The Journal of Neuroscience, 15 March 2001, 21(6): 2123-2130;
+ Autorzy oddziałów
Abstrakcyjny
Transmisja dopaminy w jądrze półleżącym może być aktywowana przez leki, stres lub zachowania motywowane, a powtarzająca się ekspozycja na te bodźce może uwrażliwić tę reakcję dopaminy. Celem tego badania było ustalenie, czy zachowania seksualne kobiet aktywują neurony jądra półleżącego i czy przeszłe doświadczenia seksualne uwrażliwiają reakcje neuronalne w jądrze półleżącym na amfetaminę. Stosując znakowanie immunocytochemiczne, ekspresję c-Fos w różnych podregionach (powłoka vs rdzeń na poziomie dziobowym, środkowym i ogonowym) jądra półleżącego zbadano u samic chomików, które miały różne ilości doświadczeń seksualnych. Samice chomików, biorąc pod uwagę 6 tygodnie doświadczenia seksualnego lub pozostając naiwnymi seksualnie, były testowane pod kątem zachowań seksualnych poprzez kontakt z dorosłymi samcami chomików. Poprzednie doświadczenia seksualne zwiększyły znakowanie c-Fos na poziomie dziobowym i ogonowym, ale nie na środkowym poziomie jądra półleżącego. Testowanie zachowań seksualnych zwiększyło etykietowanie w jądrze, ale nie w powłoce jądra półleżącego. Aby potwierdzić, że zachowanie seksualne kobiet może uwrażliwić neurony w mezolimbicznym szlaku dopaminowym, porównano reakcje lokomotoryczne doświadczonych seksualnie i naiwnych kobiet płci żeńskiej na zastrzyk amfetaminy. Amfetamina zwiększyła ogólną aktywność lokomotoryczną u wszystkich kobiet. Jednak doświadczone seksualnie zwierzęta wcześniej zareagowały na amfetaminę niż zwierzęta naiwne seksualnie. Dane te wskazują, że zachowanie seksualne kobiet może aktywować neurony w jądrze półleżącym, a doświadczenie seksualne może uwrażliwić reakcje neuronalne na amfetaminę. Ponadto wyniki te dostarczają dodatkowych dowodów na funkcjonalne różnice między skorupą a rdzeniem jądra półleżącego i na jego osi przednio-tylnej.
Wprowadzenie
Neurony dopaminowe pochodzące z brzusznej części śródmózgowia śródmózgowia i rzutujące na różne jądra przodomózgowia, w tym jądro półleżące, są częścią mezolimbicznego układu dopaminowego. Sugerowano, że ten system dopaminy jest ważny dla regulacji zachowań apetycznych (Mitchell i Gratton, 1994; Salamone, 1994, 1996; Ikemoto i Panksepp, 1999), a także samodzielne podawanie narkotyków (Pierre i Vezina, 1998;Koob, 1999; Lorrain i wsp., 1999; McKinzie i in., 1999; Peoples i in., 1999; Bradberry i in., 2000). Systemowe podawanie różnych narkotyków (np. Kokainy, amfetaminy i heroiny) aktywuje szlaki dopaminy (Pontieri i in., 1995; Nisell i in., 1997; Pierce i Kalivas, 1997a; Tanda i in., 1997; Tanda i Di Chiara, 1998; Barrot i wsp., 1999; Cadoni i Di Chiara, 1999), a wielokrotne narażenie na te czynniki farmakologiczne może uwrażliwić te neurony reagujące na dopaminę (Robinson i wsp., 1988; Kalivas i wsp., 1992; Kalivas i Duffy, 1993; Pierce i Kalivas, 1995; Kuczenski i in., 1997; Nisell i in., 1997; Birrell i Balfour, 1998; Heidbreder i Feldon, 1998; Cadoni i Di Chiara, 1999; Cadoni i in., 2000). Badania dostarczyły dowodów na to, że jądro półleżące reaguje również na pewne właściwości związane z kryciem. Pozakomórkowe poziomy dopaminy w jądrze półleżącym zwiększają się podczas interakcji seksualnych u samic szczurów (Mermelstein i Becker, 1995; Pfaus i wsp., 1995) i chomiki (Meisel i in., 1993; Kohlert i in., 1997; Kohlert i Meisel, 1999). Podobnie jak w przypadku wielokrotnego podawania leków, wielokrotne testy zachowań seksualnych również zwiększają wzrost jądra półleżącego w poziomach dopaminy, co sugeruje, że doświadczenie seksualne może uwrażliwić neurony w szlaku dopaminowym (Kohlert i Meisel, 1999).
Jądro półleżące składa się z wielu odrębnych pod względem anatomicznym podregionów, z których najbardziej znane to skorupa i rdzeń. Anatomiczne połączenia skorupy i rdzenia rozchodzą się, co sugeruje, że te dwa podregiony regulują różne funkcje (Crawley i in., 1985a,b; Heimer i in., 1991; Zahm i Brog, 1992; Brog i in., 1993;Kalivas i Duffy, 1995; Maldonado-Irizarry i in., 1995; Pierce i Kalivas, 1995; Pontieri i in., 1995; Broening i in., 1997; Heimer i in., 1997; Kelley i in., 1997; Stratford i Kelley, 1997; Heidbreder i Feldon, 1998; Lanca i in., 1998; Bassareo i Di Chiara, 1999; Di Chiara i in., 1999b; Groenewegen i in., 1999; Kelley, 1999; McKinzie i in., 1999; Zahm, 1999; Brown i Molliver, 2000). Ponieważ jądro półleżące jest heterogenicznym jądrem, nie jest jasne, czy reakcje na zachowania seksualne kobiet są zlokalizowane w określonych podregionach jądra półleżącego, czy też rozprzestrzeniają się w całym jądrze. Techniki poprzednio stosowane do odpowiedzi na to pytanie (np. Mikrodializa) nie są wystarczająco wrażliwe przestrzennie, aby zbadać funkcjonalną heterogeniczność półleżących. W przeciwieństwie do tego, przetwarzanie immunocytochemiczne białka c-Fos zapewnia metodę badania dyskretnej aktywacji komórkowej wśród podregionów jądra półleżącego. Zatem pierwszym celem tego eksperymentu było ustalenie, czy aktywacja komórkowa po zachowaniu seksualnym kobiet jest zlokalizowana w określonych podregionach jądra półleżącego.
