Źródło
Zespół Farmakologii Komórkowej i Molekularnej, Katedra Farmakologii, Uniwersytecka Szkoła Medyczna, Murcja, Hiszpania.
Abstrakcja
Przewlekłe używanie narkotyków głęboko zmienia system reagujący na stres. Powtarzająca się ekspozycja na morfinę prowadzi do akumulacji czynnika transkrypcyjnego ΔFosB, szczególnie w obszarach mózgu związanych z nagrodą i stresem. Trwały wpływ ΔFosB na geny docelowe może odgrywać ważną rolę w plastyczności indukowanej przez nadużywanie narkotyków. Najnowsze dowody sugerują, że hormony związane ze stresem (np. glukokortykoidy, GC) mogą indukować adaptacje w mózgu, które powodują stres, co prawdopodobnie wiąże się ze zmianami w ekspresji genów i czynnikach transkrypcyjnych. W tym badaniu zbadano rolę GC w regulacji FosB/ΔFosB zarówno w podwzgórzowych, jak i pozapodwzgórzowych układach stresu mózgowego podczas uzależnienia od morfiny. W tym celu mierzono ekspresję FosB/ΔFosB u szczurów kontrolnych (po pozorowanej operacji) i szczurów z adrenalektomią (ADX), u których uzależniono się od opiatów po dziesięciu dniach leczenia morfiną. U szczurów poddanych pozorowanej operacji FosB/ΔFosB indukowano po przewlekłym podawaniu morfiny we wszystkich badanych obszarach mózgu objętych stresem: jądro półleżące (powłoka) (NAc), jądro łożyska prążkowia końcowego (BNST), centralne ciało migdałowate (CeA), podwzgórze przykomorowe jądro (PVN) i jądro grupy komórek noradrenergicznych przewodu pojedynczego (NTS-A(2)). Adrenalektomia osłabiła zwiększoną produkcję FosB/ΔFosB obserwowaną po przewlekłej ekspozycji na morfinę w NAc, CeA i NTS. Ponadto ADX zmniejszyło ekspresję FosB/ΔFosB w neuronach CRH-dodatnich BNST, PVN i CeA. Podobne wyniki uzyskano w neuronach NTS-A(2) TH-dodatnich i neuronach NAc-dodatnich pod względem prodynorfiny. Dane te sugerują, że neuroadaptacja (szacowana jako akumulacja FosB/ΔFosB) do opiatów w obszarach mózgu związanych ze stresem jest modulowana przez GC, co potwierdza dowody na związek między hormonami stresu w mózgu a uzależnieniem.
Wprowadzenie
Opiaty, takie jak morfina, są skutecznymi środkami przeciwbólowymi stosowanymi w leczeniu wielu postaci ostrego i przewlekłego bólu. Jednakże poważne działania niepożądane, takie jak tolerancja i odstawienie, przyczyniają się do uzależnienia od opiatów i ograniczają ich stosowanie. Co więcej, w ciągu ostatnich kilku lat wzrosło pozamedyczne użycie opiatów (heroiny, morfiny). Coraz więcej dowodów wskazuje na różne mechanizmy regulacji genów (w tym efekty epigenetyczne, molekularne, komórkowe i na poziomie obwodów) w zmianach wywoływanych w mózgu przez narkotyki, co wskazuje na potencjalną strategię terapeutyczną w terapii uzależnień [1]-[4].
Głównym pytaniem w dziedzinie nadużywania narkotyków była identyfikacja białek, które pośredniczą w przejściu od ostrych do długotrwałych skutków tych narkotyków. Szczególnie interesująca w badaniu uzależnień jest rodzina czynników transkrypcyjnych Fos. Ta rodzina obejmuje c-Fos, Fra-1 i Fra-2, FosB i ΔFosB, wariant pełnego połączenia FosB ze skróconym splotem [5]. W przeciwieństwie do innych członków rodziny Fos, ΔFosB jest umiarkowanie indukowany w mózgu po ostrym podaniu leku, ale ze względu na jego niezwykle długi okres półtrwania utrzymuje się przez tygodnie, a nawet miesiące po zaprzestaniu używania narkotyku. W rezultacie, Poziomy ΔFosB stopniowo kumulują się w wyniku powtarzającej się ekspozycji na lek [6], [7], co sugeruje, że ΔFosB może reprezentować mechanizm, dzięki któremu nadużywane narkotyki powodują trwałe zmiany we wzorcu ekspresji genów długo po odstawieniu leku [8].
Donoszono, że wielokrotne narażenie na kokainę, amfetaminę, kannabinoidy lub morfinę prowadzi do wzrostu ΔFosB w obszarach mózgu związanych z pozytywnym wzmacniającym działaniem narkotyków, takich jak jądro półleżące (NAc), kora przedczołowa i prążkowie grzbietowe. Zaproponowano, że wzrost ten jest neuroadaptacją prowadzącą do zwiększonej wrażliwości na narkotyki i podatności na rozwój charakterystycznych zachowań uzależniających [9]-[13]. Niedawno pokazaliśmy, że tzwiększenie poziomu FosB/ΔFosB po przewlekłym podawaniu morfiny nie ogranicza się tylko do układu nagrody, ale występuje także w układzie stresu mózgu (co jest powiązane z negatywnym, wzmacniającym działaniem leków), jak również w jądrze przewodu samotnego-A2 grupa komórek noradrenergicznych (NTS-A2, główny układ noradrenergiczny unerwiający neuroobwód stresowy) [14]. Zgodnie z tymi odkryciami kilka form przewlekłego stresu indukuje również ΔFosB w NAc i innych obszarach mózgu [15], [16].
