-inhibitoren DRB hadde en signifikant effekt på omsetningshastigheten av ΔFosB, vist ved forandring i formen av nedbrytningskurven, fra bifasisk til en kurve som er nærmere det av eksponentiell forfall. Omvendt forårsaket nærværet av CK2-aktivator-spermin en signifikant reduksjon i nedbrytningshastigheten avFosB, noe som førte til akkumulering av proteinet i løpet av de første timene av jakten (Fig. 4D).

Som det er tilfelle med mange kinaseaktivatorer og inhibitorer, kan spermin og DRB ha metabole effekter utenfor moduleringen av CK2-aktivitet. Faktisk har DRB vist seg å hemme transkripsjonsfaktor IIH (TFIIH) -associert kinase (Yankulov et al., 1995), noe som resulterer i inhibering av RNA-polymerase II-mediert transkripsjon. Fordi denne effekten kunne tenke på stabiliteten til ΔFosB, analyserte vi effekten av bredspektret kinaseinhibitor H-8 (Hidaka og Kobayashi, 1992) på ΔFosB omsetning ved en konsentrasjon (200 μm) kjent for å hemme TFIIH-assosiert kinase, men ikke CK2 (Yankulov et al., 1995). Som vist i Figur 4E, påvirket behandlingen med H-8 ikke omsetningshastigheten til ΔFosB. Lignende resultater ble oppnådd med H-7, en annen bredspektret kinaseinhibitor, anvendt ved en konsentrasjon som hemmer TFIIH-assosiert kinase, men ikke CK2 (data ikke vist). Disse dataene støtter videre tolkningen at reduksjonen av ΔFosB-stabilitet forårsaket av DRB, er mest sannsynlig tilskrevet hemming av CK2.

For å videreutvikle rollen som CK2 i ΔFosB omsetning, undersøkte vi konsekvensene av å slå ned CK2 via siRNA. Vi utførte disse forsøkene ved hjelp av PC12-celler som først ble transfektert med kontroll (nontargeting) siRNA eller et siRNA som retter seg mot mRNA av den katalytiske underenheten av rotte CK2 (CK2α) og 24 h transfektert med ΔFosB. Som vist i Figur 4Ftransfeksjon med CK2a siRNA effektivt og spesifikt slått ned CK2α protein nivåer uten å påvirke ΔFosB nivåer (topppanel). Pulse-chase-analyse viste at nedslagning av CK2 resulterte i en signifikant økning i ΔFosB-omsetningshastighet som påvist ved raskere nedbrytning av proteinet. Det faktum at inhibering av CK2-aktivitet (enten via DRB-behandling eller siRNA) øker omsetningen av ΔFosB og resulterer i forsinkelsen av den langsomme hastighetskomponent av bifasisk kurve, mens CK2-aktivering øker den langsomme fasen av kurven, gir sterk støtte for ideen om at CK2 spiller en rolle i å regulere ΔFosB stabilitet.

CK2 fosforylerer ΔFosB på Ser27

For å begynne å identifisere nettstedet / områdene på ΔFosB fosforylert av CK2, gjennomførte vi fosfonaminosyreanalyse av rekombinant ΔFosB fosforylert av CK2 vitro og av fosfosylert i PC12-celler. Disse forsøkene viste at i begge tilfeller var den eneste fosfonaminosyren detekterte fosfor-Ser (Fig. 5A). Dette funnet, sammen med støkiometrien oppnådd for CK2 vitro fosforyleringsreaksjon (~50%) (Fig. 3B) og tilstedeværelsen av bare ett signifikant punkt på CK2 fosfopeptidkartet (Fig. 4A), antyder at CK2-fosforylering av ΔFosB sannsynligvis er begrenset til en enkelt serinrest. Denne konklusjonen er konsistent med fosforylerings-konsensusstedanalysen (Fig. 2B), som forutslo bare en kandidat serin, dvs. Ser27, for CK2. Taxonomisk analyse viste at Ser27 er sterkt bevart gjennom evolusjon blant Fos familiemedlemmer (Fig. 5B), noe som tyder på at det kan ha en viktig fysiologisk funksjon.

Se større versjon:

• På denne siden
• I et nytt vindu

• Last ned som PowerPoint Slide

Figur 5.

CK2 fosforylater ΔFosB på Ser27. A, Fosfonaminosyreanalyse av CK2-fosforylert (vitro) og PC12-cellefosforylert FFosB som viser at i begge tilfeller er den viktigste rest fosforylert serin. B, Korsartsanalyse av FosB / ΔFosB aminosyresekvens avslørte høy bevaring av Ser27 blant Fos-familiemedlemmer fra humant til sebrafisk (mørkt høydepunkt). Imidlertid er det sure residuet ved posisjon + 3, som kreves for CK2-konsensusområdet, ikke bevart (lys høydepunkt). C, HeLa-celler ble transientt transfektert med enten villtype ΔFosB (WT) ellerΔFosB som inneholdt en punktmutasjon for å erstatte Ser27 med Ala (S27A). Celler ble metabolisk merket med ³²PH₃PO₄ og behandles med vehikel eller med spermin (SP) for å aktivere CK2. Et representativt autoradiogram (topppanel) og immunoblot (bunnpanel) av de oppnådde FosB immunoprecipitater er vist. Immunpræcipitatet av mock-transfekterte celler (vektor) er vist.

For å avgjøre om Ser27 er fosforylert i FFosB, muterte vi denne resten til Ala og analyserte konsekvensene på fosforyleringsstatusen til proteinet. Til dette formål brukte vi HeLa-celler (som kan transfekteres med høyere effektivitet) for å forkorte enten WT eller S27A mutant ΔFosB. Ca. 24 h etter transfeksjon ble cellene metabolisert med ³²P-ortofosfat og helcellelysater ble fremstilt. Etter immunutfelling og SDS-PAGE, ³²P-ΔFosB ble påvist ved autoradiografi og totalt ΔFosB ved immunoblotting. Som vist i Figur 5C (bunnpanel) ble ΔFosB ikke detektert i de vektor-transfekterte cellene, mens celler transfektert med enten WT eller S27A mutant FFosB med hell uttrykte proteinet. Vi fant at S27A-mutasjonen forårsaket en betydelig reduksjon av (~ 30%) i ³²P-ΔFosB nivåer (Fig. 5C, topppanel og graf), som indikerer at i levende celler fosforyleres ΔFosB på Ser27. I et forsøk på å fastslå hvorvidt CYP27 i celler ser2 faktisk er fosforylert sammenlignet vi CK2-aktivatorsperminens evne til å modulere fosforyleringen av WT og S27A ΔFosB. Som vi tidligere hadde observert i PC12-celler (Fig. 4B), behandling av HeLa-celler med spermin økte signifikant fosforylering av WT-proteinet. Det faktum at denne effekten ble signifikant redusert ved S27A-mutasjonen (Fig. 5C) støtter tolkningen at Ser27 i ΔFosB er et fysiologisk substrat for CK2.