Interesującą właściwością tych szlaków dopaminowych jest uczulenie krzyżowe. Innymi słowy, neurony dopaminowe uprzednio uczulone na jeden lek będą wykazywać uczulone odpowiedzi na inny lek podawany po raz pierwszy (Cunningham i Kelley, 1992; Pierce i Kalivas, 1997a; Birrell i Balfour, 1998; Taylor i Horger, 1999). Oprócz uczulenia krzyżowego wśród leków, kilka badań wykazało uczulenie krzyżowe między powtarzanym narażeniem na czynniki farmakologiczne a zachowaniami naturalnie motywowanymi (Mitchell i Stewart, 1990a,b; Tidey i Miczek, 1997; Fiorino i Phillips, 1999). Dlatego zbadaliśmy, czy zwierzęta doświadczone seksualnie i naiwne seksualnie zareagują inaczej na nowy bodziec, o którym wiadomo, że aktywują szlaki dopaminowe (tj. Uczulenie krzyżowe), takie jak amfetamina. Jeśli zachowania seksualne kobiet uwrażliwiają szlaki dopaminowe, doświadczone seksualnie kobiety powinny wykazywać zwiększoną reakcję behawioralną na pojedyncze wstrzyknięcie amfetaminy.
MATERIAŁY I METODY
Ogólne metody
Zwierząt. Samce i samice chomików syryjskich dostarczono z Charles River Laboratories (Kingston, NY) w ∼60 d of age. Samice trzymano osobno, a samce zwierząt pobudzających trzymano w grupach po trzy lub cztery w plastikowych klatkach (50.8 x 40.6 x 20.3 cm). Pomieszczenie kolonii zwierząt utrzymywano w stałej temperaturze (22 ° C) z wyłączonymi światłami między 1: 30 i 11: 30 PM (14 / 10 hr cykl światło / ciemność). Żywność i woda były dostępne ad libitum.
Procedury stosowane w tym eksperymencie są zgodne z National Institutes of Health Wytyczne dotyczące opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Purdue.
Doświadczenia seksualne. Około 1 tydzień po tym, jak samice przybyły do laboratorium, zostały obustronnie wycięte w jajnikach pod znieczuleniem pentobarbitalem sodu (Nembutal) (8.5 mg na 100 gm masa ciała, ip). Po wycięciu jajników samice początkowo podzielono na dwie grupy. Jedna grupa kobiet otrzymała 6 tygodnie doświadczenia seksualnego z mężczyzną stymulującym; druga grupa pozostała naiwna seksualnie. Wszystkie kobiety były szczepione hormonalnie raz w tygodniu przez okres 6. Zarówno w przypadku 48, jak i 24 h przed doświadczeniem seksualnym, samice wstrzyknięto podskórnie 10 μg benzoesanu estradiolu w 0.1 ml oleju z nasion bawełny. W dniu testu doświadczenia samice otrzymały 500 μg progesteronu w 0.1 ml oleju z nasion bawełny (wstrzyknięcie podskórne). Samicom, które nie otrzymały doświadczenia seksualnego, wstrzykiwano tryb hormonalny i pozostawały w swoich klatkach domowych w pokoju kolonii. W 4 – 5 hr po podaniu progesteronu dorosły chomik płci męskiej, który doświadczył seksualnego doświadczenia w trakcie innych badań zachowania seksualnego, został umieszczony w klatce domowej samicy eksperymentalnej. Kolejność klatek zawierających samce była zmieniana co tydzień, aby zminimalizować prawdopodobieństwo, że pojedynczy samiec i samica były parowane więcej niż raz podczas tygodni seksualnych 6.
Immunocytochemia. Samice chomików zabitych przedawkowaniem pentobarbitalu sodu poddano perfuzji wewnątrzsercowej za pomocą 25 mm Roztwór PBS, pH 7.5, dla 2 min (szybkość przepływu, 25 ml / min), a następnie 4% paraformaldehyd w PBS dla 20 min. Mózgi utrwalano po 2 hr w paraformaldehydzie i przechowywano w 10% sacharozy PBS przez noc w 4 ° C.
Szeregowe zamrożone części 40 μm pobrano przez całe jądro półleżące. Po trzech płukaniach min 10 w PBS, skrawki inkubowano w jednym z pierwszorzędowych przeciwciał przeciwko c-Fos (1: 6000 w PBS z 0.3% Triton X-100; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) lub w pierwszorzędowym przeciwciele dla calbindin-D (28 kDa) (1: 6000 w PBS z 0.3% Triton X-100; Chemicon International, Temecula, CA) w 4 ° C dla 48 hr. Zarówno sekcje c-Fos, jak i kalbindyny-D inkubowano następnie przez 45 min w temperaturze pokojowej w biotynylowanym drugorzędowym przeciwciele IgG anty-króliczym (1: 200 w PBS; zestaw Elite Vectastain ABC; Vector Laboratories, Burlingame, CA), a następnie inkubacja z kompleksem peroksydazy chrzanowej awidyna-biotyna (1: 50 w PBS; zestaw Elite Vectastain ABC) dla 45 min w temperaturze pokojowej, z trzema płukaniami 10 min w PBS przed każdą inkubacją. Po dwóch płukaniach w PBS i płukaniu 10 min w 0.1 m Bufor Tris, pH 7.6, skrawki c-Fos i calbindin-D inkubowano odpowiednio dla 5 i 10 min w 0.08% diaminobenzydynie (DAB) (Aldrich, Milwaukee, WI) w buforze Tris zawierającym 0.003% nadtlenku wodoru i 0.015% chlorek niklu. Wszystkie skrawki ponownie przepłukano buforem Tris i wodą dejonizowaną, a następnie zamontowano na szkiełkach powlekanych chromem ałunowym. Szkiełka wysuszono, odwodniono, oczyszczono i nakryto szkiełkiem nakrywkowym przy użyciu Permount (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA).
