Zwiększona aktywność kinazy zależnej od cyklin 5 prowadzi do osłabienia sygnalizacji dopaminowej za pośrednictwem kokainy (2005)

Proc Natl Acad Sci US A. 2005 February 1; 102(5): 1737-1742.

Opublikowane online 2005 January 21. doi:  10.1073 / pnas.0409456102
PMCID: PMC547862
Neuroscience
Ten artykuł został cytowany przez inne artykuły w PMC.

Abstrakcyjny

Kokaina, lek nadużywający, zwiększa synaptyczne poziomy dopaminy w prążkowiu, blokując wychwyt zwrotny dopaminy w końcówkach aksonów. Stwierdzono, że zależna od cyklin kinaza 5 (Cdk5) i jej aktywator p35, białka zaangażowane w fosforylację substratów w neuronach postmitotycznych, są regulowane w górę po przewlekłej ekspozycji na kokainę. Aby dokładniej zbadać wpływ indukcji Cdk5 i p35 na sygnalizację dopaminową prążkowia, wygenerowaliśmy dwie niezależne linie myszy transgenicznych, w których nadeksprymowano Cdk5 lub p35 w neuronach. Opisujemy tutaj, że zwiększona aktywność Cdk5, w wyniku p35, ale nie nadekspresji Cdk5, prowadzi do osłabienia sygnalizacji dopaminy za pośrednictwem kokainy. Zwiększonej fosforylacji dopaminy i fosfoproteiny regulowanej przez cdk5, masy cząsteczkowej 32 kDa (DARPP-32) w Thr-75, towarzyszyła zmniejszona fosforylacja DARPP-32 w Thr-34. Zwiększonej fosforylacji kinazy 5 regulowanej sygnałem pozakomórkowym za pośrednictwem Cdk1 w Thr-286 towarzyszyła zmniejszona aktywacja kinazy 1 / 2 regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym. Efekty te przyczyniły się do osłabienia indukowanej kokainą fosforylacji białka wiążącego element odpowiedzi cAMP, a także mniejszej indukcji c-fos w prążkowiu. Wyniki te potwierdzają tezę, że aktywność Cdk5 jest zaangażowana w zmienioną ekspresję genu po przewlekłej ekspozycji na kokainę, a zatem wpływa na długotrwałe zmiany funkcji neuronalnej leżące u podstaw uzależnienia od kokainy.

Słowa kluczowe: uzależnienie od kokainy, fosforylacja, prążkowie

Kokaina zwiększa synaptyczne poziomy dopaminy w prążkowiu i zmienia ekspresję genów w neuronach dopaminoceptywnych poprzez aktywację szlaków wewnątrzkomórkowych, które propagują początkowy sygnał z receptora dopaminy D1 do jądra (1). Chroniczna ekspozycja na kokainę reguluje w górę kilka czynników transkrypcyjnych, powodując długotrwałe zmiany w ekspresji genów, które, jak się uważa, leżą u podstaw adaptacji neuronalnych w uzależnieniu od kokainy (2). ΔFosB, zidentyfikowany jako taki czynnik transkrypcyjny (3), wykazano, że zwiększa reakcję behawioralną zwierząt na kokainę (4, 5). Dlatego oczekuje się, że identyfikacja docelowych genów regulowanych przez indukcję ΔFosB przyczyni się do lepszego zrozumienia mechanizmu molekularnego leżącego u podstaw uzależnienia od kokainy. Ostatnio wykazano, że przewlekłe leczenie zwierząt kokainą reguluje ekspresję kinazy zależnej od cykliny 5 (Cdk5) i jej aktywatora p35 w prążkowiu poprzez indukcję ΔFosB (6, 7).

Cdk5 jest członkiem rodziny Cdk kinaz serynowych / treoninowych. W przeciwieństwie do innych Cdk, które są głównymi regulatorami postępu cyklu komórkowego, Cdk5 jest głównie zaangażowany w fosforylację substratów w neuronach postmitotycznych (8). Swoistość neuronalna aktywności Cdk5 jest osiągana poprzez połączenie z jej aktywatorami, p35 lub p39, które są głównie wyrażane w neuronach postmitotycznych (8). Oprócz podstawowej roli Cdk5 w rozwoju mózgu (9, 10),t ma również związek z transmisją dopaminergiczną w mózgu po urodzeniu (11, 12). Hamowanie aktywności Cdk5 powoduje zwiększone uwalnianie dopaminy w prążkowiu, co wskazuje na presynaptyczną funkcję Cdk5 jako negatywnego regulatora uwalniania dopaminy (11). Ponadto Cdk5 moduluje skuteczność postsynaptycznej sygnalizacji dopaminy przez fosforylację fosfoproteiny regulowanej dopaminą i cAMP, masy cząsteczkowej 32 kDa (DARPP-32) w Thr-75, która przekształca DARPP-32 w inhibitor kinazy zależnej od cAMP (PKA) (12).

