(LUDZI) Reakcje behawioralne i strukturalne na proliferację kokainy wymagają pętli feedforward z udziałem ΔFosB i zależnej od wapnia / kalmoduliny kinazy białkowej II w powłoce Nucleus Accumbens (2013)

Czynnik transkrypcyjny ΔFosB i wzbogacona w mózg kinaza białkowa II zależna od wapnia/kalmoduliny (CaMKIIα) są indukowane w jądrze półleżącym (NAc) w wyniku przewlekłej ekspozycji na kokainę lub inne nadużywane leki psychostymulujące, w przypadku których te dwa białka pośredniczą w reakcjach na lek uwrażliwiony . Chociaż zarówno ΔFosB, jak i CaMKIIα regulują ekspresję i funkcję receptora glutaminianu AMPA w NAc, tworzenie kolców dendrytycznych na średnich neuronach kolczastych NAc (MSN) i uczulenie narządu ruchu na kokainę, jak dotąd nie badano bezpośredniego związku między tymi cząsteczkami. Tutaj pokazujemy, że ΔFosB jest fosforylowany przez CaMKIIα w Ser27 stabilizującym białko i że CaMKII jest wymagane do akumulacji ΔFosB za pośrednictwem kokainy w szczurzym NAc.

I odwrotnie, pokazujemy, że ΔFosB jest zarówno konieczny, jak i wystarczający do indukcji kokainy ekspresji genu CaMKIIα in vivo, efektu selektywnego dla D₁-typ MSN w podregionie powłoki NAc.

Ponadto indukcja kolców dendrytycznych na MSN NAc i zwiększona reakcja behawioralna na kokainę po nadekspresji ΔFosB NAc są zależne od CaMKII.

Co ważne, po raz pierwszy demonstrujemy indukcję ΔFosB i CaMKII w NAc ludzi uzależnionych od kokainy, sugerując możliwe cele przyszłej interwencji terapeutycznej. Dane te ustalają, że ΔFosB i CaMKII angażują się w specyficzną dla typu komórki i regionu mózgu dodatnią pętlę wyprzedzającą jako kluczowy mechanizm regulacji obwodu nagrody w mózgu w odpowiedzi na przewlekłą kokainę.

Wprowadzenie

Coraz więcej dowodów potwierdza pogląd, że zmiany w ekspresji genów przyczyniają się do mechanizmów uzależnienia od narkotyków (Robison i Nestler, 2011). Jednym z ważnych mediatorów tych zmian jest ΔFosB, czynnik transkrypcyjny rodziny Fos (Nestler, 2008). Przewlekłe podawanie praktycznie każdego narkotyku powoduje długotrwałą akumulację ΔFosB w jądrze półleżącym (NAc), regionie limbicznym niezbędnym do zachowań nagradzających. Sindukcja wydaje się specyficzna dla klasy średnich neuronów kolczastych NAc (MSN), które wyrażają receptory dopaminowe D1. Indukowalna nadekspresja ΔFosB w tych MSN NAc typu D1 zwiększa reakcje lokomotoryczne i nagradzające na kokainę i morfinę (Kelz i wsp., 1999; Zachariou i wsp., 2006), w tym zwiększone samodzielne przyjmowanie kokainy (Colby i wsp., 2003). Co więcej, genetyczna lub wirusowa blokada aktywności transkrypcyjnej ΔFosB zmniejsza nagradzające działanie tych leków (Zachariou i wsp., 2006), wskazując, że ta trwała indukcja ΔFosB jest krytycznym mediatorem trwałych zmian wywołanych w NAc przez przewlekłe podawanie leku.

Niezwykła stabilność ΔFosB (w porównaniu do wszystkich innych białek z rodziny Fos) jest zarówno wewnętrzną właściwością cząsteczki, wynikającą z obcięcia domen degronu obecnych w FosB pełnej długości (Carle i in., 2007) i proces regulowany. ΔFosB jest fosforylowany in vitro i in vivo przy Ser27, a reakcja ta dodatkowo stabilizuje ΔFosB ~ 10-krotnie w hodowli komórkowej i NAc in vivo (Ulery-Reynolds i in., 2009). Chociaż wykazano, że Ser27-ΔFosB jest substratem dla kinazy kazeinowej-2 in vitro (Ulery i in., 2006), jego mechanizm in vivo fosforylacja pozostaje nieznana.

Kinaza białkowa II zależna od wapnia/kalmoduliny (CaMKII) jest kinazą serynowo/treoninową o wysokiej ekspresji, której izoformy α i β tworzą dodekameryczne homo- i hetero-holoenzymy in vivoi są niezbędne dla wielu form neuroplastyczności (Lisman i in., 2002; Colbran i Brown, 2004). CaMKIIα jest indukowany selektywnie w powłoce NAc przez przewlekłą amfetaminę (Loweth i in., 2010), a farmakologiczna blokada aktywności CaMKII w otoczce NAc zmniejsza uczulenie behawioralne na amfetaminę (Loweth i in., 2008) i kokaina (Pierce i in., 1998), podczas gdy wirusowa nadekspresja CaMKIIα w tym podregionie NAc zwiększa uczulenie narządu ruchu i samodzielne podawanie amfetaminy (Loweth i in., 2010). CaMKIIα może wpływać na zachowania związane z nagradzaniem poprzez modulację podjednostek receptora glutaminianu AMPA (Pierce i in., 1998), ponieważ aktywność CaMKIIα od dawna jest powiązana z funkcją receptora AMPA i celowaniem synaptycznym w kilku formach neuroplastyczności (Malinow i Malenka, 2002).

Literatura ta pokazuje kilka podobieństw między ΔFosB i CaMKII: oba są konieczne i wystarczające dla wielu skutków behawioralnych nadużywanych narkotyków, oba zwiększają poziom kolców dendrytycznych w różnych typach komórek neuronowych in vivo (Jourdain i in., 2003; Maze i wsp., 2010) i oba wywierają przynajmniej część swoich skutków behawioralnych poprzez modulację receptorów AMPA (Kelz i wsp., 1999; Malinow i Malenka, 2002; Vialou i wsp., 2010). Pomimo tych podobieństw nie jest znane żadne funkcjonalne powiązanie między ΔFosB i CaMKII. Tutaj ustalamy wzajemną regulację między ΔFosB i CaMKII i wykazujemy, że te dwa białka tworzą pętlę sprzężenia zwrotnego specyficzną dla MSN typu D1 w powłoce NAc, która jest indukowana przez kokainę i reguluje zakres odpowiedzi na kokainę in vivo.

Idź do:

Materiały i Metody

Eksperyment 1: Analiza proteomiczna iTRAQ powłoki i rdzenia NAc po leczeniu kokainą (Ryc. 1A)

Dorosłym (8-tygodniowym) samcom szczurów podawano dootrzewnowo 20 mg/kg kokainy lub soli fizjologicznej raz dziennie przez siedem dni. 24 godziny po ostatnim wstrzyknięciu otoczkę i rdzeń NAc poddano mikrodysekcji (Ryc. 1A) i zamrożono. Analizy iTRAQ przeprowadzono w sposób opisany wcześniej (Ross i in., 2004; Davalos i in., 2010).

Rysunek 1

Specyficzna dla powłoki indukcja CaMKII w NAc przez kokainę

Eksperyment 2: Ilościowe określenie zmian w białku w rdzeniu i skorupie NAc szczura po leczeniu kokainą (Ryc. 1B – D)

Dorosłym (8-tygodniowym) samcom szczurów podawano dootrzewnowo 10 mg/kg kokainy lub soli fizjologicznej jako nośnik raz dziennie przez siedem dni w komorach rejestrujących ruch. Reakcje lokomotoryczne na pojedynczy zastrzyk kokainy (5 mg/kg IP) rejestrowano u zwierząt leczonych wcześniej kokainą (tzw. „przewlekłych”) i części zwierząt leczonych solą fizjologiczną (tzw. „ostrych”), a reakcje lokomotoryczne na sól fizjologiczną u pozostałych zwierząt leczonych długotrwale solą fizjologiczną (zwanych „solą fizjologiczną”). Testy aktywności lokomotorycznej przeprowadzono zgodnie z opisem (Hiroi i wsp., 1997). W skrócie, dorosłe samce szczurów umieszczono w otwartych skrzynkach rejestracyjnych PAS o wymiarach 18 × 24 cali (San Diego Instruments) na 30 minut w celu przyzwyczajenia, podano im pojedynczy zastrzyk IP soli fizjologicznej i monitorowano przez dodatkowe 30 minut, a następnie podano im pojedynczy wstrzyknięcie IP 5 mg/kg kokainy i monitorowanie przez 30 minut.

24 godziny po ostatnim wstrzyknięciu szczury pozbawiono głów bez znieczulenia, aby uniknąć wpływu środków znieczulających na poziomy białek neuronalnych i stany fosfofosforanowe. Mózgi pocięto seryjnie na matrycę o grubości 1.2 mm (Braintree Scientific), a tkankę docelową usunięto w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami zawierającej inhibitory proteazy (Roche) i fosfatazy (Sigma Aldrich), stosując stempel nr 14 dla rdzenia NAc i stempel nr 12 dla pozostałych tkanka dla powłoki NAc (patrz Ryc. 1A) i natychmiast zamrożono na suchym lodzie. Próbki homogenizowano metodą sonikacji świetlnej w modyfikowanym buforze RIPA: 10 mM zasada Tris, 150 mM chlorek sodu, 1 mM EDTA, 0.1% dodecylosiarczan sodu, 1% Triton X-100, 1% dezoksycholan sodu, pH 7.4, inhibitory proteazy i fosfatazy jak powyżej. Po dodaniu buforu Laemmli białka rozdzielono na 4–15% żelach gradientowych poliakryloamidowych (Criterion System, BioRad) i przeprowadzono Western blot przy użyciu systemu Odyssey (Li-Cor) zgodnie z protokołami producenta.

Eksperyment 3: Ilościowe określenie zmian w białku w rdzeniu i skorupie NAc szczura po odstawieniu kokainy (Rys. 1E)

Dorosłym (8-tygodniowym) samcom szczurów podawano dootrzewnowo 10 mg/kg kokainy lub soli fizjologicznej raz dziennie przez siedem dni. 14 dni po ostatnim wstrzyknięciu zwierzętom leczonym solą fizjologiczną podano kolejny zastrzyk soli fizjologicznej (zwany „solą fizjologiczną), a zwierzętom leczonym kokainą podano kolejny zastrzyk soli fizjologicznej (zwany 14-dniowym odstawieniem lub „14d WD”) lub pojedynczy zastrzyk kokainy ( zwany „14d WD Chal” w ramach wyzwania). Godzinę po ostatnim wstrzyknięciu zwierzęta dekapitowano i przeprowadzono analizę Western jak w pkt Experiment 2.

Eksperyment 4: Ilościowe określenie zmian w białku w rdzeniu i skorupie NAc szczura po samodzielnym podaniu kokainy (Ryc. 2A – C)

Szczury szkolono w zakresie samodzielnego podawania 0.5 mg/kg/wlew kokainy w jednogodzinnych sesjach według schematu o stałym stosunku 1 przez dziewięć dni. Po dziewięciu sesjach wyjściowych szczury podzielono na dwie grupy zrównoważone spożyciem kokainy podczas dwóch ostatnich sesji. Jednej grupie szczurów pozwolono samodzielnie podawać kokainę (0.5 mg/kg/wlew) w sesjach jednogodzinnych (krótki dostęp, ShA), podczas gdy druga grupa szczurów samodzielnie podawała kokainę w sesjach sześciogodzinnych (długi dostęp, LgA ) przez dziesięć dodatkowych dni (sesje eskalacyjne).

