Nat Neurosci. Forfatter manuskript; tilgjengelig i PMC 2016 Jan 15.
Publisert i siste redigert form som:
Nat Neurosci. 2014 mai; 17 (5): 704-709.
Publisert på nett 6. april 2014. doi: 10.1038/nn.3694
PMCID: PMC4714770
NIHMSID: NIHMS574802
Ingo Willuhn , 1, 2, 3, * Lauren M. Burgeno , 1, 2 , Peter A. Groblewski , 2 og Paul EM Phillips 1, 2
Forlagets endelige redigerte versjon av denne artikkelen er tilgjengelig på Nat Neurosci
Se kommentaren « Tap av fasisk dopaminsignalering: en ny avhengighetsmarkør » i Nat Neurosci , bind 17 på side 644.
Se andre artikler i PMC som siterer den publiserte artikkelen.
Abstrakt
Narkotikamisbruk er en nevropsykiatrisk lidelse preget av økende narkotikabruk. Dopamin nevrotransmission i ventromedial striatum (VMS) medierer akutte forsterkende effekter av misbrukte stoffer, men med langvarig bruk antas dorsolateral striatum (DLS) å ta kontroll over narkotikasøk. Vi målte striatal dopaminfrigivelse under en selvbehandling av kokain som resulterte i økning av narkotika i rotter. Overraskende fant vi at phasic dopamin gikk ned i begge regioner ettersom økningen av kokaininntaket økte; med reduksjonen i dopamin i VMS korrelert betydelig med økningsgraden. Administrasjon av dopaminforløperen L-DOPA i en dose som påfyllde dopamin-signalering i VMS reversert eskalering, og demonstrerte dermed årsakssammenhenget mellom redusert dopaminoverføring og overdreven bruk av narkotika. Således gir disse dataene sammen mekanistisk og terapeutisk innsikt i overdreven legemiddelinntak som oppstår etter langvarig bruk.
INNLEDNING
Rusmiddelmisbruk er nært knyttet til frigjøring av dopamin i striatum 1 , 2. Imidlertid varierer endringer i dopamin-nevrotransmisjon relatert til rusmiddelbruk i varighet og subregion 3–5 . Langsomme økninger i den ekstracellulære konsentrasjonen av dopamin i ventromediale striatum (VMS), stimulert av mange rusmidler, inkludert kokain 6 , antas å gjenspeile de forsterkende egenskapene til rusmidler 7 , ettersom dyr regulerer hastigheten på kokain-selvadministrering for å opprettholde et forhøyet nivå av dopaminkonsentrasjon i omgivelsene 8. Innenfor VMS er det rapportert om overlappende antatte roller for dopaminsignalering i kjerne- og skall-subregionene til nucleus accumbens, men med vekt på skallet for å formidle primær rusmiddelbelønning og kjernen for å fungere som et substrat for betinget forsterkning 1. Faktisk er fasisk dopaminfrigjøring i nucleus accumbens-kjernen, som varer i noen få sekunder, betinget til presentasjon av miljøstimuli som gjentatte ganger har blitt parret med rusmidlet 9–12 og er i stand til å kontrollere rusmiddelsøking og -inntak 9 . Kodingen av slike betingede stimuli ved dopaminfrigjøring finnes også i sensorimotoriske aspekter av striatum (dorsolateral striatum, DLS) 13 , en striatal subregion som har vært knyttet til utviklingen av vanemessig og tvangsmessig rusmiddelsøking 14–16 . Dermed anses utviklingen av rusmiddelbruk utover rekreasjonsbruk å gjenspeile engasjementet av dopaminsignalering i forskjellige striatale subregioner 1 , 17 , med vekt på skifte fra det limbiske (VMS) til det sensorimotoriske (DLS) striatum under utviklingen av etablert rusmiddelsøkende atferd 1 , 18. Det er imidlertid ikke kjent om koding av rusmiddelrelaterte handlinger eller stimuli ved fasisk dopamin endres når moderat rusmiddelatferd eskalerer.
Gnagerparadigmer som anses å best modellere overgangen fra moderat rusmiddelbruk til avhengighet, benytter langvarig tilgang til stoffet 19 , 20 , som å utvide tilgangen fra én (kort tilgang, ShA) til seks timer (lang tilgang, LgA) per dag i en periode på uker 21. Et slikt selvadministrasjonsregime for stoffet er i stand til å produsere eskalert 21 og tvangsmessig rusmiddelsøking 22 , blant andre kardinalsymptomer som karakteriserer rusavhengighet hos mennesker 23. Her testet vi hvordan LgA til kokain påvirker den regionale dynamikken i fasisk dopaminsignalering i striatum som tidligere ble karakterisert under stabil ShA-rusmiddelbruk 13 for å få en bedre forståelse av de nevrobiologiske mekanismene som ligger til grunn for eskalering av rusmiddelbruk.