Uzależnienie jest złożonym zaburzeniem, ponieważ wiele czynników przyczynia się do rozwoju i utrzymywania się tego zaburzenia neurologicznego. Jednym z czynników jest stres, który ma wpływ na określone aspekty uzależnienia od narkotyków [17]-[21]. Zarówno oś podwzgórze-przysadka-nadnercza (HPA, pierwotna ścieżka stresu hormonalnego), jak i pozapodwzgórzowy układ stresu (który obejmuje rozszerzone ciało migdałowate i NTS-A)2) ulegają rozregulowaniu w wyniku przewlekłego podawania leków mogących powodować uzależnienie [14], [22]. Ponadto reakcja osi HPA jest podobna zarówno po stresującym bodźcu, jak i ostrej ekspozycji na narkotyki [23], [24], ze zwiększonym uwalnianiem hormonu uwalniającego kortykotropinę (CRH), hormonu adrenokortykotropowego (ACTH) i glukokortykoidów (GC). Tjego reakcja ułatwia adaptację do ostrych zmian środowiskowych, ale może także prowadzić do patologii behawioralnych w stanach przewlekłego stresu, takich jak uzależnienie i depresja [25]. W badaniach nie zbadano jeszcze związku między GC a indukcją FosB/ΔFosB wywołaną uzależnieniem od morfiny w układzie stresu mózgowego. Dlatego oceniliśmy wpływ GC na ekspresję FosB/ΔFosB po ciągłym podawaniu morfiny w obszarach związanych ze stresem mózgu. Aby odpowiedzieć na to pytanie, najpierw zbadaliśmy wpływ obustronnej adrenalektomii (ADX) na immunoreaktywność FosB/ΔFosB (IR) w głównych jądrach układu stresu u szczurów zależnych od morfiny.
W działaniu układu stresu mózgowego pośredniczy szereg neuroprzekaźników/neuromodulatorów. CRH jest głównym neuropeptydem regulującym aktywność układu stresowego i postuluje się jego wpływ zarówno na istniejącą wcześniej podatność na uzależniające używanie narkotyków, jak i późniejszą podatność na nawroty [26]. Ponadto liczne prace potwierdzają znaczenie NTS-A2 unerwianie układu stresowego mózgu w uzależnieniu od narkotyków i kluczowa rola noradrenaliny (NA) jako neuroprzekaźnika modulującego ten układ nerwowy [27]. Wreszcie istotne dowody sugerują, że ekspresja dynorfiny jest aktywowana w prążkowiu i ciele migdałowatym podczas ostrego i przewlekłego podawania leku [28]. Biorąc pod uwagę te fakty, następującym celem tego badania było określenie roli GC na ekspresję FosB/ΔFosB w określonych populacjach układu stresu mózgowego podczas uzależnienia od morfiny.
Efekty
Wpływ adrenalektomii na przyrost masy ciała oraz stężenie ACTH i kortykosteronu w osoczu u szczurów zależnych od morfiny
Przed wykonaniem testów immunodetekcyjnych ocenialiśmy skuteczność przewlekłego leczenia morfiną. W tym celu rejestrowano masę zwierząt w dniu wszczepienia granulatu oraz w dniu uśmiercenia (dzień 10). Dwuczynnikowa analiza ANOVA ujawniła istotny główny wpływ adrenalektomii na przyrost masy ciała [F(1,47)
=13.24, str=0.0007), leczenie morfiną [F(1,47)=281.05, str<0.0001] i interakcję pomiędzy ADX a leczeniem morfiną [F(1,47)=4.13, str=0.0479]. Zgodnie z wcześniejszymi ustaleniami [29], [30], post hoc analiza wykazała, że zarówno grupy pozorowane, jak i grupy ADX uzależnione od morfiny wykazały znaczący (str<0.001) mniejszy przyrost masy ciała (−13.75±5.0 g, n=12; 3.84±2.45 g, rz=13) niż obserwowane u zwierząt pozorowanych i zwierząt ADX otrzymujących peletki placebo (44.58±1.7 g, n=12; 49.57±2.4 g, rz=12), co przypisano zmniejszonemu spożyciu pokarmu obserwowanemu u tych zwierząt [29].
W celu sprawdzenia skuteczności adrenalektomii mierzono stężenie hormonów w osoczu. Dwuczynnikowa analiza ANOVA badająca wpływ adrenalektomii i morfiny na stężenie ACTH i kortykosteronu w osoczu wykazała istotne główne skutki adrenalektomii [ACTH: F(1,18)=68.12, str<0.0001; kortykosteron: F(1,45)=10.42, str=0.0023). Zgodnie z oczekiwaniami, Newman post hoc badanie wykazało (Rys. S1), że w placebo (n=6)- i morfina (n=4) - Stężenie ACTH w osoczu szczurów ADX było wyższe (str<0.001) w porównaniu ze zwierzętami poddanymi pozorowanej operacji w przypadku dwóch ocenianych terapii (placebo, n=6; i morfina, n=6). Nie zaobserwowano żadnych zmian w stężeniu kortykosteronu w osoczu pomiędzy ADX i placebo (n=14) i ADX-morfina (nr=13) leczone szczury. Stężenie kortykosteronu u szczurów leczonych ADX-morfiną było znacząco (p<0.01) niższe niż te obserwowane w pozorowanej morfinie (n=10) leczone szczury. Nie zaobserwowano znaczących zmian w grupie otrzymującej terapię pozorowaną morfiną w porównaniu z grupą otrzymującą placebo (n=12).
