Tilstrekkelig bruk av Mesolimbic Dopamin Neuron Stimulering for Progression to Addiction (2015)

Introduksjon

Avhengighet er en sykdom som utvikler seg i flere trinn (Everitt et al., 2008, George et al., 2014). Diagnosen stilles når fritidsbruk blir tvangsmessig, vedvarende til tross for negative konsekvenser. Mens en ledende avhengighetshypotese antyder at misbruksmedisiner forårsaker sykdommen fordi de for mye øker konsentrasjonen av dopamin (DA) i hjernen, er det uklart om det å utløse dette systemet er tilstrekkelig til å drive overgangene fra fritidsbruk til avhengighet (Di Chiara og Bassareo, 2007, Volkow og Morales, 2015). Det støttende beviset for DA-hypotesen for legemiddelforsterkning har samlet seg over flere tiår og er avhengig av den første effekten av narkotika. For eksempel reduserer vanedannende medikamenter terskelen for intrakraniell selvstimulering (ICSS) av den mediale forhjernebunken, en fiberkanal som blant annet inneholder stigende DA-projeksjon fra mellomhjernen (Stein, 1964, Crow, 1970, Kornetsky et al., 1979). Farmakologi og lesjonsstudier identifiserte deretter det mesokortikolimbiske DA-systemet som opprinnelsen til denne kretsen (Wise og Bozarth, 1982). På slutten av 1980-tallet bekreftet et direkte mål på den ekstracellulære DA-konsentrasjonen med mikrodialyse at vanedannende medikamenter delte egenskapen til å fremkalle en DA-bølge i NAc (Di Chiara og Imperato, 1988). Dette førte til forslaget om en mekanistisk klassifisering av vanedannende stoffer (Lüscher og Ungless, 2006).

Mye mindre er kjent om hvordan disse første effektene av narkotikabruk letter overgangen til avhengighet. DA-uavhengige mekanismer har blitt vurdert fordi vanedannende legemidler har andre farmakologiske mål. For eksempel binder kokain, i tillegg til å hemme DA-transportøren (DAT), også til SERT (serotonintransportør) og NET (noradrenalintransportør) for å redusere henholdsvis serotonin- og norepinefrinopptak, og øker dermed konsentrasjonen av alle større monoaminer (Han og Gu, 2006, Tassin, 2008). Lignende bekymringer kan gjelde andre psykostimulerende midler. Videre er det et krav om at opiater er, i det minste i den innledende fasen, DA-uavhengige (Badiani et al., 2011, Ting-A-Kee og van der Kooy, 2012). DA-hypotesen har også blitt utfordret basert på genetiske musemodeller, der det etter forstyrrelse med DA-systemet fremdeles var noen former for legemiddeladaptiv atferd. For eksempel, DAT knockout-mus selvadministrerer kokain (Rocha et al., 1998), og avskaffelse av DA-syntese enten farmakologisk (Pettit et al., 1984) eller genetisk (Hnasko et al., 2007) klarte ikke å forhindre medikamentell selvadministrasjon eller betinget sted preferanse. Mens bedre karakterisering av disse transgene musene og generering av doble monoamintransportører knockouts har løst noen av disse problemene (Rocha, 2003, Thomsen et al., 2009), er tilstrekkelig DA til å utløse hovedfunksjoner av avhengighet ukjent. For å omgå spørsmål om ikke-spesifisitet, har vi derfor besluttet å tillate mus å selvstimulere VTA DA-neuroner ved hjelp av en optogenetisk tilnærming.

Nyere studier har vist at aktivering av DA-neuroner i mellomhjernen kan indusere stedspreferanser (Tsai et al., 2009) eller forsterke instrumental atferd (Adamantidis et al., 2011, Witten et al., 2011, Kim et al., 2012, Rossi et al., 2013, McDevitt et al., 2014, Ilango et al., 2014). Mens denne selektive aktivering av DA-baner bekrefter intrakraniell selvstimuleringsstudier (ICSS) -studier som ble utført for mer enn 30 år siden for å avgrense belønningssystemet (Fouriezos et al., 1978), kommer de til kort og viser induksjon av adaptiv oppførsel på sent stadium som definerer avhengighet, og identifiserte heller ikke de underliggende nevronale tilpasningene. Her brukte vi optogenetisk manipulasjon ikke bare for å tillate direkte testing av tilstrekkelighetskriteriet for fasetisk DA-signalering i å initiere forsterkning, men også for å teste for overgangen til avhengighet.