Skrawki mózgu poddano obróbce immunohistochemicznej zgodnie z opisem (Perrotti i wsp., 2004). Mózgi poddano perfundacji 18–24 godzin po ostatniej ekspozycji na lek, co spowodowało degradację wszelkich resztkowych białek FosB pełnej długości, tak że cała pozostała immunoreaktywność odzwierciedla ΔFosB. Degradację tę potwierdzono metodą Western blot, która nie wykazała znaczącego barwienia przeciwciałem skierowanym przeciwko C-końcowi pełnej długości FosB, które nie rozpoznaje ΔFosB (dane nie pokazane). Po pocięciu na skrawki o wielkości 35 µm, zaślepiony obserwator określił ilościowo komórki immunopozytywne ΔFosB w dwóch skrawkach poprzez NAc każdego szczura, a następnie obliczono średnie wartości na pole 40× według regionu dla każdego zwierzęcia. Każde zwierzę traktowano jako indywidualną obserwację do celów analizy statystycznej. Interesujące regiony zidentyfikowano za pomocą Paxinos i Watson (Paxinos i Watson, 2007).

Ilościowe oznaczenie immunoreaktywności CaMKIIα przeprowadzono przy użyciu systemu Licor, jak opisano (Covington i in., 2009). Zintegrowane intensywności CaMKII i GAPDH określono za pomocą oprogramowania Odyssey. Wyniki przedstawiono jako zintegrowane wartości intensywności na mm² i są przedstawione jako średnie ± sem (n = 4–10 na grupę). Wartości GAPDH wykorzystano jako odniesienie do normalizacji intensywności CaMKII dla grubości plastra i warunków.

Rysunek 2

Indukcja CaMKII w skorupie NAc samodzielnie podających szczurów i ludzi uzależnionych od kokainy

Eksperyment 5: Ilościowe oznaczanie poziomu białka u ludzi uzależnionych od kokainy (Rys. 2D)

Procedura

Pośmiertne tkanki ludzkiego mózgu uzyskano z Banku Mózgów Samobójców w Quebecu (Instytut Uniwersytetu Zdrowia Psychicznego Douglasa, Montreal, Quebec, Kanada). Konserwacja tkanki przebiegała zasadniczo zgodnie z opisem (Quirion i in., 1987). W skrócie, po ekstrakcji mózg umieszcza się na mokrym lodzie w styropianowym pudełku i przesyła do placówek Banku Mózgów Samobójców w Quebecu. Półkule są natychmiast oddzielone strzałkowym nacięciem pośrodku mózgu, pnia mózgu i móżdżku. Naczynia krwionośne, szyszynka, splot naczyniówkowy, połowa móżdżku i połowa pnia mózgu są zazwyczaj wycinane z lewej półkuli, a następnie cięte czołowo na plastry o grubości 1 cm przed zamrożeniem. Przed zamrożeniem drugą połowę móżdżku kroi się strzałkowo na plastry o grubości 1 cm. Tkanki szybko zamraża się w 2-metylobutanie w temperaturze -40°C przez ~60 sekund. Wszystkie zamrożone tkanki są przechowywane oddzielnie w plastikowych torebkach w temperaturze -80°C w celu długotrwałego przechowywania. Z zamrożonych przekrojów koronowych na płytce ze stali nierdzewnej pokrytej dookoła suchym lodem wycina się określone obszary mózgu, aby kontrolować temperaturę otoczenia. Western blot przeprowadzono w sposób opisany w Experiment 2.

Kohorta

Kohorta składała się z 37 mężczyzn i 3 kobiet w wieku od 15 do 66 lat. Wszyscy badani zmarli nagle, bez długotrwałego stanu agonalnego lub przewlekłej choroby medycznej. W każdym przypadku biuro koronera Quebecu ustaliło przyczynę śmierci i przeprowadzono badanie toksykologiczne próbek tkanek w celu uzyskania informacji na temat zażywanych leków i nielegalnych substancji w chwili śmierci. Grupę badaną stanowiło 20 osób, które spełniały kryteria SCID-I uzależnienia od kokainy. Grupę kontrolną stanowiło 20 osób bez historii uzależnienia od kokainy i bez poważnych diagnoz psychiatrycznych. Wszyscy badani zmarli nagle z przyczyn niemających bezpośredniego wpływu na tkankę mózgową. Grupy dobrano pod względem średniego wieku pacjentów, opóźnienia w chłodzeniu i pH. W przypadku wszystkich pacjentów przeprowadzono autopsję psychologiczną w sposób opisany wcześniej (Dumais i in., 2005), dzięki czemu mamy dostęp do szczegółowych informacji o przypadku, jego historii psychiatrycznej i medycznej, a także innych istotnych danych klinicznych i socjodemograficznych. W skrócie, przeszkolony ankieter przeprowadził Zorganizowany wywiad kliniczny dla DSM-IV Zaburzenia psychiczne (SCID-I) u jednego lub większej liczby informatorów zmarłego. Panel klinicystów dokonał przeglądu ocen SCID-I, opisów przypadków, notatek koronera i dokumentacji medycznej w celu uzyskania zgodnych diagnoz psychiatrycznych.

Eksperyment 6: Immunoprecypitacja chromatyny dla szczurzego NAc (Ryc. 3A – C)

Dorosłym (8-tygodniowym) samcom szczurów podawano dootrzewnowo 10 mg/kg kokainy lub soli fizjologicznej raz dziennie przez siedem dni. 24 godziny po ostatnim wstrzyknięciu otoczkę i rdzeń NAc poddano mikrodysekcji. Przeprowadzono immunoprecypitację chromatyny (ChIP), łącząc dwustronne stemple NAc z muszli lub rdzenia od siedmiu szczurów na grupę w sumie w 14 grupach (łącznie 98 zwierząt, 7 pul kokainy, 7 pul soli fizjologicznej). Tkanki sieciowano, przemywano i przechowywano w temperaturze -80°C aż do ścinania chromatyny przez sonikację. Ściętą chromatynę inkubowano przez noc z przeciwciałami wcześniej związanymi z kulkami magnetycznymi (Dynabeads M-280, Invitrogen). Jako kontrolę zastosowano nieimmunologiczną IgG. Po odwrotnym sieciowaniu i oczyszczeniu DNA, do pomiaru poziomów DNA promotora CaMKIIα zastosowano qPCR. Startery zaprojektowano do amplifikacji regionu zawierającego sekwencję konsensusową AP-1 zlokalizowaną ~450 bp przed miejscem startu transkrypcji (do przodu: ACTGACTCAGGAAGAGGGATA; do tyłu: TGTGCTCCTCAGAATCCACAA).

Rysunek 3

Specyficzna dla typu komórki i regionu indukcja ΔFosB CaMKIIα in vivo

Eksperyment 7: Pomiar transkryptu CaMKII i ekspresji białka ze specyficzną dla typu komórki nadekspresją ΔFosB (Rys. 3D)

Samce myszy bitransgenicznych pochodzące z NSE-tTA (linia A) × TetOp-ΔfosB (linia 11) i NSE-tTA (linia B) × TetOp-FLAG-ΔfosB (wiersz 11) myszy (Chen i wsp., 1998; Kelz i wsp., 1999; Werme i wsp., 2002; Zachariou i wsp., 2006) zostały stworzone i hodowane na 100 µg/ml doksycykliny w celu tłumienia ekspresji ΔFosB podczas rozwoju. Zwierzęta z miotu podzielono po odsadzeniu: połowa pozostawała na doksycyklinie, a połowa została zmieniona na wodę, a zwierzęta wykorzystano 8 do 11 tygodni później, gdy działanie transkrypcyjne ΔFosB było maksymalne (Kelz i wsp., 1999; McClung i Nestler, 2003). Do analiz transkrypcji myszy szybko dekapitowano, mózgi usuwano i umieszczano na lodzie. Wycinki NAc pobrano za pomocą igły nr 14 i szybko zamrożono na suchym lodzie do czasu ekstrakcji RNA. Izolację RNA, qPCR i analizę danych przeprowadzono w sposób opisany wcześniej (LaPlant i in., 2009). W skrócie, RNA wyizolowano za pomocą odczynnika TriZol (Invitrogen), dalej oczyszczono za pomocą zestawu mikro RNAeasy firmy Qiagen i sprawdzono jakość za pomocą Bioanalyzer firmy Agilent. Odwrotną transkrypcję przeprowadzono przy użyciu iScript (BioRad). qPCR przeprowadzono za pomocą systemu Applied Biosystems 7900HT RT PCR z następującymi parametrami cyklu: 10 min w 95°C; 40 cykli 95°C przez 1 min, 60°C przez 30 sek., 72°C przez 30 sek.; stopniowane ogrzewanie do 95°C w celu wygenerowania krzywych dysocjacji w celu potwierdzenia pojedynczych produktów PCR. Analizy immunohistochemiczne ekspresji białek ΔFosB i CaMKIIα przeprowadzono w sposób opisany w Experiment 4.

Eksperyment 8: Wpływ antagonistów receptorów dopaminy D1 i D2 wewnątrz NAc na zmiany białek za pośrednictwem kokainy (Rys. 3H)

Dorosłym (8-tygodniowym) samcom szczurów podawano dootrzewnowo 10 mg/kg kokainy lub soli fizjologicznej (grupa „nośnika”) raz dziennie przez siedem dni. 30 minut przed każdym wstrzyknięciem kokainy szczurom podano dootrzewnowo antagonistę receptora D1 SCH 23390 (0.5 mg/kg, grupa „D1 Ant”) lub antagonistę receptora D2 etklopryd (0.5 mg/kg, grupa „D2 Ant”) lub zastrzyk kontrolny soli fizjologicznej (grupa „kokaina”). 24 godziny po ostatnim wstrzyknięciu zwierzęta dekapitowano i oznaczono ilościowo białka metodą Western blot zgodnie z Experiment 2.

Eksperyment 9: Wpływ nadekspresji ΔFosB za pośrednictwem AAV na ekspresję białka (Ryc. 4 A–C)

Na dorosłych samcach szczurów (8 tygodni) przeprowadzono operację stereotaktyczną w celu wstrzyknięcia AAV-GFP (białko zielonej fluorescencji) lub AAV-GFP-ΔFosB (Maze i wsp., 2010). Do wszystkich zabiegów chirurgicznych stosowano igły nr 33 (Hamilton), podczas których obustronnie wstrzykiwano 0.5 µl oczyszczonego wirusa o wysokim mianie przez okres 5 minut, po czym następował dodatkowy 5-minutowy okres odpoczynku po infuzji. Wszystkie odległości mierzone są względem Bregmy: kąt 10°, AP = +1.7 mm, Lat = 2.5 mm, DV = −6.7 mm. 14 dni po operacji zwierzętom podano pojedynczy wstrzyknięcie IP 10 mg/kg kokainy do komór monitorujących lokomotorykę, aby ocenić behawioralne skutki nadekspresji ΔFosB. 24 godziny po ostatnim wstrzyknięciu szczury dekapitowano zgodnie z opisem Experiment 2i mikrodysekcję tkanki przeprowadzono pod kontrolą mikroskopu fluorescencyjnego, aby uzyskać tkankę NAc GFP-dodatnią. Następnie przeprowadzono analizę Western blot zgodnie z pkt Eksperymentuj 2.