Te obserwacje sugerują, że Cdk5 i p35 są dalszymi regulatorami przedłużonej aktywacji sygnalizacji dopaminy po przewlekłej ekspozycji na kokainę, a zatem w uzależnieniu od kokainy. W celu dalszego zajęcia się rolą Cdk5 w sygnalizacji dopaminowej prążkowia, wygenerowaliśmy dwie transgeniczne linie myszy, w których Cdk5 lub p35 ulegały nadekspresji specyficznie w neuronach pod kontrolą promotora p35. Nasze odkrycia wskazały, że aktywność Cdk5 była zwiększona dzięki zwiększonemu poziomowi białka p35, ale nie białka Cdk5, co sugeruje, że poziom białka p35 ogranicza szybkość działania Cdk5. Zapewniamy tutaj in vivo dowód, że zwiększona aktywność Cdk5, w wyniku nadekspresji p35, prowadzi do osłabienia dopaminy za pośrednictwem kokainy sygnalizującej jądro poprzez hamowanie kaskad PKA i kinaz regulowanych sygnałem pozakomórkowym (ERK).

Materiały i Metody

Przeciwciała. Przeciwciała poliklonalne przeciwko Cdk5 (C-8) i p35 (C-19) zakupiono z Santa Cruz Biotechnology. Zależne od fosforylacji i niezależne przeciwciała wobec kinazy ERK (MEK) 1 / 2, ERK1 / 2 i białka wiążącego element cAMP-odpowiedź (CREB) otrzymano z Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Przeciwciała przeciwko fosfo-Thr-34 DARPP 32 (13), fosfo-Thr-75 DARPP-32 (12), całkowita DARPP-32 (12) i c-fos (14) zostały użyte zgodnie z opisem. Przeciwciało przeciwko aktynie zakupiono od Sigma.

Zwierzęta eksperymentalne. Wcześniej sklonowaliśmy mysi gen p35 Cdk5r1, który koduje białko p35 i scharakteryzował jego strukturę genomową (15). Aby wygenerować transgeniczną mysz z nadekspresją neuronową p35 (Tgp35), 6-kb EcoRI-EcoFragment RI zawierający region promotora 1.2-kb subklonowano do plazmidu pGEM9Z (-) i znacznik 45-bp pochodzący z SV40 wstawiono do KpnI miejsce poniżej poli (A+) sygnał (Rys. 1A). Tag zawierał SpeI miejsce do genotypowania zwierząt. Fragment 6-kb wycięto z plazmidu i oczyszczono, a następnie wstrzyknięto przedjądrzanie transgenu w celu wytworzenia myszy transgenicznych. Aby zbadać profil ekspresji transgenu pod kontrolą regulacyjną promotora p1.2 35-kb in vivo, podwójnie transgeniczna mysz (Tgp35; p35 - / -) była dalej wytwarzana przy użyciu dwuetapowej strategii hodowli, w której mysz Tgp35 była regenerowana w endogennym tle p35-null. Inne modele myszy stosowane w tym badaniu obejmowały p35 +/–, p35 - / -, Cdk5 +/– oraz mysz transgeniczną z nadekspresją neuronalną Cdk5 (TgCdk5) (9, 16, 17). Genotypy tych myszy określono przez wykonanie analizy Southern blot lub PCR na genomowym DNA wyizolowanym z biopsji ogona. Myszy trzymano w ciemnym cyklu 12-h light / 12-h. Cała opieka została udzielona zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i eksperymentalnymi oraz korzystania z nich.

Rys.. 1.  

Wytwarzanie myszy transgenicznej z nadekspresją neuronową p35 kierowaną przez promotor p35 (Tgp35). (A) Konstrukt transgenu jest pokazany w schematycznych strukturach dzikich i ukierunkowanych alleli p35. Czerwone słupki wskazują sondę używaną do genotypowania. ...

Analiza Southern Blot. Genomowy DNA ekstrahowany z biopsji ogona trawiono EcoRI i SpeI poddano elektroforezie na żelu agarozowym 0.9% i przeniesiono na membranę nylonową. Membranę hybrydyzowano z próbką losową 32Sonda znakowana P w 42 ° C przez noc. Sondę 485-bp do genotypowania myszy z nokautem p35 (p35 - / -) i myszy Tgp35 wytworzono metodą PCR, stosując następujące startery: 5′-ACATCCTGCTGCCACGGTGAC-3 ′ i 5′-CCACTGTAAAAGCAACAAGA-3 ′. Zhybrydyzowaną błonę przemyto dwa razy w 2 x SSC / 0.1% SDS w 42 ° C przez 10 min i dwa razy w 0.1 x SSC / 0.1% SDS w 65 ° C przez min 20 i wystawiono na film rentgenowski.