Fosforylering av Ser27 regulerer stabiliteten av ΔFosB

Etter å ha fastslått at stabiliteten av ΔFosB er redusert når CK2 hemmes og forsterkes når CK2 er aktivert (Fig. 4), og at CK2 fosforylerer ΔFosB på Ser27 (Fig. 5), spådde vi at forebygging av fosforylering av dette nettstedet skulle destabilisere proteinet. Pulsjakteksperimenter utført med HeLa-celler som transiently uttrykker enten WT eller S27A-mutant ΔFosB viste at, som antydet, resulterte S27A-mutasjonen i en signifikant økning i nedbrytningshastigheten av ΔFosB og en samtidig reduksjon i halveringstiden for proteinet (Fig. 6A). Vi undersøkte deretter om denne reguleringsmekanismen også forekommer i den mer nevronlignende PC12-cellelinjen. Disse forsøkene viste at, som vi hadde observert i HeLa-celler, forårsaker S27A-punktmutasjonen en dramatisk reduksjon i halveringstiden til ΔFosB i PC12-celler (fra ~11 til ~4 h) (Fig. 6B). Det faktum at denne destabiliseringen ligner den som er forårsaket av CK2-inhibering eller knock-down (Fig. 4) gir videre støtte til ideen om at CK2-mediert fosforylering av Ser27 regulerer stabiliteten av FosB. Ytterligere bevis for regulatorisk rolle Ser27 fosforylering på ΔFosB protein omsetning ble oppnådd ved bruk av en fosfomimetisk Ser27 til Asp mutasjon (S27D). S27D-mutasjonen betraktes som fosfomimetisk, fordi den plasserer en stor negativt ladet (karboksyl) gruppe ved aminosyre 27 og derved delvis etterligner fosforyleringen av Ser27. Som vist i Figur 6C, forårsaket S27D-mutasjonen motsatt effekt av S27A-mutasjonen og resulterte i et protein som var betydelig stabilere enn WT-proteinet. På samme måte som effekten oppnådd etter CK2-aktivering (Fig. 4D) resulterte S27D-mutasjonen i akkumuleringen og økte dermed ΔFosB-nivåene i løpet av de første timene av jakten.

Se større versjon:

• På denne siden
• I et nytt vindu

• Last ned som PowerPoint Slide

Figur 6.

Fosforylering av Ser27 regulerer stabiliteten av ΔFosB. A, C, Pulse-chase analyse som viser effekten av Ser27 fosforylering på omsetningshastigheten av ΔFosB. Nedbrytningsprofilen og estimerte halveringstider for villtype ΔFosB (WT), Ser27 til Ala mutant (S27A) og den fosfomimetiske Ser27 til Asp mutant (S27D) er vist. De samme funnene ble oppnådd i HeLa-celler (A) og PC12-celler (B, C).

Ser27 fosforylering stabiliserer ΔFosB ved å hindre dets proteasomale nedbrytning

For å begynne å belyse mekanismen ved hvilken fosforylering av Ser27 stabiliserer FFosB, undersøkte vi egenskapen til proteasomeinhibitorene MG132 (Palombella et al., 1994; Tsubuki et al., 1996) og epoxomicin (Hanada et al., 1992; Kim et al., 1999) for å modulere nedbrytningshastigheten av WT og S27A mutant FFosB. Pulse-chase-eksperimenter ble utført ved bruk av PC12-celler infisert med en rekombinant HSV som uttrykker enten WT eller S27A FFosB og behandlet med enten DMSO eller en av de to proteasomeinhibitorene. Disse forsøkene viste at selv om nedbrytningshastigheten av WT-proteinet er relativt ufølsom for nærværet av en av de to proteasominhibitorene (Fig. 7A), den av S27A-mutanten er følsom for disse legemidlene (Fig. 7B). Dette indikerer at, i motsetning til WT-proteinet, er S27A-mutanten et mål for proteasomal nedbrytning. Faktisk reverserte behandling av celler med enten MG132 eller epoxomicin fullstendig effekten av S27A-mutasjonen på nedbrytningshastigheten avΔFosB, vist ved en økning i halveringstiden til S27A-mutanten fra ~4 til ~9 h for MG132 og til ~ 12 h for epoksomicin (Fig. 7B). Sammen viser disse funnene at fosforylering av FosB på Ser27 beskytter proteinet mot proteasomal nedbrytning og er derfor viktig for sin uvanlige stabilitet.

Se større versjon:

• På denne siden
• I et nytt vindu

• Last ned som PowerPoint Slide

Figur 7.

Fosforylering av Ser27 stabiliserer ΔFosB ved å forhindre dets proteasomal nedbrytning. A, B, Pulse-chase-analyse med HSV-infiserte PC12-celler som viser nedbrytningsprofilen og estimerte halveringstider for villtype ΔFosB (A) eller S27A ΔFosB (B) i fravær eller nærvær av en av to proteasominhibitorer [MG132 og epoxomicin (Epoxo)]. Legg merke til at ingen av stoffene har en signifikant effekt på omsetningen av villtype ΔFosB, mens behandling av celler med enten proteasominhibitor resulterte i stabilisering av S27A FosB. C, En modell for rollen som Ser27 fosforylering i evne til ΔFosB til å formidle langsiktig hjerneplastisitet. Når en gang er indusert, stabiliseres en del avFosB i hjernen ved CK2-mediert fosforylering av S27. Dette resulterer i akkumulering, noe som igjen medfører langvarige endringer i genuttrykk. Disse stabile endringene i genuttrykk bidrar til stabile atferdsmessige tilpasninger. Omvendt resulterer defosforyleringen av S27 av Ser / Thr-fosfataser PP1 og / eller PP2A i destabilisering av proteinet og dets behandling av proteasomalt maskineri.

Forrige seksjonNeste seksjon

Diskusjon

I den foreliggende studien viser vi at ΔFosB har en halveringstid på ~10 h i cellekultur, noe som gjør den stabil i forhold til FosB i full lengde og de fleste andre inducerbare transkripsjonsfaktorer, hvis halveringstid i cellekultur kan være så kort som noen få minutter og sjelden overskrider 3 h (Hann og Eisenman, 1984; Dobrazanski et al., 1991; Roberts og Whitelaw, 1999; Ferrara et al., 2003; Hirata et al., 2004). I tillegg finner vi at ΔFosB er fosforylert i hjernen, og at dets fosforylering er følsom overfor PPADNUMX / PP1A-inhibitor okadasyre. Våre cellekulturstudier viser at stabiliteten av ΔFosB er modulert av CK2, med høyere CK2-aktivitet som stabiliserer proteinet. Til slutt foreslår våre funn at CK2 fosforylerer ΔFosB på en sterkt konservert N-terminus serin (S2) og demonstrerer at fosforylering av S27 beskytter ΔFosB mot proteasomal nedbrytning. Vi foreslår derfor en modell hvor fosforylering av ΔFosB på S27 av CK27 er en kritisk reguleringsmekanisme for omsetning av ΔFosB (Fig. 7C). Slike fosforyleringsmedierte stabiliseringer av FFosB er funksjonelt viktig fordi økte nivåer avFosB spesielt hjernegrupper har vist seg å regulere direkte en rekke neuronale gener in vivo og å utøve kraftige atferdsvirkninger i dyremodeller av flere nevropsykiatriske lidelser (se Introduksjon).