En slående observasjon av de senere stadiene av sykdommen er at selv med de mest vanedannende stoffene blir bare en brøkdel av brukerne avhengige (Warner et al., 1995, O'Brien, 1997). Menneskeavhengige vil fortsette narkotikaforbruket til tross for negative konsekvenser (se American Society for Addiction Medicine's “Definition of Addiction,” DSM5, American Psychiatric Association, 2013), vanligvis relatert til sosiale og psykologiske nederlag som ofte blir forsinket i tide. Tilsvarende blir omtrent ett av fem dyr som får selvadministrering av kokain til slutt klassifisert som avhengige hos gnagere (Deroche-Gamonet et al., 2004, Kasanetz et al., 2010; men se George et al., 2014). Utholdenhet av legemiddelinntak til tross for negative konsekvenser kan også modelleres hos gnagere ved å innføre en enkel aversiv stimulans til forbruksplanen. Mens menneskers sykdom er mer kompleks, er det å forbinde straff med forbruk en rettferdig modell av en kjernekomponent av avhengighet.

Her brukte vi et mildt fotstøt for å evaluere dens konsekvens på selvadministrasjon av kokain, sukrose og optogenetisk selvstimulering. Vi undersøker ytterligere om DA neuron selvstimulering kan fremkalle to avhengighetsrelaterte atferd-cue-assosiert belønningssøk og tvangsmessig forbundet med forbruk til tross for negative konsekvenser - og karakteriserer den nevrale plastisiteten forbundet med disse atferdene.

Resultater

For å kontrollere DA-nevronaktiviteten injiserte vi et Cre-induserbart adeno-assosiert virus (AAV) med en dobbeltflokset invertert åpen leseramme (DIO) som inneholdt ChR2 fusjonert med forbedret gult fluorescerende protein (eYFP) (Atasoy et al., 2008, Brown et al., 2010) inn i VTA-en til DAT-Cre-mus. I tillegg ble en optisk fiber plassert for å målrette VTA-en ( ChR2 , se eksperimentelle prosedyrer ). Spesifisiteten til ChR2- ekspresjonen ble bekreftet ved kolokalisering av eYFP med tyrosinhydroksylase (TH), et enzym som kreves for DA-syntese ( figur 1 A).

For å etablere laserstimuleringsprotokollen ble musene plassert i en operant boks hvor de kunne trykke på en aktiv spak, som utløste en rekke laserstimuleringer som ble variert (1, 2, 8, 32, 60 eller 120 bursts) annenhver økt. For å etterligne et fasisk avfyringsmønster (Hyland et al., 2002, Mameli-Engvall et al., 2006, Zhang et al., 2009), vanligvis indusert av naturlig belønning (Schultz, 1998), brukte vi burst-stimulering. Ett burst besto av fem laserpulser på 4 ms, ved 20 Hz, og ble gjentatt to ganger per sekund. Vi fant at musene tilpasset sin spaktrykkatferd som en funksjon av bursts per laserstimulering, og dermed kontrollerte det totale antallet mottatte bursts ( figur 1 B). Denne atferden minnet om selvadministrasjon av vanedannende legemidler, når dosen per infusjon ble variert (Piazza et al., 2000). For de påfølgende eksperimentene valgte vi å administrere 30 utbrudd per spaktrykk, noe som ga et halvt maksimalt antall utbrudd ( figur 1 B). For å etterligne forsinkelsen i DA-økning som vanligvis observeres når legemidler administreres intravenøst ​​(Aragona et al., 2008), forsinket vi laserstimuleringen med 5 sekunder og la til et blinkende signallys i 10 sekunder ( figur 1 C).

I løpet av 12 sammenhengende dager fikk musene muligheten til å selvstimulere maksimalt 80 ganger i løpet av 2 timer. Musene økte raskt hastigheten på laserstimuleringen og nådde 80 laserstimuleringer (LS) før slutten av den første timen av en økt ( figur 1 D og 1 E). Skillet mellom den aktive og inaktive spaken ble raskt tilegnet, og antallet aktive spaktrykk økte tilsvarende med økende faste forholdsregler (FR1, 2, 3) ( figur 1 F og 1 G). I kontrolleksperimenter med DAT-Cre−-mus eller mus som uttrykte ChR2 i γ-aminosmørsyre (GABA)-nevroner (GAD-Cre+-mus, for å målrette de hemmende nevronene til VTA), var selvstimuleringsratene lave og reduserte kontinuerlig på tvers av øktene. Dette gjaldt også for to Cre+-dyr der post hoc-validering viste at VTA ikke var infisert med ChR2-eYFP (ikke vist). Dessuten ble det ikke oppdaget noen forskjell mellom den aktive og inaktive spaken ( figur S1 A og S1B).

