Doświadczenie lekowe epigenetycznie steruje indukowalnością genu Fosb w jądrze szczura accumbens (2012)

Abstrakcyjny

Wprowadzenie

Uzależnienie od narkotyków charakteryzuje się kompulsywnym poszukiwaniem narkotyków i przyjmowaniem pomimo poważnych negatywnych konsekwencji (Kalivas i wsp., 2005; Hyman i wsp., 2006). Przewlekła ekspozycja na lek powoduje trwałe zmiany w ekspresji genów w prążkowiu brzusznym (lub jądrze półleżącym; NAc) i prążkowiu grzbietowym (lub skorupie ogoniastej; CPu), strukturach prążkowia zaangażowanych w nagradzanie leków i uzależnienie (Freeman i in., 2001; Robinson i Kolb, 2004; Shaham and Hope, 2005; Maze and Nestler, 2011). ΔFosB, skrócone i stabilne białko kodowane przez natychmiastowy wczesny gen, Fosb, jest dobrze scharakteryzowanym czynnikiem transkrypcyjnym indukowanym w NAc i CPu przez chroniczną ekspozycję na praktycznie wszystkie leki nadużywające, w których pośredniczy uwrażliwione reakcje behawioralne na powtarzane podawanie leku (Nestler, 2008). Nie wiadomo jednak, czy wcześniejsze przewlekłe narażenie na lek nadużywający zmienia późniejszą indukcję ΔFosB.

Ostatnio postawiliśmy hipotezę, że modyfikacje chromatyny w odpowiedzi na chroniczną ekspozycję na leki mogą zmienić indukowalność określonych genów w docelowych regionach mózgu (Robison i Nestler, 2011). Coraz więcej dowodów wskazuje, że nadużywanie leków po długotrwałym podawaniu zmienia strukturę i dostępność transkrypcyjną chromatyny poprzez liczne rodzaje modyfikacji, w tym fosforylację, acetylację i metylację ogonów histonowych. Nowsze prace w systemach hodowli komórek skupiły się na rekrutacji polimerazy RNA II (Pol II) do promotora „indukowalnych” genów przed ich ekspresją, przy czym Pol II wiąże się trwale z proksymalnymi regionami promotora i wokół miejsca rozpoczęcia transkrypcji (TSS ) w stanie „zablokowanym” (Core i Lis, 2008; Nechaev i Adelman, 2008). Uważa się, że aktywacja zablokowanego Pol II jest odpowiedzialna za jego ucieczkę z regionów promotora i TSS oraz transkrypcję tych „zagruntowanych” genów (Zeitlinger i in., 2007; Saha i in., 2011; Bataille i in., 2012).

Tutaj pokazujemy, że wcześniejsza chroniczna ekspozycja na kokainę, po której następuje przedłużony okres karencji, zmienia indukowalność Fosb gen do dalszego podawania kokainy, przy czym NAc jest przygotowywany do indukcji, podczas gdy CPu nie. Następnie identyfikujemy wyraźne sygnatury chromatyny na Fosb promotor genu w NAc i CPu, które są związane z taką nieprawidłową indukowalnością Fosb gen, w tym rekrutacja utkniętego Pol II w Fosb promotor proksymalny tylko w NAc, jak również zmiany w kilku aktywujących lub represyjnych modyfikacjach histonów w obu obszarach mózgu. Wyniki te dostarczają nowych informacji na temat dynamiki chromatyny Fosb promotor genu i po raz pierwszy wskazać mechanizm, za pomocą którego zatrzymuje się liczby pierwsze Pol II Fosb dla większej aktywacji w NAc po ponownej ekspozycji na kokainę.