Analiza mikroskopowa. Tkanka nerwowa barwiona na kalbindynę-D, która wyznacza skorupę i rdzeń jądra półleżącego (Jongen-Relo i in., 1994a; Johnson and Wood, 1999) użyto do zidentyfikowania jednej sekcji na poziomie dziobowym, środkowym i ogonowym jądra grzbietowego półleżącego. Skrawki jądra półleżącego na poziomie dziobowym, środkowym i ogonowym barwione na kalbindynę pokazano na rysunku 1 A-C. Doniesiono, że istnieją mniejsze różnice między rdzeniem a otoczką w immunoreaktywności kalbindyny-D w chomiku syryjskim w porównaniu ze szczurem, ale barwienie tego peptydu jest nadal w stanie wytyczyć podregiony jądra półleżącego (Johnson and Wood, 1999). Pudełko obejmujące obszar próbkowania 0.1 mm2 (0.2 × 0.5 mm) umieszczono nad grzbietową skorupą i rdzeniem jądra półleżącego dla każdej sekcji. Obraz każdej sekcji został wydrukowany na folii przezroczystej, a następnie obrazy zostały nałożone na odpowiednie sekcje c-Fos dla każdego zwierzęcia, zapewniając, że pudełko zostało umieszczone w tej samej pozycji dla wszystkich zwierząt. Postać 1, D i E, ilustruje jedną część ogonową zwierzęcia, które otrzymało 6 tygodnie doświadczenia seksualnego i zostało przetestowane pod kątem zachowań seksualnych. Pudełko umieszczono w rdzeniu jądra ogonowego półleżącego na rysunku 1 Doraz w skorupie ogonowej półleżącej na rysunku1 E. Pudełko o tych samych wymiarach umieszczono w tej samej sekcji tkanki w korze przyśrodkowej obręczy i nad jądrem ogoniastym przyśrodkowym i bocznym grzbietowym na każdym z trzech poziomów, z których pobierano próbki dla jądra półleżącego. Ponieważ postawiliśmy hipotezę, że mogą występować zmiany od czoła do ogona w skutkach kojarzenia na c-Fos, przeanalizowano tylko jedną sekcję na poziom, aby zwiększyć anatomiczną precyzję naszego pobierania próbek. Liczbę immunoreaktywnych komórek c-Fos w każdym wybranym obszarze zliczano za pomocą kamery wideo podłączonej do skomputeryzowanego systemu analizy obrazu (BioQuant MegM; R&M Biometrics, Nashville, TN).
Jądrowe skrawki tkanki półleżącej wybarwione na calbindin-D i c-Fos. A-C są sekcje z rostral (A), środkowy (B) i ogonowe (C) jądro półleżące wybarwione (linia środkowa jest lewo) dla calbindin, ilustrując podział na skorupę i podregiony podstawowe (gwiazdki). Pomiędzy sekcjami dziobową i środkową znajduje się 320 μm, a między sekcjami środkową i ogonową 240 μm. Dolne obrazy (D, E) są przykładami barwienia c-Fos z rdzenia ogonowego (D) i powłoki (E) jądra półleżącego (linia środkowa jest prawo) seksualnie doświadczonej kobiety zabitej po teście zachowań seksualnych. Theprostokąt ilustruje obszar pobierania próbek (0.2 × 0.5 mm).
Eksperymentuj 1
W pierwszym eksperymencie badano wpływ doświadczeń seksualnych i badań na indukcję c-Fos w jądrze półleżącym, grzbietowym jądrze ogoniastym i korze zakrętu obręczy. Cel eksperymentu był dwojaki. Pierwszym celem było ustalenie, czy istnieją różnice w aktywacji komórkowej w którymkolwiek z obszarów mózgu z powodu wcześniejszych doświadczeń seksualnych i / lub testów behawioralnych. Jeśli zmieniono ekspresję c-Fos, ustalono, czy zmiany mogą być zlokalizowane w określonych podregionach w obrębie trzech analizowanych obszarów mózgu.
Chomiki syryjskie otrzymały 6 tygodnie doświadczenia seksualnego lub pozostały naiwne seksualnie. Podczas tygodni doświadczenia 6, skumulowany czas, w którym samica przyjmowała lordozę (bezruch towarzyszący zgięciu grzbietowemu) mierzono dla każdej sesji testu 10 min. Nie odnotowano żadnych miar męskiego zachowania seksualnego. Podczas tygodnia 7 podano tę samą serię zastrzyków benzoesanu estradiolu i progesteronu. Tym razem połowa doświadczonych seksualnie i naiwnych kobiet została przetestowana pod kątem zachowań seksualnych, umieszczając dorosłego mężczyznę w klatce domowej. Pozostałe kobiety pozostawiono w swoich klatkach domowych. W 60 – 90 min po ekspozycji na samca samice poddano perfuzji wewnątrzsercowej, a ich mózgi poddano obróbce pod kątem ekspresji c-Fos. Te samice, które nie były testowane pod kątem zachowania seksualnego, poddano perfuzji 4 hr po podaniu progesteronu.