RESULTATER
Hannlige Wistar-rotter med innlagte intravenøse katetre ble trent til å selvadministrere kokain under daglige ShA-økter, og etter tilegnelse ble de byttet til LgA-økter i kamre utstyrt med to nesestikkporter. Et nesestikk inn i den aktive porten fremkaller en infusjon av kokain (0.5 mg/kg/infusjon) og 20 sekunders presentasjon av en lys stimulus på et forsterkningsprogram med fast intervall (FI) 20. Responser i den andre (inaktive) nesestikkporten, eller i den aktive porten under stimuluspresentasjon (20 sekunders timeout), var uten programmert konsekvens. For rapporteringsformål refereres nesestikkresponser i den aktive porten utenfor timeout-perioden (dvs. de som fremkaller en kokaininfusjon) til "aktive nesestikk" og de i den inaktive porten utenfor timeout-perioden som "inaktive nesestikk". Antall aktive nesepoker oversteg signifikant inaktive nesepoker (hovedeffekt av nesepoke-port: F (1, 23) = 383.226, P < 0.001; Fig. 1 ) i løpet av hver uke ( P < 0.001). Etter overgangen fra ShA til LgA økte kokaininntaket signifikant over tid (hovedeffekt av uken: F (3, 69) = 25.504, P < 0.001; Fig. 1 ), som konsekvent rapportert av mange andre 24.
For å vurdere den langsiktige dynamikken i dopamintransmisjonen ble langsgående nevrokemiske opptakene utført samtidig i kjernen accumbens kjernen av VMS og i DLS ved kronisk implanterte mikrosensorer25 ved hjelp av hurtig-skanning syklisk voltammetri (se Supplerende Fig. 1 for histologisk verifisering av elektrodplassering). I den første uken av LgA observerte vi en forbigående økning i ekstracellulær dopaminkonsentrasjon i VMS etter aktive responser (P <0.001; Fig. 2a). Dette aktiveringsmønsteret gikk ned under LgA hvor dopaminfrigivelse i den tredje uken var betydelig mindre enn i den første (P <0.001) og andre (P = 0.030) uker (hovedvirkningen av uken: F(2,72) = 10.230, P <0.001; Fig. 2b). Phasic dopaminfrigivelse i DLS dukket opp i den andre uken (P = 0.006; Fig. 2c), men var fraværende i tredje uke av LgA (hovedvirkning av uken: F(2,51) = 3.474, P = 0.039; aktivt poke × uke interaksjon: F(2,51) = 4.021, P = 0.024; Fig. 2c, d). Disse dataene viser at phasic dopaminsignaler i VMS og DLS dukker opp i rekkefølge på forskjellige stadier av narkotika, som ligner på det vi rapporterte for en ShA-diett13. Imidlertid redusert denne signalering i begge regioner i løpet av LgA, en periode over hvilken det er kjent at farmakokinetikken til intravenøst administrert kokain ikke forandres26,27.
For å teste sammenhengen mellom tapet av dopamin-signalering og eskalering av narkotikaforbruk, utnyttet vi individuelle forskjeller i følsomhet for å eskalere stoffet selvadministrasjon under LgA-diett ved å skille dyr inn i to grupper avhengig av om de viste betydelig eskalering basert på lineær regresjon av narkotikaforbruk over LgA-økter eller ikke (Fig. 3a, b). Validering av denne separasjonen av dyr viste at ikke-eskalerte dyr viste ingen signifikant økning i aktive nesepoker i løpet av tre uker med LgA (hovedvirkning i uken: F(2,18) = 0.633, P = 0.542; Fig. 3b, venstre), mens eskalerte rotter økte inntaket betydelig (hovedvirkningen av uken: F(2,26) = 14.826, P <0.001; Fig. 3b, Ikke sant; inntak × uke interaksjon: F(2,44) = 4.674, P = 0.014) gjør mer aktive nesepoker enn ikke-eskalerte dyr i løpet av den tredje LgA-uken (t(22) = 2.307, P = 0.031; Fig. 3b). Spesielt viste eskalerte dyr økt motivasjon for å skaffe kokain, som vist i en progressiv forholdsoppgave (P = 0.028; Supplerende Fig. 2). I eskalerte rotter var det en signifikant nedgang i dopaminutslipp i VMS (hovedvirkningen av uken: F(2,51) = 15.507, P <0.001; Fig. 3c, høyre og Supplerende Fig. 3a). Imidlertid var VMS dopaminfrigivelse stabil i ikke-eskalerte rotter (hovedvirkningen av uken: F(2,18) = 0.057, P = 0.945; Fig. 3c, venstre og Supplerende Fig. 4a) gir signifikant mer phasic dopamin i den tredje uken sammenlignet med eskalerte rotter (hovedvirkningen av inntaket: F(1,69) = 6.444, P = 0. 013; Fig. 3d, venstre; inntak × uke interaksjon: F(1,70) = 4.303, P = 0.042). Denne forskjellen i dopaminfrigivelse mellom eskalerte og ikke-eskalerte rotter var tydelig gjennom hele seks timer med selvadministrasjon (t(43) = 2.599, P = 0.013). Det er viktig at denne forskjellen ikke skyldes en generell nedgang i dopaminfunksjonen i eskalerte dyr, da dopaminfrigivelse etter ikke-betingede eksperiment-inducerte infusjoner av kokain ikke var forskjellig mellom ikke-eskalerte og eskalerte dyr (P = 0. 605; Supplerende Fig. 5a).