Selv om fosforylering er en rask og reversibel måte å regulere transkripsjonsaktiviteten til visse transkripsjonsfaktorer, slik som CREB (cAMP-responselementbindende protein) (Bohmann, 1990), modulerer nedbrytningen av transkripsjonsfaktorer en enda kraftigere (mindre lett reversibel) form for regulering (Desterro et al., 2000). Transkripsjonsfaktorer hvis funksjonsaktivitet er regulert ved nivået av deres nedbrytning, inkluderer NFκB (Desterro et al., 2000), c-Myc (Sears et al., 1999), og c-Fos (Ferrara et al., 2003), blant andre. I mange tilfeller er fosforylering en nøkkelregulator for stabiliteten av en transkripsjonsfaktor, som det har blitt vist for c-Fos (Okazaki og Sagata, 1995; Tsurumi et al., 1995), Fos-relatert antigen-1 (Fra-1) (Hetteglass og Marshall, 2003), Fra-2 (Manabe et al., 2001), c-juni (Fuchs et al., 1996), JunB (Fuchs et al., 1997), ATF2 (Fuchs et al., 2000), og p53 (Buschmann et al., 2001). Våre studier legger således ΔFosB til denne listen over transkripsjonsfaktorer hvis funksjonsaktivitet reguleres gjennom sin fosforylerte avhengige stabilitet.

CK2 er en allestedsnærværende og konstitutivt aktiv Ser / Thr-kinase som har> 300 påståtte substrater hittil identifisert og er implisert i flere biologiske prosesser, inkludert celledød og overlevelse (Litchfield, 2003; Unger et al., 2004), cellulære stressresponser (Yanagawa et al., 1997; Kato et al., 2003), og DNA reparasjon og kromatin remodeling (Barz et al., 2003; Krohn et al., 2003). Mer enn en tredjedel av de antatte substratene til CK2 er proteiner involvert i reguleringen av genuttrykk (Meggio og Pinna, 2003). Faktisk har CK2 vist seg å være en fremtredende kjernekinase (Krek et al., 1992) (for gjennomgang, se Yu et al., 2001) og å samhandle med bZIP-domenene til flere transkripsjonsfaktorer (Yamaguchi et al., 1998). CK2-mediert fosforylering har også vist seg å modulere nedbrytningen (enten å øke eller redusere den) av mange proteiner, inkludert IkB (Schwarz et al., 1996), PTEN (Torres og Pulido, 2001), linse connexin (Yin et al., 2000), kromatinassosiert protein HMG1 (Wisniewski et al., 1999), og flere transkripsjonsfaktorer som HMGB (Stemmer et al., 2002), Myf-5 (Winter et al., 1997), og c-Myc (Channavajhala og Seldin, 2002). CK2 er mest rikelig i hjernen (Alcazar et al., 1988; Girault et al., 1990), og dens aktivitet har blitt involvert i mange aspekter av hjernefunksjon, inkludert nevrononal overlevelse (Boehning et al., 2003), differensiering (Nuthall et al., 2004), ionkanalfunksjon (Jones og Yakel, 2003; Bildl et al., 2004), og langsiktig potensiering og neuronal plastisitet (Diaz-Nido et al., 1992; Lieberman og Mody, 1999; Reikhardt et al., 2003).

Til tross for dette voksende bevis for rollen som CK2 i reguleringen av nevronfunksjonen, er lite kjent om hva som styrer sin aktivitet. CK2 antas å være konstitutivt aktiv, med regulering av dets evne til å fosforylere bestemte substrater som hovedsakelig stammer fra endringer i sin intracellulære lokalisering (f.eks. Cytosol mot kjernen) (Ahmed og Tawfic, 1994; Yu et al., 1999). Denne informasjonen reiser et viktig spørsmål angående hvilke signaler som kreves for å indusere ΔFosB akkumulering i hjernen etter kronisk stimulering (Fig. 7C). Ett krav er gjentatt aktivering av fosB gen og induksjon av ΔFosB mRNA (Chen et al., 1995). Våre data indikerer at CK2 fosforylering av ΔFosB er kritisk for stabiliteten, noe som tyder på at et andre signal kan være nødvendig for langsiktige effekter av FosB på genuttrykk, nemlig et signal som stimulerer fosforyleringen av protein med CK2. Dette kan innebære aktivering av CK2 ved hjelp av noen ukjent mekanisme eller dens translokasjon til kjernen. Alternativt kan CK2-fosforylering av FFosB være konstitutiv, slik at som ΔFosB-protein translateres som respons på hver stimulus, blir en del av det fosforylert og stabiliseres dermed, slik at det ved gjentatt stimulering akkumuleres til høye nivåer i berørte neuroner.

Våre funn viser at CK2 og S27 trolig ikke er den eneste kinasen og stedet som er ansvarlig for FosB-fosforylering, fordi verken inhibering av CK2 eller S27A-mutasjonen var i stand til å fullstendig forhindre ΔFosB-fosforylering. På samme måte skyldes det faktum at S27A-mutasjonen resulterer i en 30% reduksjon i fosfos-FosB at S27 er et stort fosforyleringssted på proteinet. Vi undersøker imidlertid andre formative kinaser og fosforyleringssteder på ΔFosB. Til slutt vil det også være viktig å analysere fosforyleringen av S27 og andre fosforyleringssteder i FosB i hjernen in vivo etter ulike typer kronisk stimulering, for eksempel ved bruk av massespektrometri eller fosfospesifikke antistoffer.

Som nevnt ovenfor er S27 i ΔFosB sterkt konservert gjennom hele evolusjonen og blant andre Fos-familieproteiner. Konsensusstedet for CK2 er imidlertid ikke: som vist i Figur 5B, bare FosB / ΔFosB (og Zebrafish xenolog), men ikke c-Fos eller Fra-2, besitter en sur rest ved + 3, en nøkkelbestemmende faktor for CK2-fosforylering (Marin et al., 1986; Meggio et al., 1994). Dermed kan mangelen på CK2-fosforylering på S27 forklare hvorfor andre Fos-familieproteiner ikke er like stabile som ΔFosB. Dette forklarer imidlertid ikke hvorfor FosB i full lengde, som har samme CK2-konsensusområde som ΔFosB, ikke stabiliseres på samme måte. Vi vet ikke om FosB i full lengde fosforyleres av CK2 på denne konserverte resten. De eneste rapportene fra FosB (Skinner et al., 1997) og c-Fos (Okazaki og Sagata, 1995; Chen et al., 1996) fosforylering beskriver steder i den C-terminale regionen av disse proteinene, som er fraværende i ΔFosB. Den potensielle fosforylering av FosB i full lengde og andre Fos-familieproteiner av CK2 krever direkte undersøkelse. Selv om de fosforyleres, er de andre Fos-familieproteinene imidlertid kjent for å inneholde motiver ved deres C termini som målretter proteinene for rask nedbrytning (Papavassiliou et al., 1992; Jariel-Encontre et al., 1997; Acquaviva et al., 2002). For eksempel har det blitt vist at en strekk av ~21 rester som er til stede i C-terminalen av alle Fos-familieproteiner, men fraværende i ΔFosB, virker som et destabiliserende domene for c-Fos (Acquaviva et al., 2001). Vi fant at selv om denne sekvensen også destabiliserer full lengde FosB (Carle et al., 2004), viser fraværet av dette domenet i ΔFosB ikke fullt ut for stabilisering. Kombinasjonen av fraværet av dette C-terminaldomenet og Ser27-fosforyleringen synes i stedet å utgjøre fullstendig den femdobbelte forskjellen i stabilitet mellom ΔFosB og FosB.

