PLoS ONE. 2013 Nov 25; 8 (11): e81245. doi: 10.1371 / journal.pone.0081245.
Nishijima T, Kawakami M, Kita I.
Źródło
Laboratorium Fizjologii Behawioralnej, Absolwent Szkoły Nauk o Zdrowiu Człowieka, Tokyo Metropolitan University, Tokio, Japonia.
Abstrakcyjny
Ćwiczenia fizyczne poprawiają wiele aspektów funkcji hipokampa. Zgodnie z poglądem, że aktywność neuronów jest kluczowa dla promowania funkcji neuronalnych, poprzednia literatura konsekwentnie wykazała, że ostre napady wysiłku wywołują aktywację neuronów w hipokampie. Powtarzające się bodźce aktywujące prowadzą do akumulacji czynnika transkrypcyjnego ΔFosB, który pośredniczy w długoterminowej plastyczności neuronów.
W tym badaniu przetestowaliśmy hipotezę, że długoterminowe dobrowolne bieganie koła indukuje ekspresję ΔFosB w hipokampie i badało wszelkie potencjalne efekty specyficzne dla regionu w obrębie podpól hipokampowych wzdłuż osi grzbietowo-brzusznej. Samce myszy C57BL / 6 trzymano z kółkiem do biegania lub bez niego dla tygodni 4. Długotrwały bieg koła znacząco zwiększał immunoreaktywność FosB / ΔFosB we wszystkich zmierzonych regionach hipokampa (tj. w podpólach DG, CA1 i CA3 zarówno hipokampa grzbietowego, jak i brzusznego). Wyniki potwierdziły, że bieg koła wywołał specyficzną dla regionu ekspresję immunoreaktywności FosB / ΔFosB w korze, co sugeruje, że jednolity wzrost FosB / ΔFosB w hipokampie nie jest niespecyficzną konsekwencją biegania. Dane Western blot wskazują, że zwiększona immunoreaktywność FosB / ΔFosB hipokampa była głównie spowodowana zwiększeniem ΔFosB. Wyniki te sugerują, że długotrwałe ćwiczenia fizyczne są silnym wyzwalaczem indukcji ΔFosB w całym hipokampie, co wyjaśniałoby, dlaczego ćwiczenia mogą poprawić zarówno funkcje grzbietowe, jak i brzuszne zależne od hipokampa. Co ciekawe, odkryliśmy, że ekspresja FosB / ΔFosB w DG była dodatnio skorelowana z liczbą immunoreaktywnych (tj. Niedojrzałych) neuronów doublecortin.
Chociaż mechanizmy, w których osFosB pośredniczy w neurogenezie wywołanej wysiłkiem fizycznym, są nadal niepewne, dane te sugerują, że neurogeneza wywołana wysiłkiem fizycznym jest co najmniej zależna od aktywności. Podsumowując, nasze obecne wyniki sugerują, że ΔFosB jest nowym celem molekularnym zaangażowanym w regulację plastyczności hipokampa indukowanej wysiłkiem fizycznym.