Adrenalektomia w różny sposób osłabia FosB/ΔFosB wywołane uzależnieniem od morfiny w podobszarach układu stresu mózgu
U zwierząt kontrolnych (szczury z wszczepionym placebo) zidentyfikowano słabą konstytutywną ekspresję FosB/ΔFosB-IR we wszystkich obszarach układu mózgowego związanego ze stresem. Przewlekłe leczenie morfiną spowodowało pojawienie się FosB/ΔFosB we wszystkich badanych obszarach mózgu. W NAc(shell) dwukierunkowa ANOVA wykazała znaczące główne efekty adrenalektomii [F(1,16)=6.44, str=0.0220] i przewlekłe leczenie morfiną [F(1,16)=19.98, str=0.0004]. Test post hoc Newmana-Keulsa wykazał (Ryc. 2A – E), że u szczurów leczonych morfiną nastąpił znaczący (p<0.01) wzrost ekspresji FosB/ΔFosB. U szczurów ADX zależnych od morfiny zaobserwowano znaczące (p<0.05) zmniejszenie ekspresji białka FosB/ΔFosB w NAc. Dwuczynnikowa analiza ANOVA dla BNST wykazała istotny efekt główny przewlekłego leczenia morfiną [F(1,16)=48.92, str<0.0001]. Analiza post hoc wykazała wzrost (s<0.001) w FosB/ΔFosB zarówno u zwierząt pozornie zależnych od morfiny, jak i ADX, co wskazuje, że regulacja FosB/ΔFosB była związana z przewlekłą ekspozycją na morfinę niezależnie od stężenia GC (Ryc. 2F – J). Dwuczynnikowa analiza ANOVA dla FosB/ΔFosB w CeA wykazała istotny wpływ adrenalektomii [F(1,15)=20.51, str=0.0004] i obróbka wstępna morfiną [F(1,15)=27.52, str<0.0001]. Post hoc test wykazał znaczny wzrost (p<0.01) poziomów FosB/ΔFosB u szczurów otrzymujących pozornie morfinę w porównaniu ze szczurami pozornie otrzymującymi placebo, który był osłabiony (p<0.01) w grupie ADX zależnej od morfiny (Ryc. 2K–O). Ponadto szczury ADX, którym podano granulat placebo, wykazywały niższy poziom (p<0.01) FosB/ΔFosB niż grupa otrzymująca pozorowane placebo.
Dwuczynnikowa analiza ANOVA badająca wpływ adrenalektomii i morfiny na ekspresję FosB/ΔFosB w PVN (podział okołokomórkowy) ujawniła istotny wpływ leczenia morfiną [F(1,16)=16.31, str<0.0001]. Post hoc analiza wykazała znaczny (Ryc. 3A – E) wzrost (str<0.05) w FosB/ΔFosB-IR w PVN od szczurów leczonych pozornie i ADX-morfiną. W NTS-A2 grupie komórek katecholaminergicznych dwuczynnikowa ANOVA ujawniła główny efekt leczenia morfiną [F(1,11)=76.33, str<0.0001]. Post hoc analiza wykazała znaczny (Ryc. 3F – J) wzrost FosB/ΔFosB-IR u szczurów, którym podano morfinę w porównaniu z grupą, której podano placebo (p<0.001), który był osłabiony (p<0.05) w grupie ADX zależnej od morfiny.
Przewlekła ekspozycja na morfinę indukuje ekspresję FosB/ΔFosB w neuronach CRH w PVN, BNST i CeA. Wpływ glukokortykoidów
Dwukierunkowa analiza ANOVA dla neuronów FosB/ΔFosB-dodatnich/CRH-dodatnich w BNST wykazała główny efekt adrenalektomii [F(1,20)=64.43, str<0.0001] i istotną interakcję pomiędzy adrenalektomią a leczeniem morfiną [F(1,20)=6.80, str=0.0169]. W PVN dwukierunkowa ANOVA ujawniła istotny główny efekt adrenalektomii [F(1,19)=11.35, str=0.0032]. Dwukierunkowa analiza ANOVA dla neuronów FosB/ΔFosB-dodatnich/CRH-dodatnich w CeA wykazała znaczący główny efekt adrenalektomii [F(1,20)=106.85, str<0.0001], leczenie morfiną [F(1,20)=7.33, str=0.0136] i istotną interakcję pomiędzy adrenalektomią a wstępnym leczeniem farmakologicznym [F(1,20)=7.07, str=0.0151]. Ryciny 4, , 5,5, ,66 pokazują reprezentatywne obrazy skrawków BNST, PVN i CeA od szczurów pozorowanych lub kontrolnych ADX i szczurów zależnych od morfiny. Post hoc analiza ujawniła, że stwierdzono, że znaczna liczba neuronów dodatnich FosB/ΔFosB wykazuje wspólną ekspresję CRH w BNST (p<0.01; Rys. 4E), PVN (s<0.05; Rys. 6E) i CeA (str<0.01; Rys. 6E) u szczurów otrzymujących pozornie morfinę w porównaniu z grupą otrzymującą pozornie placebo. Dodatkowo, liczba neuronów FosB/ΔFosB-dodatnich wykazujących wspólną ekspresję CRH u szczurów ADX, którym podano placebo i u szczurów zależnych od morfiny, była znacząco niższa w trzech jądrach w porównaniu z odpowiednim leczeniem u pozorowanych zwierząt, jak pokazano na Ryciny 4, , 5,5, ,66 (BNST: s<0.01 vs. pozorowane plus placebo; P<0.001 vs. pozorowana plus morfina; PVN: s. XNUMX<0.05 vs. pozorowane plus placebo; P<0.001 vs. pozorowana plus morfina; CeA: str. XNUMX<0.001 vs pozoracja plus placebo i vs pozoracja plus morfina).