Rysunek 4

ΔFosB jest zarówno niezbędny, jak i wystarczający do indukcji CaMKIIα zależnej od receptora D1 za pośrednictwem kokainy w powłoce NAc

Eksperyment 10: Wpływ nadekspresji ΔJunD za pośrednictwem AAV na ekspresję białek zależnych od kokainy (Ryc. 4 D – F)

Wstrzyknięcie stereotaktyczne AAV-GFP lub AAV-GFP-ΔJunD wykonano zgodnie z pkt Eksperymentuj 8. 14 dni po zabiegu zwierzętom podawano dootrzewnowo nośnik 10 mg/kg kokainy lub soli fizjologicznej raz dziennie przez siedem dni w komorach rejestrujących ruch. Rejestrowano reakcje lokomotoryczne na pojedynczy zastrzyk kokainy (5 mg/kg IP) lub soli fizjologicznej. 24 godziny po ostatnim wstrzyknięciu szczury dekapitowano, pobierano tkanki i przeprowadzano analizę Western blot jak w pkt. Eksperymentuj 9.

Eksperyment 11: In Vitro Testy kinazy białkowej (Ryc. 5A – D)

Z komórek owadów oczyszczono rekombinowane CaMKIIα i ΔFosB (Brickey i in., 1990; Jorissen i in., 2007) i przeprowadzono testy kinazy białkowej (Colbran, 1993), jak opisano wcześniej. W skrócie, CaMKII preinkubowano na lodzie z 2.5 µM (lub wskazanym stężeniem) ΔFosB, 1 mM Ca²⁺, 40 mM Mg²⁺, 15 µM kalmoduliny i 200 mM HEPES pH 7.5. Fosforylację inicjowano przez dodanie 200 µM ATP z lub bez [γ-³²P]ATP i pozostawiono na 10 minut w temperaturze pokojowej (Rys. 5A i B.) lub 2 min na lodzie (Ryc. 5C i D). Produkty rozdzielono metodą Western blot (Rys. 5A i B.) lub autoradiogramem i zliczaniem scyntylacyjnym (ryc. B – D).

Rysunek 5

ΔFosB jest silnym substratem dla CaMKIIα

Eksperyment 12: Identyfikacja fosforylacji Ser27 ΔFosB (Rys. 5E)

In vitro Oznaczenia kinazy przeprowadzono zgodnie z Experiment 11białka rozdzielono metodą SDS-PAGE i wycięto prążki odpowiadające ΔFosB i poddano tandemowej spektrometrii mas. Przypisania m/z odpowiednich fragmentów jonów we wszystkich panelach są oznaczone na górze pików jonów. Nie wszystkie jony fragmentacyjne są oznakowane ze względu na ograniczenia przestrzenne. Ogólnie rzecz biorąc, tekst etykiet fragmentów jonów jest zabarwiony na czarno, z wyjątkiem sytuacji, gdy bezpośrednio potwierdzają one lub dodają dowód na obecność interesujących miejsc fosforylacji, w którym to przypadku są one zaznaczone na czerwono. Dowody na produkty fragmentacji szkieletu przedstawiono w odczycie sekwencji fosfopeptydu z wykrytym miejscem reszty fosforylacyjnej zaznaczonym na czerwono z oznaczeniem pojedynczej litery aminokwasu. Numeryczny opis obserwowanych jonów fragmentacyjnych jest również oznaczony na sekwencji peptydowej jako jony b i y. Współczynniki powiększenia odcinków osi m/z pokazujące jony fragmentacyjne o niższej intensywności zaznaczono u góry widma masowego każdego fragmentu. Jony fragmentacyjne pokazane na panelu H potwierdzają jednak obecność fosforylowanej izoformy Ser27 w mieszaninie innych fosforylowanych izoform w miejscach Ser28, Ser31, Ser34 i Thr37. Obecność jonów pa5, pa5-P, pb5 i pb5-P jednoznacznie potwierdza fosforylację reszty Ser27.

Eksperyment 13: Kwantyfikacja fosforylacji Ser27 (Rys. 5F)

Zaprojektowano standardowe peptydy naśladujące formy fosfo i niefosfo Ser27 ΔFosB. Po syntezie i oczyszczeniu każdy „ciężki” idiotypowy peptyd rozpuszczono w buforze acetonitryl/woda 50/50 i przesłano do analizy aminokwasów w celu określenia stężenia bezwzględnego w roztworze podstawowym syntetycznego peptydu. Każdy „ciężki” peptyd następnie wstrzyknięto bezpośrednio do spektrometru mas (MS) 4000 QTRAP w celu określenia najlepszej energii zderzenia dla fragmentacji MS/MS i dwóch do czterech przejść MRM. Następnie czyste „ciężkie” peptydy poddano LCMS na 4000 QTRAP, aby zapewnić rozdzielenie peptydów. Urządzenie pracowało w trybie potrójnego kwadrupola, z Q1 ustawionym na konkretną wartość m/z prekursora (Q1 nie skanuje), a Q3 ustawionym na konkretną wartość m/z odpowiadającą konkretnemu fragmentowi tego peptydu. W trybie MRM mierzono sekwencyjnie serię pojedynczych reakcji (przejścia jonów prekursorowych/fragmentowych, gdzie energia zderzenia jest dostrojona w celu optymalizacji intensywności jonów fragmentacyjnych będących przedmiotem zainteresowania), a cykl (zwykle 1–2 s) był pętlowany przez cały czas. przez cały czas rozdziału metodą HPLC. Przejścia MRM określono na podstawie widm MS/MS istniejących peptydów. Następnie wybrano dwa przejścia na peptyd, odpowiadające jonom fragmentów o dużej intensywności i zoptymalizowano energię zderzenia, aby zmaksymalizować siłę sygnału przejść MRM przy użyciu oprogramowania do automatyzacji. Następnie porównano piki wynikające ze standardowych peptydów i próbek ΔFosB wystawionych na działanie CaMKII lub kontroli, aby określić bezwzględną liczebność każdej postaci peptydu w reakcji. Analizę danych LC-MRM przeprowadzono przy użyciu oprogramowania AB Multiquant 1.1.

Eksperyment 14: Indukcja ΔFosB u myszy z nadekspresją CaMKII (Ryc. 5G&H)

Myszy transgeniczne z nadekspresją T286D CaMKII (Mayford i in., 1996; Kourrich i in., 2012) i osobniki z miotu typu dzikiego hodowano przy braku doksycykliny, aby umożliwić ekspresję transgenu. Dorosłym myszom podawano dootrzewnowo 20 mg/kg kokainy lub soli fizjologicznej raz dziennie przez 14 dni. 24 godziny po ostatnim wstrzyknięciu zwierzęta dekapitowano i przeprowadzono immunohistochemię oraz ilościowe oznaczenie ekspresji ΔFosB jak w pkt. Experiment 4.

Eksperyment 15: Wpływ nadekspresji ΔFosB za pośrednictwem HSV i hamowania CaMKII na kolce dendrytyczne NAc (Ryc. 6A – E)

Dorosłym samcom myszy (8 tygodni) wstrzyknięto stereotaktycznie NAc HSV-GFP, HSV-GFP-ΔFosB (Olausson i wsp., 2006), HSV-GFPAC3I lub HSV-GFPAC3I-ΔFosB. W tych konstruktach AC3I, oparty na peptydzie inhibitor aktywności CaMKII, jest połączony z C-końcem GFP. GFPAC3I sklonowano metodą PCR, stosując wektor pMM400 zawierający GFPAC3I jako matrycę z następującymi starterami: GFP-AC3I-F: 5' CC GCTAGC GCCGCCACC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT 3' (clampNheIKozakmet); GFP-AC3I-R: 5' CC TCCGGA TTCAGGCAGTCCACGGCCT 3' (zaciskBspEIstop). Powstały produkt PCR wstawiono do wektorów p1005+ i p1005+-Δ FosB przy użyciu miejsc NheI i BspEI. Konstrukt sprawdzono przez sekwencjonowanie. Współrzędne stereotaktyczne wynosiły: kąt 10°, AP = +1.6 mm, Lat = +1.5 mm, DV = −4.4 mm (Barrot i in., 2002). Przeprowadzono perfuzję i skrawki mózgu według Experiment 4.

Analizę kręgosłupa przeprowadzono zgodnie z opisem (Christoffel i in., 2011). W skrócie, segmenty dendrytyczne oddalone o 50–150 µm od somy wybrano losowo z komórek zakażonych HSV, które wyrażają GFP. Obrazy uzyskano na konfokalnym LSM 710 (Carl Zeiss) do analizy morfologicznej przy użyciu NeuronStudio z algorytmem rayburst. NeuronStudio klasyfikuje kolce jako cienkie, grzybkowate lub przysadziste na podstawie następujących wartości: (1) współczynnik proporcji, (2) stosunek głowy do szyi oraz (3) średnica główki. Kolce z szyją można sklasyfikować jako cienkie lub grzybkowate, a te bez znaczącej szyi są klasyfikowane jako przysadziste. Kolce z szyjką są oznaczone jako cienkie lub grzybkowe w zależności od średnicy głowy.

Rysunek 6

Blokada aktywności CaMKII zapobiega morfologicznym i behawioralnym skutkom ΔFosB w NAc

Eksperyment 16: Wpływ nadekspresji ΔFosB za pośrednictwem HSV i hamowania CaMKII na reakcje na kokainę (Rys. 6F)

Dorosłym samcom myszy wstrzyknięto wirusy zgodnie z opisem Experiment 15i reakcje lokomotoryczne na pojedynczy zastrzyk kokainy w dawce 5 mg/kg mierzono zgodnie z pkt Eksperymentuj 9. Dane lokomotoryczne wyrażono jako całkowite przerwanie wiązki w ciągu 30 minut po wstrzyknięciu kokainy.

Dodatkowe informacje

Obudowa dla zwierząt

Samce szczurów Sprague Dawley (250–275 g; Charles River Laboratories) trzymano w parach. Ośmiotygodniowe samce myszy C57BL/6J (The Jackson Laboratory) trzymano w grupach liczących maksymalnie pięć zwierząt w klatce. Wszystkie zwierzęta przyzwyczajano do obiektu dla zwierząt przez ≥1 tydzień przed manipulacjami doświadczalnymi i trzymano w pomieszczeniach o kontrolowanym klimacie (23–25°C) w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność (światło włączone o 7:00) z dostępem do pożywienia i woda ad libitum. Eksperymenty przeprowadzono zgodnie z wytycznymi Towarzystwa Neuronauki i instytucjonalnej komisji ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania (IACUC) w Mount Sinai.

Narkotyki

Leki podawano dootrzewnowo i rozpuszczono w sterylnej soli fizjologicznej, w tym kokainę (5–20 mg/kg na 10 µl dla myszy, na 1 ml dla szczurów, NIDA) i SCH 23390 lub chlorowodorek etkloprydu (0.5 mg/kg na 1 ml, Tocris) . Do operacji stereotaktycznej myszy znieczulono „koktajlem” ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) (Henry Schein) w sterylnej soli fizjologicznej.