I motsetning til den opprettholdte fasiske dopaminfrigjøringen i VMS hos ikke-eskalerende rotter, rapporterte vi tidligere at det var en reduksjon i dopaminfrigjøring hos dyr som hadde gjennomgått tre uker med begrenset kokaintilgang (ShA) på bare én time per daglig økt 13. Derfor utførte vi ytterligere analyser på dataene innhentet fra disse ShA-rottene for å tillate en detaljert karakterisering av forholdet mellom dopaminfunksjon og medikamentinntak hos dyr som hadde gjennomgått ShA- eller LgA-kokain-selvadministrering. Selv om det ikke var en signifikant opptrapping av gjennomsnittlig medikamentforbruk hos dyr under ShA, var det individuelle forskjeller med en undergruppe av dyr (6 av 16) som viste signifikant opptrapping av medikamentinntak over tre uker med ShA-kokain-selvadministrering. Interessant nok var VMS fasisk dopamin i den tredje uken med ShA-kokain-selvadministrering i gruppen av dyr som opprettholdt stabilt medikamentforbruk (dvs. ikke viste signifikant opptrapping) ikke signifikant forskjellig fra ikke-eskalerte dyr i den tredje uken med LgA (P = 0.741; Supplerende figur 5b ). ShA-dyr som økte medikamentinntaket sitt, viste lavere medikamentforbruk (32.7 ± 3.9 versus 43.9 ± 3.1 infusjoner i løpet av den første timen, P = 0.017) og mindre svekket dopaminfrigjøring (P = 0.049; tilleggsfigur 5b ) enn dyr som økte inntaket sitt under LgA-forhold. Likevel var det en ikke-signifikant trend for redusert VMS-dopamin sammenlignet med deres ikke-eskalerende motparter (P = 0.094) og ingen signifikant interaksjon for dopaminfrigjøring over tid mellom ShA- og LgA-eskalerende rotter (ingen interaksjon mellom inntak × regime: F (1,57) = 0.111 P = 0.740; tilleggsfigur 5b ). Gitt disse individuelle forskjellene, utførte vi regresjonsanalyse på tvers av alle ShA- og LgA-rottene for å teste for en direkte sammenheng mellom dopaminnivåer og graden av eskalering, og fant signifikant negativ korrelasjon (ShA- og LgA-rotter samlet; r = −0.628, P = 0.005) med størst eskalering hos dyr som hadde den laveste dopaminfrigjøringen i uke 3 ( fig. 3e , venstre). Derfor var dempningen av dopaminsignalering i VMS prediktiv for eskalering av selvadministrasjon av legemidler på tvers av LgA- og ShA-legemiddeltilgangsregimer. Disse dataene fremhever at det relevante aspektet knyttet til endringer i dopaminfrigjøring er om dyrene eskalerer eller ikke, snarere enn selvadministrasjonsregimet de har blitt utsatt for i seg selv . På samme måte finner vi at på tvers av alle rotter er eskalering en signifikant prediktor for økt motivasjon for kokain ( P = 0.037, tilleggsfigur 6a ), men LgA/ShA-regimet er ikke det, som vurdert i en progressiv ratio-plan ( P = 0.340, tilleggsfigur 6b ).
I motsetning til VMS, var det ingen responsavhengig dopaminfrigjøring i DLS forskjellig mellom eskalerte og ikke-eskalerte LgA-dyr (hovedeffekt av inntak: F (1,48) = 0.472, P = 0,496; Fig. 3d , høyre og tilleggsfigurene 3b og 4b ), og det var heller ingen signifikant sammenheng mellom eskaleringshelningen og dopaminfrigjøring hos dyr som gjennomgikk ShA- eller LgA-kokain-selvadministrering (r = −0.112, P = 0.649; Fig. 3e , høyre). Mens dopamin i VMS korrelerte med eskalering av medikamentinntak, ble det derfor ikke observert en lignende korrelasjon i DLS, en hjerneregion som har vært mye assosiert med utvidet selvadministrering av medikamenter 1 , 14 , 16 , 18.
Gitt denne provoserende korrelasjonen mellom nevrokemi og oppførsel, antydet vi at nedgangen i phasic dopamin-signalering var årsakssammenhengende ved å produsere eskalering av narkotikaproblemer, i likhet med økningen i narkotikaopptak produsert av dopaminreseptorantagonister28-30, og så gjenopprette det ville gi en reversering i eskalering (Fig. 4a). Derfor behandlet vi eskalerte dyr (P = 0.024; Fig. 4b) med L-DOPA før økt begynner å øke fasisk dopaminfrigivelse31. L-DOPA doseavhengig (0, 10, 30, og 90 mg / kg, intravenøs) redusert kokaininntak (hovedvirkningen av L-DOPA: F(3,53) = 5.053, P = 0.004; Fig. 4b), med 30 mg / kg returinntak til det pre-escalated nivået. Det var viktig at 30 mg / kg dosen av L-DOPA var tilstrekkelig til fullstendig gjenoppretting av phasic dopamin-signalering i VMS (se Supplerende Fig. 7 for opptak av nettsteder) under narkotikamisbruk (F(2,8) = 6.316, P = 0.023; Fig. 4c), en effekt observert også for hele seks timers selvadministrasjon (F(2,8) = 7.610, P = 0.0141). Dermed forutslo mengden av fasisk dopaminfrigivelse i VMS mengden av stoffinntaket under en kokain-selvadministrasjonsøkt (r = -0.525, P = 0.046; Fig. 4d). Denne adferdseffekten av L-DOPA kan ikke forklares ved endringer i farmakologisk respons på kokain, da den langsomme konsentrasjonen i VMS dopamin etter kontingent medikamentinfusjon ikke ble endret ved L-DOPA-behandling og faktisk ikke var forskjellig mellom pre- eskalering, eskalering og eskalert L-DOPA-behandlede tilstander (F(2,8) = 0.020, P = 0.980; Supplerende Fig. 8). Videre ble effekten av L-DOPA på stoffforbruk observert når L-DOPA ble lokalt infisert i VMS (se Supplerende Fig. 9 for infusjonssteder) av eskalerte rotter før en økt (t(7) = 6.517, P <0.001; Fig. 4e). Samlet sett demonstrerer dette settet av studier at en enkelt dose av L-DOPA administrert før legemiddeladgang er effektiv for å gjenopprette dopamin-signalering og normalisere kokainbruk til den pre-escalated tilstanden.