Na poziomie BNST dwukierunkowa analiza ANOVA dla liczby neuronów CRH-dodatnich wykazała, że istnieje główny efekt ADX [F(1,20)=103.92, p<0.0001] oraz przewlekła morfina [F(1,20)=4.35, p<0.05]. Jak pokazano w Tabela 1, Newmana – Keulsa post hoc test ujawnił, że szczury ADX, którym podano placebo i morfinę, wykazywały mniejszą liczbę neuronów CRH (p<0.001) niż grupy otrzymujące pozornie placebo lub grupy zależne od morfiny. W PVN dwuczynnikowa ANOVA wykazała istotny wpływ adrenalektomii [F(1,19)=11.35, str=0.0032]. Dwukierunkowa analiza ANOVA dla wszystkich neuronów CRH na poziomie CeA ujawniła istotny wpływ ADX [F(1,20)=240.09, p<0.0001] i główna interakcja ADX z przewlekłą morfiną [F(1,20)=4.49, str=0.0467]. Tabela 1 przedstawia, że nastąpił znaczny spadek liczby neuronów CRH w CeA u szczurów ADX leczonych placebo lub morfiną. Tabela 1 pokazuje również, że przewlekła ekspozycja na morfinę powoduje podwyższenie (p<0.05) neuronów CRH-dodatnich na poziomach BNST i CeA.
Wpływ adrenalektomii na FosB/ΔFosB na neurony DYN-dodatnie w NAc (powłoce)
Nie zaobserwowaliśmy znaczących zmian w liczbie komórek pro-DYN-dodatnich, które koeksprymują FosB/ΔFosB w NAc (powłoce) po przewlekłej ekspozycji na morfinę (Rys. 7) w odniesieniu do grupy placebo. Dwukierunkowa analiza ANOVA dla neuronów FosB/ΔFosB-dodatnich/pro-DYN-dodatnich w NAc (powłoce) wykazała główny efekt ADX [F(1,19)=10.11, str=0.0049]. Jak pokazano w Rys. 7C, liczba neuronów FosB/ΔFosB-dodatnich, które wyrażają pro-DYN u szczurów ADX zależnych od morfiny, była znacząco (p<0.05) niższe w odniesieniu do odpowiedniego leczenia zwierząt pozorowanych. Jak pokazano w Tabela 1, ADX nie indukował żadnych zmian w całkowitej liczbie komórek pro-DYN z NAc (powłoki).
Adrenalektomia hamuje wywołane uzależnieniem od morfiny FosB/ΔFosB w neuronach TH-dodatnich w NTS-A2 Grupa komórek noradrenergicznych
Dwukierunkowa ANOVA dla neuronów FosB/ΔFosB-dodatnich/TH-dodatnich w NTS-A2 wykazał główny efekt ADX [F(1,15)=64.86, str<0.0001], leczenie morfiną [F(1,15)=29.62, str<0.0001] oraz istotną interakcję pomiędzy adrenalektomią a leczeniem morfiną [F(1,15)=19.24, str=0.0005]. Newmana-Keulsa post hoc test wskazuje, że stwierdzono, że znaczna liczba neuronów dodatnich pod względem FosB/ΔFosB wykazuje koekspresję TH w NTS (p<0.001; Rys. 7F) u szczurów otrzymujących pozorowaną morfinę. Ponadto liczba neuronów FosB/ΔFosB-dodatnich wykazujących wspólną ekspresję TH u szczurów ADX zależnych od morfiny była znacząco niższa (p<0.001) w porównaniu z odpowiednim leczeniem zwierząt pozorowanych, jak pokazano w Rys. 7F. Z drugiej strony, jak pokazano na Tabela 1, ADX nie indukował żadnych zmian w neuronach ogółem TH-dodatnich w NTS.
Dyskusja
Obecne wyniki wskazują po raz pierwszy, że sygnalizacja GC w mózgu moduluje ekspresję FosB/ΔFosB indukowaną przewlekłym podawaniem morfiny w układzie stresu mózgowego w sposób specyficzny dla regionu.
Zbieżne dowody wskazują, że stres zwiększa ryzyko zachowań uzależniających [18]. Trwałe bodźce stresowe zmieniają syntezę, ekspresję i sygnalizację w szlakach związanych ze stresem (np. CRH, GC, NA itp.). Ponadto narkotyki wpływają na szlaki stresu, co skutkuje zmianą w ekspresji genów, co ma wpływ sygnalizacyjny na cząsteczki związane z nagrodą i stresem [31]. Stres i nadużywane leki mają tę samą zdolność wyzwalania nakładających się wzorców aktywacji neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym, co skutkuje natychmiastową aktywacją ekspresji genów.
Szeroko opisano, że substancje uzależniające i przewlekłe bodźce stresowe zwiększają ekspresję czynnika transkrypcyjnego ΔFosB w głównych jądrach biorących udział w ich pozytywnym działaniu wzmacniającym [12], [13], [32], [33]i zaproponowano, że utrzymujący się wpływ ΔFosB na geny docelowe może odgrywać ważną rolę w rozwoju adaptacji charakteryzujących uzależnienie [9], [34]. Jednak niewiele wiadomo na temat ekspresji ΔFosB w układzie stresu mózgowego po przewlekłym podawaniu narkotyków lub molekularnych mechanizmach akumulacji ΔFosB wywołanej morfiną w obszarach związanych ze stresem.
W niniejszym badaniu badaliśmy wpływ GC na indukowaną morfiną ekspresję FosB/ΔFosB w hormonalnym układzie stresu (oś HPA), który jest kontrolowany przez CRH w PVN, jak również w pozapodwzgórzowych układach stresu (do których należą m.in. rozszerzone ciało migdałowate; [35]), za pośrednictwem CRH i innych układów związanych ze stresem (w tym NA i dynorfina; [19]).