Wprowadzenie
Ćwiczenia dają różnorodne korzyści w odniesieniu do molekularnych, strukturalnych i funkcjonalnych aspektów hipokampa u gryzoni [1,2], niektóre z nich były wspierane przez badania na ludziach [3,4]. Jednak mechanizmy leżące u podstaw zmian w plastyczności hipokampa wywołanych wysiłkiem fizycznym nie są wystarczająco zrozumiałe. Wcześniejsza literatura konsekwentnie wykazywała, że ćwiczenia wywołują aktywację neuronalną hipokampa u gryzoni. Badania immunohistochemiczne z zastosowaniem c-Fos, markera przejściowej aktywacji neuronalnej, wykazały, że zarówno wymuszone, jak i dobrowolne prowadzenie zwiększonej ekspresji c-Fos w podobszarach zakrętu zębatego (DG), CA1 i CA3 hipokampa gryzonia [5-7]. Ponadto poprzednie badanie z wykorzystaniem przepływomierza laserowo-dopplerowskiego (LDF) wykazało, że łagodne bieganie na bieżni zwiększało regionalny przepływ krwi w mózgu (rCBF), alternatywny marker aktywacji neuronów, w podobszarze CA1 u szczura [8]. Badania immunohistochemiczne umożliwiają szczegółowe analizy specyficzne dla regionu po zaprzestaniu ćwiczeń, podczas gdy LDF umożliwia monitorowanie rCBF w czasie rzeczywistym w zlokalizowanym obszarze podczas wysiłku. Pomimo zalet i ograniczeń każdego badania, badania te podobnie wykazały wpływ ostrych ataków wysiłkowych na aktywność neuronalną hipokampa. Wyniki te sugerują mechanizm, dzięki któremu długotrwałe regularne ćwiczenia wspomagają plastyczność hipokampa poprzez wielokrotne uruchamianie aktywacji neuronalnej [9].
Czynnik transkrypcyjny ΔFosB, skrócona izoforma splicingowa pełnej długości FosB, jest indukowany przez różne rodzaje powtarzających się bodźców w określonych regionach mózgu, gdzie stopniowo gromadzi się z powodu swojej wyjątkowej stabilności (okres półtrwania tygodni) [10-12]. Coraz więcej dowodów pokazuje, że zwiększone poziomy ΔFosB pośredniczą w długotrwałej plastyczności neuronalnej i behawioralnej związanej z poszczególnymi bodźcami [11,13]. Na przykład, przewlekłe podawanie leków, takich jak kokaina i morfina, zwykle zwiększa ekspresję ΔFosB w jądrze półleżącym, co stanowi jeden z mechanizmów molekularnych leżących u podstaw zwiększonej wrażliwości na te leki [11,14,15]. Spodobnie do innych bodźców nagrody, w tym diety wysokotłuszczowej i doświadczeń seksualnych [16,17], long-terminowa dobrowolna jazda koła również zwiększyła immunoreaktywność FosB / ΔFosB w jądrze półleżącym szczura, co sugeruje, że dobrowolne bieganie jest naturalną nagrodą dla gryzoni [18,19]. Jednakże, zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, w żadnej literaturze nie zbadano, czy powtarzająca się ekspozycja na ćwiczenia fizyczne indukuje ekspresję ΔFosB w hipokampie. Ponieważ ćwiczenie wywołuje aktywację neuronów w hipokampie, postawiliśmy hipotezę, że długotrwałe dobrowolne bieganie kół również wywoła ekspresję ΔFosB w hipokampie. Chociaż dokładne mechanizmy, za pomocą których ΔFosB reguluje plastyczność hipokampa, pozostają niepewne, badania wykazały, że myszy pozbawione fosB gen wykazuje upośledzoną neurogenezę hipokampa i zwiększone zachowanie podobne do depresji [20,21]. jawiadomo, że wysiłek fizyczny wzmacnia neurogenezę i ma właściwości przeciwdepresyjne [22-25]. jaJeśli nasza hipoteza jest poprawna, ΔFosB byłby nowym potencjalnym celem molekularnym pośredniczącym w plastyczności hipokampa indukowanej wysiłkiem fizycznym.
Hipokamp ma anatomiczny i funkcjonalny gradient wzdłuż osi wzdłużnej (grzbietowo-brzusznej) [26]. Hipokamp grzbietowy odgrywa kluczową rolę w uczeniu się przestrzennym i pamięci [27,28], natomiast hipokamp brzuszny jest preferencyjnie zaangażowany w regulowanie zachowań emocjonalnych [29,30]. Ponadto badania wykazały, że bodźce fizjologiczne indukują różne wzory ekspresji c-Fos w grzbietowych i brzusznych częściach hipokampa [31-33]. Ponieważ ćwiczenie poprawia zarówno grzbietową [34-37] i brzuszne funkcje zależne od hipokampa [24,25,38] ważne jest, aby zbadać, czy długotrwałe dobrowolne bieganie powoduje specyficzną dla regionu ekspresję ΔFosB w hipokampie.