Farmakoterapia. Kokainę (Sigma) rozpuszczono w jałowym roztworze soli fizjologicznej. Zwierzętom wstrzyknięto dootrzewnowo kokainę (15 mg / kg) lub równą objętość soli fizjologicznej w wieku 3 miesięcy i zabito przez dekapitację w różnych punktach czasowych (15, 30, 60 i 120 min) po wstrzyknięciu. Mózgi szybko usunięto i schłodzono w lodowatym PBS. Następnie prążkowane wycięto i poddano analizie Northern lub Western blot. Do analizy immunohistochemicznej skrawki prążkowia otrzymano od myszy 2 h po iniekcji.

Analiza Northern Blot. Całkowity RNA ekstrahowano z prążkowia za pomocą odczynnika TRIzol (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) i poddano analizie Northern blot, jak opisano (18). Do wykrywania mRNA c-fos zastosowano fragment 189-bp mysiego cDNA c-fos jako sondę, jak opisano (19). Poziomy mRNA c-fos określono ilościowo przez pomiar gęstości optycznej określonego pasma przy użyciu systemu analizy obrazu z oprogramowaniem do obrazowania nih, wersja 1.62.

Analiza Western Blot. Tkanki prążkowia poddano działaniu ultradźwięków w 1% SDS i gotowano przez 10 min. Stężenie białka w każdej próbce określono za pomocą testu białka BCA (Pierce). Równe ilości białka rozdzielono za pomocą SDS / PAGE przed przeniesieniem na membranę nitrocelulozową. Błony zablokowano w 1 x PBS zawierającym 5% odtłuszczonego mleka i 0.05% Tween 20 i inkubowano z pierwszorzędowymi przeciwciałami przez noc w 4 ° C. Inkubację ze sprzężoną z peroksydazą IgG anty-mysią lub króliczą (Sigma) przeprowadzono w temperaturze pokojowej przez 60 min. Sygnał wykryto przez zwiększoną chemiluminescencję (Pierce), a gęstości optyczne pasm określono ilościowo jak opisano powyżej.

Test kinazy Cdk5. Lizaty prążkowia przygotowano za pomocą buforu do lizy składającego się z 50 mM Tris · HCl, pH 7.4 / 50 mM NaCl / 5 mM EDTA / 1% Triton X-100 / 1mMDTT / 1 mM fluorku fenylometylosulfonylu / 1 μg / ml aprotyniny / 1 μg / ml aprotyniny / 5 μg / ml inhibitorów leupeptyny / fosfatazy (mieszanina inhibitora fosfatazy I i II, Sigma). Lizaty poddano immunoprecypitacji za pomocą przeciwciał anty-Cdk8 (C-35) lub anty-p19 (C-5). Immunoprecypitaty Cdk300 wytworzono przez inkubację 300 μl lizatu (odpowiadającego 5 μg białka) z przeciwciałem anty-Cdk3 (4 μg) przez noc w 25 ° C, a następnie dalszą inkubację z 50 μl kulek agarozowych białka A (3 zawiesina w buforze do lizy, Santa Cruz Biotechnology) dla 4 hw 35 ° C. W celu przygotowania immunoprecypitatów p500, 1 μl lizatu (odpowiadającego mg 35 białka) inkubowano z przeciwciałem anty-p3 (50 μg) jak opisano powyżej. Immunoprecypitaty przemyto dwukrotnie buforem do lizy i dwukrotnie buforem kinazowym składającym się z 7.4 mM Tris · HCl, pH 5 / XNUMX mM MgCl2/ 1 mM EDTA / 1 mM EGTA / 1 mM DTT, ponownie zawieszony w 60 μl buforu kinazy. Aktywność kinazy mierzono stosując histon H1 jako substrat (18).

Immunohistochemia. Myszy znieczulono przez iniekcje dootrzewnowe avertiny (250 mg / kg, Fluka) i perfundowano przezsercowo buforem fosforanu sodu 0.1 M, pH 7.4, a następnie Streck Tissue Fixative (Streck Laboratories, La Vista, NE), utrwalacz niesieciujący. Rozcięte mózgi utrwalano w tym samym utrwalaczu przez noc w 37 ° C. Następnie mózgi zatopiono w parafinie, pocięto na skrawki koronalne o grubości 5-μm i poddano immunohistochemii, stosując technikę kompleksu awidyna-biotyna-peroksydaza (Vector Laboratories) z diaminobenzydyną jako substratem. Skrawki inkubowano z oczyszczonym przez powinowactwo poliklonalnym przeciwciałem przeciwko c-fos przez noc w 4 ° C. Specyficzność barwienia oceniano przez pominięcie pierwszorzędowego przeciwciała.