Przeciwciała

CaMKIIα (ogółem): północ stanu 05–532, 1:5,000 XNUMX

CaMKII fosfo-Thr286: Promega V111A, 1:1,000

ΔFosB (łącznie): sygnalizacja komórkowa 5G4, 1:250

ΔFosB fosfo-Ser27: Fosfosolucje, 1:500

GluA1 (ogółem): Abcam, Ab31232, 1:1,000

GluA1 fosfo-Ser831: Millipore N453, 1:1,000

GluA1 fosfo-Ser845: Chemicon Ab5849, 1:2,000

GluA2: Millipore 07–598, 1:2,000 XNUMX

NR2A: Sigma HPA004692, 1:2,500

NR2B: Millipore Ab1557P, 1:1,000

Analizy statystyczne

Wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu pakietu oprogramowania Prism 6 (GraphPad). Do wszystkich porównań parami zastosowano testy t-Studenta (wskazane w Wyniki, gdzie podana jest wartość t), a jednoczynnikowe testy ANOVA zastosowano do wszystkich porównań wielokrotnych (wskazane w sekcji wyników, gdzie podana jest wartość F).

Idź do:

Efekt

Przewlekła kokaina indukuje CaMKII w powłoce NAc

Wiele badań wykazało, że MSN w powłoce i rdzeniu NAc mają różne reakcje biochemiczne i fizjologiczne na chroniczną ekspozycję na narkotyki (Kourrich i Thomas, 2009; Loweth i in., 2010) oraz że oba podregiony w różny sposób regulują zachowania związane z poszukiwaniem narkotyków (Ito i wsp., 2004). Aby określić zróżnicowany wpływ kokainy na składniki białkowe otoczki NAc vs rdzenia zastosowaliśmy multipleksowane znakowanie izobaryczne (iTRAQ) i tandemową spektroskopię mas (MS/MS). Dorosłym samcom szczurów wstrzykiwano dootrzewnowo kokainę (20 mg/kg) lub sól fizjologiczną codziennie przez 7 dni; 24 godziny po ostatnim wstrzyknięciu otoczkę i rdzeń NAc poddano mikrodysekcji (Ryc. 1A) i zamrożono. Następnie oznaczono ilościowo białka w tych próbkach za pomocą iTRAQ. Wszystkie cztery izoformy CaMKII wykazywały duży wzrost ekspresji po leczeniu kokainą, który był specyficzny dla otoczki NAc w porównaniu z rdzeniem. Kilka fosfataz białkowych, w tym podjednostki katalityczne i regulatorowe PP1 oraz PP2A, które wcześniej łączono z różnymi substratami CaMKII w innych układach (Colbran, 2004) według podobnego schematu. Odkrycia te dostarczyły nowych, bezstronnych dowodów na to, że szlak sygnalizacyjny CaMKII jest w znacznym stopniu regulowany przez kokainę w NAc w sposób specyficzny dla powłoki.

Aby potwierdzić to odkrycie bardziej ilościowo, leczyliśmy szczury jak powyżej kokainą (w różnych dawkach) lub solą fizjologiczną i mierzyliśmy reakcje lokomotoryczne na dawkę prowokacyjną kokainy (5 mg/kg) lub soli fizjologicznej. Powtarzająca się ekspozycja na kokainę w dawce 10 mg/kg powodowała typowy wzór uczulenia narządu ruchu (Ryc. 1B). Dalsze badania z tym schematem dawkowania wykazały, za pomocą metody Western blot, że powtarzana kokaina indukuje selektywnie CaMKIIα w otoczce NAc 24 godziny po ostatnim wstrzyknięciu kokainy (Ryc. 1C i D; p=0.0019; F=7.943; df=29). Ponadto fosforylacja kanonicznego substratu CaMKII Ser831 podjednostki GluA1 receptora AMPA była znacząco zwiększona w powłoce NAc, a nie w rdzeniu (p=0.0261; F=4.208; df=28), podczas gdy autofosforylacja CaMKIIα Thr286 wykazywała silną, ale nie znacząca tendencja do indukcji tylko w skorupie (Rys. 1D). Kilka innych receptorów glutaminianu pozostało nienaruszonych. W przeciwieństwie do tych pomiarów CaMKII, te same próbki tkanek wykazywały indukcję ΔFosB zarówno w powłoce (p=0.0260; F=4.189; df=29), jak i rdzeniu (p=0.0350; F=3.807; df=29) NAc (Ryc. 1C i D), zgodnie z wcześniejszymi ustaleniami (Perrotti i wsp., 2008).

Ponieważ w kilku wcześniejszych badaniach regulacji kokainy przez receptory AMPA analizowano zwierzęta po ~14 dniach odstawienia przewlekłej kokainy (patrz Dyskusja), powtórzyliśmy te analizy biochemiczne w tym momencie. Odkryliśmy, że 14 dni po ostatnim wstrzyknięciu kokainy ΔFosB pozostaje podwyższone w NAc (p=0.0288; F=4.258; df=22), podczas gdy ani CaMKII, ani fosforylacja GluA1 Ser831 nie pozostają zwiększone (Rys. 1E). Jednakże 1 godzinę po pojedynczej dawce prowokacyjnej kokainy 10 mg/kg poziomy całkowitego CaMKII (p=0.0330; F=3.947; df=26) i GluA1 Ser831 (p=0.0213; F=4.509; df=27) fosforylacja są podwyższone w stopniu podobnym do stwierdzanego po początkowej przewlekłej ekspozycji na kokainę (Rys. 1E). Dane te wskazują, że neurony powłoki NAc są przygotowywane do indukcji CaMKII podczas dłuższych okresów abstynencji, być może poprzez bezpośrednie pobudzanie promotora genu CaMKII (patrz Dyskusja). Co więcej, fakt, że indukcja ΔFosB jest trwalsza niż indukcja CaMKII, sugeruje istnienie dodatkowych mechanizmów, zarówno opartych na chromatynie, jak i innych, które wywierają „hamulec” na regulację CaMKII, jak omówiono w dyskusji.

Aby jeszcze bardziej wzmocnić te obserwacje, zbadaliśmy modele samodzielnego podawania kokainy, które obejmują dobrowolne przyjmowanie narkotyku. Dorosłym samcom szczurów zapewniono krótki lub długi dostęp do kokainy; zgodnie z oczekiwaniami (Ahmed i Koob, 1998), dopiero długie warunki dostępu doprowadziły do ​​eskalacji samodzielnego podawania leku (Ryc. 2A). ΔFosB był indukowany w większym stopniu przez długi czas vs krótki dostęp do kokainy zarówno w otoczce NAc (p=0.0011; F=11.12; df=17), jak i w rdzeniu (p=0.0004; F=13.86; df=17). Natomiast CaMKIIα indukowano w powłoce NAc jedynie poprzez długi dostęp do kokainy (Ryc. 2B i C; p=0.0236; F=4.957; df=16). Interesujące jest porównanie średniego dziennego spożycia kokainy u zwierząt o krótkim dostępie (~12 mg/kg iv), zwierząt o długim dostępie (~70 mg/kg iv) i zwierząt podawanych przez eksperymentatora (10 mg/kg) oraz zapytaj, dlaczego ten ostatni wywołuje silną indukcję ΔFosB i CaMKII, podczas gdy krótki dostęp nie. Ta rozbieżność prawdopodobnie wynika z różnic w maksymalnych poziomach kokainy (kokaina podawana przez eksperymentatora jest podawana w postaci pojedynczego bolusa IP, podczas gdy kokaina podawana samodzielnie jest dostarczana w postaci wielokrotnych dawek dożylnych) lub z różnic w długości ekspozycji na lek (7 dni dla eksperymentatora podanie, 19 dni na samodzielne podanie).

Pomimo obszernej literatury na temat ΔFosB i CaMKII w działaniu kokainy, nie ma badań dotyczących tych białek u osób zażywających kokainę. Tutaj przedstawiamy pierwszy dowód na to, że poziomy zarówno ΔFosB (p=0.0316; t=1.921; df=34), jak i CaMKII (p=0.0444; t=1.755; df=32) są zwiększone w NAc ludzi uzależnionych od kokainy (Rys. 2D, Tabela 1). Dane te wskazują, że nasze badanie indukcji ΔFosB i CaMKII przez kokainę w NAc gryzoni jest klinicznie istotne dla uzależnienia od kokainy u ludzi.

Tabela 1

Charakterystyka próbek od ludzi uzależnionych od kokainy i dopasowanej grupy kontrolnej

ΔFosB reguluje transkrypcję CaMKII selektywnie w MSN typu D1 powłoki NAc

Odkrycie, że zarówno CaMKII, jak i ΔFosB są regulowane w górę przez kokainę w NAc gryzoni, doprowadziło nas do ustalenia, czy ΔFosB może regulować transkrypcję genu CaMKII. Wcześniej zgłaszaliśmy CaMKIIα jako możliwy cel dla ΔFosB w bezstronnej analizie NAc na mikromacierzy (McClung i Nestler, 2003), ale ustalenia tego nie potwierdzono dalej w tym badaniu. Najpierw zastosowaliśmy ilościowe ChIP (qChIP – ChIP, a następnie ilościową PCR), aby określić, czy ΔFosB wiąże się z promotorem genu CaMKIIα w NAc dorosłych samców szczurów i zaskakująco odkryliśmy, że to wiązanie jest znacznie zwiększone w wyniku przewlekłego podawania kokainy w skorupce ( p=0.0133; t=2.901; df=12), ale nie rdzeń, podregion (Ryc. 3A). Aby lepiej zrozumieć mechanizmy związane z tą specyficzną dla podregionu różnicą w wiązaniu ΔFosB z promotorem CaMKIIα, użyliśmy qChIP do scharakteryzowania stanu modyfikacji histonów w tym regionie genomowym. Wcześniejsze badania wykazały indukcję acetylacji H3 przez kokainę przy promotorze CaMKIIα w całkowitym mysim NAc (Wang i wsp., 2010). Natomiast odkryliśmy, że kokaina selektywnie zmniejsza acetylację H3 przy promotorze CaMKIIα w rdzeniu NAc (Ryc. 3B; p=0.0213; t=2.726; df = 10), bez widocznych zmian w powłoce, zgodnie ze zmianami chromatyny specyficznymi dla podregionu poza wiązaniem ΔFosB. qChIP dla znaku represyjnego, dimetylowana H3 lizyna 9 (H3K9me2), ujawniła trendy spadków zarówno w podregionach otoczki, jak i rdzenia (Rys 3C).

Aby określić, czy ΔFosB reguluje transkrypcję CaMKIIα in vivo, wykorzystaliśmy dwie bitransgeniczne linie myszy, które indukowalnie wykazują nadekspresję ΔFosB specyficznie w D1 vs MSN typu D2 w sposób kontrolowany poprzez podanie doksycykliny z wodą pitną (Chen i wsp., 1998; Kelz i wsp., 1999; Werme i wsp., 2002). Dorosłe samce myszy wykazujące nadekspresję ΔFosB wyłącznie w MSN typu D1 miały znacząco zwiększone poziomy mRNA CaMKIIα w NAc (p = 0.0337; t = 1.996; df = 13), efekt nie obserwowany u myszy z nadekspresją ΔFosB głównie w MSN typu D2 (Rys. 3D). Wzrostowi mRNA CaMKIIα, indukowanemu ekspresją ΔFosB w MSN typu D1, towarzyszył równoczesny wzrost białka CaMKIIα zarówno w powłoce NAc (p=0.0030; t=3.578; df=14), jak i rdzeniu (p=0.0392; t =2.275;df=14; Ryc. 3E i F). Dane te pokazują, że ΔFosB jest zdolny do kierowania ekspresją genu CaMKIIα w MSN typu D1 w obu podregionach, chociaż Rysunek 3B sugeruje, że zmiany chromatyny za pośrednictwem kokainy w promotorze CaMKIIα (np. zmniejszona acetylacja) uniemożliwiają ΔFosB regulację w górę CaMKII w podregionie rdzeniowym po kokainie.