Vi observerte at DAT-Cre+ mus presset oftere på den aktive spaken enn nødvendig for laserstimuleringen. Faktisk utgjorde slike "forgjeves" aktive spaktrykk mer enn 30 % av alle aktive spaktrykk ( figur S2 A) og forekom – etter hvert som øktene utviklet seg – hovedsakelig mellom signalet og laserstimuleringens start ( figur S2 B og S2C). Denne enestående oppførselen utviklet seg under tilegnelsen og kan gjenspeile impulsive responser.

Samlet sett forsterker bruddaktiviteten i VTA DA-neuroner sterkt spaken.

Okklusjon av VTA DA Neuron selvstimulering av kokain

For å teste om VTA DA-nevroners selvstimulering er avhengig av de samme hjernekretsene som er målrettet av avhengighetsskapende stoffer for å forsterke atferd, injiserte vi kokain intraperitonealt (ip) rett før selvstimuleringsøkter (fri tilgang til laser i 45 minutter, figur 2 A). Ved baseline presset veltrente dyr omtrent 400 ganger for å oppnå 85 LS på 45 minutter under FR3-skjemaet. Etter kokaininjeksjon falt ytelsen betydelig på en doseavhengig måte til omtrent 30 LS for 100 spaktrykk med den høyeste dosen ( figur 2 B). Denne okklusjonen var mest uttalt i løpet av de første 30 minuttene av økten, noe som gjenspeiler farmakokinetikken til stoffet ( figur 2 C). Dette eksperimentet indikerer at forsterkning ved optogenetisk selvstimulering og forsterkning ved kokain deler underliggende nevrale kretser.

For å sammenligne optogenetisk selvstimulering ytterligere med avhengighetsskapende legemidler, spurte vi deretter om mus ville falle tilbake til selvstimulering av VTA DA-nevroner etter flere uker med abstinenser. Siden signalassosiert medikamentsøking er en etablert modell for tilbakefall (Epstein et al., 2006, Soria et al., 2008, Bossert et al., 2013), plasserte vi musene tilbake i operantkammeret 30 dager etter den siste selvstimuleringsøkten, hvor aktiv spaktrykking nå utløste signallyset uten laserstimulering ( figur 3 A). Robust signalassosiert søkeatferd, demonstrert av en høy andel aktive spaktrykk, var bare tydelig hos mus med uttrykk av eYFP- ChR2 i VTA DA-nevroner (DAT-Cre+ men ikke DAT-Cre− mus, figur 3 B).

Tidligere studier har vist årsakssammenhengen mellom signalassosiert tilbakefall og synaptisk plastisitet fremkalt av kokain i en subtype av NAc-nevroner som uttrykker DA D1R (Pascoli, Terrier et al., 2014). For å evaluere denne synaptiske plastisiteten genererte vi derfor DAT-Cre-mus krysset med Drd1a-tdTomato -mus for å identifisere subtypen av mellomstore, piggete nevroner (MSN-er) i NAc. I stedet for søketesten ble det fremstilt skiver av NAc der D1R-MSN-ene var røde, i kontrast til grønne fibre fra VTA DA-nevroner infisert med flox-ChR2-eYFP ( figur 3 C). Helcelle patch-clamp-opptak ex vivo avslørte et likeretterspenningsforhold for AMPAR-fremkalte postsynaptiske strømmer (AMPAR-EPSC-er) og et økt AMPAR/NMDAR-forhold ( figur 3 D og 3E), i D1R-MSN-ene, men ikke i D2R-MSN-ene. Lignende funn som tidligere ble oppnådd etter abstinens fra selvadministrasjon av kokain, viste seg å indikere kombinert innsetting av GluA2-manglende og GluA2-holdige AMPAR-er, ved separate innganger på D1R-MSN-er (Pascoli, Terrier et al., 2014).

