Abstrakcyjny
Wywołana psychostymulantem zmiana kolców dendrytycznych na neurony dopaminoceptywne w jądrze półleżącym (NAcc) została postawiona jako adaptacyjna odpowiedź neuronalna, która jest związana z długotrwałymi zachowaniami uzależniającymi. NAcc składa się głównie z dwóch odrębnych subpopulacji średnich kolczastych neuronów wyrażających wysokie poziomy receptorów dopaminy D1 lub D2. W niniejszym badaniu analizowaliśmy gęstość kręgosłupa dendrytycznego po przewlekłym leczeniu kokainą w różnych neuronach kolczastych o średniej wielkości zawierających D1 lub D2 w NAcc. W tych badaniach wykorzystano myszy transgeniczne, które eksprymowały EGFP pod kontrolą promotora receptora D1 lub D2 (Drd1-EGFP lub Drd2-EGFP). Po dniach 28 leczenia kokainą i dniach wycofania 2, gęstość kręgosłupa wzrosła zarówno w neuronach dodatnich Drd1-EGFP, jak i Drd2-EGFP. Jednak wzrost gęstości kręgosłupa utrzymywał się tylko w neuronach Drd1-EGFP-dodatnich 30 dni po odstawieniu leku. Warto zauważyć, że zwiększona ekspresja ΔFosB była również obserwowana w neuronach Drd1-EGFP- i Drd2-EGFP-dodatnich po 2 dniach odstawienia leku, ale tylko w neuronach Drd1-EGFP-dodatnich po 30 dniach odstawienia leku. Wyniki te sugerują, że zwiększona gęstość kręgosłupa obserwowana po przewlekłym leczeniu kokainą jest stabilna tylko w neuronach zawierających receptor D1 i że ekspresja ΔFosB jest związana z tworzeniem i / lub utrzymaniem kolców dendrytycznych w neuronach zawierających D1, a także neuronów zawierających receptor D2 w NAcc.
Mezolimbiczny szlak dopaminergiczny składa się z neuronów w brzusznym obszarze nakrywkowym, które unerwiają jądro półleżące (NAcc), guzek węchowy, kora przedczołowa i ciało migdałowate (1), podczas gdy nigrostriatalne neurony dopaminergiczne w istocie czarnej (pars compacta) zapewniają projekcję wstępującą do prążkowia grzbietowego (2). Psychostymulanty podwyższają synaptyczne stężenia dopaminy w NAcc: kokaina, blokując wychwyt dopaminy z szczeliny synaptycznej i amfetamina, promując uwalnianie dopaminy z zakończeń nerwowych (3-5). Powtarzające się, sporadyczne podawanie psychostymulantów skutkuje zwiększonymi reakcjami behawioralnymi (uczuleniem) na ostre działanie stymulujące tych leków (6-8). Większość dowodów sugeruje, że zmiany adaptacyjne w układzie dopaminergicznym brzusznej strefy nakrywkowej – NAcc mają kluczowe znaczenie dla zmian zależnej od doświadczenia plastyczności, która leży u podstaw zachowania wywołanego lekami.
Oprócz dopaminy, glutaminian jest wymagany do rozwoju uczulenia behawioralnego w odpowiedzi na środki psychostymulujące (9, 10). Średnie kolczaste neurony (MSN) w prążkowiu brzusznym otrzymują pobudzające projekcje glutaminergiczne z kory przedczołowej, które synapsują na głowy kolców dendrytycznych. MSN są również głównym celem dla aksonów dopaminergicznych, które synapsują na szyje kręgosłupa (1, 11, 12). Dlatego kolce dendrytyczne w MSN reprezentują przedział komórkowy, w którym początkowo zintegrowane są transmisje dopaminergiczne i glutaminergiczne.