Selv om nedbrytningen av Fos-familieproteiner er kompleks og ikke fullt ut forstått, synes proteasomal nedbrytning å være den viktigste vei involvert (Salvat et al., 1999; Acquaviva et al., 2002; Ferrara et al., 2003). Data som presenteres her, hvor proteasomale hemmere ikke signifikant endrer graden av ΔFosB nedbrytning, hevder at, i motsetning til andre Fos-familieproteiner, ΔFosB unngår 26S proteasomet, og dette spiller en sentral rolle i stabiliseringen. Vi foreslår derfor et system hvorved den forbedrede stabiliteten av ΔFosB skyldes kombinasjonen av to hovedfaktorer: (1) fraværet av et C-terminalt destabiliserende domene og (2) fosforyleringen av S27 av CK2.

Sammendrag gir den foreliggende studien mekanisk innsikt om hvorfor ΔFosB, et produkt av det umiddelbare tidlige genet fosB, er, i motsetning til alle andre Fos-familiemedlemmer, et relativt langlivet protein. Selv om andre Fos-familieproteiner antas å formidle rask, men forbigående stimulus-transkripsjonskobling (Morgan og Curran, 1995), gir den relative stabiliteten til ΔFosB den muligheten til å mediere langvarige transkripsjonelle forandringer indusert ved kronisk stimulering. Dette støtter visningen om at ΔFosB fungerer som en vedvarende molekylær bryter i hjernen, og gradvis konverterer akutte responser til kroniske tilpasninger. Identifikasjon av Ser27 fosforylering som en sentral mekanisme for stabiliteten av FosB åpner nye veier for utvikling av midler for å regulere funksjonen av ΔFosB og derved modulere dets langsiktige effekter på nevrale og atferdsplasticitet.

Forrige seksjonNeste seksjon

Fotnoter

• Mottatt November 21, 2005.
• Revisjon mottok februar 21, 2006.
• Godkjent April 2, 2006.

• Dette arbeidet ble støttet av en National Alliance for forskning om skizofreni og depresjon Young Investigator Award til PGU, et National Institute for Drug Abuse (NIDA) National Research Service Award til PGU, og tilskudd fra National Institute of Mental Health og NIDA til EJN We takk Dr. James Bibb for hans hjelp med vitro fosforyleringsanalyser, Dr. Ming-Hu Han for hans hjelp med utarbeidelsen av hjerneskiver som brukes til metabolsk merking, og Dr. Rachael Neve for hennes hjelp med emballering av rekombinante HSVs.
• G. Rudenkos nåværende adresse: Life Sciences Institute og Department of Pharmacology, University of Michigan, 210 Washtenaw Avenue # 3163A, Ann Arbor, MI 48109-2216.
• Korrespondanse skal rettes til Eric J. Nestler, 5323 Harry Hines Boulevard, Dallas, TX 75390-9070. e-post: [e-postbeskyttet]

Forrige seksjon

Referanser

1. ↵

Acquaviva C, Brockly F, Ferrara P, Bossis G, Salvat C, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2001) Identifikasjon av et C-terminalt tripeptidmotiv involvert i kontrollen av rask proteasomal nedbrytning av c-Fos-protokoprotein under G (0) -til-S-faseovergangen. onkogen 20:7563-7572.

CrossRefMedline

2. ↵

Acquaviva C, Bossis G, Ferrara P, Brockly F, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2002) Flere nedbrytningsveier for Fos-familieproteiner. Ann NY Acad Sci 973:426-434.

Medline

3. ↵

Ahmed K, Tawfic S (1994) Mekanisme for intracellulær regulering av proteinkinase CK2: rolle av stimulus-mediert subnuclear forening. Cell Mol Biol Res 40:539-545.

Medline

4. ↵

Alcazar A, Martin E, Lopez-Fando J, Salinas M (1988) En forbedret rensingsprosedyre og egenskaper av kasein kinas II fra hjernen. Neurochem Res 13:829-836.

CrossRefMedline

5. ↵

Andersson M, Westin JE, Cenci MA (2003) Tidskurs for striatal DeltaFosB-lignende immunreaktivitet og prodynorfinmRNA-nivå etter seponering av kronisk dopaminomimetisk behandling. Eur J Neurosci 17:661-666.

CrossRefMedline

6. ↵

Barz T, Ackermann K, Dubois G, Eils R, Pyerin W (2003) Genom-brede ekspressionsskjermbilder indikerer en global rolle for proteinkinase CK2 i kromatin-remodeling. J Cell Sci 116:1563-1577.

Abstrakt / GRATIS Fulltekst

7. ↵

Beh I, Schmidt R, Hecker E (1989) To isozymer av PKC funnet i HL-60-celler viser en forskjell i aktivering av phorbolester TPA. FEBS Lett 249:264-266.

Medline

8. ↵

Bildl W, Strassmaier T, Thurm H, Andersen J, Eble S, Oliver D, Knipper M, Mann M, Schulte U, Adelman JP, Fakler B (2004) Proteinkinase CK2 samles sammen med små konduktans Ca (2 +) - aktiverte K + kanaler og regulerer kanalgating. Neuron 43:847-858.

CrossRefMedline

9. ↵

Bing G, Wang W, Qi Q, Feng Z, Hudson P, Jin L, Zhang W, Bing R, Hong JS (1997) Langtidsuttrykk av Fos-relatert antigen og forbigående ekspression av delta FosB assosiert med anfall i rottehippocampus og striatum. J Neurochem 68:272-279.

Medline

10. ↵

Blom N, Sicheritz-Ponten T, Gupta R, Gammeltoft S, Brunak S (2004) Forutsigelse av post-translasjonell glykosylering og fosforylering av proteiner fra aminosyresekvensen. proteomikk 4:1633-1649.

CrossRefMedline

11. ↵

Boehning D, Moon C, Sharma S, Hurt KJ, Hester LD, Ronnett GV, Shugar D, Snyder SH (2003) Kullmonoksyd-neurotransmisjon aktivert ved CK2-fosforylering av hemeoxysase-2. Neuron 40:129-137.

CrossRefMedline

12. ↵

Bohmann D (1990) Transskripsjonsfaktor fosforylering: En kobling mellom signaltransduksjon og regulering av genuttrykk. Kreftceller 2:337-344.

Medline

13. ↵

Buschmann T, Potapova O, Bar-Shira A, Ivanov VN, Fuchs SY, Henderson S, Fried VA, Minamoto T, Alarcon-Vargas D, Pincus MR, Gaarde WA, Holbrook NJ, Shiloh Y, Ronai Z (2001) Juni NH2-terminal kinasefosforylering av p53 på Thr-81 er viktig for p53-stabilisering og transkripsjonelle aktiviteter som respons på stress. Mol Cell Biol 21:2743-2754.

Abstrakt / GRATIS Fulltekst

14. ↵

Carle TL, Ulery PG, Nestler EJ (2004) Fravær av et konservert Fos-familie C-terminal domene bidrar til deltaFosBs unike stabilitet. Soc Neurosci Abstr 30: 692.2.

