PLOS One. 2014 Jul 29; 9 (7): e102524. doi: 10.1371 / journal.pone.0102524. eCollection 2014.
Abstrakt
Kronisk kokaineksponering hos både menneskelige rusavhengige og i gnagermodeller avhengighet reduserer prefrontal kortikal aktivitet, som deretter disregulerer belønningsbehandling og utøvende funksjon av høyere orden. Nettoeffekten av denne svekkede oppførselen til portene er økt sårbarheten for tilbakefall. Tidligere har vi vist at kokainindusert økning i hjerneavledet nevrotrofisk faktor (BDNF) -uttrykk i den mediale prefrontale cortex (PFC) er en neuroadaptiv mekanisme som blunker den forsterkende effekten av kokain. Ettersom BDNF er kjent for å påvirke neuronal overlevelse og synaptisk plastisitet, testet vi hypotesen om at avholdenhet fra selvadministrasjon av kokain ville føre til endringer i nevronal morfologi og synaptisk tetthet i PFC. Ved å bruke en ny teknikk, matriotomografi og Golgi-farging, ble morfologiske forandringer i rotte-PFC analysert etter 14 dager med selvadministrasjon av kokain og 7 dager med tvungen avholdenhet. Resultatene våre indikerer at generell dendritisk forgrening og total synaptisk tetthet er betydelig redusert i rotte-PFC. I kontrast er tettheten av tynne dendritiske ryggrader betydelig økt på pyramidale nevroner i lag V i PFC. Disse funnene indikerer at dynamiske strukturelle forandringer oppstår under avholdenhet av kokain som kan bidra til den observerte hypoaktiviteten til PFC hos kokainavhengige individer.
Introduksjon
Endringer i strukturell plastisitet i belønningskretsene foreslås å være viktige mekanismer som bidrar til kokainens kraftige evne til å opprettholde narkotikasøkende atferd (gjennomgått i [1]). Tidligere studier har vist en økning i dendritisk arborisering og ryggetetthet i nucleus accumbens (NAc) [2]-[4], ventral tegmental område [5], og den prefrontale cortex (PFC) [6] etter eksponering for kokain. Mens de fleste studier har fokusert på strukturelle endringer assosiert med den dysfunksjonelle aktiviteten til NAc, har betydelig færre studier undersøkt endringene i PFC. Flere bevislinjer demonstrerer dysfunksjon av PFC etter kronisk kokaineksponering hos begge menneskelige rusavhengige [7], [8] og i gnagermodeller avhengighet [9], [10]. Derfor er det å karakterisere de strukturelle endringene som skjer i PFC relevant for å forstå molekylære hendelser som ligger til grunn for avhengighet.
PFC regulerer impulskontroll og beslutningstaking og spiller dermed en viktig rolle i individets evne til å kontrollere atferd, spesielt i narkotikaavhengighet [8], [11]. For eksempel, hos individer som er avhengige av kokain, er redusert aktivering av prefrontal cortex assosiert med tilbaketrekning av medikamenter og forstyrret utøvende svar av høyere orden [7], [8], som kan forbedre sårbarheten for tilbakefall. Hos gnagere er økt nevronal aktivitet i PFC assosiert med kokaininntak [9], [10], tvangsmessig stoffsøkende oppførsel [12], og gjeninnføring av kokain etter tilbaketrekning [13]-[15]. I tillegg blir membranbistabilitet avskaffet i PFC etter kronisk kokainadministrasjon [16]. Til slutt blir medikamentindusert metabolsk aktivitet i PFC sløvet i rotter administrert en utfordringsinjeksjon under tilbaketrekning fra selvadministrasjon av kokain [9], [17]. Til sammen indikerer disse studiene at kronisk kokain induserer dyptgripende funksjonelle endringer i PFC som kan være assosiert med en økning i antall hemmende synapser og / eller en reduksjon i eksitatoriske synapser i PFC. Imidlertid er ikke de morfologiske endringene som skjer i PFC etter kronisk medisinbruk blitt belyst.