Vi testet neste gang om bruk av L-DOPA ville være effektiv for å redusere eskalert narkotikaforbruk i langsiktige doseringsregimer, mer relevant for kliniske anvendelser. Først har vi gjennomført eksperimenter som introduserer gjentatt infusjon av L-DOPA i påfølgende dager under induksjon av eskalering. Dyrene ble trent til stabilt selvadministrerende kokain og deretter enten byttet til LgA eller forblir på ShA i løpet av hvilken tid de ble injisert med L-DOPA (30 mg / kg, intravenøs) eller saltoppløsning før hver økt i to uker (Fig. 5a). L-DOPA signifikant påvirket legemiddelinntak på en regimespesifikk måte (hovedvirkning av behandlingen: F(1,53) = 9.297, P = 0.004; hovedvirkningen av diett: F(1,53) = 5.968, P = 0.018; Fig. 5a) med redusert kokaininntak i LgA-dyr (P = 0.004), men ikke ShA-dyr (P = 0.170; Fig. 5a), og uten virkning på inaktive nesepokes (LgA, P = 0.202; sha, P = 0.101; data ikke vist). Derfor var L-DOPA-behandlingen effektiv for å hindre eskalering av narkotikaforbruk under LgA. Ved behandlingens avbrudd var imidlertid denne effekten ikke utholdende (P = 0.789; Fig. 5a). For det andre administrerte vi gjentatte ganger L-DOPA på påfølgende dager hos dyr med etablert eskalert stoffforbruk. Dyrene ble trent til stabilt selvadministrerende kokain, og deretter ble de enten byttet til LgA eller forblir på ShA i tre uker. Disse dyrene ble deretter behandlet med L-DOPA eller saltoppløsning før selvadministrasjonsøkter i den tredje uken (Fig. 5b). LgA-trente dyr viste en signifikant økning i kokainbruk i løpet av de første to ukene sammenlignet med ShA-trente dyr (hovedvirkningen av diett: F(1,51) = 15.706, P <0.001; data ikke vist). L-DOPA-behandling ga en diett-spesifikk effekt (hovedeffekt av behandlingen: F(1,51) = 5.303, P = 0.025; hovedvirkningen av diett: F(1,51) = 11.884, P = 0.001; Fig. 5b), redusert kokaininntak i LgA-dyr (P = 0.048), men ikke ShA-dyr (P = 0.210; Fig. 5b) uten å påvirke inaktiv respons (LgA, P = 0.641; sha, P = 0.664). Det var viktigere at differensial effekten av L-DOPA på aktive nesepokes var mer robust når dyrene ble gruppert til eskalert og ikke-eskalert, i stedet for ShA og LgA (eskalerte dyr, P = 0.005; ikke-eskalerte dyr, P = 0.421; Fig. 5c), noe som indikerer at L-DOPA redusert eskalert kokaininntak fortrinnsvis i stedet for å påvirke stoffforbruket per se, en interaksjon som utviklet seg over dager (inntak × behandling (dag 1) interaksjon: F(1,51) = 0.562, P = 0.457; men inntak × behandling (dag 5) interaksjon: F(1,51) = 4.091, P = 0.048). Viktig er også at disse forskjellene mellom eskalerte og ikke-eskalerte subpopulasjoner, samt de-eskalerende virkningene av akutt og kronisk administrert L-DOPA, observeres i alle seks timer med selvadministrasjon (Supplerende Fig. 10). Sammen viser disse funnene at fasisk dopaminfrigivelse avtar hos dyr som eskalerer sitt kokaininntak og gjenoppretter det ved gjentatt administrasjon av dopaminforløperen, L-DOPA, forhindrer og reverserer denne eskalering, noe som gir bevis for at redusert dopamin-drev eskalering av narkotika selvadministrasjon.