15. ↵

Channavajhala P, Seldin DC (2002) Funksjonell interaksjon av proteinkinase CK2 og c-Myc i lymfomagenese. onkogen 21:5280-5288.

CrossRefMedline

16. ↵

Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, Håper BT, Nestler EJ (1995) Regulering av delta FosB og FosB-lignende proteiner ved elektrokonvulsiv anfall og kokainbehandling. Mol Pharmacol 48:880-889.

Abstrakt

17. ↵

Chen J, Kelz MB, Håper BT, Nakabeppu Y, Nestler EJ (1997) Kroniske Fos-relaterte antigener: stabile varianter av FosB indusert i hjernen ved kroniske behandlinger. J Neurosci 17:4933-4941.

Abstrakt / GRATIS Fulltekst

18. ↵

Chen RH, Juo PC, Curran T, Blenis J (1996) Fosforylering av c-Fos ved C-terminalen øker dens transformasjonsaktivitet. onkogen 12:1493-1502.

Medline

19. ↵

Choe ES, Parelkar NK, Kim JY, Cho HW, Kang HS, Mao L, Wang JQ (2004) Proteinfosfatase 1 / 2A-inhibitor okadasyre øker CREB og Elk-1 fosforylering og c-fos ekspresjon i rottestriatum in vivo. J Neurochem 89:383-390.

CrossRefMedline

20. ↵

Cochet C, Chambaz EM (1983) Polyamin-medierte proteinfosforyleringer: et mulig mål for intracellulær polyamin-virkning. Mol Cell Endocrinol 30:247-266.

CrossRefMedline

21. ↵

Cochet C, Feige JJ, Chambaz EM (1983) Katalytiske og molekylære egenskaper av en høyrenset G-type kasein-kinase fra bovin lungvev. Biochim Biophys Acta 743:1-12.

Medline

22. ↵

Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW (2003) Striatal celletype-spesifikk overekspresjon av DeltaFosB øker incitamentet til kokain. J Neurosci 23:2488-2493.

Abstrakt / GRATIS Fulltekst

23. ↵

Daunais JB, Roberts DC, McGinty JF (1993) Kokain selvadministrasjon øker preprodynorfin, men ikke c-fos, mRNA i rottestriatum. NeuroReport 4:543-546.

Medline

24. ↵

Desterro JM, Rodriguez MS, Hay RT (2000) Regulering av transkripsjonsfaktorer ved proteindegradering. Cell Mol Life Sci 57:1207-1219.

CrossRefMedline

25. ↵

Diaz-Nido J, Armas-Portela R, Avila J (1992) Økning i cytoplasmatisk kasein-kinase II-type aktivitet følger med nevitutvækst etter DNA-synteseinhibering i NIA-103-neuroblastomceller. J Neurochem 58:1820-1828.

Medline

26. ↵

Di Maira G, Salvi M, Arrigoni G, Marin O, Sarno S, Brustolon F, Pinna LA, Ruzzene M (2005) Proteinkinase CK2 fosforylerer og oppregulerer Akt / PKB. Cell Death Differ 12:668-677.

CrossRefMedline

27. ↵

Dobrazanski P, Noguchi T, Kovary K, Rizzo CA, Lazo PS, Bravo R (1991) Begge produkter av fosB-genet, FosB og dets korte form, FosB / SF, er transkripsjonelle aktivatorer i fibroblaster. Mol Cell Biol 11:5470-5478.

Abstrakt / GRATIS Fulltekst

28. ↵

Ferrara P, Andermarcher E, Bossis G, Acquaviva C, Brockly F, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2003) De strukturelle determinanter som er ansvarlige for c-Fos proteinproteasomal nedbrytning, varierer i henhold til uttryksbetingelsene. onkogen 22:1461-1474.

CrossRefMedline

29. ↵

Fuchs SY, Dolan L, Davis RJ, Ronai Z (1996) Fosforyleringsavhengig målretting av c-Jun ubiquitinasjon ved Jun N-kinase. onkogen 13:1531-1535.

Medline

30. ↵

Fuchs SY, Xie B, Adler V, Fried VA, Davis RJ, Ronai Z (1997) c-Jun NH2-terminale kinaser målretter ubiquitinasjonen av deres tilhørende transkripsjonsfaktorer. J Biol Chem 272:32163-32168.

Abstrakt / GRATIS Fulltekst

31. ↵

Fuchs SY, Tappin I, Ronai Z (2000) Stabiliteten av ATF2 transkripsjonsfaktoren er regulert ved fosforylering og de fosforylering. J Biol Chem 275:12560-12564.

Abstrakt / GRATIS Fulltekst

32. ↵

Girault JA, Hemmings HC Jr, Williams KR, Nairn AC, Greengard P (1989) Fosforylering av DARPP-32, et dopamin- og cAMP-regulert fosfoprotein, med kasein kinase II. J Biol Chem 264:21748-21759.

Abstrakt / GRATIS Fulltekst

33. ↵

Girault JA, Hemmings HC Jr, Zorn SH, Gustafson EL, Greengard P (1990) Karakterisering i pattedyrhjernen av en DARPP-32 serinkinase identisk med kasein kinas II. J Neurochem 55:1772-1783.

Medline

34. ↵

Hanada M, Sugawara K, Kaneta K, Toda S, Nishiyama Y, Tomita K, Yamamoto H, Konishi M, Oki T (1992) Epoxomicin, et nytt antitumormiddel av mikrobiell opprinnelse. J Antibiot (Tokyo) 45:1746-1752.

Medline

35. ↵

Hann SR, Eisenman RN (1984) Proteiner kodet av den humane c-myc-onkogen: differensial ekspresjon i neoplastiske celler. Mol Cell Biol 4:2486-2497.

Abstrakt / GRATIS Fulltekst

36. ↵

Hemmings HC Jr, Girault JA, Williams KR, LoPresti MB, Greengard P (1989) ARPP-21, et cyklisk AMP-regulert fosfoprotein (Mr = 21,000) beriket i dopamininnerverte hjerneområder. Aminosyresekvens av stedet fosforylert av cyklisk AMP i intakte celler og kinetiske studier av dets fosforylering in vitro. J Biol Chem 264:7726-7733.

37. ↵

Hidaka H, ​​Kobayashi R (1992) Farmakologi av proteinkinaseinhibitorer. Annu Rev Pharmacol Toxicol 32:377-397.

CrossRefMedline

38. ↵

Hirata H, Bessho Y, Kokubu H, Masamizu Y, Yamada S, Lewis J, Kageyama R (2004) Ustabilitet av Hes7 protein er avgjørende for den somite segmenteringsklokke. Nat Genet 36:750-754.

CrossRefMedline

39. ↵

Hiroi N, Graybiel AM (1996) Atypiske og typiske nevoleptiske behandlinger induserer forskjellige programmer for transkripsjonsfaktoruttrykk i striatumet. J Comp Neurol 374:70-83.

CrossRefMedline

40. ↵

Håper B, Kosofsky B, Hyman SE, Nestler EJ (1992) Regulering av umiddelbar tidlig genuttrykk og AP-1 binding i rottekjernen accumbens av kronisk kokain. Proc Natl Acad Sci USA 89:5764-5768.