Dopamina działa na dwie główne podrodziny receptora, podrodzinę D1 (podtypy D1 i D5) i podrodzinę D2 (podtypy D2, D3 i D4) (13). W prążkowiu grzbietowym badania anatomiczne wykazały, że MSN striatonigralne zawierają wysokie poziomy receptorów D1 (razem z substancją P i dynorfiną), podczas gdy MSN striatopallidalne wyrażają głównie receptory D2 (razem z enkephaliną) (14-17). Projekcje z NAcc są bardziej złożone niż w prążkowiu grzbietowym, z powłoką i rdzeniowymi częściami NAcc wystającymi do różnych podregionów brzusznej blady i do brzusznej strefy nakrywkowej i istoty czarnej (18). Podczas gdy receptory D2 i enkefalina są silnie wyrażone w projekcjach do bladej części brzusznej, receptory D1 i substancja P znajdują się równo rozmieszczone w rzutach do bladości brzusznej i brzusznej strefy nakrywkowej (19). Badania agonistów i antagonistów selektywnych dla receptorów D1 lub D2 wykazały, że zarówno receptory D1, jak i D2 są wymagane do zmian behawioralnych zależnych od psychostymulantów (20-25). Jednak role tych receptorów wydają się być różne. Na przykład stymulacja receptorów D1 osłabia poszukiwanie kokainy indukowanej przez zastrzyki pobudzające kokainę i związane z kokainą sygnały środowiskowe, podczas gdy stymulacja receptorów D2 ułatwia przywrócenie wywoływane kokainą (26-28).
Nieprawidłowości behawioralne związane z uzależnieniem psychostymulującym są niezwykle długotrwałe. Dlatego też istnieje duże zainteresowanie identyfikacją długotrwałych zmian wywołanych lekami na poziomie molekularnym i strukturalnym w obwodach neuronalnych regulowanych przez dopaminę i glutaminian (29-32). W szczególności stwierdzono, że długotrwałe narażenie na kokainę lub amfetaminę zwiększa liczbę punktów rozgałęzień dendrytycznych i kolców MSN w NAcc (33-35). Wykazano, że te zmiany strukturalne utrzymują się do ≈1 – 3.5 miesięcy po ostatniej ekspozycji na lek (30, 35) i sugerowano, że leżą u podstaw długotrwałych zmian w plastyczności synaptycznej związanych z ekspozycją na psychostymulant.
Celem niniejszego badania było zbadanie indukowanych kokainą zmian strukturalnych kolców dendrytycznych w subpopulacjach półleżących MSN, które wyrażają receptory D1 lub D2. W tych badaniach wykorzystaliśmy transgeniczne myszy bakteryjnego sztucznego chromosomu (BAC), które wyrażają EGFP pod kontrolą promotora receptora dopaminy D1 (Drd1-EGFP) lub D2 (Drd2-EGFP) (36). Wyniki wskazują, że chociaż zwiększona gęstość kręgosłupa początkowo występuje w MSN zawierających receptor D1 i MSN zawierające receptor D2, zmieniona gęstość kręgosłupa jest stabilna tylko w neuronach zawierających receptor D1. Ponadto, znajdujemy podobne zmiany w ekspresji czynnika transkrypcyjnego ΔFosB, sugerując, że ΔFosB może być zaangażowany w tworzenie i / lub utrzymanie kolców dendrytycznych w D1, jak również neuronów zawierających receptor D2 w NAcc.
Efekt
Analiza MSN w myszach transgenicznych Drd1-EGFP i Drd2-EGFP BAC.
Wzór projekcji MSN z prążkowia grzbietowego i brzusznego w transgenicznych myszach Drd1-EGFP lub Drd2-EGFP BAC scharakteryzowano poprzez analizę ekspresji GFP (36). Zróżnicowana ekspresja GFP w MSN prążkowia grzbietowego odpowiada na ogół odpowiednio ekspresji endogennych receptorów D1 lub D2 (36). Następnie przeanalizowaliśmy różnicową ekspresję GFP w NAcc u myszy Drd1-EGFP lub Drd2-EGFP (Rys. 1a i b). Chociaż N58% neuronów w NAcc ulegało ekspresji GFP u myszy Drd1-EGFP (Rys. 1a), N48% neuronów w NAcc ulegało ekspresji GFP u myszy Drd-2-EGFP (Rys. 1b). MSN reprezentują 90 – 95% wszystkich neuronów w NAcc (12, 37). Receptory D1 ulegają ekspresji tylko w MSN, a receptory D2 ulegają ekspresji w MSN i neuronach cholinergicznych, które reprezentują 1 – 3% neuronów prążkowia (37). Biorąc pod uwagę te czynniki, wyniki sugerują, że minimalnie ≈10 – 15% MSN w NAcc może wyrażać zarówno receptory D1, jak i D2.