Niedawno wykazaliśmy, że przewlekłe podawanie morfiny przez siedem dni zwiększało ekspresję FosB/ΔFosB w rozszerzonym ciele migdałowatym, PVN i NTS-A2 [14]. Zgodnie z tymi danymi, obecne wyniki pokazują, że przewlekłe podawanie morfiny wywołało wzrost FosB/ΔFosB w CeA, BNST i NAc(shell), jak również w PVN i NTS-A2. Rozszerzone ciało migdałowate zostało powiązane z nagrodą za narkotyki. W rzeczywistości wszystkie główne narkotyki aktywują transmisję dopaminergiczną z VTA do NAc (powłoki) i CeA. Wykazano, że ta aktywacja i wynikające z niej pozytywne, wzmacniające działanie substancji uzależniających są powiązane z działaniami GC na GR zlokalizowanymi w VTA [28]. Potwierdzając tę hipotezę, nasze wyniki pokazują, że FosB/ΔFosB-IR w NAc (skorupie) i CeA był atenuowany u zwierząt ADX, co może wskazywać na wzajemne oddziaływanie czynników transkrypcyjnych AP-1 i GR podczas uzależnienia od morfiny [36]. W przeciwieństwie do obserwowanego wpływu ADX na ekspresję FosB w NAc i CeA, obecne wyniki sugerują, że przewlekła morfina zwiększała ekspresję Fos/ΔFosB w PVN i BNST w sposób niezależny od GC.
Kilka neuroprzekaźników układu stresu mózgowego, takich jak CRH, NA i DYN, powiązano ze stanami awersyjnymi charakterystycznymi dla procesu uzależnienia [35], [37]-[39]. Obecne ustalenia wykazały, że przewlekła ekspozycja na morfinę wywołała znaczny wzrost ekspresji Fos/ΔFosB w neuronach zawierających CRH w BNST, CeA i PVN. Rodzina czynników transkrypcyjnych Fos może działać w miejscach cyklicznego elementu odpowiedzi na AMP (CRE). [40]. Znaczące dowody wskazują, że ΔFosB może działać jako represor lub aktywator transkrypcji [40], [41]. solnawet jeśli gen CRH ma motyw CRE w swojej sekwencji promotorowej, można zaproponować, że akumulacja FosB/ΔFosB w neuronach CRH może pośredniczyć w wywołanych morfiną zmianach w poziomach CRH, jak opisano w przypadku działania kokainy [42], zwłaszcza w CeA i BNST, gdzie po raz pierwszy zaobserwowaliśmy zwiększenie liczby neuronów CRH-dodatnich w czasie uzależnienia od morfiny. Na poparcie tej hipotezy opisano wzrost poziomu mRNA CRH w CeA po długotrwałym podawaniu morfiny [43]. Jednakże liczba neuronów CRH-dodatnich w PVN po przewlekłym leczeniu morfiną nie uległa zmianie. Wyniki te są zgodne z wcześniejszymi ustaleniami wskazującymi, że przewlekła ekspozycja na morfinę nie powoduje zmian w hnRNA PVN CRH [44]. Ponieważ ekspresja PVN CRH jest regulowana w dół przez GC [45]i biorąc pod uwagę tę obecną pracę i inne [29], [44] wykazano, że przewlekła ekspozycja na opiaty nie wpływa na uwalnianie kortykosteronu, logiczne wydaje się, że przewlekłe podawanie morfiny nie zmieniało liczby komórek CRH.
Obwodowe podanie kortykosteronu zwiększa ekspresję mRNA CRH w CeA i BNST [46], [47]. Dodatkowo ADX zmniejszył ekspresję CRH w CeA [48], [49]. W związku z tym zaobserwowaliśmy, że wzrost liczby neuronów CRH w BNST i CeA podczas uzależnienia od morfiny został zniesiony po adrenalektomii. Biorąc pod uwagę, że wzrost Fos/ΔFosB w neuronach CRH podczas uzależnienia od morfiny został osłabiony u zwierząt ADX, można zasugerować rolę Fos/ΔFosB w regulacji ekspresji CRH przez GC w rozszerzonym ciele migdałowatym. Z drugiej strony dobrze wiadomo, że GC negatywnie reguluje ekspresję genu CRH w PVN [45]. Zgodnie z tym, obecne dane wyraźnie wykazały, że adrenalektomia zniosła wzrost Fos/ΔFosB-IR w neuronach zawierających CRH podczas uzależnienia od morfiny w tym jądrze.
W tym badaniu dane immunochemiczne ujawniły, że przewlekłe leczenie morfiną znacząco zwiększyło barwienie Fos/ΔFosB w NTS-A2, który spadł po ADX. Kiedy zbadaliśmy specyficzne populacje neuronowe, które wyrażały FosB/ΔFosB, stwierdziliśmy silny wzrost Fos/ΔFosB-IR w neuronach dodatnich pod względem TH (enzymu ograniczającego szybkość syntezy katecholamin). Wykazano, że NA odgrywa główną rolę w uzależnieniu [50]. We wcześniejszych pracach przewlekła ekspozycja na morfinę wywołała wzrost poziomu TH w NTS-A2 [14], [29]. Wiadomo, że gen TH ma w swoim promotorze miejsce AP-1 [51]. Nasze wyniki mogą sugerować, że FosB/ΔFosB bierze udział w wywołanym opioidami wzroście poziomów TH w NTS-A2. Grupa komórek noradrenergicznych pnia mózgu wyraża wysoki poziom receptorów GC (GR). Wykazano, że GC odgrywają permisywną rolę w neurotransmisji noradrenergicznej [29], [30], [52]. Odpowiednio, podawanie antagonistów GR wpływało na kilka aspektów aktywności NA, w tym aktywację TH i aktywność neuronalną [30]. Obecne wyniki pokazały, że po ADX nastąpił spadek liczby komórek TH-dodatnich wyrażających FosB/ΔFosB w NTS-A2. Wzięto pod uwagę, że adrenalektomia blokowała wzrost poziomu białka TH w NTS-A2 podczas uzależnienia od morfiny [29]i że w promotorze genu TH opisano miejsce GRE/AP-1 [53], nasze dane mogą wskazywać ΔFosB jako mediator wpływu GC na aktywność noradrenergiczną w NTS-A2 podczas uzależnienia od opiatów.