wyniki

Wytwarzanie myszy transgenicznych z nadekspresją neuronów p35. Transgen stosowany do osiągnięcia zwiększonej ekspresji neuronowej p35 zawierał fragment 6-kb sklonowanego mysiego genu p35 zawierający promotor 1.2-kb i całą sekwencję kodującą p35 (Rys. 1 A). Genotypy myszy określono za pomocą analizy Southern blot przy użyciu sondy zaprojektowanej do odróżnienia myszy p35 - / - i myszy Tgp35 od myszy typu dzikiego (Rys. 1 A i B). Aby zbadać ekspresję transgenu pod kontrolą promotora p1.2 35-kb, wygenerowaliśmy myszy podwójnie transgeniczne (Tgp35; p35 - / -), w których ekspresja p35 była napędzana tylko przez transgen. Ekspresję p35 w Tgp35; myszy p35 - / - obserwowano tylko w mózgu (Rys. 1C), gdzie przestrzenny wzór ekspresji był podobny do wzorca myszy typu dzikiego (Rys. 1D). Wykazano, że brak p35 powoduje nieprawidłową strukturę warstwową w korze mózgowej i hipokampie myszy (10). Jednak myszy Tgp35; p35 - / - wykazały całkowite uratowanie fenotypu p35 - / - mózgu (Rys. 1E). Dane te wskazują, że promotor p1.2 35-kb kontrolował ekspresję transgenu o podobnym profilu ekspresji do p35 z endogennego genu p35.

Poziom białka p35 jest ograniczający szybkość dla regulacji w górę aktywności Cdk5. Zbadaliśmy efekty dawkowania genów genów kodujących p35 i Cdk5 na ekspresję białka w ekstraktach prążkowia z myszy p35 - / -, p35 +/–, typu dzikiego, Tgp35, Cdk5 +/– i TgCdk5 w wieku 3. Poziomy białka p35 i Cdk5 dobrze korelowały odpowiednio z dawkami genów (Rys. 2 A i B). Myszy Tgp35 wykazywały N1.6-krotny wzrost poziomu białka p35 w porównaniu z myszami typu dzikiego, podczas gdy na poziomy białka Cdk5 nie miały wpływu różne poziomy białka p35. Myszy TgCdk5 wykazywały N1.9-krotny wzrost poziomu białka Cdk5 w porównaniu z myszami typu dzikiego, podczas gdy na poziomy białka p35 nie miały wpływu różne poziomy białka Cdk5. Aby zbadać wpływ różnych ilości białka p35 na aktywność Cdk5, Cdk5 poddano immunoprecypitacji z ekstraktów prążkowia za pomocą przeciwciała anty-Cdk5 i zmierzono aktywność kinazy. Podobnie, w celu zbadania wpływu różnych ilości białka Cdk5 na aktywność kinazy, p35 poddano immunoprecypitacji z ekstraktów prążkowia z przeciwciałem anty-p35 i zmierzono aktywność kinazy. Aktywność Cdk5 dobrze korelowała z poziomem białka p35, ale nie z poziomem białka Cdk5 (Rys. 2 C i D). Wyniki te wskazują, że ilość białka p35 jest czynnikiem ograniczającym szybkość działania Cdk5. Dlatego wykorzystaliśmy myszy Tgp35 do zbadania wpływu zwiększonej aktywności Cdk5 na sygnalizację dopaminy w prążkowiu.

Rys.. 2.  

Regulacja w górę aktywności Cdk5 jest ograniczona szybkością przez poziom białka p35. (A) Western blot pokazujący, że poziomy białka p35 i Cdk5 korelują odpowiednio z dawkami genów genów p35 i Cdk5. (B) Względne poziomy białka p35 lub Cdk5 ...

Indukowana kokainą fosforylacja DARPP-32 w Thr-34 jest atenuowana w myszach Tgp35. Funkcja DARPP-32 zależy od stanu fosforylacji w wielu miejscach (20). PKA fosforyluje DARPP-32 w Thr-34, podczas gdy Cdk5 fosforyluje DARPP-32 w Thr-75. Zatem zbadaliśmy stan fosforylacji DARPP-32 w ekstraktach prążkowia myszy typu dzikiego i myszy Tgp35. Poziom fosfo-Thr-75 DARPP-32 był wyższy u myszy Tgp35 (Rys. 3A; 1.6 ± 0.2-krotnie powyżej wartości myszy typu dzikiego). Następnie oceniliśmy wpływ zwiększonej aktywności Cdk5 na sygnalizację dopaminową prążkowia. Zbadaliśmy indukowaną kokainą aktywację PKA u myszy Tgp35, analizując stan fosforylacji DARPP-32 w Thr-34. Poziom fosfo-Thr-34 DARPP-32 był zwiększony u myszy typu dzikiego 15 min po wstrzyknięciu kokainy (Rys. 3B; 1.8 ± 0.2-krotnie powyżej poziomu podstawowego. Jednak wpływ kokainy na fosforylację DARPP-34 przez Thr-32 był osłabiony u myszy Tgp35 (1.2 ± 0.3-krotnie powyżej poziomu podstawowego). Wyniki te wskazują, że wzrost aktywności Cdk5 osłabiał aktywację PKA indukowaną kokainą, prawdopodobnie przez fosforylację DARPP-32 w Thr-75 (6, 12). Możliwe jest również, że zwiększenie aktywności presynaptycznej Cdk5 prowadzi do zmniejszenia uwalniania dopaminy, co przyczynia się do zmniejszenia działania kokainy. Warto zauważyć, że pojedyncze wstrzyknięcie kokainy nie wpłynęło na poziomy białka p35 i Cdk5, jak również na aktywność kinazy (Rys. 3 C i D). Jest to przeciwieństwo wcześniejszych badań, w których wykazano, że przewlekła ekspozycja na kokainę reguluje ekspresję p35 i Cdk5 (6).