Analiza kolców dendrytycznych u myszy Drd1-EGFP i Drd2-EGFP.
Ekspresja GFP w myszach Drd1-EGFP i Drd2-EGFP była przydatna do barwienia ciał komórek neuronalnych. Jednak sygnał GFP w dendrytach i kolcach dendrytycznych był zbyt słaby, aby umożliwić ich analizę po immunobarwieniu przeciwciałami anty-GFP. Balistyczne dostarczanie barwników fluorescencyjnych za pośrednictwem cząstek zostało ostatnio wykorzystane do szybkiego i skutecznego znakowania populacji neuronów (38). Całe neurony można oznaczyć za pomocą tej techniki, a metoda wydaje się porównywalna z barwieniem Golgiego – Coxa. Aby przeanalizować morfologię dendrytyczną neuronów w NAcc, utrwalone wycinki półleżące znakowano lipofilowym barwnikiem fluorescencyjnym 1,1′-diotadecylo-3,3,3 ′, 3′-tetrametyloindokarbocyjaninowym nadchloranem (DiI) stosując pistolet genowy. Przykład barwionego przez DiN MSN jest pokazany w Rys. 1c. W zastosowanych warunkach obserwowaliśmy ogólnie oznakowane neurony bez nakładających się dendrytów z innych oznakowanych neuronów. Przy większym powiększeniu można było zaobserwować szczegółową morfologię dendrytyczną, w tym kolce dendrytyczne (Rys. 1d).
Następnie zastosowaliśmy połączenie znakowania DiI i immunohistochemii dla GFP w transgenicznych myszach Drd1-EGFP lub Drd2-EGFP, co było możliwe dzięki zastosowaniu małego stężenia detergentu do permeabilizacji tkanek (patrz Metody). Dzięki starannemu porównaniu barwnika DiI i ekspresji GFP w ciałach komórek MSN, mogliśmy zidentyfikować neurony DiI- i GFP-dodatnie lub DiI-dodatnie i GFP-ujemne w Drd1-EGFP (Rys. 2a) lub Drd2-EGFP (Rys. 2b) myszy. W następujących badaniach analizowaliśmy morfologię dendrytyczną tylko w neuronach DiI- i GFP-dodatnich z myszy Drd1-EGFP lub Drd2-EGFP.
Przewlekłe leczenie kokainy skutkuje zwiększoną gęstością kręgosłupa w punktowych MSN wyrażających Drd1-EGFP lub Drd2-EGFP.
Myszom Drd1-EGFP lub Drd2-EGFP wstrzykiwano wielokrotnie kokainę (30 mg / kg) lub sól fizjologiczną przez cztery kolejne tygodnie (patrz Metody). Dwa dni (2WD) lub dni 30 (30WD) po ostatnim leczeniu lekiem, mózgi przetwarzano w celu znakowania DiI i immunohistochemii, jak opisano powyżej. Poprzednie badanie wykazało, że przewlekłe leczenie amfetaminą zwiększa gęstość kręgosłupa na dystalnych, ale nie proksymalnych dendrytach MSN w NAcc (35). Dlatego ograniczyliśmy naszą analizę do dystalnych dendrytów (tj. Tych z gałęziami drugiego lub trzeciego rzędu), w tym regionów końcowych. Po analizie w 2WD stwierdzono, że gęstość kręgosłupa zwiększa się w MSN Drd1-EGFP-dodatnim (128% grupy soli fizjologicznej) (Rys. 3a i c) iw mniejszym stopniu w neuronach Drd2-EGFP-dodatnich (115% grupy soli fizjologicznej) (Rys. 3 b i d). Po 30WD zwiększono gęstość kręgosłupa w neuronach Drd1-EGFP-dodatnich (118% kontroli soli fizjologicznej) (Rys. 3 a i c) ale nie w neuronach Drd2-EGFP-dodatnich (Rys. 3 b i d).