I denne studien prøvde vi å undersøke om avholdenhet fra kokain fører til strukturelle endringer i PFC. Morfologiske endringer ble undersøkt ved bruk av en tradisjonell metode, Golgi-farging, samt en ny teknikk, matrittomografi. Arraytomografi er en unik metode som kombinerer seksjonering av ultratinvev med immunofluorescens og tredimensjonal bildekonstruksjon for å tillate nøyaktig kvantifisering av total og sub-type spesifikk synapstetthet [18], [19]. Ved å bruke disse metodene indikerte resultatene våre betydelig plastisitet i rotte-PFC som respons på avholdenhet fra kokain.
Materialer og metoder
Dyr og boliger
Sprague-Dawley hannrotter (Rattus norvegicus) som veier 250–300 g ble oppnådd fra Taconic Laboratories (Germantown, NY). Dyr ble individuelt innredet med mat og vann tilgjengelig ad libitum i deres bur. De eksperimentelle protokollene var i samsvar med retningslinjene utgitt av US National Institutes of Health og ble godkjent av Perelman School of Medicine ved University of Pennsylvania og University of Pennsylvania's Institutional Animal Care and Use Committee.
Kirurgi
Før operasjonen ble rottene bedøvd med 80 mg / kg ketamin og 12 mg / kg xylazin (ip; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Et innbyggende silastisk kateter (indre diameter 0.33 mm, ytre diameter 0.64 mm) ble satt inn i den høyre halsvene og suturert på plass. Kateteret ble deretter ført subkutant over skulderbladet og ført til en mesh bakplattform (CamCath, Cambridge, Storbritannia) som ble suturert under huden rett over scapulae. Katetrene ble skylt daglig med 0.3 ml av antibiotikumet Timentin (ticarcillin dinatrium / kaliumklavulanat, 0.93 mg / ml; Henry Schein, Melville, NY) oppløst i heparinisert saltoppløsning (10 U / ml). Katetrene ble forseglet med plastiske obturatorer når de ikke var i bruk.
Kokain selvadministrasjon
Rotter fikk 7 dager til å komme seg etter operasjonen før kokainens egenadministrasjon startet. Rotter ble tilfeldig tildelt en av to grupper: kokain, selvadministrerende dyr og åk saltoppløsning. Hver rotte som ble opplært til å svare på betingede kokaininfusjoner, ble parret med en åk som fikk samme antall og det tidsmessige infusjonsmønsteret som det selv administrerte av den parvise kokaineksperimentelle rotten. Spakpressing for saltvoksede rotter hadde ingen planlagte konsekvenser.
Opprinnelig ble kokaineksperimentelle rotter plassert i de modulære operantkamrene (Med Associates, St. Albans, VT) og fikk lov til å gi trykk for intravenøs kokaininfusjon (0.25 mg kokain / 59 µl saltoppløsning, infusjon over 5 s) på en fast- ratio 1 (FR1) plan for forsterkning. Når en kokaineksperimentell rotte oppnådde minst 20 infusjoner med kokain i en enkelt operantsession under FR1-planen, ble responskravet byttet til et FR5-armeringsskjema. For å svare på begge fastforholdsplanene, var det maksimale antallet kokaininfusjoner begrenset til 30 per daglig selvadministrasjonsøkt, og en 20-tidsperiode fulgte hver kokaininfusjon, i løpet av hvilken periode aktive spakresponser ble tabulert, men hadde ingen planlagte konsekvenser . Daglige 2 h operantøkter (7 dager / uke) ble gjennomført i totalt 14 dager. Svar som ble gitt på den inaktive spaken, som ikke hadde planlagte konsekvenser, ble også registrert under både treningsøktene FR1 og FR5.
Etter 14th daglig operantøkt, kokaineksperimentelle og åkede saltvannskontrollrotter ble returnert til hjemmeburene deres der de gjennomgikk 7 dager med tvangsinnhold. På 7th dag med avholdenhet av kokain, hjerner ble fjernet og PFC ble dissekert på is. Syv dager med kokainavhold ble valgt for å trekke direkte sammenligning med vår tidligere publiserte studie som undersøkte kokaininduserte endringer i PFC BDNF-uttrykk [20].
drypp
Rotter ble bedøvet (100 mg / kg, ip natrium pentobarbital) og perfusert med iskald 4% paraformaldehyd i 0.1 M PB, pH 7.4 (PFA). En hjernehalvdel fra hver hjerne ble brukt til golgi-farging og den andre halvkule for arraytomografi. Array-halvkuler ble postfiksert i 4% PFA med 2.5% sukrose i 2 timer og Golgi-halvkuler ble postfiksert i 48 h i 4% PFA.