Materiały i Metody

Efekt

Większy Indukowalność Fosb u NAc, ale nie CPu u szczurów doświadczonych kokainą

Aby zbadać wpływ wcześniejszego przewlekłego przebiegu kokainy, a następnie przedłużającego się okresu wycofania, na indukowalność Fosb gen w odpowiedzi na kolejną prowokację kokainą, szczurom, którym wcześniej wstrzyknięto ip dwa razy dziennie solą fizjologiczną lub kokainą (15 mg / kg) w dniach 10 podawano dawki prowokacyjne leku po 28 dniach odstawienia (Ryc. 1A). Najpierw zmierzyliśmy reakcje lokomotoryczne w jednej grupie zwierząt, aby potwierdzić indukcję uczulenia narządów przez uprzednią ekspozycję na kokainę, oczekiwaną trwałą konsekwencję podawania leku. U szczurów doświadczonych kokainą i -nave nie wykazywały równoważnej podstawowej aktywności lokomotorycznej, z prowokacją kokainą u zwierząt nieleczonych lekami, zwiększając ich ruchliwość (Ryc. 1B. Powtarzane pomiary dwukierunkowej ANOVA, leczenie: F_1,66 = 30.42, p <0.0001; wyzwanie kokainowe: F._2,66= 58.39, p <0.0001; leczenie x wyzwanie kokainowe: F._2,66= 8.56, p = 0.0005, Bonferroni po testach ^{^}p <0.001). Ta prowokacja kokainą indukowała znacznie większą aktywność lokomotoryczną, tj. Uczulenie, u szczurów doświadczonych kokainą (testy po testach Bonferroniego * p <0.001).

  

Rysunek 1

Wpływ wcześniejszej chronicznej ekspozycji na kokainę na aktywność lokomotoryczną i Fosb indukcja w NAc i CPu po ponownej ekspozycji na lek

Aby ocenić wpływ tego schematu leczenia wstępnego kokainą na ekspresję ΔFosB w NAc i CPu, zmierzono białko ΔFosB metodami immunohistochemicznymi 24 hr po zwierzętach nieleczonych kokainą i doświadczonych kokainą podawano codziennie kokainę 0, 1, 3 lub 6 zastrzyki (15 mg / kg; patrz Ryc. 1A). Jak wcześniej ustalono (Nye i wsp., 1995), Wstrzyknięcia kokainy 3 były wystarczające, aby znacząco indukować białko ΔFosB w NAc i CPu zwierząt nieleczonych lekiem i jego akumulacja pozostała znacząca po dniach 6 iniekcji kokainy (Rys 1C. Powtarzające się pomiary dwukierunkowej ANOVA, rdzeń NAc, leczenie: F_1,28= 23.5, p <0.0001; wyzwanie kokainowe: F._3,28= 49.16, p <0.0001; leczenie x wyzwanie kokainowe: F._3,28= 6.83, p = 0.0014; Powłoka NAc, leczenie: F_1,28= 18.69, p <0.0001; wyzwanie kokainowe: F._3,28= 31.52, p <0.0001; leczenie x wyzwanie kokainowe: F._3,28= 3.21, p <0.05; CPu, leczenie: F._1,28= 9.47, p <0.001; wyzwanie kokainowe: F._3,28= 19.74, p <0.0001; leczenie x wyzwanie kokainowe: F._3,28= 0.94, p> 0.05. W rdzeniu, powłoce i CPu NAc, testy końcowe Bonferroni ^{^}p <0.05). U zwierząt doświadczonych kokainą nie było dowodów na utrzymującą się indukcję ΔFosB w NAc lub CPu po 28 dniach odstawienia, co jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami, że sygnał ΔFosB całkowicie zanika do tego punktu czasowego (Nye i wsp., 1995), powód, dla którego ten punkt czasowy został użyty w tym badaniu. Uderzające jest jednak to, że szczury doświadczone kokainą, które otrzymały iniekcje 3 lub 6 z kokainą, wykazywały znacznie większą indukcję białka ΔFosB w NAc, efekt widoczny zarówno w podregionach rdzenia i powłoki (Rys 1C. Posttesty Bonferroniego * p <0.05). W przeciwieństwie do tego, w CPu nie zaobserwowano takiej większej indukcji białka ΔFosB; zamiast tego, równoważną indukcję ΔFosB obserwowano w tym regionie po 3 lub 6 dniach iniekcji kokainy u szczurów, które nie były wcześniej kokainą i doświadczały (Rys 1C).