Podstawową hipotezą tego badania było to, że długoterminowe dobrowolne bieganie koła powodowałoby ekspresję ΔFosB w hipokampie myszy. Hipotezę tę badano za pomocą immunohistochemii FosB / ΔFosB w podpolach hipokampa grzbietowej i brzusznej, DG, CA1 i CA3, z dodatkowym naciskiem na identyfikację indukcji specyficznej dla regionu. Wyniki potwierdzono metodą Western blotting, którą zastosowano do identyfikacji izoformy fosB produkty genowe indukowane w hipokampie. Zbadaliśmy również korę pod kątem indukowanej przez region indukcji FosB / ΔFosB, aby wykluczyć możliwość, że długotrwałe wysiłki nieswoiście zwiększyły immunoreaktywność FosB / ΔFosB w mózgu. Na koniec zbadano związek korelacji między ekspresją FosB / ΔFosB a neurogenezą jako pierwszy krok w poszukiwaniu funkcjonalnych implikacji indukowanej wysiłkiem indukcji ΔFosB w regulacji plastyczności hipokampa.
Materiały i Metody
1: Oświadczenie dotyczące zwierząt i etyki
Dwadzieścia samców myszy C57BL / 6 (w wieku 8) zakupiono od komercyjnego hodowcy (SLC, Shizuoka, Japonia). Dziesięć myszy wykorzystano do Eksperymentu 1, a pozostałe dziesięć do Eksperymentu 2. Myszy trzymano w kontrolowanych warunkach temperatury (22-24 ° C) i świetle (12 / 12-h cykl światła / ciemności, światło na 0500) i dostarczano im pożywienie i wodę ad libitum. Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Doświadczalnej Zwierząt w Tokyo Metropolitan University.
W każdym eksperymencie po przybyciu myszy losowo przydzielono do grupy kontrolnej (kontrola, n = 5) lub grupy biegającej (biegacz, n = 5). W pierwszym tygodniu wszystkie myszy trzymano w standardowych klatkach z tworzywa sztucznego w grupach (myszy / klatka 5) w celu wstępnej aklimatyzacji. Następnie myszy Runner przeniesiono do klatki wyposażonej w bieżące koło (ENV-046, Med Associate Inc., Georgia, VT, USA). Ponieważ wiadomo, że izolacja społeczna tłumi indukowaną wysiłkiem neurogenezę w hipokampie [39], Myszy Runner trzymano jako grupę (myszy / klatka 5) przez dodatkowe tygodnie 4. Liczbę obrotów kół rejestrowano każdego ranka, a masę ciała (g) mierzono co tydzień.
2: Eksperymentuj 1. Badanie immunohistochemiczne ekspresji FosB / ΔFosB i neurogenezy hipokampa
2.1: Perfuzja i obróbka tkanek
Rano (0900 – 1100) po ostatnim dniu biegu myszy zostały głęboko znieczulone pentobarbitalem sodu i perfundowane przezsercowo zimnym roztworem soli. Mózg szybko usunięto i utrwalono w 4% paraformaldehydzie w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem 0.1 M (PBS, pH 7.4) przez noc. Następnie mózg poddano krioprotekcji w sacharozie 30% w PBS i zamrożono do dalszego przetwarzania. Koronalne skrawki mózgu (40 μm) półkuli otrzymano za pomocą zamrażającego mikrotomu i zebrano w PBS z 0.01% azydkiem sodu.