Array Tomography
Arraytomografieksperimenter ble utført som tidligere beskrevet [19], [21]. Kort fortalt ble PFA-fast vev innebygd i harpiks og koronale (70 nm) seksjoner på nivået av mPFC ble kuttet og samlet som et bånd. Bånd ble hydrert i 50 mM glycin i Tris og blokkert i blokkerende løsning (0.05% Tween / 0.1% bovint serumalbumin i Tris-buffer (50 mM Tris / 150 mM NaCl, pH 7.6). Båndene ble farget med primære antistoffer, GADXNX ( Chemicon), PSD65 (Cell Signaling) eller synaptophysin (Abcam), i blokkerende løsning over natten ved 95 ° C. Bånd ble vasket med Tris-buffer og farget med sekundære antistoffer ved 4![[forhold]](http://www.ncbi.nlm.nih.gov/corehtml/pmc/pmcents/x2236.gif)
50 i blokkerende løsning (geit anti-mus Alexa-mel 488 og geit anti-rabbit cy3 eller esel anti-rabbit cy5). Bånd ble motfarget med DAPI for å gjøre det lettere å finne de samme stedene på hver seksjon. Fliseskanningsbilder ble samlet ved bruk av et Zeiss AxioImager Z2 epifluorescensmikroskop. Bilder fra det samme nettstedet på hver av 20 – 30 serielle seksjoner per bånd ble anskaffet på 63x med automatiserte programmer spesialisert for array-tomografi.
Array Tomography Analyse
Seriellbildene fra hvert bånd ble åpnet i rekkefølge, konvertert til en stabel og justert med plugins MultiStackReg og StackReg (med tillatelse fra B. Busse ved Stanford University og [21], [22]. Avlingskasser (19.5 umx19.5 um) ble brukt til å velge regioner av interesse (ROI) i nevropilen for kvantifisering. Utvelgelser måtte ekskludere nevrale cellelegemer eller andre skjulte funksjoner. For automatisert bildeanalyse ble vekster av interesse (eller ROI) for synaptophysin, glutaminsyre-dekarboksylase-65 (GAD65) og PSD95 automatisk terskelverdige med henholdsvis automatiserte algoritmer i ImageJ. Avlinger ble kodet og analysen ble kjørt blind for tilstand. Et automatisert, terskelbasert deteksjonsprogram for å kvantifisere antall puncta identifisert som positive synapser ble brukt som tidligere beskrevet [23]. Tettheter av presynaptiske terminaler, eksitatoriske postsynaptiske terminaler og prosentandelen av GAD-positive (hemmende) synapser ble beregnet fra et gjennomsnitt av 75 prøvesteder per dyr samlet fra to forskjellige vevsblokker fra PFC (n
=5 kokainbehandlet, 5 saltvannsbehandlede dyr) for totalt 29,154 postsynaptisk puncta og 53,565 presynaptisk puncta fra 818 prøvetakingssteder over 5 saltvannsbehandlede dyr og 29,662 postsynaptiske og 17,034 presynaptiske puncta fra 588 prøvetakingssteder over 5 prøvetakingsdyr over XNUMX. Medianverdiene for synapstetthet og prosentandelen hemmende synapser per dyr ble beregnet, og t-tester ble kjørt ved bruk av dyremedianene for å teste om det var en forskjell mellom gruppemiddel.