Aby uzyskać wgląd w zmiany transkrypcyjne występujące w NAc i CPu w odpowiedzi na prowokację kokainą, zbadaliśmy przebieg czasowy (45, 90 i 180 min) indukowalności transkryptów mRNA ΔFosB i FosB na pojedynczym wstrzyknięciu kokainy lub soli fizjologicznej na naiwne i doświadczone szczury po kokainie po 28 dniach odstawienia (patrz Ryc. 1A). W odniesieniu do prowokacji solą, prowokacja kokainą indukowała gwałtowny wzrost poziomów mRNA ΔFosB i FosB we wszystkich trzech punktach czasowych zarówno w NAc, jak i CPu zwierząt nieleczonych kokainą (Rys. 1D. Powtarzane pomiary jednokierunkowe ANOVA na punkt czasowy; Bonferroni po testach ^{^}p <0.05). W NAc, zaobserwowaliśmy większą indukcję mRNA ΔFosB i FosB u zwierząt, które doświadczyły kokainy, w porównaniu ze zwierzętami, które nie otrzymały kokainy po prowokacji kokainą, przy czym efekt był znaczący po 90 minutach, podczas gdy dla kontrastu indukowalność mRNA ΔFosB i FosB w CPu była istotnie zmniejszył się u zwierząt doświadczonych kokainą (Rys. 1D. Bonferroni po testach ^%p = 0.08, * p <0.05).

Charakterystyka górnych ścieżek sygnałowych w NAc i CPu szczurów doświadczonych kokainą

Jedno możliwe wyjaśnienie zmienionej indukowalności Fosb gen w NAc i CPu po wcześniejszym przewlekłym przebiegu kokainy jest taki, że zdalna historia narażenia na kokainę może wywołać trwałe zmiany w szlakach sygnałowych, które znajdują się powyżej Fosb indukcja genu, tak że prowokacja kokainą indukuje gen w nieprawidłowym stopniu. Aby zbadać tę hipotezę, przeanalizowaliśmy dwa czynniki transkrypcyjne, SRF i CREB, które zostały ostatnio pokazane jako wymagane do indukcji kokainy ΔFosB w tych regionach mózgu (Vialou i wsp., 2012) wraz z wyjściowymi kinazami białkowymi, ERK i AKT, również zaangażowanymi w działanie kokainy (Valjent i wsp., 2000; Lu i wsp., 2006; Boudreau i in., 2009). Nie udało nam się wykryć żadnych zmian w całkowitym lub fosforylowanym poziomie tych różnych białek, które mogłyby wyjaśnić zmienioną indukowalność Fosb obserwowane, w tym brak zmian w SRF, CREB lub AKT (Rys. 2B, C). Brak zmiany pSRF i pCREB w NAc w odpowiedzi na prowokację kokainą jest zgodny z niedawnym raportem, który wykazał, że zarówno indukowane przez przewlekłą kokainę są znacząco (Vialou i wsp., 2012).

  

Rysunek 2

Wpływ wcześniejszej chronicznej ekspozycji na kokainę na kaskady sygnalizacji molekularnej w górę w NAc i CPu

W NAc i CPu zwierząt nieleczonych lekiem, 20 min po początkowej ekspozycji na lek (Ryc. 2A), pojedyncza prowokacja kokainą obniżyła poziom pERK42 / 44 (Rys. 2B, C. Dwustronny test t Studenta: * p <0.05). Istnieją wcześniejsze doniesienia o zwiększonych poziomach pERK w tych regionach po ostrym zażyciu kokainy (Valjent i wsp., 2000). Trudno to porównać z innymi dokumentami analizującymi fosforylację ERK w NAc podczas wycofywania z powtarzanych wstrzyknięć kokainy (Boudreau i in., 2007; Shen i in., 2009), jak w naszym badaniu, pERK oceniano ilościowo po dniach odstawienia 28 i po prowokacji kokainą lub solą fizjologiczną. W stosunku do zwierząt nieżyjących narkotyków doświadczających kokainy po raz pierwszy, ponowna ekspozycja na kokainę u szczurów doświadczonych kokainą, po dniach odstawienia 28, spowodowała znaczny wzrost poziomów pERK42 / 44 w CPu (Rys. 2B, C. Dwustronny test t-studenta: * p <0.05).