Selvstimulering til tross for straff

Rusmiddelbruk til tross for negative konsekvenser er et annet avgjørende definerende trekk ved avhengighet (se DSM5-definisjonen, American Psychiatric Association, 2013). Rottemodeller er etablert (Deroche-Gamonet et al., 2004, Pelloux et al., 2007, Pelloux et al., 2015, Chen et al., 2013) der et elektrisk støt introdusert i kokain-selvadministreringsplanen undertrykker kokainforbruket hos noen dyr. Etter 12 dager med initial eksponering (tilegnelse) fikk musene ha tre ekstra økter ved FR3, men med en redusert øktgrense (60 min eller maksimalt 40 belønninger). Disse tre øktene fungerte som en grunnlinje for de påfølgende fire øktene, der hver tredje laserstimulering ble paret med et fotsjokk (500 ms; 0.2 mA) forutsagt av en ny ledetråd ( figur 4 A). Intensiteten og varigheten av fotsjokket ble justert for å fullstendig undertrykke spakpressing for sukrosebelønning (se også data nedenfor). Straffeplanen førte til to motsatte atferdsresponser ( figur 4 B). Noen mus sluttet raskt å reagere da straffen ble introdusert (kalt «sensitive»), mens andre fortsatte å reagere for å oppnå maksimalt antall laserstimuleringer og kan betraktes som «resistente» mot straff. De to klyngene av dyr dukket opp helt på slutten av de fire straffeøktene ( figur 4 C). «Resistente mus» opprettholdt antall laserstimuleringer (mindre enn 20 % reduksjon), mens «sensitive mus» reduserte selvstimuleringen med mer enn 80 %. Med disse kriteriene kunne bare ett dyr (grå prikker) ikke tildeles. Denne observasjonen viser at tvungen burst-aktivitet fremkalt av selvstimulering av VTA DA-nevroner er tilstrekkelig til å indusere utholdenhet av forbruk til tross for negative konsekvenser hos en andel av musene. Som en kontroll, i en uavhengig gruppe mus som hadde etablert resistens eller sensitivitet for straffen assosiert med selvstimulering, ble nocisepsjon evaluert ved hjelp av haleflik-analysen. Ingen forskjell i latenstiden for å trekke tilbake halen nedsenket i varmt vann mellom sensitiv og resistent ble oppdaget ( figur S3 ).

Vi spurte deretter, post hoc, om noen spesielle trekk under tilegnelsesfasen av selvstimulering kunne ha forutsagt motstanden mot straff. Sensitive og resistente mus utførte et identisk antall aktive og inaktive spaktrykk under baseline-øktene, og alle musene nådde maksimumet på 80 LS ( figur S4 A og S4B), på omtrent samme tidsperiode ( figur S4 A og S4C). Selv om andelen nytteløse aktive spaktrykk igjen ikke var forskjellig i de to delpopulasjonene ( figur 4 D og S4 D), ble antallet nytteløse spaktrykk før laserstimuleringen startet betydelig høyere hos resistente mus ved slutten av tilegnelsesøktene ( figur 4 E og S4 E). Etter hvert som denne atferden utviklet seg under tilegnelse, kan den, sammen med medfødt impulsivitet (Economidou et al., 2009, Broos et al., 2012, Jentsch et al., 2014), bidra til å etablere motstanden mot straff. I tillegg ble det utført en progressiv ratio-studie på dag 11 for å kvantifisere motivasjonen for den optogenetiske stimuleringen (Richardson og Roberts, 1996). Resistente mus viste et brytningspunkt som ikke var statistisk forskjellig fra sensitive mus ( figur S4 F).

Bestandighet mot straff for kokain, men ikke for sukrose

For å teste om paradigmet med forbruk til tross for skadelige konsekvenser sammen med impulsiv pressing av spaken også kunne forutsi tvangsmessig inntak av et avhengighetsskapende stoff, gjennomgikk en ny kohort av mus 12 dager med selvadministrasjon av kokain. Eksperimentelle parametere for tilegnelse av kokain ble satt til maksimalt 80 infusjoner av kokain innen 4 timer under tilegnelsen og til 40 infusjoner innen 2 timer i løpet av de tre baseline-øktene før de fire straffeøktene ( figur 5 A og S5 A). Igjen dukket det opp to grupper etter å ha paret kokainbelønning med elektriske støt. Faktisk ble 5 av 22 mus klassifisert som resistente (mindre enn 20 % reduksjon fra baseline), mens 17 kvalifiserte som sensitive (mer enn 80 % reduksjon) og ett dyr falt midt imellom (13 infusjoner på dag 19) ( figur 5 B). Vi så deretter etter atferdsprediktorer for motstand mot straff. Mellom de to gruppene var antallet infusjoner, infusjonshastigheten og antallet aktive eller inaktive spaktrykk ikke forskjellig ( figur S5 B–S5D), og bruddpunktene var like ( figur S5 E). Det som var forskjellig var utviklingen av tidsfordelingen av de nytteløse trykkene på den aktive spaken. I de fire første øktene minket nytteløse spaktrykk regelmessig i løpet av time-out-periodene hos både resistente og sensitive mus, mens det bare var sensitive mus som opprettholdt denne oppførselen ved slutten av tilegnelsen ( figur 5 C og 5D og S5 F). Derimot hadde resistente mus en tendens til å øke sitt totale antall nytteløse spaktrykk ( figur 5 C og S5 D), spesielt i den siste fjerdedelen av time-out-perioden ( figur 5 D). Selv om det kvalitativt ligner på observasjonen som tidligere ble gjort med optogenetisk stimulering av DA-nevroner (se ovenfor), ble ikke grupperingen av nytteløse trykk i løpet av den tidlige time-out-perioden observert med kokain, mest sannsynlig på grunn av den langsommere kinetikken som stoffet økte DA-nivåene med. Likevel kan lignende konklusjoner trekkes basert på denne enestående utviklingen av fordeling av nytteløse spakpress i løpet av den korte perioden før «den interne deteksjonen av DA-bølgen». Våre observasjoner antyder dermed at fordelingen av de nytteløse aktive spakpressene predikerer narkotikabruk til tross for negative konsekvenser.