Postulowano, że DYN jest możliwym genem docelowym ΔFosB [54], [55]. Nasze wyniki pokazują, że przewlekła ekspozycja na morfinę nie zmieniła znacząco ekspresji FosB/ΔFosB w neuronach wyrażających pro-DYN w NAc (powłoka). Jeśli chodzi o regulację ekspresji DYN przez ΔFosB, Zachariou i in [33] opisali niewielki, ale znaczący spadek poziomów mRNA DYN w NAc od myszy z nadekspresją ΔFosB, postulując w ten sposób, że ten czynnik transkrypcyjny hamuje ekspresję DYN. Z naszych danych nie można wyciągnąć wniosku, że przewlekła morfina modyfikuje ekspresję DYN poprzez aktywność FosB/ΔFosB, biorąc pod uwagę, że nasze wyniki uzyskano na poziomie białka.
Postulowano, że układ opioidowy DYN/kappa wydaje się indukować stany prodepresyjne z elementami niechęci. Ta awersyjna reakcja może obejmować wzajemne interakcje z NAc, DA i pozapodwzgórzowym układem CRH [35]. Jednak niewiele wiadomo na temat możliwej regulacji GC ekspresji DYN w NAc. Zaproponowano, że ΔFosB w NAc, częściowo poprzez tłumienie ekspresji DYN, zwiększa wrażliwość na nagradzające działanie morfiny i kokainy i prowadzi do odporności na stres [9], [33]. Nasze dane potwierdzają rolę GC w regulowaniu pozytywnego wzmacniającego działania morfiny, w którym pośredniczy mezokortykolimbiczny układ DA, biorąc pod uwagę, że liczba neuronów dodatnich FosB/ΔFosB/pro-DYN zmniejsza się w NAc u szczurów ADX. W efektach tych może pośredniczyć bezpośrednio GR, który jest obecny na całej mezolimbicznej ścieżce nagrody, lub pośrednio poprzez projekcje CRH powstające z CeA i/lub BNST do VTA i NAc, które są niedostatecznie aktywowane podczas uzależnienia od morfiny u szczurów ADX.
Podsumowując, badanie to dostarcza dowodów na to, że GC są krytycznie zaangażowane w akumulację FosB/ΔFosB w układach stresu mózgowego po przewlekłej ekspozycji na morfinę, co może skutkować trwałymi zmianami we wzorze ekspresji genów w obszarach związanych ze stresem. Niniejsze odkrycia wskazują również, że FosB/ΔFosB może przyczyniać się do zależnych od GC zmian w plastyczności układu stresu mózgowego podczas uzależnienia od opiatów. Konieczne są dalsze badania w celu określenia mechanizmów wewnątrzkomórkowych, za pomocą których przewlekłe opiaty indukują FosB/ΔFosB w wybranych obszarach związanych ze stresem, a także mechanizmu odpowiedzialnego za tłumienie indukowanej morfiną ekspresji FosB/ΔFosB przez GC.
Metody
Materiały
Kortykosteron i cholesterol zakupiono od Sigma Chemical Co. (St Louis, MO, USA). Peletki kortykosteronu zostały wytworzone przez dr Mártona Vajnę (Wydział Administracji Farmacji, Uniwersytet Farmaceutyczny, Uniwersytet Semmelweisa, Budapeszt, Węgry). Peletki zasady morfiny (Alcaliber Laboratories, Madryt, Hiszpania) lub laktozy (kontrola) przygotowano na Wydziale Farmacji i Technologii Farmaceutycznej (Szkoła Farmacji, Granada, Hiszpania). Pentobarbital zakupiono od Hospira (Hoofddorp, Holandia). Chlorowodorek ketaminy i ksylazynę zakupiono od Labs. Merial (Lyon, Francja) i Labs. Calier (Barcelona, Hiszpania).
Zwierzęta
Samce szczurów Sprague-Dawley (220–240 g na początku eksperymentu; Harlan, Barcelona, Hiszpania) trzymano w parach w klatkach (długość 45 cm, szerokość 24 cm, wysokość 20 cm) po przybyciu do pomieszczenia o kontrolowanej temperaturze (22±2°C) i wilgotności (50±10%), ze swobodnym dostępem do wody i pożywienia (standardowa karma dla gryzoni Harlan Teklad; Harlan Interfauna Ibérica, Barcelona, Hiszpania). Zwierzęta przystosowano do standardowego 12-godzinnego cyklu światło-ciemność (włączenie światła: 08:00 min – 20:00 min) przez 7 dni przed rozpoczęciem doświadczeń. Wszystkie procedury chirurgiczne i eksperymentalne zostały wykonane zgodnie z Dyrektywą Rady Wspólnot Europejskich z dnia 24 listopada 1986 roku (86/609/EEC) i zostały zatwierdzone przez lokalne Komitety ds. Badań na Zwierzętach (REGA ES300305440012). Badanie zostało zatwierdzone przez komisję bioetyczną Uniwersytetu w Murcji (RD 1201/2005) i Ministerio de Ciencia y Tecnología (SAF/FEDER 2009-07178) w Hiszpanii.
Adrenalektomia
Szczurom obustronnie usunięto adrenalektomię i wszczepiono granulkę kortykosteronu, aby zapewnić niski, ale stabilny poziom GC [29]. Szczurom obustronnie wykonano adrenalektomię (ADX) z dostępu grzbietowego w znieczuleniu w dawce 90 mg/kg chlorowodorku ketaminy i 8 mg/kg ksylazyny (i.p.), po czym podczas operacji wszczepiono im podskórnie (s.c.) peletki kortykosteronu o powolnym uwalnianiu. Skład granulek steroidów (25 mg kortykosteronu plus 75 mg cholesterolu) został dobrany w taki sposób, aby zapewnić stabilne stężenie kortykosteronu odpowiadające najniższemu dobowemu nadirowi do 20 dni po implantacji [56]. U szczurów ADX z substytucją kortykosteronu (ADX plus kortykosteron) nie obserwuje się wzrostu stężenia kortykosteronu w osoczu wywołanego prowokacją [56]. Po operacji szczury z ADX i kortykosteronem miały swobodę wyboru, czy piją izotoniczną sól fizjologiczną (0.9% NaCl), aby zastąpić zubożony sód wtórny do utraty aldosteronu w wyniku adrenalektomii. Szczury kontrolne poddano tej samej procedurze chirurgicznej (pozorowanej) bez wycięcia nadnerczy. Szczurom pozorowanym i ADX plus kortykosteron pozwolono na powrót do zdrowia po operacji przez 5 dni przed procedurą uzależnienia od morfiny. Skuteczną obustronną adrenalektomię potwierdzono na podstawie stężenia kortykosteronu i ACTH w osoczu oraz na podstawie sekcji zwłok zwierząt ADX.