Krajobraz chromatyny na Promotor genu Fosb w NAc i CPu szczurów doświadczonych kokainą

Następnie zbadaliśmy, czy zmiany w Fosb indukowalność genu jest związana ze zmianami w jego strukturze chromatyny. ChIP przeprowadzono na NAc i CPu przy użyciu przeciwciał skierowanych przeciwko trzem dobrze scharakteryzowanym formom modyfikacji histonów: trimetylacji Lys4 histonu H3 (H3K4me3) związanego z aktywacją genu oraz H3K27me3 i H3K9me2 i H28K1meXNUMX i HXNUMXKXNUMXmeXNUMX i HXNUMXKXNUMXmeXNUMX związanych z represją genów. Przeanalizowaliśmy naiwne i doświadczone szczury kokainy po dniach odstawienia XNUMX bez lub z prowokacją kokainą, ze zwierzętami badanymi XNUMX hr później (Ryc. 3A). W NAc nie stwierdziliśmy istotnych zmian w wiązaniu którejkolwiek z tych trzech modyfikacji histonowych Fosb promotor genu pod nieobecność prowokacji kokainą, chociaż wystąpił trend obniżenia poziomu H3K9me2 (Rys. 3B-D. Dwustronny test t-Studenta. ^#p = 0.2 w porównaniu z odpowiednimi kontrolami leku Naïve). Efekt ten stał się znaczący po prowokacji kokainą i był specyficzny dla proksymalnego regionu promotora genu (Rys 3C. * p <0.05). Podczas gdy poziomy H3K9me2 są bardzo niskie w niektórych genach, Fosb promotor genu wykazuje znaczące poziomy tego znaku w NAc w warunkach kontrolnych (Maze i wsp., 2010, dane nie pokazane). Natomiast w CPu odkryliśmy małe, ale znaczące zmniejszenie wiązania H3K4me3 i wzrost wiązania H3K27me3 w Fosb promotor przy braku wyzwania kokainowego, efekty utracone po wyzwaniu (Rys. 3D. * p <0.05).

  

Rysunek 3

Wpływ wcześniejszej chronicznej ekspozycji na kokainę na epigenetyczne zalewanie Fosb gen w NAc i CPu

Następnie zbadaliśmy wiązanie Pol II do Fosb gen, oparty na najnowszych odkryciach w hodowli komórkowej, że zatrzymanie Pol II w TSS, które charakteryzuje się jego fosforylacją w Ser 5 w jego regionie powtarzania CTD, jest związane z pobudzaniem genów (patrz Wprowadzenie). W ten sposób przeanalizowaliśmy wiązanie Pol II-pSer5 do Fosb w czterech różnych regionach genu (Ryc. 3B). Analiza ta wykazała znaczne wzbogacenie Pol II-pSer5 w Fosb gen w jego proksymalnym regionie promotora i wokół jego TSS u NAc zwierząt doświadczonych kokainą, po długotrwałym odstawieniu, przy braku prowokacji kokainą w porównaniu z grupą kontrolną (Rys. 3E. * p <0.05). To wzbogacenie nie było widoczne w dwóch regionach ciała genów Fosb, zgodne z przeciągnięciem Pol II opisanym w prostszych systemach eksperymentalnych. Co ciekawe, po prowokacji kokainą wiązanie Pol II-pSer5 nadal wykazywało oznaki wzbogacenia, chociaż nie było już znacząco, w Fosb proksymalny region promotora (Rys. 3E. ^%p = 0.1), ale powrócił do poziomów kontroli w TSS. Wyniki w CPu były bardziej zmienne, bez wyraźnego wzorca wiązania Pol II-pSer5.