Analiza danych. Ponieważ liczba komórek nie różniła się między kobietami, które nie były testowane pod kątem zachowań seksualnych w ciągu 7, niezależnie od wcześniejszych doświadczeń seksualnych (patrz Tabela1 na przykład) eksperymentalne samice zostały ostatecznie podzielone na trzy grupy do analizy. Pierwsza grupa zawierała samice, które otrzymały 6 tygodnie doświadczenia seksualnego i były testowane pod kątem zachowań seksualnych (doświadczenie / test, n = 6). Druga grupa składała się z kobiet, które nie otrzymały żadnego wcześniejszego doświadczenia, ale zostały przetestowane pod kątem zachowań seksualnych (brak doświadczenia / testu,n = 8). Ostatnia grupa zawierała wszystkie samice chomików, które nie były testowane pod kątem zachowań seksualnych, niezależnie od wcześniejszych doświadczeń seksualnych (brak testu, n = 13). Dwie grupy, które nie otrzymały testu zachowań seksualnych, połączono w celu zwiększenia mocy statystycznej w analizach. Liczbę komórek wybarwionych c-Fos z jądra grzbietowego półleżącego, grzbietowego jądra ogoniastego i kory zakrętu obręczy porównano pomiędzy trzema grupami.
Porównanie średniej ± SEM liczby komórek immunoreaktywnych c-Fos w jądrze półleżącym skorupy i rdzenia między grupami bez testu
Zliczenia komórek analizowano przy użyciu wieloczynnikowych ANOVA. Proste ANOVA z głównym efektem i post hoc Testy Newmana-Keulsa były przeprowadzane w odpowiednich przypadkach. Dane behawioralne (czasy trwania lordozy) analizowano za pomocą dwustronnego t test.
Eksperymentuj 2
W drugim eksperymencie porównywano zdolność nowego bodźca, amfetaminy, do wywoływania uczulenia behawioralnego u doświadczonych seksualnie i naiwnych samic chomików. Analizowano ekspresję c-Fos w jądrze półleżącym, grzbietowym jądrze ogoniastym i korze zakrętu obręczy, aby określić, czy wzór aktywności komórkowej był podobny do wyników uzyskanych w Eksperymentie 1.
Samice chomików syryjskich otrzymały 6 tygodnie doświadczenia seksualnego lub pozostały naiwne seksualnie. W tygodniu 7 wszystkie kobiety zostały przetransportowane do nowatorskiego środowiska (np. Akwarium ze szklanym galonem 10 w nieznanym pomieszczeniu) 4 hr po podaniu progesteronu. Samice umieszczono w 10 galonowym akwarium szklanym na 10 min, po czym połowę samców płciowo doświadczonych i naiwnych seksualnie podanod-siarczan amfetaminy (1 mg na 1 kg masy ciała w 1.0 ml 0.9% NaCl; prezent od Dr. Davida Nicholsa, Purdue University). Pozostałym samicom wstrzyknięto 0.9% NaCl (1 mg na 1 kg masy ciała). Samice umieszczono następnie w akwarium galonowym 10 na dodatkowe 60 min. Sesje 70 min nagrywano na wideo w celu analizy ogólnej aktywności lokomotorycznej samic. W ciągu 30 min po ogólnym teście aktywności samice poddano perfuzji wewnątrzsercowej, a ich mózgi poddano obróbce pod kątem ekspresji c-Fos.
Analiza taśmy wideo. Podczas tygodnia 7, sesje 70 min testujące aktywność lokomotoryczną były nagrywane na wideo. Akwaria szklane 10 podzielono na trzy równe obszary na ekranie wideo, a aktywność lokomotoryczną samic odnotowano pod względem liczby krzyży powierzchniowych.
Analiza danych. Przeszła historia seksualna nie wpłynęła na aktywność lokomotoryczną chomików, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną; dlatego eksperymentalne samice podzielono na trzy grupy do analizy. Pierwsza grupa zawierała samice, które otrzymywały 6 tygodnie doświadczenia seksualnego i którym wstrzyknięto amfetaminę (doświadczenie / amfetamina, n = 8). Druga grupa składała się z kobiet, którym podawano amfetaminę, ale nie otrzymywały żadnych doświadczeń seksualnych (brak doświadczenia / amfetaminy,n = 8). Ostatnia grupa zawierała wszystkie samice chomików, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną, niezależnie od wcześniejszych doświadczeń seksualnych (sól fizjologiczna, n = 15). Średnia aktywność lokomotoryczna samic została porównana pomiędzy trzema grupami leczenia w ciągu 70 min badania (w okresach 10 min) z zastosowaniem dwuczynnikowych ANOVA. Proste ANOVA z głównym efektem i post hoc Testy Newmana-Keulsa były przeprowadzane w odpowiednich przypadkach.
Liczba komórek barwionych dla c-Fos nie różniła się między kobietami, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną, niezależnie od wcześniejszych doświadczeń seksualnych. Dlatego też liczbę komórek wybarwionych c-Fos z jądra grzbietowego półleżącego, grzbietowego jądra ogoniastego i kory zakrętu obręczy porównano między tymi samymi trzema grupami leczenia, jak w pierwszym eksperymencie. Zliczenia komórek analizowano przy użyciu wieloczynnikowych ANOVA. Proste ANOVA z głównym efektem i post hoc Testy Newmana-Keulsa były przeprowadzane w odpowiednich przypadkach.
WYNIKI
Eksperymentuj 1
Środki zachowania seksualnego
Czas trwania lordozy podczas testu zachowań seksualnych w tygodniu 7 porównywano między doświadczeniem / testem a grupą bez doświadczenia / testu. Średni czas trwania lordozy podczas testu 10 min wynosił 341 ± 53 s dla grupy doświadczalnej / testowej i 478 ± 20 s dla grupy bez doświadczenia / testu. Kobiety w grupie bez doświadczenia / testowej przyjęły lordozę przez znacznie dłuższy czas niż kobiety w grupie doświadczonej / testowej (t 6 = 5.131; p = 0.05). Ponadto doświadczenia seksualne nie wpływały na czas trwania lordozy. Analiza nie wykazała istotnych różnic między średnimi czasami trwania dla tygodnia 1 (399 ± 44 s) a tygodniem 7 (341 ± 53 s) dla kobiet w grupie doświadczalnej / testowej.