Rys.. 3.  

Zwiększenie aktywności Cdk5 zwiększa poziom fosfo-Thr-75 DARPP-32 i osłabia indukowaną kokainą aktywację PKA. (A) Immunoblot wykazujący zwiększoną fosforylację DARPP-32 w Thr-75 (P-D32 Thr-75) w ekstraktach prążkowia z myszy Tgp35. W ...

Regulacja w górę aktywności Cdk5 tłumi indukowaną kokainą aktywację ERK1 / 2. Najnowsze dane wskazują, że aktywacja receptora dopaminy w prążkowiu aktywuje również inne kaskady sygnalizacyjne, w tym szlak ERK (21, 22), która odgrywa ważną rolę w reakcji behawioralnej na kokainę (23). Dlatego zbadaliśmy, czy aktywność Cdk5 może wpływać na indukowaną kokainą aktywację szlaku ERK. Aktywację szlaku ERK obserwowano po wstrzyknięciu kokainy w ekstraktach prążkowia myszy typu dzikiego, co widać po zwiększonej fosforylacji MEK1 / 2 w Ser-217 i Ser-221 (1.5 ± 0.2-krotnie powyżej poziomu podstawowego) i ERK1 / 2 w Thr-202 i Tyr-204 (fosforylacja ERK2: 1.5 ± 0.2-krotnie powyżej poziomu podstawowego) (Rys. 4 A i B). Jednakże indukowana kokainą aktywacja MEK1 / 2 (1.2 ± 0.2-krotnie powyżej poziomu podstawowego) i ERK1 / 2 (fosforylacja ERK2: 1.2 ± 0.2-krotnie powyżej poziomu podstawowego) została osłabiona u myszy Tgp35 (Rys. 4 A i B). Co więcej, podstawowe poziomy fosfo-ERK1 / 2 były niższe u myszy Tgp35 (0.8 ± 0.2-krotnie poniżej wartości myszy typu dzikiego), podczas gdy ta tendencja nie była statystycznie istotna. Ten ostatni wynik można przypisać zależnej od Cdk5 fosforylacji MEK1 w Thr-286, powodując spadek aktywności katalitycznej (24). Aby ocenić tę możliwość, zbadaliśmy stan fosforylacji MEK1 w Thr-286 i stwierdziliśmy, że wyższe poziomy fosfo-Thr-286 MEK1 były obecne w ekstraktach prążkowia z myszy Tgp35 (Rys. 4C; 1.3 ± 0.1-krotnie powyżej wartości myszy typu dzikiego). Ponadto stan fosforylacji MEK1 w Thr-286 nie został zmieniony przez pojedynczą iniekcję kokainy, zgodnie ze stwierdzeniem, że leczenie nie miało wpływu na aktywność Cdk5 (Rys. 3D).

Rys.. 4.  

Hamowanie MEK5 / 1 za pośrednictwem Cdk2 prowadzi do osłabienia indukowanej kokainą aktywacji ERK1 / 2. Ekstrakty prążkowia przygotowano z myszy dzikiego typu (WT) i Tgp35 15 min po wstrzyknięciu kokainy lub soli fizjologicznej i poddano immunoblottingowi ...

Propagacja sygnalizacji dopaminy do jądra jest osłabiona przez zwiększoną aktywność Cdk5. Indukowana kokainą aktywacja wielu kaskad sygnałowych z udziałem PKA i ERK prowadzi do następującej aktywacji czynnika transkrypcyjnego CREB w jądrze poprzez jego fosforylację w Ser-133 (22, 25). Aby zbadać, czy zależne od Cdk5 działanie hamujące na PKA i kaskady aktywacji ERK mogą zbiegać się w fosforylacji CREB w jądrze, zbadaliśmy stan fosforylacji CREB w Ser-133 w ekstraktach prążkowia myszy typu dzikiego i myszy Tgp35. Podstawowy poziom fosfo-CREB był niższy u myszy Tgp35 (0.7 ± 0.1-krotna wartość myszy typu dzikiego) (Rys. 5). W odpowiedzi na wstrzyknięcie kokainy, poziom fosfo-CREB był zwiększony w prążkowiu myszy typu dzikiego (1.5 ± 0.1-krotnie powyżej poziomu podstawowego), ale ta odpowiedź na kokainę była osłabiona u myszy Tgp35 (1.2 ± 0.1- złożyć powyżej poziomu podstawowego (Rys. 5).