Til slutt gjentok vi eksperimentet med ad libitum-forede mus som kunne bruke spakpress for å få en sukrosebelønning. Når straff ble introdusert, sluttet alle musene å selvadministrere sukrosen ( figur 5 E), noe som viste at denne planen undertrykte inntaket av en ikke-essensiell naturlig belønning, men tillot deteksjon av tvangsinntak av et avhengighetsskapende stoff eller sterk DA-nevronstimulering.

Samlet sett viser disse resultatene at VTA DA-selvstimulering er tilstrekkelig til å indusere tvangsmessighet, noe som vises ved motstanden mot straff hos en undergruppe av mus (68 %). Tilsvarende ble noen mus resistente mot straff etter kokain-SA (23 %), noe som aldri var tilfelle etter sukrose-SA ( figur 5 F).

For å finne hjerneområdet som kan kontrollere beslutningen om å fortsette med selvadministrasjon til tross for negative konsekvenser, overvåket vi først generisk "nevronaktivitet" ved å telle antall nevroner der straffesesjonen utløste uttrykk for den umiddelbare tidlige genet cFos i 15 forskjellige regioner. Mus ble intrakardielt perfusert med PFA 90 minutter etter slutten av den siste straffesesjonen. Kontrollgruppene inkluderte naive dyr, samt mus åket til følsomme eller resistente mus for å kontrollere den mulig forvirrende effekten av antall mottatte støt.

Selv om antallet cFos-positive nevroner var høyest i snitt fra resistente mus sammenlignet med snitt fra naive mus i de fleste av de valgte regionene, dukket det opp to typer responser, hvorav den prelimbiske cortex (PL) og den laterale OFC er eksempler. I PL fant vi en lignende økning av cFos-positive celler hos resistente mus og deres åk-kontroller, mens i OFC var denne økningen bare tydelig hos de resistente og ikke de tilsvarende åk-musene ( figur 6 A og 6B). For å kvantifisere denne forskjellen ble alle data først normalisert til uttrykksnivåer hos naive dyr. Deretter ble forholdet beregnet mellom resistent over sensitiv delt på åk-til-resistent over åk-til-sensitiv (forhold _cfos = (R/S) / (YR/YS), figur 6 B). Denne prosedyren identifiserte den cingulate cortex, OFC og VTA som regionene som aktiveres hos resistente, men ikke hos sensitive mus, og hvor det var liten forskjell i begge gruppene av åk-kontroller (lignende lav-cFos-positive nevroner hos åk-kontroller, faktisk). Det er ikke overraskende å finne VTA, ettersom det er regionen med laserstimulerte nevroner. Dette er i tråd med en tidligere rapport som viser at ChR2-stimulering utløser cFos-aktivering (Lobo et al., 2010, Van den Oever et al., 2013). En lav _cfos- ratio ble funnet i regioner der aktiveringen var lik hos sensitive og resistente (som CeA og PAG). Forholdet _cfos var også lavt når aktiveringen ble parallelt med en høy forskjell i de åkbaserte kontrollene (som PL, figur 6 C for oppsummerte _cfos- ratiodata). En lignende cFos-ekspresjon hos resistente og åkresistente mus var derfor mest sannsynlig drevet av antall fotsjokk og hadde lite å gjøre med motstanden mot straff. Samlet sett antyder den høye _cfos- ratioen i OFC at nevral aktivitet i denne regionen er assosiert med motstand mot straff og dermed kan favorisere overgangen til avhengighet.