Ekspresja c-Fos w jądrze półleżącym
Trójczynnikowa ANOVA leczenia razy poziom rostralno-ogonowy razy shell-core nie wykazała istotnych głównych efektów leczenia i trójstronnej interakcji między leczeniem, poziomem półleżącym i rdzeniem skorupowym (ryc. 2); jednak wykryto dwie ważne interakcje dwukierunkowe (czasy leczenia muszla-rdzeń i czas leczenia rostral-caudal level).
Ekspresja c-Fos w skorupie i jądrze jądra półleżącego na poziomie dziobowym, środkowym i ogonowym dla każdej z grup leczenia. Trzyczęściowa ANOVA (czas leczenia na poziomie rostalno-ogonowym razy shell-core) została użyta do zbadania wpływu doświadczenia seksualnego i zachowania na średnią liczbę SEM komórek c-Fos. Nie znaleziono znaczących głównych efektów leczenia i trójstronnej interakcji między leczeniem, poziomem półleżącym i rdzeniem skorupowym.
Sondowanie czasu leczenia interakcji między skorupą a rdzeniem ujawniło istotne główne efekty grup leczonych tylko w jądrze jądra półleżącego (ryc. 3). Wielokrotne porównania parami wykazały, że kobiety testowane pod kątem zachowań seksualnych w ciągu 7 (doświadczenie / test i brak doświadczenia / testu) miały znacznie więcej komórek wybarwionych c-Fos w rdzeniu jądra półleżącego niż te kobiety, które nie były badane (brak test) (Newman – Keuls, p <0.01). W powłoce jądra półleżącego nie zaobserwowano efektów testów. Ponadto nie było wyraźnego wpływu doświadczenia seksualnego na liczbę komórek wyrażających c-Fos ani w powłoce, ani w rdzeniu ciała półleżącego.
Ekspresja c-Fos w skorupie i jądrze jądra półleżącego zapadła się na poziomie dziobowo-ogonowym. Trójczynnikowa ANOVA ujawniła dwukierunkową interakcję między leczeniem i średnią ± liczba SEM komórek c-Fos w skorupie i jądrze jądra półleżącego (czas traktowania skorupa-rdzeń;F (2,24) = 4.243; p<0.026). Jednokierunkowa ANOVA sondująca tę interakcję wykazała znaczące główne efekty leczonych grup tylko w rdzeniu jądra półleżącego (F (2,24) = 7.341; p<0.003), a nie w skorupce ciał stałych (F (2,24) = 1.271; p> 0.1). Różne litery wskazują znaczące różnice między grupami.
Sondowanie czasu leczenia interakcji na poziomie rostralno-ogonowym wykazało znaczące główne efekty grup leczonych zarówno na poziomie dziobowym, jak i ogonowym, ale nie na środkowym poziomie jądra półleżącego (ryc. 4). Newman – Keuls post hoc testy wykazały, że kobiety, które otrzymały 6 tygodnie doświadczenia seksualnego i były testowane pod kątem zachowań seksualnych (doświadczenie / test) miały więcej komórek c-Fos-pozytywnych w jądrze dziobowym półleżących niż kobiety, które były testowane, ale które nie otrzymały żadnego wcześniejszego doświadczenia seksualnego (brak doświadczenia / testu; p <0.05) oraz kobiety, które nie były testowane pod kątem zachowań seksualnych (brak testu;p <0.01). Plik post hoc testy wykazały podobne wyniki dla jądra ogonowego półleżącego. Kobiety z grupy doświadczalnej / testowej miały większą liczbę komórek wyrażających c-Fos w jądrze ogonowym półleżącym niż kobiety w grupie bez doświadczenia / testowej (p <0.05) i bez grupy testowej (p <0.01). Dlatego też testy zachowań seksualnych w tygodniu 7 zwiększyły liczbę wybarwionych c-Fos komórek w jądrze czołowym i ogonowym półleżącym tylko u kobiet, które otrzymały 6 tygodni doświadczenia.
Ekspresja c-Fos poprzez wymiar rostralno-ogonowy jądra półleżącego, zapadła się w rdzeniu i powłoce. Chociaż trójczynnikowa ANOVA wskazała, że dwukierunkowa interakcja między grupami leczenia i średnia ± liczba SEM komórek c-Fos poprzez poziomy dziobowo-ogonowe jądra półleżącego zbliżały się tylko do znaczenia (F (4,48) = 2.365; p <0.066), zbadaliśmy każdy poziom jądra półleżącego oddzielnie pod kątem wpływu leczenia na barwienie c-Fos. Jednokierunkowa ANOVA ujawniła znaczące główne efekty grup terapeutycznych zarówno na poziomie rostralnym (F (2,48) = 5.230; p<0.009) i do ogona (F (2,48) = 7.455; p <0.002), ale nie na średnim poziomie (F (2,48) = 1.744; p> 0.1) jądra półleżącego. Różne literywskazują znaczące różnice między grupami.
Ekspresja c-Fos w jądrze ogoniastym i korze zakrętu obręczy
Zliczenia komórek z grzbietowego jądra ogoniastego również analizowano za pomocą trójstronnej ANOVA. Analiza wykazała jedynie interakcję między leczeniem a ekspresją c-Fos w środkowym i bocznym jądrze ogoniastym (F (2,24) = 3.514;p <0.046). Jednak oddzielna analiza przyśrodkowego i bocznego jądra ogoniastego za pomocą jednokierunkowej ANOVA wykazała brak różnicy w liczbie komórek barwionych c-Fos między doświadczeniem / testem, brakiem doświadczenia / testem i brakiem grup testowych (Tabela2). Ponadto, w korze zakrętu obręczy nie znaleziono żadnych głównych efektów doświadczenia seksualnego lub zachowania na liczbę komórek wyrażających c-Fos lub jakiekolwiek interakcje (dane nie pokazane).