Rys.. 5.  

Zwiększenie aktywności Cdk5 powoduje zmniejszenie fosforylacji CREB w Ser-133 u myszy z zastrzykiem soli fizjologicznej lub kokainy. Ekstrakty prążkowia przygotowano z myszy dzikiego typu (WT) i Tgp35 30 min po wstrzyknięciu i poddano immunoblottingowi ...

Fosforylacja CREB na Ser-133 zwiększa jego aktywność transkrypcyjną poprzez element odpowiedzi cAMP w regionie promotora niektórych genów, w tym genu c-fos (26). Dlatego zbadaliśmy indukcję c-fos w prążkowiu myszy typu dzikiego i myszy Tgp35 po wstrzyknięciu kokainy. U myszy typu dzikiego poziom mRNA c-fos wzrósł do wartości szczytowej (1.8 ± 0.2-krotnie powyżej poziomu podstawowego) 30 min po wstrzyknięciu kokainy, a następnie powrócił do poziomu podstawowego przez 120 min po wstrzyknięciu (Rys. 6 A i B). Jednak poziomy mRNA c-fos były ≈30% niższe u myszy Tgp35 niż u myszy typu dzikiego do 30 min po wstrzyknięciu (Rys. 6 A i B). Mniejszą indukcję c-fos w myszach Tgp35 potwierdzono dodatkowo immunohistochemicznie (Rys. 6 C-F). Podawanie kokainy zwiększyło immunoreaktywność c-fos, silnie w grzbietowo-przyśrodkowo-grzbietowo-środkowej części prążkowia i słabo w częściach bocznych, zarówno u myszy typu dzikiego, jak i myszy Tgp35. Jednakże indukowany kokainą wzrost liczby komórek immunopozytywnych c-fos był wyraźnie osłabiony w prążkowiu myszy Tgp35 (Rys. 6G). Łącznie wyniki te wskazywały, że za pośrednictwem kokainy wzmocnienie dopaminy w prążkowiu sygnalizującym jądrze było zahamowane u myszy Tgp35, co jest prawdopodobnym wynikiem zwiększonej aktywności Cdk5.

Rys.. 6.  

Zwiększenie aktywności Cdk5 powoduje zmniejszenie ekspresji c-fos prążkowia i jego mniejszą indukcję po podaniu kokainy. (A) Northern blot pokazujący przebieg czasowy indukcji c-fos u myszy typu dzikiego (WT) i Tgp35 (Tg) po wstrzyknięciu kokainy. ...

Dyskusja

Cdk5 i jego aktywator p35 zostały zidentyfikowane jako geny docelowe, które są regulowane przez chroniczną ekspozycję na kokainę (6). Opisujemy tutaj dowody, że zwiększona aktywność Cdk5, w wyniku regulacji w górę p35 zamiast regulacji w górę Cdk5, prowadzi do osłabienia sygnalizacji dopaminy za pośrednictwem kokainy w neuronach prążkowia. Aby zbadać konsekwencje podwyższonej ekspresji Cdk5 lub p35 na sygnalizację dopaminową prążkowia, przeanalizowano dwie linie myszy transgenicznych, myszy TgCdk5 i Tgp35. Odkryliśmy, że aktywność Cdk5 była zwiększona proporcjonalnie do zwiększonego poziomu białka p35, ale nie była pod wpływem zwiększonego poziomu białka Cdk5. Nasz poprzedni raport wykazał również, że aktywność Cdk5 w mózgu myszy TgCdk5 była niższa niż w mózgu myszy typu dzikiego, gdy aktywność mierzono za pomocą immunoprecypitatów Cdk5 (17), sugerując, że nadekspresja Cdk5 powoduje wzrost poziomu monomerycznego Cdk5, jeśli poziom p35 nie jest zwiększony. Wyniki te wskazują, że poziom białka p35 jest czynnikiem ograniczającym szybkość działania Cdk5.