Morfologia kolców dendrytycznych jest zmienna pod względem długości i szerokości głowy kręgosłupa. Dlatego klasyfikowaliśmy występy dendrytyczne w czterech klasach kręgosłupa (stubby, grzyby, cienkie i filopodia) w 2WD z kokainy (dane nie pokazane). Gęstość typu grzybkowego (119.7 ± 4.0%, P <0.01) i cienkie kolce (120.0 ± 3.4%, P <0.01) wzrosła w wyniku leczenia kokainą w MSN Drd1-EGFP-dodatnich, natomiast gęstość przysadzistych (182.4 ± 21.6%, P <0.05) i kolce grzybowe (122.5 ± 5.0%, P <0.01) wzrosła w MSN Drd2-EGFP-dodatnich. Nie było znaczącego wzrostu liczby krótkich kolców w neuronach Drd1-EGFP-dodatnich lub cienkich kolców w neuronach Drd2-EGFP-dodatnich.
Przewlekła kokaina indukuje ekspresję ΔFosB w MSN Drd1-EGFP lub Drd2-EGFP-dodatnich w NAcc.
ΔFosB jest członkiem rodziny czynników transkrypcyjnych Fos. Podczas gdy ostre podawanie kokainy wywołuje szybką i przejściową indukcję kilku izoform Fos w NAcc, powtarzana ekspozycja na kokainę zwiększa poziom ΔFosB. Co więcej, wzrost ekspresji ΔFosB utrzymuje się w NAcc przez tygodnie do miesięcy po zaprzestaniu ekspozycji na lek i sugerowano, że bierze udział w długotrwałej regulacji ekspresji genów, nawet po zaprzestaniu przyjmowania leku (29, 39, 40).
Aby zbadać indukcję ΔFosB w NAcc z myszy Drd1-EGFP lub Drd2-EGFP po leczeniu kokainą, przeanalizowaliśmy ekspresję FosB i GFP przez podwójne znakowanie (Rys. 4 i Tabela 1) Przeciwciało anty-FosB rozpoznaje wszystkie formy FosB, ale zakładamy, że zwiększona immunostaina reprezentuje ΔFosB (patrz Metody do dalszej dyskusji). W myszach traktowanych solą fizjologiczną 16% neuronów Drd1-EGFP-dodatnich i 15% neuronów Drd2-EGFP-dodatnich wykazywało immunoreaktywność FosB o stosunkowo słabej intensywności (Rys. 4 a i b i Tabela 1). Powtórne leczenie kokainą, a następnie 2WD spowodowało znaczny wzrost liczby neuronów Drd1-EGFP-dodatnich, które koeksprymowały ΔFosB (55% neuronów GFP-dodatnich) (Rys. 4c i Tabela 1). Mniejszy, ale wciąż znaczący wzrost ekspresji ΔFosB stwierdzono w neuronach Drd2-EGFP-dodatnich (25% neuronów GFP-dodatnich) (Rys. 4d i Tabela 1). Podobnie jak w przypadku zmian gęstości kręgosłupa, zwiększona ekspresja ΔFosB była utrzymywana w neuronach Drd1-EGFP-dodatnich (46% neuronów GFP-dodatnich), ale nie w neuronach Drd2-EGFP-dodatnich (15% neuronów GFP-dodatnich) po 30WD (Rys. 4 e i f i Tabela 1). Zauważ, że zwiększona ekspresja ΔFosB obserwowana w Rys. 4f jest obecny w neuronach negatywnych Drd2-EGFP.
Dyskusja
Uważa się, że długotrwałe adaptacje w neurotransmisji dopaminergicznej leżą u podstaw uzależniających zachowań związanych z lekami psychostymulującymi. W szczególności przypuszcza się, że indukowane przez psychostymulanty wzrosty gęstości kręgosłupa dendrytycznego MSN w NAcc wiążą się z reorganizacją łączności synaptycznej (30). NAcc składa się w dużej mierze z dwóch odrębnych subpopulacji MSN wyrażających wysokie poziomy receptorów dopaminy D1 lub D2. W niniejszym badaniu przeanalizowaliśmy gęstość kręgosłupa w różnych MSN D1 lub receptorów zawierających D2 w NAcc po przewlekłym leczeniu kokainą. Uzyskane wyniki pokazują, że chociaż zwiększona gęstość kręgosłupa początkowo występuje w MSN zawierających receptor D1 i MSN zawierające receptor D2, zmieniona gęstość kręgosłupa jest stabilna tylko w neuronach zawierających receptor D1. Ponadto znajdujemy podobny wzorzec zmian w ekspresji czynnika transkrypcyjnego ΔFosB w MSN zawierających receptor D1 i D2.