DISKUSJON
I denne studien undersøkte vi fasisk dopaminfrigjøring i VMS og DLS under eskalering av medikamentinntak, et fenomen som modellerer et sentralt diagnostisk kriterium for medikamentavhengighet 21 , 23. Våre funn viser at eskalering er assosiert med redusert dopaminsignalering i både VMS og DLS, der reduksjonen i dopamin i VMS er signifikant korrelert med eskaleringsraten. Denne effekten ser ut til å være selektiv for fasisk dopamin, ettersom sammenlignbare endringer ikke ble observert i tonisk dopamin i denne studien, i tidligere arbeid med samme regime hos rotter 27 eller relaterte selvadministrasjonsparadigmer hos ikke-menneskelige primater 32 , 33. Det har vært en rekke rapporter om redusert fasisk dopaminfunksjon under medikamentabstinens (testet mellom 18 timer og syv dager fra den siste selvadministrasjonsøkten), som er assosiert med redusert følsomhet for kokain 34–37 . Selv om vi observerte en lignende reduksjon i dopaminresponsen på kokain mellom ShA- og LgA-rotter ( tilleggsfigur 5a ), så ikke denne effekten ut til å være relevant for eskalering, ettersom den nevrokjemiske responsen på ikke-betinget kokain ikke er forskjellig mellom rotter som eskalerte og de som ikke gjorde det (ingen inntak × regimeinteraksjon: F (1,34) = 1.964 P = 0.170; tilleggsfigur 5a ). Tilsvarende var toppendringer i tonisk dopaminkonsentrasjon opptil 90 sekunder etter betinget kokain, antagelig på grunn av kokainens farmakologiske virkninger, ikke forskjellig mellom den føreskalerte og eskalerte tilstanden hos de samme dyrene ( tilleggsfigur 8 ). Dermed var det eneste aspektet ved dopaminoverføring vi observerte som forutså eskalering av medikamentinntak, den fasiske responsen som oppstod umiddelbart etter et aktivt nesestikk, som er en betinget respons primært på medikamentassosierte signaler 9 , 11 , 13 . Denne nevrokjemiske responsen avtok hos dyr som økte medikamentinntaket, noe som minner om en normal læringsprosess der dopaminfrigjøring i VMS fremkalt av en belønningsrelatert stimulus avtar etter hvert som stimulusen blir tidsmessig predikert 38 , 39. Imidlertid skjer dempningen av dopaminfrigjøring under selvadministrasjon mye senere i læringsprosessen enn man ville forvente for betinget læring, lenge etter at man har tilegnet seg etablert medikamentinntak. Dessuten, hos dyr som ikke øker medikamentinntaket, finner ikke demping av fasisk dopaminfrigjøring sted, selv om disse dyrene viser asymptotisk diskriminerende instrumentell atferd.
Ved første øyekast ser våre observasjoner av synkende dopaminfrigjøring etter hvert som rusmiddelbruken utvikler seg ut til å være i strid med flere samtidige teorier om avhengighet. Teorier som fokuserer på rusmiddelinduserte insentivsensibiliseringsprosesser postulerer økende reaktivitet i VMS-dopaminsystemet ved gjentatt eksponering for rusmidler, noe som medierer en sensibilisert respons på rusmiddel- og signaleksponering 40 , et fenomen som er spesielt robust etter LgA 41. Konseptualiseringer av rollen til avvikende læring og vanedannelse i rusavhengighet antyder at fremvoksende dopaminsignalering i DLS i økende grad tar kontroll over rusmiddelsøking 1 , 14 , 16. Dessuten impliserer fremtredende beregningsmodeller for avhengighet spesifikt økt dopaminsignalering til rusmiddelassosierte signaler som en drivkraft mot avhengighet 42 , 43. Motsatt ser funnene våre ut til å være mer konsistente med dopaminuttømmingshypotesen om avhengighet, foreslått av Dackis og Gold 44 , og relaterte motstander-prosessteorier 21 som vektlegger rusmiddelindusert undertrykkelse av belønningsrelaterte prosesser. Slik undertrykkelse har blitt antatt å forårsake kompenserende selvregulering av narkotikabruk for å opprettholde et foretrukket nivå av narkotikaforgiftning 21. Mer spesifikt kompenserer mennesker og dyr for reduserte enhetsdoser kokain med økt respons 45 , 46. Denne prosessen reguleres av dopaminoverføring i VMS 8 , og følgelig fremkaller senking av dopaminoverføring (f.eks. ved dopaminreseptorantagonisme) en økning i hastigheten på narkotikaforbruket 28 , 29. Derfor kan reduksjonen i dopaminsignalering som vi observerte under LgA stimulere kompenserende oppregulering av narkotikainntak for å oppnå det foretrukne nivået av rus. Til støtte for denne hypotesen var reduksjonen av dopamin i VMS mest uttalt hos dyr som viste større opptrapping av narkotikabruk.
Vi resonnerte derfor at gjenoppretting av dopaminoverføring ville dempe eskalering. Administrering av L-DOPA var faktisk effektiv til både å forhindre og reversere eskaleringen av rusmiddelinntak. Det er verdt å merke seg at effektene av L-DOPA på rusmiddelbruk ikke vedvarte etter avsluttet behandling, noe som tyder på at det ikke forhindret den underliggende nevroadaptasjonen. Derfor indikerer dataene våre at eskalering medieres av en prosess som manifesteres gjennom en reduksjon i fasisk dopamin under rusmiddelbruk. Disse funnene gir mekanistisk informasjon for bruk av L-DOPA i klinisk behandling av misbruk av psykostimulerende midler, en strategi som har hatt noen lovende, men generelt blandede, resultater i et lite antall nylige kliniske studier 47. Spesielt, siden L-DOPA reduserte eskalert rusmiddelbruk uten å produsere avholdenhet, foreslår vi at det er bedre egnet for skadereduserende tilnærminger, og spesielt for å la rusavhengige gjenvinne en grad av kontroll over rusmiddelbruken mens de går inn i atferdsterapiprogrammer. Samlet sett viser funnene våre en reduksjon i fasisk dopaminfrigjøring som finner sted under langvarig tilgang til rusmidler, noe som medierer overgangen fra rekreasjons- til ukontrollert rusmiddelbruk.