Myszy Tgp35 wykazywały mniejszą indukcję zarówno fosforylacji CREB, jak i c-fos w prążkowiu po ostrej iniekcji kokainy, co sugeruje, że odpowiedź prążkowia na kokainę była hamowana przez zwiększoną aktywność Cdk5. Osłabienie sygnalizacji dopaminy za pośrednictwem kokainy u myszy Tgp35 prawdopodobnie osiągnięto przez hamowanie przez Cdk5 wielu kaskad sygnalizacyjnych obejmujących DARPP-32, PKA i ERK. Podawanie kokainy zwiększyło fosforylację DARPP-32 przez PKA w Thr-34 u myszy typu dzikiego, podczas gdy ta odpowiedź była atenuowana u myszy Tgp35. Wykazano, że fosforylacja DARPP-32 w Thr-34 przez PKA hamuje aktywność fosfatazy białkowej 1 (PP1), enzymu odpowiedzialnego za defosforylację Ser-133 z CREB (27). Zatem aktywność PP1 nie byłaby antagonizowana przez szlak DARPP-32 / PP1 u myszy Tgp35.

Indukowana kokainą aktywacja ERK1 / 2 była również atenuowana u myszy Tgp35. Istnieje kilka odrębnych mechanizmów, dzięki którym Cdk5 może hamować indukowaną kokainą aktywację ERK1 / 2. Po pierwsze, zależna od Cdk5 fosforylacja DARPP-32 w Thr-75 może hamować PKA, prowadząc do późniejszej inhibicji dowolnej aktywacji MEK1 / 2 za pośrednictwem PKA, która jest wymagana do aktywacji ERK1 / 2. Niedawne badania wykazały również, że fosforylacja DARPP-32 w Thr-34 jest wymagana do aktywowanej przez kokainę aktywacji ERK1 / 2 przez wiele szlaków obejmujących pośrednią regulację aktywacji MEK, jak również obejmujących regulację fosfatazy wzbogaconej w prążki, tyrozyny fosfataza, która działa bezpośrednio na ERK1 / 2 (28). Wsparcie dla tej możliwości sugeruje odkrycie, że indukowana kokainą fosforylacja MEK1 / 2 w Ser-217 i Ser-221 została zniesiona u myszy Tgp35. Inną prawdopodobną drogą jest zależna od Cdk5 fosforylacja MEK1 w Thr-286, która spowoduje zmniejszenie jego aktywności katalitycznej i doprowadzi do zahamowania aktywności ERK1 / 2 (24).

Wykazano, że hamowanie aktywności Cdk5 w prążkowiu nasila behawioralne skutki przewlekłego leczenia kokainą u zwierząt (6). Zgodnie z hipotezą, że regulacja w górę aktywności Cdk5 może przyczyniać się do adaptacji neuronów w celu przeciwdziałania skutkom powtarzanego podawania kokainy (6), stwierdziliśmy, że fosforylacja DARPP-5 i MEK32 za pośrednictwem Cdk1 przyczyniła się do osłabienia indukowanej kokainą aktywacji ERK1 / 2, powodując mniejszą indukcję fosforylacji CREB i c-fos w prążkowiu. Nasze odkrycia potwierdzają pogląd, że zwiększona aktywność Cdk5 w wyniku regulacji p35 może zmienić ekspresję genów w prążkowiu po przewlekłej ekspozycji na kokainę. Może to nastąpić poprzez zmiany w aktywności czynników transkrypcyjnych, takich jak CREB i c-fos. Zatem aktywator Cdk5 p35, ze względu na jego ograniczające szybkość działanie na aktywność Cdk5, może przyczyniać się do długotrwałych zmian funkcji neuronalnych leżących u podstaw uzależnienia od kokainy.

Podziękowanie

Dziękujemy dr. Mary Jo Danton, Philip Grant i Sashi Kesavapany za krytyczne czytanie manuskryptu. Praca ta była wspierana przez National Institutes of Health Grant Z01DE00664-05 (do ABK), US Public Health Service Grant DA10044 oraz dotacje z Fundacji Simonsa, Fundacji Petera J. Sharpa i Fundacji Picower (do PG).

Uwagi

Skróty: Cdk5, kinaza zależna od cyklin 5; ERK, kinaza regulowana sygnałem zewnątrzkomórkowym; DARPP-32, fosfoproteina regulowana dopaminą i cAMP, masa cząsteczkowa 32 kDa; PKA, kinaza zależna od cAMP; MEK, kinaza ERK; CREB, białko wiążące element cAMP-odpowiedź.