Ponieważ nasze dane dotyczące myszy transgenicznych wykazały, że indukcja ekspresji genu CaMKII przez ΔFosB jest specyficzna dla MSN typu D1 w NAc, następnie staraliśmy się ustalić, czy zależna od kokainy regulacja w górę CaMKII wymaga aktywacji receptora dopaminowego D1. Dorosłym samcom szczurów podawano długotrwale kokainę lub sól fizjologiczną jak poprzednio, ale 30 minut przed każdym wstrzyknięciem szczurom z grupy kokainy podano dootrzewnowo zastrzyk soli fizjologicznej, antagonistę D1 SCH 23390 (0.5 mg/kg) lub antagonistę receptora D2 etklopryd (0.5 mg/kg). Zwierzęta analizowano 24 godziny po ostatnim wstrzyknięciu kokainy. Analiza Western blot ujawniła, że ​​antagonista D1, ale nie D2, całkowicie blokował pośredniczony przez kokainę wzrost ΔFosB (p<0.0001; F=18.96; df=18), jak podano wcześniej (Nye i wsp., 1995), a także w CaMKII (p=0.0005; F=10.99; df=18; Rys. 3G i H). Dane te potwierdzają hipotezę, że kokaina powoduje wzrost ekspresji genu CaMKII za pośrednictwem ΔFosB, szczególnie w MSN typu D1 powłoki NAc. W przyszłych badaniach ważne byłoby bezpośrednie wykazanie tego specyficznego dla typu komórkowego wpływu kokainy na ekspresję CaMKII w tym obszarze mózgu.

ΔFosB jest zarówno niezbędny, jak i wystarczający do indukcji CaMKII przez kokainę w powłoce NAc

Aby uzupełnić zastosowanie myszy bitransgenicznych, następnie zbadaliśmy rolę ΔFosB w pośredniczeniu w indukcji CaMKIIα przez kokainę poprzez zastosowanie transferu genów za pośrednictwem wirusa u szczurów. Dwustronnie wstrzyknęliśmy cząstki wirusa związanego z adenowirusem (AAV) do powłoki NAc dorosłych samców szczurów (gdzie można selektywnie celować w skorupę) w celu nadekspresji ΔFosB plus GFP lub samego GFP. Następnie zwierzętom podano pojedynczy zastrzyk IP 10 mg/kg kokainy. Zwierzęta z nadekspresją ΔFosB/GFP wykazywały zwiększoną odpowiedź lokomotoryczną w porównaniu ze zwierzętami z nadekspresją samego GFP (Ryc. 4A). 24 godziny po pojedynczym wstrzyknięciu kokainy od tych zwierząt wycięto tkankę NAc GFP-dodatnią przez rozcięcie pod źródłem światła fluorescencyjnego. Western blot tej tkanki (Ryc. 4B i C) ujawniło silną nadekspresję ΔFosB, jak również znaczny wzrost całkowitego białka CaMKIIα w porównaniu ze zwierzętami GFP (p=0.0070; t=2.894; df=30), podobny do indukcji obserwowanej przy przewlekłym podawaniu kokainy. Ponadto autofosforylacja CaMKIIα w Thr286 (wskazująca aktywację enzymu) została zwiększona przez nadekspresję ΔFosB (p=0.0330; t=2.243; df=28), podobnie jak fosforylacja substratu CaMKII, Ser831 GluA1 (p=0.0540; t= 2.012; df=28), ponownie naśladując działanie przewlekłej kokainy (Ryc. 1C i D). TPodsumowując, dane te dostarczają dalszych dowodów, że ekspresja ΔFosB w powłoce NAc jest wystarczająca do uwrażliwienia narządu ruchu na kokainę oraz do indukcji i aktywacji CaMKII w tym podregionie.

Zastosowaliśmy podobne podejście, aby określić, czy ΔFosB jest również niezbędny do indukcji CaMKIIα za pośrednictwem kokainy w powłoce NAc. AAV zastosowano do nadekspresji skróconego białka JunD, zwanego ΔJunD, które jest negatywnym regulatorem aktywacji transkrypcji ΔFosB (Winstanley i wsp., 2007) plus GFP lub sam GFP. Dwa tygodnie później, gdy ekspresja transgenu była maksymalna, zwierzętom podawano codziennie kokainę (10 mg/kg) lub sól fizjologiczną przez 7 dni i testowano pod kątem reakcji lokomotorycznych na prowokację kokainą (5 mg/kg) 24 godziny po ostatnim przewlekłym wstrzyknięciu (Rys. 4D). Nadekspresja ΔJunD zapobiegała uczuleniu narządu ruchu na kokainę, a także zapobiegała indukcji i aktywacji CaMKIIα w powłoce NAc (Ryc. 4E i F; p=0.0437; F=2.997; total df = 38), wskazując, że aktywność transkrypcyjna ΔFosB jest konieczna do indukcji CaMKIIα za pośrednictwem kokainy w tym podregionie. Co ciekawe, odkryliśmy, że ΔJunD obniżył poziom ΔFosB zarówno w warunkach leczenia solą fizjologiczną, jak i kokainą (p = 0.0004, 8.110; F = 35; df = 1), podnosząc nową możliwość, że ΔFosB zależy od aktywności AP-XNUMX dla własnych poziomów ekspresji.

CaMKII fosforyluje ΔFosB w Ser27

Korzystanie z in vitro w testach kinaz białkowych ustaliliśmy, że oczyszczony ΔFosB jest solidnym substratem dla CaMKIIα. Inkubacja Jego₆-ΔFosB z CaMKIIα i ATP spowodowały przesunięcie w górę ruchliwości elektroforetycznej ΔFosB (Ryc. 5A); kilka powstałych pasm sugerowało wiele miejsc fosforylacji. Podobny in vitro testy kinaz przy użyciu [γ-³²P]ATP wykazał włączenie znakowanego radioaktywnie fosforanu do przesuniętych pasm ΔFosB (Ryc. 5B), wykazując bezpośrednią fosforylację białka. Wygenerowaliśmy przeciwciało specyficzne dla fosfo wobec wcześniej scharakteryzowanego Ser27 z ΔFosB (Ulery i in., 2006). Chociaż to przeciwciało nie wytwarza sygnału przeciwko ekstraktom mózgowym zawierającym ΔFosB ufosforylowany Ser27 (dane nie pokazane), byliśmy w stanie wykryć fosforylację Ser27 w in vitro test kinazowy przy użyciu CaMKII (Ryc. 5B). Analizy kinetyczne fosforylacji ΔFosB przez CaMKII wskazują, że jest to silny substrat dla kinazy (Rys 5C), z wyraźnym K_M 5.7±2.0µM i K_CAT 2.3±0.3min^-1. Wyniki te są porównywalne z wieloma dobrze scharakteryzowanymi in vivo substraty CaMKII (Colbran i Brown, 2004). Ponadto ustaliliśmy, że CaMKII fosforyluje ΔFosB ze stechiometrią 2.27 ± 0.07 mol/mol (Rys. 5D), wskazując, że istnieją co najmniej trzy miejsca fosforylacji CaMKII w obrębie His₆-ΔFosB białko, zgodnie z Ryc. 5A.

Aby zbadać poszczególne miejsca fosforylacji, wykorzystaliśmy analizy MS próbek z naszego in vitro testy kinazowe. Rys. 5E wykazuje fosforylację ΔFosB we wcześniej scharakteryzowanym Ser27 i w kilku dodatkowych miejscach (dane nie pokazane). Biorąc pod uwagę wcześniejszą charakterystykę funkcjonalną Ser27, skupiliśmy się na tym miejscu, generując znakowane syntetyczne peptydy naśladujące stany fosfo i niefosfo Ser27, a następnie wykorzystaliśmy znane ilości tych peptydów jako standardy w analizach MRM ΔFosB przed i po in vitro fosforylacja przez CaMKII. Późniejsza ocena ilościowa (Rys. 5F) potwierdza, że ​​Ser27 jest silnym substratem dla CaMKII. Wyniki te wskazują, że spośród wielu fosforylowanych reszt w ΔFosB, Ser27 jest szczególnie skutecznym substratem dla CaMKII.

CaMKII pośredniczy w akumulacji kokainy ΔFosB w powłoce NAc

Ponieważ CaMKII może fosforylować ΔFosB in vitro w miejscu, które radykalnie zwiększa jego stabilność in vitro i in vivo (Ulery i in., 2006; Ulery-Reynolds i in., 2009), ustaliliśmy, czy aktywność CaMKII kontroluje poziomy ΔFosB w NAc in vivo. Aby odpowiedzieć na to pytanie, najpierw użyliśmy linii myszy wykazującej nadekspresję niezależnego od wapnia mutanta CaMKIIα (T286D) w wielu obszarach mózgu, w tym NAc (Mayford i in., 1996; Kourrich i in., 2012). Wstrzykiwaliśmy dopasowanym pod względem wieku dorosłym samcom mutantów i rodzeństwa typu dzikiego z miotu 20 mg/kg kokainy lub soli fizjologicznej raz dziennie przez 14 dni, a następnie analizowaliśmy zwierzęta dzień po ostatnim wstrzyknięciu. Odkryliśmy, że podstawowe poziomy ΔFosB wzrosły u zmutowanych zwierząt w skorupie NAc (p = 0.0001, 9.207; F = 37, XNUMX; df = XNUMX), ale nie w rdzeniu (Rys. 5G i H). Co zaskakujące, zależna od kokainy indukcja ΔFosB została zablokowana u zmutowanych zwierząt zarówno w skorupie, jak i rdzeniu, co sugeruje, że chociaż CaMKII może bezpośrednio regulować stabilność ΔFosB w otoczce NAc, może również leżeć powyżej ΔFosB w szlakach aktywowanych kokainą w obu podregionach NAc .

Aktywność CaMKII jest wymagana dla plastyczności strukturalnej i behawioralnej za pośrednictwem ΔFosB

Indukcja kolców dendrytycznych w MSN NAc przez kokainę jest jedną z najlepiej ustalonych adaptacji wywołanych lekami w tym obszarze mózgu, a taką indukcję kręgosłupa koreluje się z uwrażliwionymi reakcjami behawioralnymi na lek (Robinson i Kolb, 2004; Russo i wsp., 2010) i według doniesień jest selektywny dla numerów MSN typu D1 (Lee i wsp., 2006). Niedawno wykazaliśmy, że indukcja kolców dendrytycznych w NAc przez kokainę zależy od ΔFosB i jego dalszego programu transkrypcyjnego (Maze i wsp., 2010). Chociaż istnieje obszerna literatura dotycząca zaangażowania CaMKII w morfologię kręgosłupa dendrytycznego i indukcję w innych obszarach mózgu i układach eksperymentalnych (Jourdain i in., 2003; Penzes i in., 2008; Okamoto i in., 2009), jego rola w tworzeniu kręgosłupa NAc MSN nie była badana. Dlatego ustaliliśmy, czy aktywność CaMKII jest wymagana do indukcji kolców dendrytycznych MSN za pośrednictwem ΔFosB poprzez wykorzystanie nadekspresji za pośrednictwem HSV peptydu inhibitora CaMKII AC3I połączonego z GFP, konstruktu, który wcześniej wykazano, że hamuje aktywność CaMKII in vivo (Zhang i in., 2005; Klug i in., 2012). Wirusowa nadekspresja ΔFosB w skorupie NAc dorosłych myszy indukowała znaczny wzrost gęstości kręgosłupa dendrytycznego MSN (p<0.0001; F=8.558; df=59; Ryc. 6A i B) jak wcześniej informowaliśmy (Maze i wsp., 2010), a wzrost ten był spowodowany głównie przez cienkie (p=0.0027; F=5.319; df=59) i przysadziste (p=0.0378; F=2.988; df=59) typy kręgosłupa (oba uważane za niedojrzałe kolce) (Ryc. 6C – E). Nie zaobserwowano żadnego efektu na bardziej dojrzałych kolcach w kształcie grzybów. Jednakże, gdy GFP-AC3I ulegał koekspresji, indukcja kolców przez ΔFosB została całkowicie zniesiona (Ryc. 6A – E), wskazując, że aktywność CaMKII jest wymagana do indukcji ΔFosB kolców dendrytycznych w powłoce NAc.