Abstrakt / GRATIS Fulltekst

41. ↵

Håper BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ (1994a) Kronisk elektrokonvulsiv anfall (ECS) -behandling resulterer i uttrykk for et langvarig AP-1-kompleks i hjernen med endret sammensetning og egenskaper. J Neurosci 14:4318-4328.

Abstrakt

42. ↵

Håper BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ (1994b) Induksjon av et langvarig AP-1-kompleks bestående av endrede Fos-lignende proteiner i hjernen ved kronisk kokain og andre kroniske behandlinger. Neuron 13:1235-1244.

CrossRefMedline

43. ↵

Ishida A, Fujisawa H (1995) Stabilisering av kalmodulinavhengig proteinkinase II gjennom det autoinhibitoriske domene. J Biol Chem 270:2163-2170.

Abstrakt / GRATIS Fulltekst

44. ↵

Jariel-Encontre I, Salvat C, Steff AM, Pariat M, Acquaviva C, Furstoss O, Piechaczyk M (1997) Komplekse mekanismer for c-fos og c-jun nedbrytning. Mol Biol Rep 24:51-56.

CrossRefMedline

45. ↵

Jones S, Yakel JL (2003) Kasein kinase ii (proteinkinase ck2) regulerer serotonin 5-ht (3) reseptorkanalfunksjonen i ng108-15-celler. Neuroscience 119:629-634.

CrossRefMedline

46. ↵

Kato T Jr, Delhase M, Hoffmann A, Karin M (2003) CK2 er en C-terminal IkappaB-kinase som er ansvarlig for NF-kappaB-aktivering under UV-responsen. Mol Cell 12:829-839.

CrossRefMedline

47. ↵

Kelz MB, Chen J, Carlezon WA Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ (1999) Ekspresjon av transkripsjonsfaktoren deltaFosB i hjernen styrer følsomheten for kokain. Natur 401:272-276.

CrossRefMedline

48. ↵

Kim KB, Myung J, Sin N, Crews CM (1999) Proteasominhibering av de naturlige produktene epoxomicin og dihydroeponemycin: innsikt i spesifisitet og potens. Bioorg Med Chem Lett 9:3335-3340.

CrossRefMedline

49. ↵

Kobayashi E, Nakano H, Morimoto M, Tamaoki T (1989) Calphostin C (UCN-1028C), en ny mikrobiell forbindelse, er en svært sterk og spesifikk inhibitor av proteinkinase C. Biochem Biophys Res Commun 159:548-553.

CrossRefMedline

50. ↵

Krek W, Maridor G, Nigg EA (1992) Kasein kinase II er et overveiende kjernenzyme. J Cell Biol 116:43-55.

Abstrakt / GRATIS Fulltekst

51. ↵

Krohn NM, Stemmer C, Fojan P, Grimm R, Grasser KD (2003) Proteinkinase CK2 fosforylerer det høye mobilitetsgruppedomenet protein SSRP1, som induserer anerkjennelsen av UV-skadet DNA. J Biol Chem 278:12710-12715.

Abstrakt / GRATIS Fulltekst

52. ↵

Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DEH, Truong HT, Russo SJ, LaPlant Q, Whistler K, Neve RL, Self DW, Nestler EJ (2005) Chromatin remodeling er en nøkkelmekanisme som ligger til grunn for kokaininducert plastisitet i striatum. Neuron 48:303-314.

CrossRefMedline

53. ↵

Lieberman DN, Mody I (1999) Kasein-kasease II regulerer NMDA-kanalfunksjonen i hippokampale nevroner. Nat Neurosci 2:125-132.

CrossRefMedline

54. ↵

Litchfield DW (2003) Proteinkinase CK2: struktur, regulering og rolle i cellulære beslutninger om liv og død. Biochem J 369:1-15.

CrossRefMedline

55. ↵

Manabe T, Kuramoto N, Nakamichi N, Aramachi K, Baba K, Hirai T, Yoneyama M, Yoneda Y (2001) Nedbrytning av c-Fos-protein uttrykt ved N-metyl-d-asparaginsyre i nukleære fraksjoner av murin hippocampus. Brain Res 905:34-43.

Medline

56. ↵

Mandelzys A, Gruda MA, Bravo R, Morgan JI (1997) Fravær av et vedvarende forhøyet 37 kDa fosrelatert antigen og AP-1-lignende DNA-bindende aktivitet i hjernene av kaininsyre-behandlede fosB null-mus. J Neurosci 17:5407-5415.

Abstrakt / GRATIS Fulltekst

57. ↵

Marin O, Meggio F, Marchiori F, Borin G, Pinna LA (1986) Nettstedsspesifikitet av kasein-kinase-2 (TS) fra rotterlevercytosol. En studie med modellpeptidsubstrater. Eur J Biochem 160:239-244.

58. ↵

McClung CA, Nestler EJ (2003) Regulering av genuttrykk og kokainbelønning av CREB og DeltaFosB. Nat Neurosci 6:1208-1215.

CrossRefMedline

59. ↵

McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ (2004) DeltaFosB: en molekylær bryter for langsiktig tilpasning i hjernen. Brain Res Mol Brain Res 132:146-154.

Medline

60. ↵

Meggio F, Pinna LA (2003) Ett tusen og ett substrat av proteinkinase CK2? FASEB J 17:349-368.

Abstrakt / GRATIS Fulltekst

61. ↵

Meggio F, Donella-Deana A, Pinna LA, Moret V (1977) Fosforylering av kaseinfraksjoner av rottelever 'phosvitin kinase.'. FEBS Lett 75:192-196.

Medline

62. ↵

Meggio F, Brunati AM, Pinna LA (1983) Autofosforylering av type 2 kasein kinase TS i begge alfa- og beta-underenheter. Påvirkning av ulike effektorer. FEBS Lett 160:203-208.

CrossRefMedline

63. ↵

Meggio F, Shugar D, Pinna LA (1990) Ribofuranosyl-benzimidazolderivater som inhibitorer av kasein-kinase-2 og kasein-kinase-1. Eur J Biochem 187:89-94.

Medline

64. ↵

Meggio F, Marin O, Pinna LA (1994) Substrate specificitet av proteinkinase CK2. Cell Mol Biol Res 40:401-409.

Medline

65. ↵

Miller C, Zhang M, Han Y, Zhao J, Pelletier JP, Martel-Pelletier J, Di Battista JA (1998) Transkripsjonell induksjon av cyklooksygenase-2-genet ved okadainsyreinhibering av fosfataseaktivitet i humane kondrocytter: co-stimulering av AP-1 og CRE-nukleære bindingsproteiner. J Cell Biochem 69:392-413.

CrossRefMedline

66. ↵

Moratalla R, Elibol B, Vallejo M, Graybiel AM (1996) Nettverksnivåendringer i uttrykk for inducerbare Fos-Jun proteiner i striatum under kronisk kokainbehandling og uttak. Neuron 17:147-156.

CrossRefMedline

67. ↵

Morgan JI, Curran T (1995) Umiddelbare tidlige gener: ti år på. Trender Neurosci 18:66-67.

CrossRefMedline

68. ↵

Nakabeppu Y, Nathans D (1991) En naturlig forekommende avkortet form av FosB som hemmer Fos / Jun transkripsjonaktivitet. Cell 64:751-759.