Metoder
dyr
Voksne hannrotter av typen Wistar fra Charles River (Hollister, CA, USA) som veide mellom 300 g og 400 g ble holdt individuelt og i en 12-timers lys-/12-timers mørkesyklus (lys på kl. 0700) med kontrollert temperatur og fuktighet, med mat og vann tilgjengelig ad libitum. All bruk av dyr ble godkjent av University of Washington Institutional Animal Care and Use Committee, og kirurgiske prosedyrer ble utført under aseptiske forhold. For voltammetrieksperimentene gjennomgikk 50 dyr kirurgi, hvorav 29 opprettholdt kateteråpenhet gjennom hele eksperimentene, hadde minst én funksjonell og histologisk verifisert elektrode, og besto atferdskriteriene (se nedenfor). For det farmakologiske eksperimentet opprettholdt 28 av 32 rotter som gjennomgikk kateterimplantasjon, intravenøs kateteråpenhet og ble brukt i studien. Dyrene ble balansert i eksperimentelle grupper basert på deres selvadministrasjonshastighet under ShA pre-eksperimentell trening. Utvalgsstørrelsene ligner på de som er rapportert i tidligere publikasjoner 13.
Stereotaksisk kirurgi
Rotter ble bedøvet med isofluran, plassert i en stereotaksisk ramme, administrert med det ikke-steroide antiinflammatoriske legemidlet karprofen (5 mg/kg, subkutant), og plassert på en isotermisk pute for å opprettholde kroppstemperaturen. Hodebunnen ble penslet med alkohol og betadin, badet med en blanding av lidokain (0.5 mg/kg) og bupivakain (0.5 mg/kg), og snittet for å eksponere kraniet. Hull ble boret i kraniet og dura mater ble renset for målretting av DLS (1.2 mm anteriort, 3.1 mm lateralt og 4.8 mm ventralt for Bregma 48 ) og nucleus accumbens-kjernen i VMS (1.3 mm anteriort, 1.3 mm lateralt og 7.2 mm ventralt for Bregma). En internt produsert karbonfiber-mikroelektrode 25 ble plassert i VMS og en annen i DLS, og en Ag/AgCl-referanseelektrode ble implantert i en separat del av forhjernen. I en annen gruppe dyr ble ledekanyler (26 gauge; Plastics One, Roanoke, VA, USA), okkludert av "dummy"-kanyler av samme lengde, bilateralt implantert for å målrette VMS. Elektroder og ledekanyle ble festet med kranioplastisk sement forankret til hodeskallen med skruer. Etter operasjonen ble rottene administrert med det langtidsvirkende, ikke-steroide antiinflammatoriske legemidlet karprofen (5 mg/kg, subkutant) og plassert på en isotermisk pute for å opprettholde kroppstemperaturen inntil de var oppegående. Alle dyrene ble implantert med intravenøse katetre under en separat operasjon en uke senere.
Implantering av intravenøse katetre
Rotter ble bedøvet med isofluran, administrert med den ikke-steroide antiinflammatoriske karprofen (5 mg / kg, subkutant) og plassert på en isotermisk pute for å opprettholde kroppstemperaturen. Katetre ble laget av silastisk slange med en ytre diameter på 0.6 mm og festet til et "nav" i den ene enden (distalt til veneninnføring; Plastics One, VA, USA) for tilkobling til en infusjonspumpe. Katetre ble presset subkutant gjennom et snitt på baksiden mellom skuldrene til kroppens forside, og forankret i høyre halsvene hjulpet av en silisiumgummipar nær den nærmeste enden av kateteret. Optimal posisjonering av kateteret ble bekreftet ved å trekke blod inn i det med undertrykk. Navet ble deretter sikret av et stykke Teflon-maske sydd til omkringliggende vev og snitt ble lukket, slik at navet stakk ut fra rotten. Kateteret ble deretter spylt med en heparinoppløsning (80 U / ml i saltvann) og fylt med en viskøs oppløsning av polyvinylpyrolidon (PVP) og heparin (1000 U / ml). Kateternavet var avdekket med et kort, krympet stykke polyetylenrør, og PVP-løsningen ble værende i kateteret for å sikre åpenhet. Etter operasjonen fikk rotter komme seg i minst fem dager.