W tych badaniach wykorzystano transgeniczne myszy BAC, które eksprymują GFP w specyficznych subpopulacjach MSN pod kontrolą promotora receptora D1 lub D2. Ponadto opracowaliśmy metodę podwójnego znakowania, która łączy immunohistochemię dla GFP z etykietowaniem balistycznym neuronów za pomocą DiI. Wcześniejsze badania wykorzystywały metodę Golgiego – Coxa do analizy wpływu psychostymulantów na gęstość kręgosłupa (34), a zastosowana tutaj metoda DiI dała wyniki porównywalne ilościowo. Opracowaliśmy metodę podwójnego znakowania, ponieważ barwienie Golgiego nie jest zgodne z immunohistochemią. Immunobarwienie zwykle wymaga przepuszczalności tkanek za pomocą detergentów, procesu, który zazwyczaj prowadzi do solubilizacji lipofilowych barwników z membrany (38). Jednak w naszych obecnych badaniach barwienie immunologiczne GFP nie wymagało wysokiego stężenia detergentu do permeabilizacji tkanek, a zatem może być stosowane w połączeniu z lipofilowym znakowaniem barwnikiem. Nasza metoda podwójnego znakowania powinna być ogólnie przydatna do badań zmian strukturalnych w kolcach dendrytycznych, na przykład w przypadku analizy linii myszy transgenicznych BAC, w których GFP ulega ekspresji w określonych populacjach neuronów w korze mózgowej (36).
Chociaż nadal jest to dość kontrowersyjne, uważa się, że receptory D1 i D2 są w dużej mierze anatomicznie segregowane odpowiednio do neuronów projekcji prążkowia bezpośredniej (prążkowatej) i pośredniej (prążkowia) (17, 41). Początkowa charakterystyka lokalizacji GFP u myszy Drd1-EGFP i Drd2-EGFP była zgodna z tym wnioskiem (36). Co więcej, nasza analiza liczby neuronów GFP-dodatnich w NAcc z myszy Drd1-EGFP i Drd2-EGFP jest zgodna z wnioskiem, że ≈50% MSN wyraża tylko receptory D1, że ≈35 – 40% wyraża tylko receptory D2, oraz że ≈10 – 15% współwytwarza zarówno receptory D1, jak i D2. Ta wartość koekspresji jest podobna do tej wynikającej z badań prążkowia grzbietowego, która łączyła analizę patch-clamp pojedynczych neuronów prążkowia z technikami RT-PCR w celu wyizolowania i amplifikacji mRNA (≈17% koekspresji enkefaliny i substancji P) (42). Należy zauważyć, że nasze obecne badania nie zajmują się kwestią ekspresji receptorów D3, D4 i D5, ani nie zajmują się kwestią niskiego poziomu ekspresji receptorów D1 w MSN wyrażających wysokie poziomy receptorów D2 lub odwrotnie.
W kilku wcześniejszych badaniach zbadano lokalizację neuronalną ekspresji Fos wywołanej przez psychostymulanty oraz rolę receptorów D1 i D2 (43-45). Badania te potwierdziły wniosek, że w indukcji Fos i ΔFosB pośredniczy aktywacja receptorów D1. Jednak na lokalizację komórkową ekspresji Fos ma wpływ kontekst środowiskowy, w którym podaje się leki psychostymulujące (46, 47). Na przykład amfetamina lub kokaina podawane w klatce domowej indukują wczesne geny wczesne (w tym Fos) preferencyjnie w komórkach P-dodatnich, które koeksprymują receptory D1. W przeciwieństwie do tego, leki te mogą indukować ekspresję Fos zarówno w MSN zawierających D1, jak i D2, gdy są podawane w nowym środowisku. Protokół zastosowany w naszych obecnych badaniach nie obejmował wstrzykiwania leku w pary z ekspozycją na nowe środowisko. Nie możemy jednak wykluczyć pewnego rodzaju stresu zależnego od kontekstu, który jest odpowiedzialny za ekspresję ΔFosB w MSN zawierających receptor D2.