CrossRefMedline

69. ↵

Nestler EJ, Barrot M, Self DW (2001) Delta FosB: en vedvarende molekylær bryter for avhengighet. Proc Natl Acad Sci USA 98:11042-11046.

Abstrakt / GRATIS Fulltekst

70. ↵

Neve RL, Howe JR, Hong S, Kalb RG (1997) Innføring av glutamatreseptor-underenheten 1 i motorneuroner in vitro og in vivo ved anvendelse av et rekombinant herpes simplex-virus. Neuroscience 79:435-447.

CrossRefMedline

71. ↵

Nuthall HN, Joachim K, Stifani S (2004) Fosforylering av serin 239 av Groucho / TLE1 av proteinkinase CK2 er viktig for inhibering av nevonal differensiering. Mol Cell Biol 24:8395-8407.

Abstrakt / GRATIS Fulltekst

72. ↵

Okazaki K, Sagata N (1995) Mos / MAP-kinaseveien stabiliserer c-Fos ved fosforylering og forsterker sin transformerende aktivitet i NIH 3T3-celler. EMBO J 14:5048-5059.

Medline

73. ↵

Palombella VJ, Rando OJ, Goldberg AL, Maniatis T (1994) Ubiquitin-proteasomveien er nødvendig for behandling av NF-kappa B1 forløperproteinet og aktiveringen av NF-kappa B. Cell 78:773-785.

CrossRefMedline

74. ↵

Papavassiliou AG, Treier M, Chavrier C, Bohmann D (1992) Målrettet nedbrytning av c-Fos, men ikke v-Fos, med et fosforyleringsavhengig signal på c-Jun. Vitenskap 258:1941-1944.

Abstrakt / GRATIS Fulltekst

75. ↵

Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E (2003) Inducerbart hjernegionspesifikasjon av en dominant negativ mutant av c-Jun i transgene mus reduserer følsomheten for kokain. Brain Res 970:73-86.

CrossRefMedline

76. ↵

Perrotti LI, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ (2004) Induksjon av DeltaFosB i belønningsrelaterte hjernestrukturer etter kronisk stress. J Neurosci 24:10594-10602.

Abstrakt / GRATIS Fulltekst

77. ↵

Persico AM, Schindler CW, O'Hara BF, Brannock MT, Uhl GR (1993) Braintransskripsjonsfaktoruttrykk: effekter av akutt og kronisk amfetamin og injeksjonsspenning. Brain Res Mol Brain Res 20:91-100.

Medline

78. ↵

Ploegh HL, Dunn BM (2000) Post-translationell modifisering: fosforylering og fosfataser. I: Nåværende protokoller i proteinvitenskap (Dunn BM, ed.) Pp. 13.01-13.02. New York: Wiley og Sons.

79. ↵

Pyerin W, Burow E, Michaely K, Kubler D, Kinzel V (1987) Katalytiske og molekylære egenskaper av høyrenset fosvitin / kasein kinase type II fra humane epitelceller i kultur (HeLa) og forhold til ecto proteinkinase. Biol Chem Hoppe Seyler 368:215-227.

Medline

80. ↵

Reikhardt BA, Kulikova OG, Borisova GY, Aleksandrova IY, Sapronov NS (2003) Status for proteinkinasen CK2-HMG14-systemet i aldersrelatert amnesi hos rotter. Neurosci Behav Physiol 33:799-804.

Medline

81. ↵

Roberts BJ, Whitelaw ML (1999) Nedbrytning av den grunnleggende helix-loop-helix / Per-ARNT-Sim-homologiedomene-dioksinreseptoren via ubiquitin / proteasomveien. J Biol Chem 274:36351-36356.

Abstrakt / GRATIS Fulltekst

82. ↵

Rost B, Yachdav G, Liu J (2004) PredictProtein-serveren. Nucleic Acids Res 32:W321-W326.

Abstrakt / GRATIS Fulltekst

83. ↵

Rylski M, Kaczmarek L (2004) Ap-1 mål i hjernen. Front Biosci 9:8-23.

CrossRefMedline

84. ↵

Sahin B, Kansy JW, Nairn AC, Spychala J, Ealick SE, Fienberg AA, Greene RW, Bibb JA (2004) Molekylær karakterisering av rekombinant musadenosinkinase og evaluering som mål for proteinfosforylering. Eur J Biochem 271:3547-3555.

Medline

85. ↵

Salvat C, Aquaviva C, Jariel-Encontre I, Ferrara P, Pariat M, Steff AM, Carillo S, Piechaczyk M (1999) Er det flere proteolytiske veier som bidrar til c-Fos, c-Jun og p53 protein nedbrytning in vivo? Mol Biol Rep 26:45-51.

CrossRefMedline

86. ↵

Schmidt R, Hecker E (1975) Autoksidering av fosbolestere under normale lagringsforhold. Kreft Res 35:1375-1377.

GRATIS fulltekst

87. ↵

Schwarz EM, Van Antwerpen D, Verma IM (1996) Konstitutiv fosforylering av IkappaBalpha med kasein kinase II forekommer fortrinnsvis ved serin 293: krav til nedbrytning av fri IkappaBalpha. Mol Cell Biol 16:3554-3559.

Abstrakt / GRATIS Fulltekst

88. ↵

Sears R, Leone G, DeGregori J, Nevins JR (1999) Ras forbedrer Myc protein stabilitet. Mol Cell 3:169-179.

CrossRefMedline

89. ↵

Silva-Neto MA, Fialho E, Paes MC, Oliveira PL, Masuda H (2002) Syklisk nukleotid-uavhengig fosforylering av vitellin med kasein kinase II renset fra Rhodnius prolixus-oocytter. Insekter Biochem Mol Biol 32:847-857.

CrossRefMedline

90. ↵

Skinner M, Qu S, Moore C, Visdom R (1997) Transkripsjonal aktivering og transformasjon med FosB protein krever fosforylering av det karboksyl-terminale aktiveringsdomene. Mol Cell Biol 17:2372-2380.

Abstrakt / GRATIS Fulltekst

91. ↵

Stemmer C, Schwander A, Bauw G, Fojan P, Grasser KD (2002) Proteinkinase CK2 fosforylerer differensielt proteiner av mais kromosomal høy mobilitetsgruppe B (HMGB) som modulerer stabiliteten og DNA-interaksjonene. J Biol Chem 277:1092-1098.

Abstrakt / GRATIS Fulltekst

92. ↵

Stevens I, Derua R, Rondelez E, Waelkens E, Merlevede W, Goris J (1999) Identifikasjon av cyk, en cyklin B2 kinase, som en ny kalsium / calmodulin-avhengig proteinkinase II og dens rolle under Xenopus laevis-oocyt-modning. Exp Cell Res 252:303-318.

CrossRefMedline

93. ↵

Suh HW, Choi SS, Lee JK, Lee HK, Han EJ, Lee J (2004) Regulering av c-fos- og c-jun-genuttrykk med lipopolysakkarid og cytokiner i primære dyrkede astrocytter: effekt av PKA og PKC-veier. Arch Pharm Res 27:396-401.

Medline

94. ↵

Szyszka R, Boguszewska A, Grankowski N, Ballesta JP (1995) Differensiell fosforylering av ribosomalsyreproteiner fra gjærcelle av to endogene proteinkinaser: kasease-kinase-2 og 60S-kinase. Acta Biochim Pol 42:357-362.