Rapid-Golgi-metoden
Golgi-farging i ett snitt ble utført som beskrevet tidligere [24], [25]. Kort fortalt ble mPFC fra en halvkule av hvert dyr kuttet i 100 um koronale seksjoner og etterfiksert i 1% osmiumtetraoksyd etterfulgt av tre vasker i 0.1 M PB, pH 7.4. Seksjonene ble inkubert i 3.5% kaliumdikromat over natten, vasket kort og infiltrert med 1.5% sølvnitrat ved sandwich-metoden [25]. Seksjonene ble montert på gelatinbelagte lysbilder med 20% sukrose og dehydrert gjennom en serie alkoholkonsentrasjoner fulgt av avfetting i xylen og dekkglass.
Golgi-analyse
Golgi-lysbilder ble kodet og analysert blind for tilstand og alle analysert av samme eksperimentator. Neuronale bilder og sporinger og representative bilder av dendritiske ryggrader ble samlet ved bruk av et stående BX51-mikroskop med et integrert motorisert stadium (Prior Scientific, Rockland, MA) med et 20 × 0.7 NA-mål. For dendritisk forgreningsanalyse ble 7 nevroner valgt for analyse per dyr. Vi målte nevrittlengde og kompleksitet ved å bruke henholdsvis makroene NeuronJ og Advanced Sholl Analyse. Antall kryss (grenpunkter) i konsentriske sirkler ved radier mellom 5 – 250 um (inkludert basale og apikale dendritter) ble målt og sammenlignet mellom gruppene. For ryggetetthetsanalyse ble 4 – 5-segmenter på minst 20 um i lengde fra tredje ordens basale dendriter analysert per nevron fra 5 – 7 nevroner per dyr ved bruk av et Zeiss AxioImager Z2 epifluorescensmikroskop med et 63x olje-immersjonsmål. Ryggradsmorfologi ble klassifisert som beskrevet tidligere [26]. Lineær ryggetetthet for hvert dendritisk segment og ryggmorfologi (tynn, stubby, sopp, koppformet) av hver ryggrad ble sammenlignet mellom gruppene. Open source-programvare fra National Institutes of Health (ImageJ) ble brukt til analyse av Golgi og matografitomografi.
Resultater
Avholdenhet fra kokain reduserer total synapstetthet
Arraytomografi ble brukt til å måle forandringer i både eksitatoriske og hemmende synapser for å bestemme de spesifikke morfologiske endringene som oppstår i PFC som respons på avholdenhet fra kokain selvadministrering. Arraytomografi er en høygjennomstrømningsmetode som muliggjør nøyaktig kvantifisering av totale, hemmende og eksitatoriske synapser i strukturer som er for små til å bli identifisert eller lokalisert med tradisjonelle konfokale mikroskopimetoder. [19]. Siden både hemmende og eksitatoriske synapser er essensielle komponenter i medisin belønningskretsløpet [13], [27], [28] Vi brukte denne nye metodikken for å vurdere morfologiske endringer i PFC under avholdenhet fra kokain. Sytti nm PFC-seksjoner fra en hjernehalvdel av 5 åk-saltvann og 5 kokainopplevde rotter ble farget med antistoffer mot PSD95, en postsynaptisk eksiterende markør, synaptophysin, en presynaptisk markør og GAD65, som merket hemmende nevroner og synapser. Synapstettheter og prosentandelen av inhiberende synapser ble bestemt i kortikalt lag V (Figur 1A og 1B). Resultatene våre indikerer at under avholdenhet fra kokain var det en betydelig reduksjon i synaptofysintetthet (Figur 1C), som måler alle presynaptiske terminaler [t (7)=2, p <0.05]. Det var ingen signifikant reduksjon i eksitatorisk synapsetetthet [t (8)=0.48, s=0.32] målt ved å telle PSD95 puncta (Figur 1D). Interessant nok var det en ikke-signifikant trend mot en økning i prosentandelen av GAD65-positive hemmende synapser [t (8)=−1.39, s=0.9] (Figur 2E).