Następnie użyliśmy tych samych narzędzi wirusowych, aby określić, czy aktywność CaMKII jest wymagana dla wpływu ΔFosB na wrażliwość behawioralną na kokainę. 72 godziny po wstrzyknięciu wirusa do otoczki NAc zwierzętom podano pojedynczy zastrzyk 5 mg/kg kokainy i rejestrowano ich aktywność lokomotoryczną. Jak pokazano wcześniej w przypadku bardziej rozszerzonej nadekspresji ΔFosB w AAV (Ryc. 4A), nadekspresja ΔFosB za pośrednictwem HSV zwiększa wrażliwość lokomotoryczną na kokainę (p=0.0002; F=8.823; df=37; Rys. 6F). Podobnie jak w przypadku indukcji kolców dendrytycznych, hamowanie aktywności CaMKII przez koekspresję GFP-AC3I całkowicie blokowało wzrost wrażliwości na kokainę za pośrednictwem ΔFosB, wskazując, że aktywność CaMKII jest wymagana do indukowanych ΔFosB zmian w efektach behawioralnych kokainy.

Idź do:

Dyskusja

Niniejsze badanie wyznacza nowy mechanizm sprzężenia zwrotnego, w którym kokaina indukuje ΔFosB w NAc, co selektywnie zwiększa transkrypcję genu CaMKIIα w powłoce NAc. CaMKIIα następnie fosforyluje i stabilizuje ΔFosB, co prowadzi do większej akumulacji ΔFosB i dalszej indukcji CaMKIIα (Rys. 6G). Współrosnące poziomy tych dwóch białek podczas przewlekłego narażenia na kokainę przyczyniają się następnie w istotny sposób do uwrażliwionych reakcji behawioralnych na narkotyk. Jest to szczególnie atrakcyjna hipoteza, ponieważ wcześniej wykazano, że zarówno ΔFosB, jak i CaMKII są wymagane do zwiększenia reakcji behawioralnych na kokainę (Pierce i in., 1998; Peakman i wsp., 2003) i powtarzamy to odkrycie dla ΔFosB w powłoce NAc, szczególnie stosując podejście wirusowe (Rysunki 4 i I 66).

Chociaż transgeniczna nadekspresja ΔFosB w MSN typu D1 może powodować indukcję CaMKII zarówno w otoczce NAc, jak i rdzeniu zwierząt nieleczonych kokainą, w kontekście kokainy, akumulacja endogennego ΔFosB, która występuje w obu podregionach, napędza indukcję CaMKII specyficznie w otoczce NAc . Różnica ta może odnosić się do wyższych poziomów ΔFosB indukowanych w naszym modelu bitransgenicznym, może jednak również odzwierciedlać zdolność kokainy do zróżnicowanej zmiany promotora CaMKIIα w otoczce vs podstawowe MSN, aby albo promować wiązanie ΔFosB w pierwszym, albo wykluczać je w drugim podregionie. W rzeczywistości nasze dane ChIP, które ujawniają deacetylację histonów za pośrednictwem kokainy w promotorze genu CaMKIIα tylko w rdzeniu NAc, potwierdzają możliwe zaangażowanie mechanizmu chromatyny. Zgodnie z tą hipotezą, nadekspresja ΔFosB w MSN typu D1 była w stanie wywołać indukcję CaMKIIα w rdzeniu NAc przy braku kokainy (Rys. 3F), co sugeruje, że istnieją aktywne modyfikacje promotora CaMKIIα, które zapobiegają tej indukcji podczas przewlekłej ekspozycji na kokainę. Regulacja krajobrazu chromatyny w promotorze CaMKII może również wyjaśniać, dlaczego CaMKII jest indukowany przez dawkę prowokacyjną kokainy w skorupie NAc szczurów przewlekle odstawiających kokainę (Rys. 1E), ale nie zwierząt nieleczonych wcześniej narkotykami (Rys. 1D). Może to reprezentować epigenetyczny efekt „przygotowania genów” ΔFosB (Robison i Nestler, 2011), a zatem może być jednym z molekularnych mechanizmów inkubacji głodu kokainowego (Pickens i in., 2011). Jednakże, aby ta zmiana chromatyny była przyczynowo powiązana z inkubacją głodu, musiałaby z czasem wzrastać. Interesujące będzie ustalenie, czy tak jest i zbadanie, czy inne geny wykazują zależną od ΔFosB, specyficzną dla podregionu regulację przez kokainę. Należy również zauważyć, że opisana przez nas pętla wyprzedzająca nie prowadzi do nieskończonej akumulacji CaMKII lub ΔFosB (Rys. 1E); odkrycie molekularnego „hamulca” odpowiedzialnego za to zjawisko jest ważnym celem przyszłych badań.

Znane funkcje ΔFosB i CaMKII w kilku systemach eksperymentalnych i obszarach mózgu zbiegają się na wielu poziomach (Rys. 6F). Obie cząsteczki są ściśle powiązane ze wzrostem kolców dendrytycznych: CaMKII oddziałuje z cytoszkieletem aktynowym (Okamoto i in., 2009), reguluje wielkość głowy kręgosłupa (Matsuzaki i in., 2004) i jest zarówno konieczny, jak i wystarczający do wywołanego plastycznością wzrostu liczby filopodiów i synaps w kulturach organotypowych plasterków hipokampa (Jourdain i in., 2003), while ΔFosB jest zarówno niezbędny, jak i wystarczający do indukowanego kokainą tworzenia kolców dendrytycznych w MSN NAc (Maze i wsp., 2010). Dodatkowo obie cząsteczki powiązano z regulacją receptorów glutaminianu AMPA. CaMKII nie reguluje całkowitego poziomu podjednostek receptora AMPA, ale napędza insercję receptorów AMPA do synaps i zwiększa przewodnictwo kanału AMPA poprzez fosforylację GluA1 w Ser831 w neuronach piramidowych hipokampa w hodowli i in vivo (recenzja w (Malinow i Malenka, 2002; Colbran i Brown, 2004)). Taki zwiększony transport GluA1 do synapsy jest również powiązany z przewlekłym działaniem kokainy (Boudreau i Wolf, 2005). Co więcej, reakcje behawioralne na aktywację receptora AMPA w NAc są wzmocnione przez nadekspresję CaMKIIα w sposób zależny od receptora dopaminy D1 (Singer i in., 2010). Wykazano, że długoterminowa nadekspresja ΔFosB specyficzna dla D1 indukuje transkrypcję GluA2 w NAc (Kelz i wsp., 1999), co tłumi odpowiedzi AMPA za pośrednictwem GluA1, podczas gdy pokazujemy tutaj, że krótkoterminowa nadekspresja ΔFosB - jak również krótsza ekspozycja na kokainę - nie mają wpływu na tę podjednostkę (Rys. 1). Niemniej jednak niedawno odkryliśmy, że krótkotrwała nadekspresja ΔFosB mimo to zmniejsza odpowiedzi AMPA w MSN typu D1 w NAc (Grueter i in., 2013). Dane te sugerują czasowo odrębne mechanizmy, które mogą stanowić zależną od czasu serię neuroadaptacji do kokainy, leżącą u podstaw różnych aspektów postępu uzależnienia, które nie są jeszcze dobrze poznane. Na poziomie behawioralnym zarówno CaMKII, jak i ΔFosB są wymagane do uwrażliwienia narządu ruchu na kokainę (patrz wyżej) i oba są wymagane do długotrwałego samodzielnego podawania kokainy u gryzoni (Colby i wsp., 2003; Wang i wsp., 2010), co sugeruje, że te dwa białka są ważne zarówno dla krótko-, jak i długoterminowych adaptacji behawioralnych do narażenia na lek, aczkolwiek poprzez częściowo różne mechanizmy podstawowe. Prawdopodobnie ΔFosB i CaMKII regulują takie złożone adaptacje behawioralne poprzez zmiany w funkcji synaptycznej NAc, chociaż potrzebne są znacznie dalsze prace, aby bezpośrednio powiązać zjawiska synaptyczne ze zmianą zachowania.

Holoenzym CaMKII oddziałuje jednocześnie z różnymi białkami związanymi z synapsami (Robison i in., 2005), które, jak się uważa, regulują jego kierowanie do gęstości postsynaptycznej (PSD), zjawiska, które uważa się za ważne dla plastyczności synaptycznej. W szczególności niedawno wykazano, że interakcja CaMKII z podjednostką GluN2B receptora glutaminianu typu NMDA reguluje zarówno plastyczność synaptyczną, jak i uczenie się (Halt i in., 2012). Chociaż peptyd AC3I naśladuje domenę autoinhibicyjną CaMKII, a tym samym hamuje aktywność katalityczną enzymu, blokuje także wiele interakcji białko-białko (Strack i in., 2000; Robison i in., 2005). Zatem opisane tutaj behawioralne i morfologiczne skutki HSV-GFP-AC3I mogą wystąpić poprzez zmniejszoną fosforylację białek docelowych CaMKII, zmiany w ukierunkowaniu CaMKII lub zmianę proponowanej roli strukturalnej CaMKII w synapsach (Lisman i in., 2002).

Na szczególną uwagę zasługuje ograniczenie proponowanej pętli ΔFosB-CaMKII do powłoki NAc, ponieważ ostatnie prace wykazały kilka fizjologicznych różnic między powłoką NAc a rdzeniem w odpowiedzi na podanie kokainy, co zostało potwierdzone przez nasze bezstronne dane iTRAQ (Tabela S1) . MSN w muszli NAc wykazują spadek zdolności odpalania po przewlekłej kokainie, który utrzymuje się przez tygodnie, podczas gdy podstawowe MSN od tych samych zwierząt wykazują przejściowy (1–3 dni) wzrost zdolności odpalania, który powraca do poziomu podstawowego w ciągu 2 tygodni (Kourrich i Thomas, 2009). Ponadto liczne białka synaptyczne są regulowane w różny sposób w powłoce NAc vs rdzeń zwierząt narażonych na chroniczne działanie kokainy, w tym GluA2 (Knackstedt i in., 2010). Ponieważ przewlekła amfetamina indukuje CaMKIIα specyficznie w powłoce NAc (Loweth i in., 2010), nie jest zaskakujące, że podobny efekt obserwujemy w przypadku kokainy. Jednakże, ponieważ ΔFosB jest indukowany zarówno w powłoce, jak i rdzeniu NAc przez przewlekłą kokainę (Perrotti i wsp., 2008), a ponieważ pokazujemy, że indukcja CaMKIIα w powłoce jest zależna od ΔFosB, nasze odkrycia dostarczają nowych dowodów na odrębne mechanizmy transkrypcji w promotorze CaMKIIα między tymi dwoma podregionami, które są odpowiedzialne za selektywną indukcję CaMKIIα w powłoce.