Godną uwagi cechą obecnych wyników był równoległy wzorzec zwiększonej gęstości kręgosłupa i ekspresji ΔFosB. Zwiększona gęstość kręgosłupa i ekspresja ΔFosB początkowo występowały w MSN wyrażających Drd1-EGFP i Drd2-EGFP. Zmiany te były jednak stabilne tylko w neuronach zawierających receptor D1. Jednym z możliwych wyjaśnień obserwacji, że zwiększona gęstość kręgosłupa i ekspresja ΔFosB były przejściowo stwierdzane w neuronach zawierających receptor D2, jest to, że miało to miejsce w małej frakcji MSN, które koekspresjonują zarówno receptory dopaminy D1, jak i D2. Zatem przejściowy charakter tych wzrostów może być związany z antagonistycznymi efektami aktywacji receptora D2 na szlakach sygnałowych zależnych od D1 (48). Interesujące jest, że zmiany gęstości kręgosłupa i ekspresji ΔFosB były odwracalne, co może odzwierciedlać zdolność szlaków sygnalizacyjnych zależnych od receptora D2 do wpływania na stabilność ΔFosB.
Obserwacja, że istnieją równoległe zmiany w ekspresji ΔFosB i gęstości kręgosłupa jest zgodna z ideą, że ΔFosB bierze udział w początkowej formacji i późniejszym utrzymaniu kolców dendrytycznych w neuronach zawierających receptor D1 w NAcc. Ekspresja ΔFosB jest kontrolowana przez zależną od D1 / DARPP-32 / PP1 ścieżkę sygnalizacyjną w MSN (49). Kilka badań wykazało, że ΔFosB odgrywa ważną rolę w nagradzaniu i aktywowaniu ruchów psychostymulantów (39), prawdopodobnie poprzez wpływ na ekspresję wielu genów, które obejmują receptory neuroprzekaźników, białka sygnałowe i białka zaangażowane w regulację morfologii neuronów (50). Jednak specyficzne mechanizmy molekularne zaangażowane w przewlekłe indukowane kokainą formowanie kręgosłupa nie są obecnie znane. Nasze poprzednie badania wykazały, że wlew śródkręgowy inhibitora Cdk5, roskowityny, osłabiał indukowany kokainą wzrost gęstości kręgosłupa (51). Ponadto Cdk5 jest docelowym genem docelowym dla ΔFosB i odgrywa rolę w kompensacyjnych zmianach adaptacyjnych związanych z przewlekłym leczeniem kokainą (52). Dlatego zmiana fosforylacji zależnej od Cdk5 jest prawdopodobnym mechanizmem leżącym u podstaw indukowanego kokainą powstawania kręgosłupa i / lub stabilności kręgosłupa. PAK (53), β-katenina (54), PSD-95 (55) i spinofilina (56) są substratami dla Cdk5 i wszystkie są zaangażowane w regulację morfogenezy kręgosłupa (57-60). Mam nadzieję, że dalsza charakterystyka tych i innych substratów Cdk5 w kręgosłupach rzuci światło na mechanizmy związane z regulacją formowania kręgosłupa przez psychostymulanty.
Metody
Zwierząt.
Myszy niosące transgen EGFP pod kontrolą receptorów dopaminowych D1 lub D2 wytworzono w projekcie transgenicznym Gensat BAC (36). Transgeniczne myszy użyte w tym badaniu były 4-5 w wieku tygodni i były na tle szwajcarsko-Webster. Myszy utrzymywano w cyklu 12: 12-h światło / ciemność i trzymano w grupach 2-5 z pokarmem i wodą dostępnymi ad libitum. Wszystkie protokoły zwierząt były zgodne z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i ich użytkowania i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkiem Zwierząt Uniwersytetu Rockefellera.
Farmakoterapia.