Kokain selvadministrasjon
Selvadministrasjonsøkter ble gjennomført mellom kl. 0900 og 1700. Rottene lærte å selvadministrere kokain (Sigma, St. Louis, MO, USA) i et modulært operantkammer (Med Associates, VT, USA) utstyrt med to nesestikkresponsenheter (port med integrerte signallys) plassert på tilstøtende paneler på samme vegg, en huslampe og høyttalere for å gi stimuli i ren tone og hvit støy. Operantkammeret var plassert i et lyddempet ytre kammer. Rotter (3–4 måneder gamle) ble trent til å få tak i kokain etter en operant respons på FI20-forsterkningsskjema. Nesestikking i den aktive porten (sidebalansert mellom dyrene) resulterte i en umiddelbar intravenøs infusjon av kokain (0.5 mg/kg over omtrent ti sekunder) parret med en 20-sekunders presentasjon av en audiovisuell stimulus (belysning av lyset inne i nesestikkporten og tone; betinget stimulus, CS). Under CS-presentasjonen ble det pålagt en 20-sekunders time-out der nesepirking ikke resulterte i ytterligere medikamentinfusjon eller andre programmerte konsekvenser. Legemiddeltilgjengelighet under økten ble indikert av hvit støy og belysning av huslyset. For å kontrollere for responsspesifisitet ble nesepirking av den andre (inaktive) porten overvåket, men ble aldri forsterket. Etter førtreningsøkter med et kriterium på fem eller flere aktive responser per økt på to påfølgende økter for inkludering i studien, fikk rottene daglig tilgang til kokain i én time per dag (kort tilgang; ShA) i én uke og deretter seks timer per dag (lang tilgang; LgA) i tre uker (fem dager per uke). Antall økter for å nå kriteriet varierte mellom dyrene fra to til fem økter. Atferdsresultater fra en tidligere rapportert kontrollgruppe 13 ble brukt som en baseline for å sammenligne atferdsdata fra rotter som gjennomgikk LgA-kokain-selvadministrering med rotter trent under et ShA-regime på et likt antall dager.
Etter de tre ShA- eller LgA-ukene med FI20-kokain-selvadministrering, gjennomgikk en delmengde av rotter progressiv-ratio-testing. Disse øktene var identiske med FI20-øktene, bortsett fra at dyrene måtte utføre et økende antall operante responser for påfølgende infusjoner av kokain i løpet av denne økten. Operantkravet for hvert forsøk ( T ) var det avrundede heltallet av 1.4 ( T – 1) spaktrykk, startende ved 1 spaktrykk (det vil si 1, 1, 1, 2, 3, 5, 7, 10, 14, 20, 28, 40, 56, 79, 111, 155, 217, 304, 426). Dette arbeidskravet blir så høyt at dyrene til slutt slutter å reagere og når et "brytepunkt". Brytningspunktet ble operasjonelt definert som det totale antallet infusjoner oppnådd før en trettiminutters periode der ingen infusjoner ble oppnådd.
L-DOPA / Benserazid-administrasjon
L-DOPA (L-3,4-dihydroksyfenylalanin) ble gitt i kombinasjon med den perifert virkende DOPA-dekarboksylasehemmeren benserazid for å redusere perifer nedbrytning av L-DOPA (begge fra Sigma, St. Louis, MO, USA). Begge legemidlene ble løst opp i saltvann og infundert intravenøst med et volum på 1 ml/kg kroppsvekt. L-DOPA ble administrert 30 minutter før øktens start med 0, 10, 30 eller 90 mg/kg, mens benserazid ble gitt konsekvent med 2 mg/kg uavhengig av administrert L-DOPA-dose. I et første sett med studier (doserespons) ble rotter behandlet med L-DOPA på én dag ( fig. 4 ). Ingen av L-DOPA-dosene som ble brukt hemmet generell ytelse eller forårsaket dyskinesi. For å unngå potensielt forvirrende effekter av gjentatt L-DOPA-administrasjon, ble rotter trent uten L-DOPA-behandling etter «L-DOPA-økter». I et andre sett med studier ble dyrene behandlet med disse L-DOPA-ene før hver selvadministrasjonsøkt i en periode på opptil to uker ( fig. 5 ). I et tredje sett med studier ble effektene av bilateral infusjon av L-DOPA (25–50 µg oppløst i 0.5 µl ACSF i hver hjernehalvdel; 0.25 µl/min; Sigma, St. Louis, MO, USA) og ACSF i VMS på medikamentatferd undersøkt hos rotter som viste økt opptrapping av kokain-selvadministrasjon under LgA. På infusjonsdager ble dummy-kanylen erstattet med en 33-gauge infusjonskanyle som stakk 1.0 mm utover styrekanylen. Infusjoner ble gitt ti minutter før øktens start. Etter infusjonen ble kanylene stående på plass i to minutter før de ble fjernet for å tillate diffusjon av legemidlet.