For å identifisere substratet for den økte neuronale aktiviteten i OFC hos musene som motsto straff, preparerte vi skiver av PL og L-OFC 24 timer etter den siste straffeøkten for å teste for iboende eksitabilitet. De to regionene ble valgt på grunn av deres svært distinkte mønster av c-Fos-ekspresjon i de tidligere eksperimentene. Den neuronale eksitabiliteten ble kvantifisert ved å telle antall aksjonspotensialer (AP) fremkalt ved injeksjon av økende mengder strøm (fra 0 til 600 pA) i helcelleopptak. Disse opptakene viste en vedvarende hypoeksitabilitet i pyramideformede nevroner i PL hos resistente mus (og deres åk-kontroller) sammenlignet med sensitive eller naive mus ( figur 7 A). Hvilemembranpotensialet (RMP) til registrerte nevroner var ikke forskjellig mellom de eksperimentelle gruppene ( figur 7 B). Disse resultatene tyder sterkt på at eksitabiliteten til nevroner i PL korrelerer direkte med antall mottatte sjokk, og kanskje ikke med beslutningen om å motstå straff. Dette gjenspeiler mest sannsynlig en negativ tilbakekoblingstilpasning utløst av neuronal eksitasjon fremkalt av fotstøtene dagen før. I motsetning til dette var nevroner fra L-OFC mer eksiterbare bare hos resistente mus. Eksiterbarheten til nevroner fra mus med åk var ikke forskjellig fra eksiterbarheten til nevroner fra naive mus, noe som utelukker en effekt av selve fotstøtet ( figur 7C og 7D). Denne økte aktiviteten til OFC-nevroner ligger sannsynligvis til grunn for cFos-ekspresjonen og kan drive motstanden mot straff.

For å teste årsakssammenheng mellom økt OFC-nevroneksitabilitet og motstand mot straff, uttrykte vi den hemmende DREADD (designerreseptorer utelukkende aktivert av designerlegemidler: CamKIIα-hM4D) i pyramideformede nevroner i OFC hos DAT-Cre+ mus ( figur 8 A). I ​​akutte snitt fra OFC induserte badepåføring av CNO (klozapin-N-oksid) en langsom utadgående strøm, mest sannsynlig mediert av GIRK-kanaler, som ble reversert av barium (Ba2 ⁺ ), en uspesifikk blokkerer av kaliumkanaler ( figur 8 B). CNO forskjøvet også input/output-kurven til høyre ( figur 8 C). DAT-Cre+ musene infisert med AAV1/CamKIIα-hM4D-mCherry i OFC ( figur 8 D) tilegnet seg DA-nevron-selvstimuleringsparadigme etterfulgt av to påfølgende blokkeringer med straffeplanen, den første i nærvær av CNO og den andre uten CNO. De to blokkeringene ble avbrutt av 6 dager uten straff ( figur 8 E). Ved slutten av den første straffeblokken, i nærvær av CNO, var bare 5 av 16 mus resistente ( figur 8 F, venstre panel). I motsetning til dette, uten OFC-hemming, ble 14 av 16 klassifisert som "resistente" i løpet av den andre straffeperioden ( figur 8 F, høyre panel og 8 G). Med andre ord var andelen resistente mus betydelig lavere i nærvær av CNO sammenlignet med den første kohorten på 34 mus som tidligere ble testet under de samme forholdene (sammenligning mellom grupper, figur 8 H) og ble lik den første kohorten uten CNO (sammenligning innen gruppen). Til slutt, for de ni musene som endret seg fra sensitive til resistente, modifiserte ikke CNO haleslaglatensen ved nedsenking i varmt vann ( figur 8 I).

Samlet sett demonstrerer dette eksperimentet at aktiviteten til OFCs pyramidale nevroner bestemmer seg for å fortsette selvstimulering til tross for negative konsekvenser som representerer et viktig trekk ved overgangen til avhengighet hos gnagere.

Diskusjon 

En nylig foreslått avhengighetsmodell skiller tre trinn i sykdommens progresjon: sporadisk rekreasjonsbruk, etterfulgt av intensivert, vedvarende, eskalert narkotikabruk og til slutt tvangsmessig bruk assosiert med tap av kontroll (Piazza og Deroche-Gamonet, 2013; men se George et al., 2014). Studien vår viser at stimulering av VTA DA-neuroner er tilstrekkelig til å drive denne progresjonen med et relativt raskt tidsforløp.

Ved å etterligne et naturlig forekommende burst-avfyringsmønster, blir en effektiv frigjøring av DA fremkalt i målregioner i VTA, som NAc (Bass et al., 2010). DA-nivåer i NAc styrer derfor sannsynligvis selvstimuleringen, akkurat som gnagere selvadministrerer neste infusjon av kokain eller heroin når DA-konsentrasjonen faller under terskelen (Wise et al., 1995). Dette støttes også av vår observasjon om at kokain, injisert ip, kan okkludere selvstimulering. Dermed ligner DA-neuron selvstimulering tett selvadministrasjon av medisiner, selv om dets kinetikk absolutt er raskere enn noe farmakologisk stoff, inkludert kokain, som antydet av den forskjellige responsfrekvensen som er observert i denne studien.