Średnia ± SEM liczba komórek immunoreaktywnych c-Fos w przyśrodkowym i bocznym grzbietowym jądrze ogoniastym
Eksperymentuj 2
Aktywność lokomotoryczna
Dwukierunkowa ANOVA (okres testowania czasów leczenia), porównująca średnią aktywność kobiet w doświadczeniu / grupie amfetaminowej, bez doświadczenia / amfetaminy i soli fizjologicznej w minie testowania 70 wykazała interakcję między grupą leczoną a okresem badania. Aby zbadać tę interakcję, poszczególne grupy terapeutyczne sondowano oddzielnie za pomocą jednoczynnikowych ANOVA. Analizy wykazały znaczące zmiany w średniej ogólnej aktywności podczas badania 70 min dla dwóch grup kobiet, którym wstrzyknięto amfetaminę (doświadczenie / amfetamina i brak doświadczenia / amfetamina). Jednak ogólna aktywność samic, które otrzymały sól fizjologiczną, nie zmieniła się znacząco w 70 min (ryc.5). Newman – Keuls post hoctesty zostały następnie wykorzystane do określenia, które okresy testowania 10 min były różne. Porównania wielokrotne parami wykazały, że ogólna aktywność doświadczonych seksualnie samic otrzymujących amfetaminę znacząco zwiększyła 10 min po wstrzyknięciach (p <0.05). Ponadto, w porównaniu z 10 minutami przed wstrzyknięciami, kobiety w grupie doświadczalnej / leczonej amfetaminą pozostawały znacznie bardziej aktywne przez 20 minut (p <0.05) i 30 min (p<0.05) po iniekcjach. W przeciwieństwie do tego, wpływ amfetaminy u kobiet, które wcześniej nie miały kontaktu seksualnego, były widoczne dopiero po 20 minutach od wstrzyknięcia. W tym momencie te kobiety były znacznie bardziej aktywne w porównaniu z 10 minutami przed wstrzyknięciami (p <0.05). Ponadto aktywność kobiet, które nie miały kontaktu seksualnego z amfetaminą, pozostały istotnie zwiększone przez 30 minut (p <0.05) i 40 min (p<0.01) po iniekcjach.
Wpływ amfetaminy na ogólną aktywność doświadczonych seksualnie i naiwnych samic chomików. Dwukierunkowa ANOVA (okres badania czasów leczenia) ujawniła interakcję między grupą leczoną a okresem badania (F (12,150) = 2.288;p <0.011) dla średniej ± SEM zliczeń aktywności. Jednokierunkowa ANOVA sondująca poszczególne grupy leczone wykazała znaczące zmiany w ogólnej aktywności kobiet w doznaniu / amfetaminie (F (6,150) = 3.0468; p <0.008) i brak doświadczenia / amfetamina (F (6,150) = 3.893;p <0.001) leczonych grup. Aktywność samic, którym wstrzyknięto roztwór soli nie uległa zmianie (F (6,150) = 1.619;p < 0.1). Post hoc testy wykazały, że doświadczone seksualnie samice zareagowały szybciej na amfetaminę, wykazując wzrost aktywności w ciągu pierwszej 10 min po wstrzyknięciu. Naiwne płciowo samice nie reagowały na amfetaminę aż do 20 min po wstrzyknięciu. *p <0.05 w porównaniu z okresem przed badaniem.
wyrażenie c-Fos
Trzyczęściowa ANOVA (czas leczenia poziom dziobowo-ogonowy razy skorupa-rdzeń) została użyta do zbadania wpływu doświadczeń seksualnych i amfetaminy na ekspresję c-Fos w jądrze półleżącym. Nie znaleziono znaczących głównych efektów leczenia i trójstronnej interakcji między leczeniem, poziomem półleżącym i rdzeniem skorupowym. Ponadto analiza nie ujawniła żadnych interakcji między grupami leczonymi i ekspresją c-Fos w powłoce i rdzeniu półleżących lub między grupami leczonymi i znakowaniem c-Fos na poziomie dziobowym, środkowym i ogonowym jądra półleżącego ( dane nie pokazane).
Zliczenia komórek z grzbietowego jądra ogoniastego również analizowano za pomocą trójstronnej ANOVA. Wstępna analiza nie wykazała istotnego wpływu poprzedniego doświadczenia seksualnego lub amfetaminy na liczbę komórek c-Fos-dodatnich. Ponadto, nie stwierdzono wpływu poprzedniego doświadczenia seksualnego lub amfetaminy na liczbę komórek wyrażających c-Fos w korze zakrętu obręczy z zastosowaniem dwukierunkowej ANOVA (dane nie pokazane).
DYSKUSJA
Cel tego dochodzenia był dwojaki. Najpierw zbadaliśmy wpływ doświadczeń seksualnych na aktywność komórkową w różnych podregionach jądra półleżącego. Druga kwestia, czy poprzednie doświadczenia seksualne mogą uwrażliwić mezolimbiczny szlak dopaminowy, była badana przez porównanie reakcji behawioralnych doświadczonych seksualnie i naiwnych zwierząt z zastrzykiem amfetaminy. Nasze odkrycia nie tylko wskazują, że zachowanie seksualne kobiet może aktywować neurony w jądrze półleżącym, ale także, że doświadczenie seksualne może uwrażliwić reakcje neuronalne na amfetaminę.
Zachowania seksualne wpływają na ekspresję c-Fos w skorupie i jądrze jądra półleżącego
Testowanie zachowań seksualnych zwiększyło ekspresję c-Fos w rdzeniu, ale nie w powłoce jądra półleżącego, wspierając wcześniejsze badania pokazujące, że pojedyncze spotkanie seksualne może aktywować neurony w jądrze półleżącym u samic gryzoni (Meisel i in., 1993; Joppa i in., 1995; Mermelstein i Becker, 1995; Pfaus i wsp., 1995; Kohlert i in., 1997; Kohlert i Meisel, 1999). Literatura dotycząca funkcjonalnej dychotomii jądra półleżącego składa się z licznych doniesień o zróżnicowanych zmianach w transmisji dopaminy w skorupie i rdzeniu jądra półleżącego w odpowiedzi na bodźce farmakologiczne i fizjologiczne. Podawanie kilku narkotyków powoduje selektywny wzrost pozakomórkowych poziomów dopaminy w skorupie jądra półleżącego (Pontieri i in., 1995; Nisell i in., 1997; Pierce i Kalivas, 1997a; Tanda i in., 1997; Tanda i Di Chiara, 1998; Barrot i wsp., 1999; Cadoni i Di Chiara, 1999). W podobny sposób bardzo smaczne potrawy (Tanda i Di Chiara, 1998; Di Chiara i in., 1999a; Kelley, 1999), łagodny stres (np. szok stopy) (Kalivas i Duffy, 1995; Tidey i Miczek, 1997; Bruijnzeel i in., 1999; Wu i wsp., 1999) i nowość środowiskowa (Rebec i in., 1997;Rebec, 1998) również selektywnie zwiększa transmisję dopaminy w skorupie jądra półleżącego.