Wiele ostatnich prac skupiło się na określeniu różnic między numerami MSN NAc typu D1 i D2. Chociaż zarówno receptory D1, jak i D2 biorą udział w nagradzającym działaniu kokainy (Self, 2010), ostatnie prace pokazują, że optogenetyczna aktywacja MSN typu D1 zwiększa reakcje behawioralne na kokainę, podczas gdy aktywacja MSN typu D2 ma odwrotny skutek (Lobo i in., 2010). Zgodnie z tymi ustaleniami, myszy z nokautem receptora D1 nie potrafią nabywać samodzielnego podawania kokainy (Caine i in., 2007), podczas gdy nokauty D2 nie są (Caine i in., 2002). Podawanie agonisty D1 bezpośrednio do NAc wyzwala zachowania związane z poszukiwaniem kokainy w paradygmatach przywracania (Self, 2010). Co ciekawe, efekt ten wymaga zależnego od receptora D1 wzrostu aktywności CaMKII w powłoce NAc, ale nie w rdzeniu (Anderson i in., 2008), wynik, który ładnie współgra z zaproponowaną tutaj pętlą ΔFosB-CaMKII specyficzną dla D1 i powłoki.

Wcześniej informowaliśmy, że Ser27 w ΔFosB może być fosforylowany przez kinazę kazeinową-2 (Ulery i in., 2006), jednakże ustalamy tutaj, że CaMKII fosforyluje ΔFosB w tym i innych miejscach ze znacznie większą kinetyką i stechiometrią i może replikować wyższą pozorną M_r obserwowane dla ΔFosB (Ryc. 5A) z narażeniem na kokainę in vivo (Nestler, 2008). Wiemy już, że fosforylacja Ser27 zwiększa stabilność ΔFosB i aktywność transkrypcyjną (Ulery i in., 2006; Ulery i Nestler, 2007; Ulery-Reynolds i in., 2009). Przyszłe prace skupią się teraz na identyfikacji i funkcjonalnych konsekwencjach nowych miejsc fosforylacji ΔFosB wskazanych w niniejszym badaniu.

Opisana tutaj pętla sprzężenia zwrotnego zapewnia nowy, wiarygodny mechanizm, dzięki któremu wielokrotne podawanie kokainy powoduje postępujące nieprawidłowości w NAc. Jako taki ten szlak biochemiczny może stanowić ważny cel dla przyszłej interwencji terapeutycznej w zaburzeniach uzależniających. Ponieważ CaMKII jest wszechobecny i wymagany dla wielu podstawowych funkcji neuronalnych i behawioralnych, unikano bezpośredniego stosowania inhibitorów CaMKII w leczeniu uzależnień. Nasze dane sugerują, że bardziej subtelne ukierunkowanie mechanizmu indukcji CaMKII, specyficznego dla indywidualnego typu komórek i podregionu obwodu nagrody w mózgu, mogłoby zapewnić cel terapeutyczny, który pozwoliłby uniknąć powikłań ogólnoustrojowego hamowania CaMKII.

Idź do:

Podziękowania

Prace te były wspierane przez granty przyznane przez Narodowy Instytut ds. Narkotyków (EJN), Centrum Proteomiki NIDA-Yale DA018343 (AJR i EJN) oraz Fundację Hartwell (AJR). Autorzy chcieliby podziękować Gabby Rundenko za hojny dar oczyszczonego ΔFosB i Rogerowi Colbranowi za hojny dar oczyszczonego CaMKIIα.

Idź do:

Referencje

1. Ahmed SH, Koob GF. Przejście od umiarkowanego do nadmiernego spożycia narkotyków: zmiana hedonicznej wartości zadanej. Nauka. 1998; 282: 298-300. [PubMed]
2. Anderson SM, Famous KR, Sadri-Vakili G, Kumaresan V, Schmidt HD, Bass CE, Terwilliger EF, Cha JH, Pierce RC. CaMKII: most biochemiczny łączący półleżące układy dopaminy i glutaminianu w poszukiwaniu kokainy. Nat Neurosci. 2008;11:344–353. [PubMed]
3. Boudreau AC, Wolf ME. Uczulenie behawioralne na kokainę jest związane ze zwiększoną ekspresją powierzchniową receptora AMPA w jądrze półleżącym. J Neurosci. 2005;25:9144–9151. [PubMed]
4. Brickey DA, Colbran RJ, Fong YL, Soderling TR. Ekspresja i charakterystyka podjednostki alfa kinazy białkowej II zależnej od Ca2+/kalmoduliny przy użyciu bakulowirusowego układu ekspresyjnego. Biochem Biophys Res Commun. 1990;173:578–584. [PubMed]
5. Caine SB, Negus SS, Mello NK, Patel S, Bristow L, Kulagowski J, Vallone D, Saiardi A, Borrelli E. Rola receptorów dopaminowych D2-podobnych w samodzielnym podawaniu kokainy: badania z myszami z mutacją receptora D2 i nowym receptorem D2 antagoniści. J Neurosci. 2002;22:2977–2988. [PubMed]
6. Caine SB, Thomsen M, Gabriel KI, Berkowitz JS, Gold LH, Koob GF, Tonegawa S, Zhang J, Xu M. Brak samodzielnego podawania kokainy u myszy z nokautem receptora dopaminy D1. J Neurosci. 2007;27:13140–13150. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
7. Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A, Nestler EJ. Mechanizmy zależne od proteasomu i niezależne dla destabilizacji FosB: identyfikacja domen degronu FosB i implikacje dla stabilności DeltaFosB. Eur J Neurosci. 2007; 25: 3009 – 3019. [PubMed]
8. Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Zwierzęta transgeniczne z indukowalną, ukierunkowaną ekspresją genów w mózgu. Mol Pharmacol. 1998; 54: 495 – 503. [PubMed]
9. Christoffel DJ, Golden SA, Dumitriu D, Robison AJ, Janssen WG, Ahn HF, Krishnan V, Reyes CM, Han MH, Ables JL, Eisch AJ, Dietz DM, Ferguson D, Neve RL, Greengard P, Kim Y, Morrison JH , Russo SJ. Kinaza IkappaB reguluje plastyczność synaptyczną i behawioralną wywołaną stresem społecznym. J Neurosci. 2011;31:314–321. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
10. Colbran RJ. Inaktywacja kinazy białkowej II zależnej od Ca2+/kalmoduliny poprzez podstawową autofosforylację. J Biol Chem. 1993;268:7163–7170. [PubMed]
11. Colbran RJ. Fosfatazy białkowe i plastyczność synaptyczna zależna od wapnia/kalmoduliny zależna od kinazy białkowej II. J Neurosci. 2004;24:8404–8409. [PubMed]
12. Colbran RJ, Brown AM. Kinaza białkowa II zależna od wapnia/kalmoduliny i plastyczność synaptyczna. Curr Opin Neurobiol. 2004;14:318–327. [PubMed]
13. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW. Nadekspresja DeltaFosB specyficzna dla komórek prążkowia zwiększa zachętę do kokainy. J Neurosci. 2003; 23: 2488 – 2493. [PubMed]
14. Covington HE, 3., Maze I, LaPlant QC, Vialou VF, Ohnishi YN, Berton O, Fass DM, Renthal W, Rush AJ, 3., Wu EY, Ghose S, Krishnan V, Russo SJ, Tamminga C, Haggarty SJ, Nestler EJ. Działanie przeciwdepresyjne inhibitorów deacetylazy histonowej. J Neurosci. 2009;29:11451–11460. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
15. Davalos A, Fernandez-Hernando C, Sowa G, Derakhshan B, Lin MI, Lee JY, Zhao H, Luo R, Colangelo C, Sessa WC. Ilościowa proteomika białek regulowanych kaweoliną-1: charakterystyka polimerazy i czynnika uwalniającego transkrypt / komórek śródbłonka CAVIN-1 IN. Proteomika komórek Mol. 2010;9:2109–2124. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
16. Dumais A, Lesage AD, Alda M, Rouleau G, Dumont M, Chawky N, Roy M, Mann JJ, Benkelfat C, Turecki G. Czynniki ryzyka zakończenia samobójstwa w ciężkiej depresji: badanie kliniczno-kontrolne dotyczące zachowań impulsywnych i agresywnych w mężczyźni. Jestem J. Psychiatria. 2005;162:2116–2124. [PubMed]
17. Grueter BA, Robison AJ, Neve RL, Nestler EJ, Malenka RC. ΔFosB w różny sposób moduluje funkcję szlaku bezpośredniego i pośredniego jądra półleżącego. Proc Natl Acad Sci USA. 2013 w prasie. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
18. Halt AR, Dallapiazza RF, Zhou Y, Stein IS, Qian H, Juntti S, Wójcik S, Brose N, Silva AJ, Hell JW. Wiązanie CaMKII z GluN2B ma kluczowe znaczenie podczas konsolidacji pamięci. EMBO J. 2012;31:1203–1216. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
19. Hiroi N, Brown JR, Haile CN, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ. Myszy z mutacją FosB: utrata przewlekłej indukcji kokainy białek związanych z Fos i zwiększona wrażliwość na psychomotoryczne i nagradzające działanie kokainy. Proc Natl Acad Sci USA A. 1997;94:10397–10402. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
20. Ito R, Robbins TW, Everitt BJ. Kontrola różnicowa nad poszukiwaniem kokainy przez jądro półleżące rdzeń i skorupa. Nat Neurosci. 2004; 7: 389 – 397. [PubMed]
21. Jorissen HJ, Ulery PG, Henry L, Gourneni S, Nestler EJ, Rudenko G. Dimeryzacja i właściwości wiązania czynnika transkrypcyjnego DeltaFosB. Biochemia. 2007; 46: 8360 – 8372. [PubMed]
22. Jourdain P, Fukunaga K, Muller D. Kinaza białkowa II zależna od wapnia/kalmoduliny przyczynia się do zależnego od aktywności wzrostu filopodiów i tworzenia kręgosłupa. J Neurosci. 2003;23:10645–10649. [PubMed]
23. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ. Ekspresja czynnika transkrypcyjnego deltaFosB w mózgu kontroluje wrażliwość na kokainę. Natura. 1999; 401: 272 – 276. [PubMed]
24. Klug JR, Mathur BN, Kash TL, Wang HD, Matthews RT, Robison AJ, Anderson ME, Deutch AY, Lovinger DM, Colbran RJ, Winder DG. Genetyczne hamowanie CaMKII w średnich neuronach kolczastych grzbietowego prążkowia zmniejsza funkcjonalne synapsy pobudzające i zwiększa wewnętrzną pobudliwość. PLoS Jeden. 2012;7:e45323. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
25. Knackstedt LA, Moussawi K, Lalumiere R, Schwendt M, Klugmann M, Kalivas PW. Trening wymierania po samodzielnym podaniu kokainy indukuje plastyczność glutaminergiczną, hamując poszukiwanie kokainy. J Neurosci. 2010;30:7984–7992. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
26. Kourrich S, Thomas MJ. Podobne neurony, przeciwne adaptacje: doświadczenie psychostymulujące w różny sposób zmienia właściwości odpalania w rdzeniu półleżącym i w skorupie. J Neurosci. 2009;29:12275–12283. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
27. Kourrich S, Klug JR, Mayford M, Thomas MJ. Niezależny od AMPAR efekt alfaCaMKII prążkowia promuje uwrażliwienie na nagrodę kokainową. J Neurosci. 2012;32:6578–6586. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
28. LaPlant Q, Chakravarty S, Vialou V, Mukherjee S, Koo JW, Kalahasti G, Bradbury KR, Taylor SV, Maze I, Kumar A, Graham A, Birnbaum SG, Krishnan V, Truong HT, Neve RL, Nestler EJ, Russo SJ . Rola czynnika jądrowego kappaB w nadwrażliwości na stres wywołanej hormonami jajnikowymi u samic myszy. Biol Psychiatria. 2009;65:874–880. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
29. Lee KW, Kim Y, Kim AM, Helmin K, Nairn AC, Greengard P. Cocaine wywołał tworzenie się kręgosłupa dendrytycznego w średnich kolczastych neuronach kolistych receptorów dopaminy D1 i D2 w jądrze półleżącym. Proc Natl Acad Sci US A. 2006; 103: 3399 – 3404. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
30. Lisman J, Schulman H, Cline H. Molekularne podstawy funkcji CaMKII w pamięci synaptycznej i behawioralnej. Nat Rev Neurosci. 2002;3:175–190. [PubMed]
31. Lobo MK, Covington HE, 3rd, Chaudhury D, Friedman AK, Sun H, Damez-Werno D, Dietz DM, Zaman S, Koo JW, Kennedy PJ, Mouzon E, Mogri M, Neve RL, Deisseroth K, Han MH, Nestler EJ. Specyficzna dla typu komórki utrata sygnalizacji BDNF naśladuje optogenetyczną kontrolę nagrody kokainowej. Nauka. 2010;330:385–390. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
32. Loweth JA, Baker LK, Guptaa T, Guillory AM, Vezina P. Hamowanie CaMKII w jądrze półleżącym zmniejsza zwiększone spożycie amfetaminy u uczulonych szczurów. Neurosci Lett. 2008;444:157–160. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
33. Loweth JA, Singer BF, Baker LK, Wilke G, Inamine H, Bubula N, Alexander JK, Carlezon WA, Jr, Neve RL, Vezina P. Przejściowa nadekspresja kinazy białkowej zależnej od alfa-Ca2+/kalmoduliny II w powłoce jądra półleżącego zwiększa reakcję behawioralną na amfetaminę. J Neurosci. 2010;30:939–949. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
34. Malinow R, Malenka RC. Transport receptorów AMPA i plastyczność synaptyczna. Annu Rev Neurosci. 2002;25:103–126. [PubMed]
35. Matsuzaki M, Honkura N, Ellis-Davies GC, Kasai H. Strukturalne podstawy długotrwałego wzmocnienia w pojedynczych kolcach dendrytycznych. Natura. 2004; 429: 761 – 766. [PubMed]
36. Mayford M, Bach ME, Huang YY, Wang L, Hawkins RD, Kandel ER. Kontrola tworzenia pamięci poprzez regulowaną ekspresję transgenu CaMKII. Nauka. 1996;274:1678–1683. [PubMed]
37. Maze I, Covington HE, 3rd, Dietz DM, LaPlant Q, Renthal W, Russo SJ, Mechanik M, Mouzon E, Neve RL, Haggarty SJ, Ren Y, Sampath SC, Hurd YL, Greengard P, Tarakhovsky A, Schaefer A, Nestler EJ. Istotna rola metylotransferazy histonowej G9a w plastyczności indukowanej kokainą. Nauka. 2010; 327: 213 – 216. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
38. McClung CA, Nestler EJ. Regulacja ekspresji genów i nagrody kokainowej przez CREB i DeltaFosB. Nat Neurosci. 2003; 6: 1208 – 1215. [PubMed]
39. Nestler EJ. Przejrzeć. Transkrypcyjne mechanizmy uzależnienia: rola DeltaFosB. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008; 363: 3245 – 3255. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
40. Nye HE, Hope BT, Kelz MB, Iadarola M, Nestler EJ. Badania farmakologiczne regulacji przewlekłej indukowanej przez FOS antygenu przez kokainę w prążkowiu i jądrze półleżącym. J Pharmacol Exp Ther. 1995; 275: 1671 – 1680. [PubMed]
41. Okamoto K, Bosch M, Hayashi Y. Rola CaMKII i F-aktyny w plastyczności strukturalnej kolców dendrytycznych: potencjalna tożsamość molekularna znacznika synaptycznego? Fizjologia (Bethesda) 2009;24:357–366. [PubMed]
42. Olausson P, Jentsch JD, Tronson N, Neve RL, Nestler EJ, Taylor JR. DeltaFosB w jądrze półleżącym reguluje wzmacniane żywnością zachowanie instrumentalne i motywację. J Neurosci. 2006; 26: 9196 – 9204. [PubMed]
43. Paxinos G, Watson C. Mózg szczura we współrzędnych stereotaktycznych. Wydanie 6. Amsterdamu ; Boston: Academic Press/Elsevier; 2007.
44. Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E. Indukowalna, specyficzna dla regionu ekspresja dominującego negatywnego mutanta c-Jun u myszy transgenicznych zmniejsza wrażliwość na kokainę. Brain Res. 2003; 970: 73 – 86. [PubMed]
45. Penzes P, Cahill ME, Jones KA, Srivastava DP. Zbieżne sygnały CaMK i RacGEF kontrolują strukturę i funkcję dendrytyczną. Trendy Cell Biol. 2008;18:405–413. [PubMed]
46. Perrotti LI, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ. Indukcja deltaFosB w strukturach mózgu związanych z nagrodą po przewlekłym stresie. J Neurosci. 2004; 24: 10594 – 10602. [PubMed]
47. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. Wyraźne wzory indukcji DeltaFosB w mózgu przez narkotyki. Synapsa. 2008; 62: 358 – 369. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
48. Pickens CL, Airavaara M, Theberge F, Fanous S, Hope BT, Shaham Y. Neurobiologia inkubacji głodu narkotykowego. Trendy Neurosci. 2011;34:411–420. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
49. Pierce RC, Quick EA, Reeder DC, Morgan ZR, Kalivas PW. Drugie przekaźniki pośredniczone przez wapń modulują ekspresję uczulenia behawioralnego na kokainę. J Pharmacol Exp Ther. 1998;286:1171–1176. [PubMed]
50. Quirion R, Robitaille Y, Martial J, Chabot JG, Lemoine P, Pilapil C, Dalpe M. Autoriografia receptora ludzkiego mózgu przy użyciu skrawków całej półkuli: ogólna metoda minimalizująca artefakty tkankowe. Synapsa. 1987;1:446–454. [PubMed]
51. Robinson TE, Kolb B. Plastyczność strukturalna związana z ekspozycją na narkotyki. Neuropharmakologia. 2004; 47 (Suppl 1): 33 – 46. [PubMed]
52. Robison AJ, Nestler EJ. Transkrypcyjne i epigenetyczne mechanizmy uzależnienia. Nat Rev Neurosci. 2011;12:623–637. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
53. Robison AJ, Bass MA, Jiao Y, MacMillan LB, Carmody LC, Bartlett RK, Colbran RJ. Wielowartościowe interakcje kinazy białkowej II zależnej od wapnia/kalmoduliny z białkami gęstości postsynaptycznej NR2B, densyną-180 i alfa-aktyniną-2. J Biol Chem. 2005;280:35329–35336. [PubMed]
54. Ross PL, Huang YN, Marchese JN, Williamson B, Parker K, Hattan S, Khainovski N, Pillai S, Dey S, Daniels S, Purkayastha S, Juhasz P, Martin S, Bartlet-Jones M, He F, Jacobson A, Pappin DJ. Multipleksowane oznaczanie ilościowe białka w Saccharomyces cerevisiae przy użyciu izobarycznych odczynników znakujących reagujących z aminą. Proteomika komórek Mol. 2004;3:1154–1169. [PubMed]
55. Russo SJ, Dietz DM, Dumitriu D, Morrison JH, Malenka RC, Nestler EJ. Uzależniona synapsa: mechanizmy synaptycznej i strukturalnej plastyczności jądra półleżącego. Trendy Neurosci. 2010; 33: 267 – 276. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
56. Własny DW. W: Receptory dopaminy. Neve KA, redaktor. Nowy Jork: Humana Press; 2010. s. 479–524.
57. Singer BF, Loweth JA, Neve RL, Vezina P. Przejściowa, za pośrednictwem wirusów nadekspresja kinazy białkowej zależnej od alfa-wapnia/kalmoduliny II w powłoce jądra półleżącego prowadzi do długotrwałej funkcjonalnej regulacji w górę alfa-amino-3-hydroksylo-5 Receptory -4-izoksazolopropionianu metylu: receptor dopaminy typu 1 i zależność od kinazy białkowej A. Eur J Neurosci. 2010;31:1243–1251. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
58. Strack S, McNeill RB, Colbran RJ. Mechanizm i regulacja zależnej od wapnia/kalmoduliny kinazy białkowej II kierującej się do podjednostki NR2B receptora N-metylo-D-asparaginianu. J Biol Chem. 2000;275:23798–23806. [PubMed]
59. Ulery-Reynolds PG, Castillo MA, Vialou V, Russo SJ, Nestler EJ. Fosforylacja DeltaFosB pośredniczy w jego stabilności in vivo. Neuronauka. 2009;158:369–372. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
60. Ulery PG, Nestler EJ. Regulacja aktywności transkrypcyjnej DeltaFosB przez fosforylację Ser27. Eur J Neurosci. 2007; 25: 224 – 230. [PubMed]
61. Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ. Regulacja stabilności DeltaFosB przez fosforylację. J Neurosci. 2006; 26: 5131 – 5142. [PubMed]
62. Vialou V i in. DeltaFosB w obwodach nagrody w mózgu pośredniczy w odporności na stres i reakcjach przeciwdepresyjnych. Nat Neurosci. 2010;13:745–752. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
63. Wang L, Lv Z, Hu Z, Sheng J, Hui B, Sun J, Ma L. Przewlekła indukowana kokainą acetylacja H3 i aktywacja transkrypcyjna CaMKIIalfa w jądrze półleżącym ma kluczowe znaczenie dla motywacji do wzmocnienia leku. Neuropsychofarmakologia. 2010;35:913–928. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
64. Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S. Delta FosB reguluje pracę kół. J Neurosci. 2002; 22: 8133 – 8138. [PubMed]
65. Winstanley CA, LaPlant Q, Theobald DE, Green TA, Bachtell RK, Perrotti LI, DiLeone RJ, Russo SJ, Garth WJ, Self DW, Nestler EJ. Indukcja DeltaFosB w korze oczodołowo-czołowej pośredniczy w tolerancji na indukowane kokainą zaburzenia poznawcze. J Neurosci. 2007; 27: 10497 – 10507. [PubMed]
66. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchman T, Berton O, Sim-Selley LJ, Dileone RJ, Kumar A, Nestler EJ. Istotna rola DeltaFosB w jądrze półleżącym w działaniu morfiny. Nat Neurosci. 2006; 9: 205 – 211. [PubMed]
67. Zhang R, Khoo MS, Wu Y, Yang Y, Grueter CE, Ni G, Cena EE, Jr, Thiel W, Guatimosim S, Song LS, Madu EC, Shah AN, Vishnivetskaya TA, Atkinson JB, Gurevich VV, Salama G, Lederer WJ, Colbran RJ, Anderson ME. Inhibicja kinazy kalmodulinowej II chroni przed strukturalną chorobą serca. Nat Med. 2005;11:409–417. [PubMed]