Mens vi selektivt målrettet mot DA-neuroner i VTA, kan deres optogenetiske selvstimulering ha aktivert grupper av celler med forskjellige fysiologiske funksjoner. For eksempel er det nylig blitt foreslått at noen DA-neuroner koder for aversive stimuli (Lammel et al., 2012, Gunaydin et al., 2014). Disse cellene projiserer til mPFC, mens VTA DA-neuroner som projiserer til lateralt NAc-skall, formidler positiv forsterkning (Lammel et al., 2012). Det ville være interessant å vurdere selvstimulering og progresjon med selektiv målretting (Gunaydin et al., 2014). Siden vår manipulering aktiverte alle VTA DA-neuroner, akkurat som kokain virker på alle DAT-uttrykkende nevroner, kan det tenkes at noen DA-neuroner vil drive forsterkningslæring, mens andre DA-neuroner vil drive aversjonslæring. Nettoeffekten vil fremdeles være en forsterkning av atferden; "Aversjonsneuronene" kan imidlertid bidra til induksjon av en motstanderprosess (Koob, 2013, Wise og Koob, 2014).

Etter tvungen avholdenhet, re-eksponering til konteksten indusert søker etter selvstimulering, en etablert gnagermodell for medikamenttilbakefall. Bemerkelsesverdig er den underliggende nevrale plastisiteten ikke å skille fra den som ble observert etter tilbaketrekning fra kokain selvadministrasjon (Pascoli, Terrier et al., 2014). Dette legger til en studie som tidligere rapporterte identisk synaptisk plastisitet i VTA DA-neuroner fremkalt av en enkelt økt med optisk stimulering eller en første injeksjon av et vanedannende legemiddel (Brown et al., 2010). Et mønster av synaptiske tilpasninger dukker opp som c adaptiv atferd som er vanlig for alle vanedannende stoffer.

Et slående trekk ved studien vår er dikotomien i responsen til en aversiv stimulans som er sterk nok til å forstyrre forbruket av ikke-essensiell naturlig belønning hos alle dyr. I vår setting viste resistente mus ikke signifikant høyere motivasjon for belønningen av selvlevering, som står i kontrast til en studie med kokain hos rotter (Pelloux et al., 2007). Atferdsmessig prediktor for motstand mot straff hos mus, derimot, var nytteløst spakpressing under 5 s forut for begynnelsen av DA-neuronstimulering. Manglende evne til å vente til belønningsleveranse kan derfor sees på som en markør for impulsivitet (Dalley et al., 2011, Olmstead, 2006, Everitt et al., 2008, Winstanley, 2011, Leyton and Vezina, 2014). Vi ble fascinert av observasjonen at impulsiv inntak bare utviklet seg etter flere økter med selvstimulering. Dette reiser muligheten for at motstand mot straff (og som utvidelse sårbarhet for avhengighet) kanskje ikke er fullt medfødt, men utvikler seg i de innledende fasene mot avhengighet. Hvis dette er tilfelle, kan det hende at dikotomi observert av oss og andre (Deroche-Gamonet et al., 2004) ikke bare bestemmes av genetiske faktorer. Dette vil også forklare at en lignende brøkdel av individer blir avhengige av genetisk relativt homogene musestammer og genetisk sikkert mer forskjellige menneskelige populasjoner.

Hvis motstand mot straff avslører den individuelle sårbarheten for avhengighet, anslått til topp 20% hos mennesker selv med kokain (Warner et al., 1995, O'Brien, 1997, George et al., 2014), så er den mye høyere andelen som finnes her kunne gjenspeile kraften til den direkte og selektive DA-neuronstimuleringen. Med andre ord kan selektiv DA-neuronstimulering være mye mer vanedannende enn noe stoff. Dette kan forklares med den ikke-selektive virkningen av farmakologiske stoffer. Når det gjelder kokain, kan for eksempel monoaminer enn DA faktisk forsinke induksjonen av avhengighet. Faktisk kan serotonin motsette seg DA-avhengig adaptiv atferd som å svare for betinget belønning, selvstimulering og betinget stedpreferanse (Wang et al., 1995, Fletcher og Korth, 1999, Fletcher et al., 2002) ved å legge til rette for foreningen av signaler til aversive stimuli (Bauer, 2015, Hindi Attar et al., 2012). Alternativt kan forskjellen ligge i forskjellen i kinetikk mellom optogenetisk selvstimulering og farmakologisk induksjon av ekstracellulær DA-økning. Slike vanedannende potensvariasjoner kan også eksistere blant forskjellige rusmisbrukere (George et al., 2014).