Avholdenhet fra kokain reduserer dendritisk forgrening, mens den forbigående øker ryggetettheten i PFC
Golgi-metoden ble brukt for å undersøke endringer i nevronforgrening og dendritisk ryggetetthet for å bekrefte ultrastrukturelle forandringer observert i synapstetthetFigur 1). Vi utførte hurtig seksjon av Golgi-impregnering med en seksjon på en undergruppe av nevroner i PFC fra de andre halvkule av de samme dyrene som ble brukt til studier av arktomografi. Dendritisk forgrening, antall dendritiske ryggrader og ryggmorfologi ble vurdert. To representative pyramidale nevroner fra PFC av en ok-saltvannskontroll og en kokaineksponert rotte er vist i Figur 2A. Sholl-plottet målte antall kryss (grenpunkter) i konsentriske sirkler ved radier mellom 5 – 250 um. Resultatene våre viser at etter 7 dager med tvungen avholdenhet fra selvadministrasjon av kokain var det en betydelig reduksjon i dendritisk kompleksitet (Figur 2B). To-veis gjentatte målinger ANOVA-analyse av data om sholl-plott avslørte betydelige hovedeffekter av behandlingen [F(1,738)=30.59, p <0.0001] og radius [F(245, 738)=289.6, p <0.0001] (Figur 2B), som bekrefter et tap av dendritter som stemmer overens med tapet av synapser målt i array-studier (Figur 1C). Analyse av andre og tredje ordens basilare dendritter avslørte en signifikant økning i dendritiske ryggrader etter 7 dager med kokainavhold [t (6)=−3.12, p <0.05] (Figur 2D). Mer spesifikt økte avholdenhet fra kokaineksponering antall tynne ryggradsundertyper, mens de ikke hadde noen signifikant effekt på andre undergrupper av ryggraden (Figur 2E), som avslørt av toveis gjentatte målinger ANOVA med hovedeffekter av behandlingen [F(1,30)=11.9, s=0.0017], ryggundertype [F(4,30)=57.7, p <0.0001], og en signifikant behandling x ryggrad undertype interaksjon [F(1, 4, 30)=8.8, p <0.0001].
Diskusjon
I denne studien demonstrerer vi at det er uttalte strukturelle og synaptiske endringer i lag V av PFC etter 7 dager med tvungen avholdenhet fra kokainens selvadministrasjon. Spesifikt er det en signifikant reduksjon i dendritisk forgrening av pyramidale nevroner og et generelt tap i synapstetthet målt ved redusert tetthet av generelle presynaptiske boutoner merket med synaptophysin. Til tross for tap av presynaptisk tetthet, gjennomgikk basale dendritter av lag V-pyramidale nevroner en økning i dendritisk ryggetetthet, spesielt av tynne, plastiske ryggrader. Ettersom vi ikke oppdaget vesentlige endringer i tetthet av PSD95, kan det spekuleres i at nedgang i presynaptiske terminaler, men økning i ryggetetthet kan skyldes en økning i antall multisynaptiske boutoner. I tillegg er det også verdt å merke seg at vi observerte en trend mot økte hemmende synapser i PFC. Siden tynne ryggrader er involvert i plastisitet [29], økningen i disse ryggradene kunne representere kompenserende plastisitet for å opprettholde synaptiske innganger på disse denerverte nevronene som har mistet dendritiske grener.