Doniesiono, że przewlekłe leczenie kokainą (30 mg / kg, codziennie) powoduje silny wzrost gęstości kręgosłupa MSN zarówno w rdzeniu, jak i skorupie NAcc od szczura, ale niższa dawka (15 mg / kg) zwiększa gęstość kręgosłupa tylko w muszla (61). Użyliśmy zatem wyższej dawki kokainy do wywołania modyfikacji strukturalnej w obu częściach NAcc. Myszy otrzymywały jeden zastrzyk (ip) 30 mg / kg kokainy-HCl (lub soli fizjologicznej) każdego dnia przez kolejne dni 5, a następnie dni bez iniekcji 2, i tę procedurę powtórzono dla kolejnych tygodni 4. Zastrzyki przeprowadzono w klatce domowej. 2WD lub 30WD, mózgi myszy przetwarzano w celu znakowania DiI i / lub immunohistochemii.
Etykietowanie balistyczne z barwnikiem fluorescencyjnym DiI.
Myszy znieczulono za pomocą 80 mg / kg pentobarbitalu sodu i perfundowano przezsercowo za pomocą 5 ml PBS, a następnie szybką perfuzję 40 ml 4% paraformaldehydu w PBS (20 ml / min). Mózgi szybko usunięto z czaszki i utrwalono w 4% paraformaldehydzie dla 10 min. Plasterki mózgu (100 μm) znakowano za pomocą balistycznego dostarczania fluorescencyjnego barwnika DiI (Molecular Probes), jak opisano w ref. 38. Połączona metoda znakowania DiI - immunohistochemia została opracowana przy niskim stężeniu detergentu. Skrawki znakowane DiI permeabilizowano 0.01% Triton X-100 w PBS dla 15 min, a następnie inkubowano w 0.01% Triton X-100 i 10% normalnej surowicy koziej w PBS dla 1 h w celu zminimalizowania nieswoistego znakowania. Skrawki tkanek inkubowano następnie z 1% normalną surowicą kozią / 0.01% Triton X-100 i przeciwciałem anty-GFP (Abcam, Cambridge, MA) dla 2h w temperaturze pokojowej, przemyto i inkubowano w rozcieńczeniu 1: 1,000 FITC- sprzężone drugorzędowe przeciwciało (Molecular Probes). Skrawki umieszczano na szkiełkach mikroskopowych i nakrywano szkiełkiem nakrywkowym. Metoda znakowania balistycznego pozwoliła na szczegółową analizę struktury dendrytycznej kręgosłupa, a uzyskane wyniki były jakościowo i ilościowo porównywalne z poprzednimi badaniami z zastosowaniem metody impregnacji Golgiego-Coxa w skrawkach mózgu szczura (34). Jednakże, w przeciwieństwie do poprzednich badań, rzadko obserwowaliśmy dwugłowe kolce w neuronach barwionych DiI. Ta różnica może być spowodowana wrażliwością metod barwienia lub zmiennością myszy (to badanie) w porównaniu z tkanką szczura (34).
Immunohistochemia.
Zwierzęta znieczulono i poddano perfuzji, jak opisano powyżej. Mózgi usunięto i przechowywano przez noc w 4% paraformaldehydzie w 4 ° C. Mózgi przeniesiono do 30% sacharozy w roztworze PBS do krioprotekcji. Skrawki koronalne (12 μm) cięto na mikrotomie zamrażającym (Leica), a następnie przetwarzano do immunohistochemii. Skrawki mózgu następnie permeabilizowano w 0.3% Triton X-100 w PBS dla 15 min i przepłukano dwukrotnie w PBS. Skrawki wstępnie inkubowano w 10% normalnej surowicy koziej w PBS dla 1 hw 37 ° C, eksponowano na przeciwciała pierwotne (rozcieńczone w 1% normalnej surowicy koziej w PBS) przez noc w 4 ° C, a następnie płukano w PBS i inkubowano z wtórnym przeciwciała dla 1 hw 37 ° C. Zastosowano następujące przeciwciała: królicze anty-pan-FosB (SC-48, 1: 500; Santa Cruz Biotechnology), mysie anty-NeuN (Chemicon), królicze anty-GFP, sprzężone z FITC anty-królicze IgG i rodaminę sprzężone anty-mysie IgG (Molecular Probes). W celu potrójnego znakowania (ΔFosB, NeuN i GFP) skrawki mózgu najpierw barwiono immunologicznie przeciwciałem anty-pan FosB i przeciwciałem anty-NeuN, a następnie inkubowano z przeciwciałami drugorzędowymi (skoniugowane z rodaminą anty-królicze IgG i sprzężone z cyjanem anty-mysie IgG ). Dwukolorowe skrawki mózgu poddano dalszej obróbce w celu wybarwienia immunologicznego GFP przy użyciu technologii znakowania Zenon (Zenon Alexa Fluor 488, Molecular Probes). Przeciwciało anty-pan-FosB podniesiono do N-końca FosB i rozpoznaje ΔFosB i pełnej długości FosB (62). W oparciu o wcześniejsze badania, które wykazały, że ΔFosB, ale nie FosB lub inne antygeny związane z Fos, są stabilnie wyrażane po przewlekłym leczeniu kokainą, zakładamy, że długotrwałe wzrosty immunoreaktywności reprezentują stabilną ekspresję ΔFosB. Jednakże tożsamość immunoreaktywnego sygnału FosB obserwowanego u myszy leczonych solą fizjologiczną jest nieznana. Analiza statystyczna w Tabela 1 użył ucznia t test.