Selv om vi ikke formelt kan utelukke at forskjeller i DA-frigjøring og/eller relativ signalering bidrar til etablering av strafferesistens, er dette scenariet usannsynlig fordi den histologiske valideringen av infeksjonen hos dyrene som var inkludert i studien, viste eYFP-ChR2 -ekspresjon i hele VTA. Dessuten førte den optogenetiske stimuleringsprotokollen som var utformet for å mette DA-frigjøring, til selvstimulering som kulminerte i unimodalt fordelte verdier for bristepunktet, noe som gjenspeiler insentivmotivasjonen.

Et annet overraskende resultat er at antall elektriske fotstøter korrelerer med nervøsitetens nervøsitet i PL. Redusert excitabilitet av pyramidale nevroner og økt AMPAR / NMDAR-forhold i pyramidale nevroner av de samme cellene har blitt observert i "avhengige rotter", men disse studiene kontrollerte ikke effekten av elektriske støt i seg selv (Kasanetz et al., 2010, Kasanetz et al., 2013, Chen et al., 2013). Ikke-dissosiasjonen kan derfor forklares med den doble rollen til mPFC i både beslutningsprosesser og fryktintegrasjon (Peters et al., 2009). For det omvendte korrelerer endring i excitabilitet av pyramidale nevroner i infralimbisk cortex med fotsjokk (Santini et al., 2008). Dette beviset utelukker ikke muligheten for at mPFC spiller en fremtredende rolle for beslutningen om inntaksforfølgelse. Imidlertid peker vår cFos-analyse og observasjoner av indre opphisselse mot OFC og cingulate cortex. Videre forhindret inhibering av neuronal eksitabilitet i OFC med DREADD motstand mot straff. Denne årsakssammenhengen representerer et viktig skritt i å forstå de cellulære mekanismene som er ansvarlige for overgangen til avhengighet. Fremtidige studier vil være nødvendig for å teste om dette også gjelder hele spekteret av vanedannende stoffer.

Våre funn er i tråd med observasjoner om at en dysfunksjon av OFC kan svekke kostnads-nytte-beslutningstaking (Seo og Lee, 2010, Walton et al., 2010, Fellows, 2011) og kan føre til tvangsmessig atferd (Burguière et al., 2013 ). Hos mennesker har narkotikamisbruk vært knyttet til nedsatt beslutningstaking og endret OFC-funksjon (Lucantonio et al., 2012, Gowin et al., 2013). Samlet fremstår aktiviteten til OFC-neuroner som en nøkkelbestemmende faktor for overgangen til tvangsmessig narkotikabruk (Everitt et al., 2007). Dette utelukker ikke en rolle for stoff-fremkalt plastisitet hos eksitatoriske afferenter på MSNs observert her og i andre studier (Kasanetz et al., 2010). Det vil være interessant å evaluere om manipulasjoner som tar sikte på å kontrollere OFCs spenning påvirker motivasjonen hos narkomane.

Her foreslår vi DA-neuron selvstimulering som en kraftig modell for å studere stadiene som fører til avhengighet. Vi gjengir kjernekomponenter av narkotikamisbruk, for eksempel tilbakefall, synaptisk plastisitet og utholdenhet av forbruket til tross for negative konsekvenser. Selv om modellen absolutt ikke er egnet til å studere effekter som er spesifikke for et gitt legemiddel (f.eks. Sammenligne opioid med psykostimulerende midler), har den flere fordeler. Det muliggjør en presis tidsmessig kontroll av belønningsleveransen, det er veldig spesifikt å aktivere bare VTA DA-nerveceller, og sist men ikke minst, det gir muligheten for å studere mus i mye lengre tid enn med medisinens selvadministrasjon. Ved å fokusere på den definerende fellesskapet til vanedannende stoffer, er håpet å oppklare nevrale mekanismer som ligger til grunn også ikke-avhengige former for avhengighet (Alavi et al., 2012, Robbins og Clark, 2015) og dermed bidra til en generell teori om sykdommen. Optogenetiske sykdomsmodeller tillater således et avgjørende skritt for en grundig forståelse av nevronell dysfunksjon involvert i sene stadier av avhengighet og vil lede nye, rasjonelle behandlinger for en sykdom som for tiden ikke er kur.

VP, JT og AH utførte atferdseksperimentene mens VP gjorde elektrofysiologiske opptak og koordinert analysen. Studien ble designet og skrevet av alle forfattere.

Arbeidet ble støttet av tilskudd fra den sveitsiske nasjonale fondet og ERC avanserte tilskudd (MeSSI), Carigest SA, Genèves fagforening og Fondation Privée des Hopitaux Universitaires de Genève. JT er en MD-PhD student betalt av Sveitsiske Forbundet.

Dokument S1. Supplerende eksperimentelle prosedyrer og figurer S1-S6

Tabell S1. Statistiske analyser