Tidligere studier viste at kokain øker dendritisk arborisering og ryggetetthet i NAc [2]-[4]. Nylig har Dumitriu et al., 2012 [30] demonstrert at kokain dynamisk endrer proksimale ryggrader i NAc-kjernen og skallet. Spesielt i skallet økte uttaket fra kokain tynne ryggrader, mens det reduserte tettheten av soppryggets rygghode i NAc-skallet [30]. I motsetning til studier av NAc er det bare noen få studier som har undersøkt kokainens effekter på nevronmorfologi i PFC [6], [31]. Våre data stemmer overens med en fersk undersøkelse som viser at kokain induserer en økning i ryggetettheten i PFC [31]. Spesielt mus som hadde en større økning i vedvarende og stabile ryggrader, dvs. ryggrader som er til stede 3 dager etter tilbaketrekking, på apikale dendritter, viste høyere kokainkondisjonert stedspreferansescore og kokainindusert hyperaktivitet [31]. En tidligere studie på PFC-lag II-III-neuroner fra rotte rapporterte verdier på omtrent 3 ryggrad per mikrometer dendritt på både apikale og basale dendritter, et overraskende tett nivå av ryggrader som var modifiserbart av stress [32]. Verdiene våre i kontrollrotter av ∼2 ryggrad / 10 um dendritiske segmenter er lavere, noe som kan skyldes den forskjellige nevrale populasjonen som er analysert (lag V basale dendritter) eller på forskjellen i bildeteknikk. I den foreliggende studien brukte vi hurtig seksjonen Golgi-farging med ett snitt mens iontoforetiske injeksjoner av gult Luciferfargestoff kombinert med konfokal avbildning ble brukt av Radley og kollegene [32] å visualisere nevronal og dendritisk morfologi. I tillegg viser funnene våre også viktigheten av varigheten av avholdenhet fra selvadministrasjon av kokain som fører til strukturelle endringer i hjernen. En tidligere publisert rapport demonstrerte en økning i dendritisk arborisering etter langvarig (24 – 25 dager) tilbaketrekning fra kokain hos hunnrotter [6], i motsetning til vår observerte reduksjon etter 7 dager med tvungen avholdenhet hos hannrotter. Til tross for disse metodologiske forskjellene og forskjellene i forgreningsdata, ble økt antall ryggrader observert i begge studiene, noe som bekreftet storskala omorganisering av kretsløp under kokainavhold. Fremtidige studier vil belyse tidsforløpet for disse hendelsene for å avgjøre om disse strukturelle endringene er forbigående eller varige.
Våre funn indikerer at tvungen avholdenhet fra selvadministrasjon av kokain induserer dynamiske strukturelle endringer og forårsaker synaptisk omorganisering i PFC. Disse resultatene kan forklare hypoaktiviteten i PFC som oppstår som et resultat av gjentatt kokaineksponering [8], [33]. Videre støtter funnene våre tidligere studier som demonstrerer deaktivering av PFC [7], [8], og økt ekstracellulær GABA i medial PFC under tilbaketrekning av kokain [34]. Dermed er mekanismene som står for PFC-hypoaktivitet etter kronisk kokaineksponering [8], [10] kan inkludere (1) en økning i GABAergic, (2) reduksjon i glutamatergisk og / eller (3) reduksjon i dopaminerg synaptisk inngang til PFC. Foreliggende studie viser at avholdenhet fra kokain signifikant reduserer den totale synapstettheten som indikert av en reduksjon i antall synaptophysin-positive synaptiske puncta. Disse dataene antyder at det er en reduksjon i postsynaptisk respons i PFC, muligens mediert av nedsatt glutamat- eller dopamininngang. Det er faktisk studier som indikerer at kokain induserer reduksjon i glutamaterg tone [35], [36]. Imidlertid, ved bruk av Golgi-metoden, observerte vi en økning i antall tynne dendritiske ryggrader på basale dendritter av pyramidale nevroner, noe som antyder en økning i stimulerende tilførsel i PFC til gjenværende neuritter. Disse tilsynelatende motstridende data kan gjenspeile et samlet tap av synapser assosiert med det store tapet av dendritter vi observerer med en kompenserende respons, muligens mediert av økt BDNF, som vist i våre tidligere funn [20], for å øke tettheten av dendritiske ryggrader på gjenværende nevritt.
Samlet tyder funnene våre på dynamisk omorganisering i PFC under avholdenhet av kokain. Spesifikt er det en signifikant reduksjon i synaptisk tilkobling, tap av dendritisk forgrening og en økning i antall tynne ryggrader i rotte-PFC etter 7 dager med tvungen avholdenhet fra kokain selvadministrering. Disse resultatene kan gi det strukturelle grunnlaget for den observerte hypoaktiviteten observert i PFC for kroniske kokainmisbrukere og kanskje forklare tapet av kognitiv kontroll som oppstår under kokainavhengighet.
Erkjennelsene
Forfatterne vil takke Gavin Sangrey for hans hjelp med å forberede de innebygde kapslene.
Finansieringserklæring
Dette arbeidet ble støttet av NIDA-tilskudd DA22339 og DA033641 (RCP & GSV) og DA18678 (RCP). HDS ble støttet av en individuell K01-pris (DA030445). Finansierne hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet.
Referanser