Analiza kręgosłupa dendrytycznego.
Poszczególne MSN w NAcc wybrano do analizy kręgosłupa na podstawie kilku kryteriów. (i) Było minimalne lub żadne nakładanie się z innymi znakowanymi komórkami, aby zapewnić, że procesy z różnych komórek nie będą mylone. (ii) Co najmniej trzy podstawowe dendryty muszą być widoczne dla komórek, które mają być użyte do analizy. (iii) Zbadano dystalne dendryty (końcowe dendryty lub w pobliżu końcowych dendrytów). Przeanalizowano dendryty z obu MSN w rdzeniu i powłoce NAcc. Chociaż zaobserwowaliśmy rzadko kolczaste MSN (kolczaste typu II), przeanalizowaliśmy tylko gęsto kolczaste MSN (kolczaste typu I). Aby obliczyć gęstość kręgosłupa, wyznaczono długość dendrytu (> 20 μm długości) za pomocą mikroskopu konfokalnego (Zeiss LSM 510) z soczewką immersyjną w olejku (x 40). Wszystkie zdjęcia dendrytów zostały wykonane w inny sposób z poziomy (przedziały głębokości 0.5 – 1 μm) w celu zbadania morfologii kolców dendrytycznych. Wszystkie pomiary wykonano za pomocą oprogramowania do analizy obrazu metamorficznego (Universal Imaging, Downingtown, PA). W analizie statystycznej zastosowano test Kołmogorowa – Smirnowa.
Występy z dendrytów podzielono na cztery typy na podstawie ich długości, jak opisano w ref. 63 i 64. Wypukłości klasy 1, zwane również grubymi wypukłościami, miały <0.5 μm długości, nie miały dużej głowy kręgosłupa i nie wydawały się mieć szyi; klasy 2, czyli kolce w kształcie grzyba, miały od 0.5 do 1.25 μm długości i charakteryzowały się krótką szyją i dużą głową kręgosłupa; klasa 3, czyli cienkie kolce, mieściły się w zakresie od 1.25 do 3.0 μm i miały wydłużone szyje kręgosłupa z małymi główkami; klasa 4 lub filopodialne przedłużenia były długimi nitkowatymi wypukłościami, które nie miały zauważalnej głowy kręgosłupa.
Podziękowanie
Praca ta była wspierana przez amerykańską służbę zdrowia publicznego Grant DA10044 (do PG i ACN) oraz przez The Simons Foundation, Peter J. Sharp Foundation, Picower Foundation i FM Kirby Foundation.
Skróty
- NAcc
- jądro półleżące
- MSN
- średniej wielkości neuron kolczasty
- BAC
- sztuczny chromosom bakteryjny
- Drd1
- Sterowany promotorem D1 receptora dopaminy
- Drd2
- Sterowany promotorem D2 receptora dopaminy
- DiI
- Nadchloran 1,1′-diotadecyl-3,3,3 ′, 3′-tetrametyloindokarbocyjanina
- 2WD
- 2 dni po ostatniej terapii lekowej
- 30WD
- 30 dni po ostatniej terapii lekowej.
Referencje
;