Leczenie farmakologiczne i procedura eksperymentalna
Pięć dni po zabiegu szczurom wszczepiono podskórnie. z dwoma granulkami morfiny po 75 mg w lekkim znieczuleniu eterowym. Szczury kontrolne otrzymywały peletki placebo zawierające laktozę. Wykazano, że procedura ta powoduje uzyskanie stałego stężenia morfiny w osoczu, rozpoczynającego się kilka godzin po wszczepieniu peletek i pełnego zespołu odstawiennego po ostrym wstrzyknięciu antagonistów opioidów [57]. Uzależnienie od morfiny osiąga się po 24 godzinach od wszczepienia peletek i utrzymuje się na stałym poziomie przez 15 dni [58]. Dziesięć dni po wszczepieniu peletek morfiny lub placebo szczury uśmiercano. Cztery warunki eksperymentalne badane pod kątem aktywności osi HPA (stężenie kortykosteronu i ACTH w osoczu), ekspresji FosB/ΔFosB, ekspresji CRH, ekspresji DYN, ekspresji TH i ekspresji FosB/ΔFosB w neuronach CRH-, DYN- i TH-dodatnich to: (i) pozorowane placebo; (ii) pozorowana morfina; (iii) ADX-placebo; (iv) ADX-morfina. Podczas leczenia sprawdzono przyrost masy ciała szczurów, aby upewnić się, że morfina została prawidłowo uwolniona z granulek, ponieważ wiadomo, że długotrwałe leczenie morfiną powoduje zmniejszenie przyrostu masy ciała spowodowane niższym spożyciem kalorii [29].
Perfuzja i sekcje mózgu
Szczury głęboko znieczulono przedawkowaniem pentobarbitalu (100 mg/kg i.p.) i perfundowano przezsercowo solą fizjologiczną, a następnie utrwalaczem zawierającym paraformaldehyd (4% paraformaldehyd w 0.1 M buforze boranowym, pH 9.5). Po usunięciu perfundowanych mózgów, utrwalono je w tym samym utrwalaczu przez 3 godziny i przechowywano w temperaturze 4°C w PBS zawierającym 10% sacharozy, aż do pocięcia skrawków koronowych (o grubości 30 µm) w kierunku rostrokaudalnym na mikrotomie zamrażającym (Leica, Nussloch , Niemcy). Atlas Paxinosa i Watsona (2007) [59] wykorzystano do identyfikacji różnych obszarów mózgu szczurów: NAc (skorupa), BNST, PVN, CeA i NTS-A2 (Rysunek 1). Skrawki zabezpieczono kriogenicznie i przechowywano w temperaturze -20°C do czasu użycia.
Immunohistochemia FosB/ΔFosB
Skrawki poddano immunohistochemii zgodnie z opisem Núñeza i in [29]. W skrócie, po zablokowaniu 0.3% H2O2 i 2% normalnej surowicy koziej (Sigma, USA) inkubowano w pierwotnej surowicy odpornościowej anty-FosB/ΔFosB (królicza poliklonalna, #sc-48, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornia, USA; 1![[stosunek]](http://www.ncbi.nlm.nih.gov/corehtml/pmc/pmcents/x2236.gif)
1000). Przeciwciało pierwszorzędowe użyte w tym badaniu nie rozróżnia FosB od jego stabilnego wariantu splicingowego ΔFosB. Wykazano, że powtarzająca się ekspozycja na bodźce indukujące FosB zmniejsza wrażliwość na ostrą indukowalność FosB [15], [40], [60]. Dlatego różnice między barwieniem FosB/ΔFosB u szczurów traktowanych wstępnie i nietraktowanych morfiną można interpretować jako odzwierciedlające przede wszystkim różnice w akumulacji ΔFosB. Antygeny wizualizowano za pomocą konwencjonalnego protokołu awidyna-biotyna-immunoperoksydaza (zestaw Vectastain ABC Elite; Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornia, USA). Reakcję tetrachlorowodorku 3,3′-diaminobenzydyny (DAB; Sigma, USA) zintensyfikowano dodatkiem siarczanu niklu i amonu. Skrawki umieszczono na szkiełkach pokrytych żelatyną z ałunu chromowego, odwodniono i nakryto szkiełkami nakrywkowymi.
Immunohistochemia podwójnego znakowania jąder immunoreaktywnych FosB/ΔFosB oraz neuronów CRH-, TH- i DYN-dodatnich
W przypadku podwójnego znakowania FosB/ΔFosB-TH skrawki tkanek od każdego szczura w każdej grupie leczenia poddano obróbce pod kątem immunoreaktywności FosB/ΔFosB przy użyciu intensyfikacji niklu DAB, a następnie ujawniono TH przy użyciu samego chromogenu DAB. Barwienie immunologiczne FosB/ΔFosB przeprowadzono jak opisano wcześniej. Po wybarwieniu FosB/ΔFosB skrawki przepłukano w PBS, potraktowano 2% normalną surowicą kozią, a następnie inkubowano przez noc z króliczym przeciwciałem poliklonalnym anty-TH (AB152, Chemicon, USA; 16000) w temperaturze pokojowej. Zastosowano te same procedury immunohistochemiczne, które opisano powyżej. W DAB opracowano kompleks przeciwciało TH – peroksydaza. Skrawki umieszczono na szkiełkach pokrytych żelatyną chromowo-alunową i nakryto szkiełkami nakrywkowymi.