Dyskusja

Niniejsze badanie zapewnia nowy wgląd w trwałą regulację Fosb tygodnie po zaprzestaniu powtarzającej się ekspozycji na kokainę. Pokazujemy, że wcześniejsze chroniczne podawanie kokainy powoduje Fosb gen bardziej indukowalny w NAc, co skutkuje szybszą akumulacją ΔFosB po ponownej ekspozycji na lek. Biorąc pod uwagę przewagę dowodów, że indukcja ΔFosB w NAc pośredniczy w uczulonych reakcjach behawioralnych na kokainę (Nestler, 2008), nasze odkrycia ujawniają nowy mechanizm szybszego przywracania takich uczulonych odpowiedzi po przedłużającym się odstawieniu.

Wykazujemy, że zwiększona indukcja ΔFosB w NAc jest związana ze zmianami chromatyny w Fosb gen, od którego można by oczekiwać, że będzie większy. Tak więc, wykazaliśmy zwiększone wiązanie Pol II do proksymalnego promotora i regionów TSS genu, które są obecne po tygodniach wycofania 4 z wcześniejszego przewlekłego podawania kokainy. Takie wzbogacenie Pol II w TSS jest szybko tracone po prowokacji kokainą i Fosb indukcja, zgodna z modelem w hodowli komórkowej, który zatrzymał Pol II jest uwalniany z TSS po aktywacji genu (patrz Wprowadzenie). Prowokacja kokainą wywołuje również szybki spadek wiązania H3K9me2 - znaku represji genów - do Fosb promotor. W przeciwieństwie do tego, nie wykryliśmy trwałej indukcji kilku czynników transkrypcyjnych lub ich kinaz upstream, o których wiadomo, że pośredniczą Fosb indukcja kokainą. Wyniki te potwierdzają naszą hipotezę, że zwiększona indukcja ΔFosB w NAc odbywa się za pośrednictwem epigenetycznego primingu Fosb gen, a nie poprzez regulację w górę wydarzeń.

Bardzo różne wyniki uzyskano dla CPu. Nie było dowodów na to, że Pol II zwlekał Fosb u szczurów doświadczonych kokainą przed prowokacją kokainą, chociaż były małe, ale znaczące modyfikacje histonów zgodne z represją genów: zwiększone wiązanie H3K27me3 i zmniejszenie wiązania H3K4me3. Nie zaobserwowano również zmian w czynnikach transkrypcji w górę lub kinaz zgodnych ze zmniejszeniem Fosb indukcja. Wyniki te sugerują, że po przewlekłym podawaniu kokainy, modyfikacje epigenetyczne służą tłumieniu Fosb indukowalność genu w CPu, w przeciwieństwie do primingu obserwowanego w NAc. Jednakże, podczas gdy te efekty tłumią indukcję mRNA ΔFosB po ponownej ekspozycji na kokainę, nie ma straty w akumulacji białka ΔFosB. Mechanizm leżący u podstaw tego paradoksu wymaga teraz dalszych badań.

Bardziej ogólnie, nasze wyniki wspierają model, w którym zmiany w krajobrazie chromatyny w określonych genach w odpowiedzi na przewlekłe podawanie kokainy służą do zalewania lub stępienia tych genów w celu późniejszej indukcji po ponownej ekspozycji na lek. Takie zmiany chromatyny, które można postrzegać jako „blizny epigenetyczne”, zostałyby pominięte w analizach poziomów mRNA genów w stanie ustalonym. W ten sposób charakterystyka epigenomu uzależnienia zapowiada ujawnienie nowych informacji o molekularnej patogenezie zaburzenia, które można wydobywać w celu opracowania nowych metod leczenia.

Podziękowania

Referencje