Nasze odkrycia są zgodne z hipotezą, że skorupa i rdzeń są funkcjonalnie różne, chociaż rdzeń, a nie skorupa, uznaliśmy za reagujący na zachowania seksualne. Możliwe jest jednak, że wystąpiły zmiany w immunoreaktywności c-Fos w powłoce jądra półleżącego, ale tych zmian nie wykryto. Skorupa jest złożona w różnych podregionach, przyśrodkowej, brzusznej i bocznej skorupie, z brzusznymi i grzbietowymi obszarami środkowej skorupy, które prawdopodobnie są dwoma odrębnymi podregionami (Groenewegen i in., 1999). Te podregiony skorupy, jak również przyśrodkowe i boczne części rdzenia, otrzymują różne kombinacje danych wejściowych z obszarów korowych i podkorowych (Groenewegen i in., 1999). Ponadto zlokalizowane w tych podregionach są funkcjonalnie odrębne zespoły neuronów, które są zorganizowane w odrębne przedziały anatomiczne (Groenewegen i in., 1999). Ponieważ wpływ zachowań seksualnych na ekspresję c-Fos w tym badaniu badano tylko w powłoce grzbietowo-przyśrodkowej, możliwe jest, że liczba komórek c-Fos-dodatnich faktycznie zmieniła się w innym podregionie powłoki.
Pomimo obserwacji, że wiele funkcji jądra półleżącego jest zlokalizowanych w regionie powłoki, uzasadnione jest postawienie hipotezy, że różne obwody nerwowe w jądrze półleżącym pośredniczą we wzmacniających właściwościach różnych zachowań. Carelli i in. (2000)donieśli niedawno, że neurony jądra półleżącego u szczurów wykazują podobną aktywność neuronalną podczas działania operanta na dwa naturalne wzmacniacze (tj. pożywienie i wodę), ale różne wzorce wypalania podczas odpowiedzi na naturalne wzmocnienie przeciw kokainie. Doszli do wniosku, że oddzielenie obwodów nerwowych w jądrze półleżącym przetwarza informacje o wzmocnieniu żywności i wody w porównaniu z nagrodą za kokainę (Carelli i wsp., 2000).
Doświadczenia seksualne wpływają na ekspresję c-Fos poprzez oś dziobowo-ogonową jądra półleżącego
Literatura badająca organizację podjądrową poprzez jądro dziobowo-ogonowe półleżące jest niewielka; jednak zaobserwowano wyraźne różnice funkcjonalne i anatomiczne. Nasze odkrycia są zgodne z wynikami badań, które wykazały zróżnicowaną regulację odpowiedzi neurochemicznych i motorycznych w poprzek osi ogonowej półleżących. Cholecystokinina (CCK) moduluje różnicowo efekty indukowane dopaminą w jądrze dziobowym i ogonowym półleżącym (Crawley i in., 1985a,b), wzmagając hiperlokomocję indukowaną dopaminą po wlewie do ogona półleżącego, regionu unerwionego przez neurony CCK kolokalizowane z dopaminą (Crawley i in., 1985a,b; Lanca i in., 1998). Jednak CCK jest nieaktywny behawioralnie po wstrzyknięciu do jądra dziobowego półleżącego, regionu, który otrzymuje oddzielne projekcje CCK i dopaminy (Crawley i in., 1985a,b; Lanca i in., 1998). Donoszono również, że bezpośredni wlew amfetaminy do skorupy dziobowej, skorupy ogonowej lub rdzenia w różny sposób wpływa na aktywność behawioralną i pozakomórkowe poziomy dopaminy i serotoniny (Heidbreder i Feldon, 1998). Regulacja peptydów opioidowych, substancji P, receptorów dopaminy D1 (Voorn i Docter, 1992; Jongen-Relo i in., 1994b; Voorn i in., 1994) i uwalnianie acetylocholiny (Jongen-Relo i in., 1995) przez dopaminę i agonistów receptora dopaminowego różni się także między częściami dziobowymi i ogonowymi półleżących, przy czym dziobowe półleżące są bardziej wrażliwe na zubożenie dopaminy i podawanie. Chociaż opisywano te różnice funkcjonalne między jądrem dziobowym a ogoniastym półleżącym, to dlaczego te różnice funkcjonalne istnieją nadal nie są w pełni zrozumiałe.