W przypadku podwójnego znakowania FosB/ΔFosB-CRH i FosB/ΔFosB-pro-DYN proces był taki sam, jak opisano wcześniej dla FosB/ΔFosB-TH. W celu wykrycia neuronów wykazujących ekspresję DYN w NAc zastosowano procedurę odzyskiwania antygenu poprzez inkubację skrawków mózgu w buforze cytrynianowym (10 mM kwas cytrynowy, 0.05% Tween 20, pH 6.0) w temperaturze 60°C przez 20 minut przed procedurą blokowania. Podstawowa królicza surowica odpornościowa anty-CRH została udostępniona dzięki uprzejmości Wylie W. Vale (The Salk Institute, La Jolla, Kalifornia, USA) i została użyta w 1Rozcieńczenie 500 przez 72 godziny w 4°C. Pierwotne przeciwciało pro-DYN zakupiono od Neuromics (# GP10110, Neuromics, Edina, MN, USA) i rozcieńczono 12000 (72 godz., 4°C).
Analiza obrazu
Obrazy wykonano za pomocą mikroskopu Leica (DM 4000B; Leica) podłączonego do kamery wideo (DFC290, Leica). Jądra komórkowe FosB/ΔFosB-dodatnie zliczano przy użyciu komputerowego systemu analizy obrazu (QWIN, Leica). Granice NTS-A2Nakreślono BNST, CeA, NAc(skorupa) i okołokomórkowy podział PVN i zarejestrowano liczbę profili pozytywnych. Liczbę profili jądrowych FosB/ΔFosB w granicach interesujących grup komórek zliczono obustronnie w czterech do pięciu skrawkach od każdego szczura i uśredniono w celu uzyskania pojedynczej wartości dla każdego szczura. Aby uniknąć stronniczości obserwatora, wszystkie sekcje zostały ocenione ilościowo przez zaślepionego badacza. Całkowite zliczenia dla różnych obszarów mózgu wyrażono jako średnią ± SEM.
Kwantyfikacja komórek TH, CRH i DYN-dodatnich oraz profili podwójnie barwionych FosB/ΔFosB
Pozytywne jądra pod względem immunoreaktywności FosB/ΔFosB wykryto przy użyciu tej samej konwencjonalnej mikroskopii świetlnej opisanej powyżej i zliczono przy powiększeniu x40. Komórki CRH, TH lub DYN dodatnie pod względem FosB/ΔFosB zidentyfikowano jako komórki z brązowymi złogami cytozolowymi dla barwienia CRH-dodatniego, TH-dodatniego i DYN-dodatniego oraz barwienia jądrowego na niebiesko/ciemno dla FosB/ΔFosB. Na przechwycony obraz nałożono kwadratowe pole (195 µm) w celu wykorzystania go jako obszaru odniesienia. Liczbę podwójnie znakowanych neuronów obserwowanych obustronnie zliczano w czterech do pięciu skrawkach od każdego zwierzęcia w PVN, BNST i CeA w przypadku neuronów CRH, NTS w przypadku neuronów TH i NAc w przypadku neuronów DYN. Do analizy włączono także komórki CRH, TH i DYN dodatnie bez widocznego jądra (komórki CRH, TH lub DYN ujemne FosB/ΔFosB).
Test radioimmunologiczny
Krew zebrano do chłodzonych lodem probówek zawierających 5% EDTA, a następnie odwirowano (500 g; 4°C; 15 minut). Osocze oddzielono, podzielono na dwie porcje i przechowywano w temperaturze -80°C do czasu oznaczenia kortykosteronu lub ACTH. Stężenie kortykosteronu i ACTH w osoczu oznaczano ilościowo przy użyciu specyficznych przeciwciał przeciwko kortykosteronowi i ACTH dla szczurów ([125I]-CORT i [125I]-ACTH RIA; MP Biomedicals, Orangeburg, NY, USA). Czułość testu wyniosła 7.7 ng/ml dla kortykosteronu i 5.7 pg/ml dla ACTH.
Analiza statystyczna
Dane przedstawiono jako średnią ± SEM i analizowano przy użyciu pakietu statystycznego GraphPad Prism (San Diego, Kalifornia, USA). Dane analizowano za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z leczeniem (placebo, morfina) i zabiegiem chirurgicznym (pozorowanym, ADX) jako zmiennymi niezależnymi. Newmana-Keulsa post hoc Do porównań indywidualnych grup wykorzystano test. Za istotne uznano różnice przy p<0.05.
Informacje uzupełniające
Rysunek S1
Wpływ adrenalektomii (ADX) na stężenia ACTH (A) i kortykosteronu (B) w osoczu u zwierząt kontrolnych i zwierząt leczonych morfiną. Chirurgiczne ADX zwiększało poziom ACTH zarówno u szczurów leczonych placebo, jak i u szczurów leczonych morfiną, podczas gdy zmniejszało stężenie kortykosteronu w osoczu u szczurów leczonych morfiną. Dane przedstawiają średnią ± SEM poziomów ACTH i kortykosteronu w osoczu u szczurów, którym przez 10 dni podano placebo lub morfinę. ***P<0.001 w porównaniu z pozorowanym placebo; ++p<0.01, + + +p<0.001 w porównaniu z pozorowaną morfiną.
(TIF)
Podziękowanie
Dziękujemy dr Mártonowi Vajnie i Annie Földes z Uniwersytetu Semmelweis (Budapeszt, Węgry) za przygotowanie granulek kortykosteronu.