Medline

95. ↵

Tamaoki T, Takahashi I, Kobayashi E, Nakano H, Akinaga S, Suzuki K (1990) Calphostin (UCN1028) og calphostin-relaterte forbindelser, en ny klasse av spesifikke og potente inhibitorer av proteinkinase C. Adv Second Messenger Phosphoprotein Res 24:497-501.

Medline

96. ↵

Torres J, Pulido R (2001) Svulsterundertrykkeren PTEN blir fosforylert av proteinkinasen CK2 ved sin C-terminus. Implikasjoner for PTEN-stabilitet til proteasomediert nedbrytning. J Biol Chem 276:993-998.

Abstrakt / GRATIS Fulltekst

97. ↵

Tsubuki S, Saito Y, Tomioka M, Ito H, Kawashima S (1996) Differensiell inhibering av kalpain og proteasomaktiviteter ved peptidylaldehyder av di-leucin og tri-leucin. J Biochem (Tokyo) 119:572-576.

Abstrakt / GRATIS Fulltekst

98. ↵

Tsurumi C, Ishida N, Tamura T, Kakizuka A, Nishida E, Okumura E, Kishimoto T, Inagaki M, Okazaki K, Sagata N (1995) Nedbrytning av c-Fos ved 26S proteasomet akselereres av c-Jun og multiple proteinkinaser. Mol Cell Biol 15:5682-5687.

Abstrakt / GRATIS Fulltekst

99. ↵

Unger GM, Davis AT, Slaton JW, Ahmed K (2004) Proteinkinase CK2 som regulator for celleoverlevelse: implikasjoner for kreftbehandling. Curr Cancer Drug Mål 4:77-84.

CrossRefMedline

100. ↵

Hetteglass E, Marshall CJ (2003) Forhøyet ERK-MAP kinaseaktivitet beskytter FOS-familiemedlemmet FRA-1 mot proteasomal nedbrytning i kolonkarsinomceller. J Cell Sci 116:4957-4963.

Abstrakt / GRATIS Fulltekst

101. ↵

Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S (2002) ΔFosB regulerer hjulløp. J Neurosci 22:8133-8138.

Abstrakt / GRATIS Fulltekst

102. ↵

Whitmarsh AJ, Davis RJ (2000) Regulering av transkripsjonsfaktor funksjon ved fosforylering. Cell Mol Life Sci 57:1172-1183.

CrossRefMedline

103. ↵

Vinter B, Kautzner I, Issinger OG, Arnold HH (1997) To formodede proteinkinase-CK2-fosforyleringssteder er viktige for Myf-5-aktivitet. Biol Chem 378:1445-1456.

Medline

104. ↵

Wisniewski JR, Szewczuk Z, Petry I, Schwanbeck R, Renner U (1999) Konstitutiv fosforylering av de sure haler av høymobilitetsgruppens 1-proteiner ved kasein-kinase II endrer deres konformasjon, stabilitet og DNA-bindings-spesifisitet. J Biol Chem 274:20116-20122.

Abstrakt / GRATIS Fulltekst

105. ↵

Yamaguchi Y, Wada T, Suzuki F, Takagi T, Hasegawa J, Handa H (1998) Kasein kinase II interagerer med bZIP-domenene til flere transkripsjonsfaktorer. Nucleic Acids Res 26:3854-3861.

Abstrakt / GRATIS Fulltekst

106. ↵

Yanagawa T, Yuki K, Yoshida H, Bannai S, Ishii T (1997) Fosforylering av A170 stressprotein med kasein-kinase II-lignende aktivitet i makrofager. Biochem Biophys Res Commun 241:157-163.

CrossRefMedline

107. ↵

Yankulov K, Yamashita K, Roy R, Egly JM, Bentley DL (1995) Den transkriptionelle forlengelsesinhibitoren 5,6-diklor-1-beta-d-ribofuranosylbenzimidazol hemmer transkripsjonsfaktor IIH-assosiert proteinkinase. J Biol Chem 270:23922-23925.

Abstrakt / GRATIS Fulltekst

108. ↵

Yen J, Visdom RM, Tratner I, Verma IM (1991) En alternativ spleisform av FosB er en negativ regulator for transkripsjonal aktivering og transformasjon av Fos-proteiner. Proc Natl Acad Sci USA 88:5077-5081.

Abstrakt / GRATIS Fulltekst

109. ↵

Yin X, Jedrzejewski PT, Jiang JX (2000) Kasein kasease II fosforylerer linsekonnexin 45.6 og er involvert i dens nedbrytning. J Biol Chem 275:6850-6856.

Abstrakt / GRATIS Fulltekst

110. ↵

Yoza BK, Brooks JW, Mizel SB (1992) Induksjon av AP-1 transkripsjonsfaktorkomponenter under T-celleaktivering av interleukin 1 og fosbolestere. Cell Vekst Differ 3:677-684.

Abstrakt

111. ↵

Yu S, Wang H, Davis A, Ahmed K (2001) Konsekvenser av CK2-signalering til kjernefysisk matrise. Mol Cell Biochem 227:67-71.

CrossRefMedline

112. ↵

Yu S, Davis AT, Guo C, Green JE, Ahmed K (1999) Differensiell målretting av proteinkinase CK2 til nukleærmatrisen ved transient overekspresjon av dens underenheter. J Cell Biochem 74:127-134.

CrossRefMedline

113. ↵

Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton O, Sim-Selley LJ, DiLeone RJ, Kumar A, Nestler EJ (2006) ΔFosB: En viktig rolle for ΔFosB i nucleus accumbens i morfinvirkning. Nat Neurosci 9:205-211.

CrossRefMedline

Artikler som refererer til denne artikkelen

• Behavioral og strukturelle responser på kronisk kokain Krever en feedforward Loop som involverer {Delta} FosB og Calcium / Calmodulin-Dependent Protein Kinase II i Nucleus Accumbens Shell Journal of Neuroscience, 6 Mars 2013, 33(10):4295-4307
  • Abstrakt
  • Full tekst
  • Fulltekst (PDF)
• Striatal Overekspresjon av {Delta} FosB gjengir kronisk levodopa-inducerte ufrivillige bevegelser Journal of Neuroscience, 26 kan 2010, 30(21):7335-7343
• Abstrakt
• Full tekst
• Fulltekst (PDF)
• Abstrakt
• Full tekst
• Fulltekst (PDF)
• Abstrakt
• Full tekst
• Fulltekst (PDF)
• Abstrakt
• Full tekst
• Fulltekst (PDF)
• Transkripsjonsmekanismer av avhengighet: rolle av {Delta} FosB Filosofiske transaksjoner av Royal Society B: Biological Sciences, 12 oktober 2008, 363(1507):3245-3255
• Vedvarende sårbarhet for gjeninnføring av metamfetamin-søkeradferdighet i glialcellelinje-avledede nevrotrofiske faktor mutante mus FASEB Journal, 1 juli 2007, 21(9):1994-2004
• Aktivatorprotein-1-transkripsjonsfaktoren i respiratorisk epitelkarsinogenese Molekylær Kreftforskning, 1 februar 2007, 5(2):109-120