Voltammetrisk måling og analyse
For dopaminpåvisning ved hjelp av hurtigskanningssyklisk voltammetri under eksperimentelle økter (opptak utført i løpet av to økter per uke), ble kronisk implanterte karbonfibermikrosensorer koblet til en hodemontert voltammetriforsterker, koblet til et PC-drevet datainnsamlings- og analysesystem (National Instruments, TX, USA) gjennom en elektrisk svivel (Med Associates, VT, USA) som var montert over testkammeret. Voltammetriske skanninger ble gjentatt hver 100 ms for å oppnå en samplingsfrekvens på 10 Hz. Under hver voltammetriske skanning ble potensialet ved karbonfiberelektroden lineært rampet fra −0.4 V versus Ag/AgCl til +1.3 V (anodisk sveip) og tilbake (katodisk sveip) ved 400 V/s (8.5 ms total skanningstid) og holdt på −0.4 V mellom skanningene. Når dopamin er tilstede på overflaten av elektroden, oksideres det under det anodiske sveipet for å danne dopamin-o-kinon (toppreaksjon detektert ved omtrent +0.7 V) som reduseres tilbake til dopamin i det katodiske sveipet (toppreaksjon detektert ved omtrent -0.3 V). Den påfølgende elektronfluksen måles som strøm og er direkte proporsjonal med antall molekyler som gjennomgår elektrolyse. Voltammetriske data ble båndpassfiltrert ved 0.025–2,000 Hz. Den bakgrunnssubtraherte, tidsoppløste strømmen oppnådd fra hver skanning ga en kjemisk signaturkarakteristikk for analytten, noe som tillot separasjon av dopamin fra andre stoffer 49. Dopamin ble isolert fra det voltammetriske signalet ved kjemometrisk analyse ved bruk av et standard treningssett 25 basert på elektrisk stimulert dopaminfrigjøring detektert av kronisk implanterte elektroder. Dopaminkonsentrasjonen ble estimert basert på den gjennomsnittlige postimplantasjonsfølsomheten til elektrodene 25. Før analyse av gjennomsnittlig konsentrasjon ble alle data utjevnet med et 5-punkts innenfor forsøkets løpende gjennomsnitt. Dopaminkonsentrasjonen ble gjennomsnittlig over syv sekunder (omtrentlig varighet av det observerte fasiske signalet) etter den operante responsen (etterrespons) eller den ikke-betingede presentasjonen av CS, og ble sammenlignet med den gjennomsnittlige konsentrasjonen over de to sekundene før den operante responsen (baseline). CS ble presentert ikke-betinget under alle opptaksøkter som ble gjennomført i den andre og tredje uken (to ganger per økt i 20 sekunder hver), men ikke i løpet av den første uken for å unngå interferens med den assosiative betingingen mellom medikamentlevering og signalet i en periode hvor denne assosiasjonen antagelig fortsatt var under utvikling.
Statistisk analyse
Individuelle elektrokjemiske signaler ble gjennomsnittsberegnet over selvadministrasjonsøkten, og deretter på tvers av dyr og uker, for å øke den statistiske styrken. Signalene ble sammenlignet ved hjelp av multivariate ANOVA-er med respons, hjerneområde, kokaininntak og uke som faktorer. For sammenligning med elektrokjemiske data ble atferdsdata også gruppert i uker. For L-DOPA-eksperimenter ble atferdsdata (gjennomsnittsberegnet over dager hvis administrert på sammenhengende dager) for en respektive medikamentell behandling (ingen behandling, L-DOPA-dose eller vehikkel) analysert ved hjelp av multivariate ANOVA-er med medikamentell behandling, treningsregime, kokaininntak og uke som faktorer. Ved signifikante hovedeffekter eller interaksjoner ble det utført post-hoc-analyser og P- verdier ble justert i henhold til Holm-Bonferroni-korreksjonsmetoden for multippel testing 50. Plott ble laget ved hjelp av Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS, versjon 17.0 (Chicago, IL, USA) og Prism. Dataene er passende for parametrisk statistisk analyse. Datainnsamling og -analyse ble ikke utført blindt for forholdene i eksperimentene.
Histologisk verifisering av opptakssteder
Etter avsluttet forsøk ble dyrene bedøvet med en intraperitoneal injeksjon av ketamin (100 mg / kg) og xylazin (20 mg / kg). Hos dyr med elektrodeimplantater ble registreringssteder merket med en elektrolytisk lesjon (300 V) før transkardiell perfusjon med saltoppløsning etterfulgt av 4% -paramidaldehyd. Hjernene ble fjernet og etterfiksert i paraformaldehyd i 24 timer og deretter raskt frosset i et isopentanbad, skåret på en kryostat (50-μm koronalseksjoner, -20 ° C) og farget med cresylviolett for å hjelpe til med visualisering av anatomiske strukturer og elektrode-induserte lesjon- eller infusjonssteder.
Tilleggsmateriale
1
8
9
10
11
2
3
4
5
6
7
Erkjennelsene
Vi takker Scott Ng-Evans, Christina Akers Sanford, Chad Zietz, Nicole Murray og Daniel Hadidi for teknisk støtte, og Monica Arnold og Jeremy Clark for nyttig tilbakemelding. Dette arbeidet ble støttet av Tyskforskningsstiftelsen (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG) Grant WI 3643 / 1-1 (IW), priser fra Alcohol and Drug Institute (PEMP) og Provost ved University of Washington (PEMP) og National Institutes av helseforsikringer T32-DA027858 (LMB), F32-DA033004 (PAG), P01-DA015916 (PEMP), R21-DA021793 (PEMP) og R01-DA027858 (PEMP).
Fotnoter
Forfatterbidrag
IW og PEMP designet forskning, IW, LMB og PAG utførte forskning, og IW analyserte data; IW og PEMP skrev papiret.
Forfatterinformasjon
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Referanser