Referencje

1. Hope, B., Kosofsky, B., Hyman, SE & Nestler, EJ (1992) Proc. Natl. Natl. Acad. Sci. Polska 89, 5764-5768. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
2. Nestler, EJ, Hope, BT & Widnell, KL (1993) Neuron 11, 995-1006. [PubMed]
3. Hope, BT, Nye, HE, Kelz, MB, Self, DW, Iadarola, MJ, Nakabeppu, Y., Duman, RS & Nestler, EJ (1994) Neuron 13, 1235-1244. [PubMed]
4. Kelz, MB, Chen, J., Carlezon, WA, Jr., Whisler, K., Gilden, L., Beckmann, AM, Steffen, C., Zhang, YJ, Marotti, L., Self, DW, i in. (1999) Nature 401, 272 – 276. [PubMed]
5. McClung, CA i Nestler, EJ (2003) Nat. Neurosci. 6, 1208-1215. [PubMed]
6. Bibb, JA, Chen, J., Taylor, JR, Svenningsson, P., Nishi, A., Snyder, GL, Yan, Z., Sagawa, ZK, Ouimet, CC, Nairn, AC, i in. (2001) Nature 410, 376-380. [PubMed]
7. Chen, J., Zhang, Y., Kelz, MB, Steffen, C., Ang, ES, Zeng, L. & Nestler, EJ (2000) J. Neurosci. 20, 8965-8971. [PubMed]
8. Dhavan, R. & Tsai, LH (2001) Nat. Rev. Mol. Komórka. Biol. 2, 749-759. [PubMed]
9. Ohshima, T., Ward, JM, Huh, CG, Longenecker, G., Veeranna, Pant, HC, Brady, RO, Martin, LJ & Kulkarni, AB (1996) Proc. Natl. Natl. Acad. Sci. Stany Zjednoczone 93, 11173-11178. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
10. Chae, T., Kwon, YT, Bronson, R., Dikkes, P., Li, E. & Tsai, LH (1997) Neuron 18, 29-42. [PubMed]
11. Chergui, K., Svenningsson, P. & Greengard, P. (2004) Proc. Natl. Natl. Acad. Sci. USA 101, 2191-2196. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
12. Bibb, JA, Snyder, GL, Nishi, A., Yan, Z., Meijer, L., Fienberg, AA, Tsai, LH, Kwon, YT, Girault, JA, Czernik, AJ, i in. (1999) Nature 402, 669-671. [PubMed]
13. Snyder, GL, Girault, JA, Chen, JY, Czernik, AJ, Kebabian, JW, Nathanson, JA & Greengard, P. (1992) J. Neurosci. 12, 3071-3083. [PubMed]
14. Young, ST, Porrino, LJ & Iadarola, MJ (1991) Proc. Natl. Natl. Acad. Sci. Polska 88, 1291-1295. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
15. Ohshima, T., Kozak, CA, Nagle, JW, Pant, HC, Brady, RO & Kulkarni, AB (1996) Genomics 35, 372-375. [PubMed]
16. Ohshima, T., Ogawa, M., Veeranna, Hirasawa, M., Longenecker, G., Ishiguro, K., Pant, HC, Brady, RO, Kulkarni, AB & Mikoshiba, K. (2001) Proc. Natl. Natl. Acad. Sci. Stany Zjednoczone 98, 2764-2769. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
17. Tanaka, T., Veeranna, Ohshima, T., Rajan, P., Amin, ND, Cho, A., Sreenath, T., Pant, HC, Brady, RO & Kulkarni, AB (2001) J. Neurosci . 21, 550-558. [PubMed]
18. Takahashi, S., Saito, T., Hisanaga, S., Pant, HC & Kulkarni, AB (2003) J. Biol. Chem. 278, 10506-10515. [PubMed]
19. Grimm, C., Wenzel, A., Hafezi, F. & Reme, CE (2000) Mol. Vis. 6, 252-260. [PubMed]
20. Nairn, AC, Svenningsson, P., Nishi, A., Fisone, G., Girault, JA & Greengard, P. (2004) Neuropharmacology 47, 14-23. [PubMed]
21. Nestler, EJ (2001) Nat. Ks. Neurosci. 2, 119-128. [PubMed]
22. Zanassi, P., Paolillo, M., Feliciello, A., Avvedimento, EV, Gallo, V. & Schinelli, S. (2001) J. Biol. Chem. 276, 11487-11495. [PubMed]
23. Valjent, E., Corvol, JC, Pages, C., Besson, MJ, Maldonado, R. & Caboche, J. (2000) J. Neurosci. 20, 8701-8709. [PubMed]
24. Sharma, P., Veeranna, Sharma, M., Amin, ND, Sihag, RK, Grant, P., Ahn, N., Kulkarni, AB & Pant, HC (2002) J. Biol. Chem. 277, 528-534. [PubMed]
25. Hyman, SE, Cole, RL, Konradi, C. & Kosofsky, BE (1995) Chem. Zmysły 20, 257-260. [PubMed]
26. Dash, PK, Karl, KA, Colicos, MA, Prywes, R. & Kandel, ER (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. Polska 88, 5061-5065. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
27. Greengard, P., Allen, PB i Nairn, AC (1999) Neuron 23, 435-447. [PubMed]
28. Valjent, E., Pascoli, V., Svenningsson, P., Paul, S., Enslen, H., Corvol, JC, Stipanovich, A., Caboche, J., Lombroso, P., Nairn, AC, i in. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 491-496.