Doświadczenia seksualne na aktywność lokomotoryczną indukowaną amfetaminą
Wyniki przedstawione tutaj i we wcześniejszych badaniach sugerują, że wcześniejsze doświadczenia seksualne uwrażliwiają reakcje neuronalne na testy zachowania seksualnego, wskazując na uczulone zwiększenie uwalniania dopaminy (Kohlert i Meisel, 1999) i aktywność komórkowa w jądrze półleżącym (to badanie). Jedną z obaw jest jednak to, że doświadczone kobiety w poprzednim badaniu mogły odpowiedzieć zarówno na testy zachowania seksualnego, jak i sygnały środowiskowe, ponieważ doświadczenia seksualne i testy były przeprowadzane w tym samym pomieszczeniu. Sygnały środowiskowe warunkowo związane z zachowaniami motywowanymi mogą nabierać właściwości motywacyjnych i dalej zwiększać poziomy dopaminy w jądrze półleżącym (Reid i wsp., 1996, 1998; Watson i Little, 1999). Drugą kwestią jest to, że ponieważ nie odnotowano pomiarów zachowań seksualnych mężczyzn, nie wiadomo, czy dwie grupy samic testowanych pod kątem zachowań seksualnych otrzymały porównywalne ilości stymulacji pochwy i szyjki macicy. Donoszono, że stymulacja dopochwowo-szyjna jest konieczna do uwalniania dopaminy w jądrze półleżącym podczas krycia (Kohlert i in., 1997). Być może doświadczone seksualnie kobiety otrzymały większą stymulację pochwy i szyjki macicy (nie zmierzono w tym badaniu), zwiększając w ten sposób indukcję c-Fos. Dlatego, aby potwierdzić, że zachowanie seksualne kobiet uwrażliwia mezolimbiczny szlak dopaminowy, zbadaliśmy, czy doświadczone seksualnie i naiwne samice zareagowały inaczej na wstrzyknięcie amfetaminy, inny bodziec, o którym wiadomo, że pośredniczy w jego skutkach poprzez szlaki dopaminowe. Ponadto, aby zapewnić, że zaobserwowane uczulone reakcje były spowodowane powtarzającymi się zachowaniami seksualnymi, a nie z powodu uwarunkowanego związku środowiska z zachowaniami seksualnymi, reakcje behawioralne chomików na amfetaminę były testowane w nowym środowisku.
Amfetamina zwiększyła ogólną aktywność u wszystkich samic chomików. Jednak doświadczone seksualnie kobiety wcześniej zareagowały na amfetaminę niż samice naiwne seksualnie. Wyniki te potwierdzają hipotezę, że powtarzające się zachowania seksualne mogą uwrażliwiać neurony w mezolimbicznym szlaku dopaminowym i sugerować, że zmiany w szlaku powodują uwrażliwione reakcje behawioralne zarówno na naturalnie motywowane zachowanie, jak i na stymulator psychomotoryczny (uczulenie krzyżowe).
Odkrycia te są zgodne z hipotezą, że istnieją zbieżne mechanizmy neuronalne pośredniczące w odpowiedziach na leki i zachowania seksualne (Robinson i Berridge, 1993; Pierce i Kalivas, 1997b). W kilku ostatnich badaniach zaobserwowano uczulenie krzyżowe między powtarzaną ekspozycją na lek a zachowaniami naturalnymi. Stres związany z porażką społeczną skraca czas nabywania kokainy do samodzielnego podawania szczurom (Tidey i Miczek, 1997). Środowisko połączone z wielokrotnymi wstrzyknięciami morfiny może ułatwić zachowanie seksualne u samców szczurów (Mitchell i Stewart, 1990a,b). Wstępne leczenie amfetaminą ułatwia również zachowania seksualne u samców szczurów płciowo naiwnych i jest skorelowane ze zwiększonym uwalnianiem dopaminy w jądrze półleżącym (Fiorino i Phillips, 1999).
Ekspresję c-Fos analizowano w jądrze półleżącym po traktowaniu amfetaminą. Postawiono hipotezę, że amfetamina zwiększy ekspresję c-Fos w jądrze półleżącym, aw większym stopniu u samic doświadczonych seksualnie. Jednakże nie stwierdzono wpływu amfetaminy na liczbę komórek wyrażających c-Fos w żadnym z podregionów jądra półleżącego. Widać to z tabeli3 że zwierzęta kontrolne w doświadczeniu 2 (samice z solą) miały większą liczbę komórek c-Fos-dodatnich w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi w eksperymencie 1 (brak testowanych samic). Badiani i in. (1998) poinformował, że wzrosła nowość c-fos zawartość mRNA w jądrze półleżącym i ten efekt nowościc-fos zawartość była tak silna w kilku regionach mózgu, że podawanie amfetaminy w nowym środowisku nie dało dodatkowej odpowiedzi przyrostowej. Zatem wydaje się możliwe, że w naszym badaniu stres związany z przenoszeniem do nowego środowiska w pomieszczeniu testowym aktywował syntezę białka c-Fos, maskując w ten sposób zmiany w ekspresji c-Fos indukowanej przez amfetaminę i doświadczenia seksualne.
Średnia ± SEM podstawowa liczba komórek immunoreaktywnych c-Fos w jądrze półleżącym skorupa i rdzeń dla zwierząt kontrolnych w doświadczeniach 1 i 2
Potencjalne znaczenie
Te eksperymenty dołączają do rosnącej listy badań (Mitchell i Stewart, 1990b; Fiorino i Phillips, 1999; Miczek i in., 1999) wskazujące, że doświadczenia zwierzęcia mogą uwrażliwić reakcję mezolimbicznego szlaku dopaminowego zarówno na zachowania, które są częścią naturalnego repertuaru zwierzęcia, jak i na pewne leki, o których wiadomo, że nadużywają ludzi (Wise and Bozarth, 1987). Kluczową kwestią w badaniach nad narkomanią jest indywidualna podatność na skutki narkotyków (Newcomb, 1992; Robinson i Berridge, 1993), a wspólnie badania te mogą dać wgląd w rozwój uzależnienia u ludzi.
Przypisy
- Odebrane Czerwiec 8, 2000.
- Otrzymano wersję Grudzień 12, 2000.
- Zaakceptowane Grudzień 20, 2000.
Badania te były wspierane przez National Science Foundation Grant IBN-9723876. Dziękujemy Melissie Zila, Shannon McCanna, Marchelle Baker, Michaelowi Huntingtonowi i Deborah Shelley za ich fachową pomoc w testowaniu behawioralnym i przetwarzaniu c-Fos.
Korespondencję należy kierować do dr Roberta L. Meisela, Wydział Nauk Psychologicznych, Purdue University, West Lafayette, IN 47907-1364. E-mail: [email chroniony].
- Copyright © 2001 Society for Neuroscience
;