2.2: Immunohistochemia
Jeden na sześć serii przekrojów wybrano losowo do immunobarwienia FosB / A FosB. Przylegająca seria została użyta do znakowania doublecortin (DCX), markera niedojrzałych neuronów zwalidowanych do oceny neurogenezy [40,41]. Po wygaszeniu aktywności endogennej peroksydazy za pomocą 1% H2O2 w PBS, swobodnie pływające skrawki wstępnie inkubowano z roztworem blokującym zawierającym 10% normalnej surowicy końskiej w PBS dla 2 h. Po płukaniach w PBS skrawki inkubowano z króliczym poliklonalnym przeciwciałem pan-FosB (1: 1000, sc-48, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) rozcieńczonym w PBS z 0.5% Triton X-100 i 0.5% BSA (PBST -BSA) dla 24 h w 4 ° C. Inną serię skrawków inkubowano z kozim poliklonalnym przeciwciałem anty-DCX (1: 500, sc-8066, Santa Cruz) w PBST-BSA dla 48 h w 4 ° C. Skrawki dalej inkubowano z odpowiednim biotynylowanym drugorzędowym przeciwciałem (anty-królicze IgG, 1: 1000, AP182B; anty-kozie IgG, 1: 1000, AP180B, oba przeciwciała z EMD Millipore, Billerica, MA, USA) w PBST-BSA dla 2 hw temperaturze pokojowej. Skrawki następnie potraktowano kompleksem awidyna-biotyna-peroksydaza (zestaw Vectastain ABC peroxidase, Vector Laboratories Inc, Burlingame, CA, USA) dla 90 min zgodnie z instrukcjami producenta. Antygeny ostatecznie uwidoczniono za pomocą 0.02% 3,3-diaminobenzydyny (DAB) w 0.1 M Tris-HCl (pH 7.6) zawierającego 0.01% H2O2. W celu wybarwienia immunologicznego FosB / AFosB reakcję zintensyfikowano siarczanem amonowym niklu. W celu barwienia DCX, jądra komórkowe wybarwiono kontrastowo za pomocą barwienia Nissl. Skrawki umieszczono na szkiełkach pokrytych żelatyną i umieszczono szkiełka nakrywkowe.
2.3: Oznaczenie ilościowe immunoreaktywności FosB / ΔFosB przy użyciu progowania obrazu
Przeciwciało pan-FosB zastosowane w tym badaniu podniesiono przeciwko wewnętrznemu regionowi dzielonemu przez region N-końcowy FosB i ΔFosB, tak że nie można odróżnić dwóch izoform. Zatem immunobarwione struktury opisano jako jądra immunoreaktywne FosB / ΔFosB (FosB / ΔFosB-ir). Aby uzyskać obiektywną, ślepą kwantyfikację, preparaty kodowano przed analizą. Atlas mózgu myszy [42] użyto do identyfikacji lokalizacji następujących obszarów zainteresowania (ROI): warstwa komórek ziarnistych (GCL) DG (przekroje 3), warstwa komórek piramidalnych CA1 (skrawki 3) i CA3 (skrawki 2 – 3) w hipokampie grzbietowym (zamknięte do -2.2 mm od bregmy); DG (sekcje 2), CA1 (sekcje 2) i CA3 (sekcje 2) w brzusznym hipokampie (zamknięte do -3.4 mm od bregmy) (Rysunek 4, lewo). Części ogonowe zawierają zarówno grzbietową, jak i brzuszną część hipokampa, ale część brzuszna była ukierunkowana. W DG analizowano osobno ostrza suprapiramidalne (DGsp) i infrapiramidalne (DGip). Kora ruchowa (sekcje 2 – 3, zamknięta do -0.6 mm od bregmy), kora beczkowata somatosensoryczna (sekcje 2 – 3, zamknięta do -0.6 mm od bregmy), kora wzrokowa (sekcje 3, zamknięte do -2.9 mm od bregma), analizowano również korę słuchową (sekcje 3, zamknięte do -2.9 mm od bregmy) i opuszkę węchową (sekcje 3, zamknięte do + 4.3 mm od bregmy) (Rysunek 6, lewo).
Obrazy cyfrowe (2070 × 1548 pikseli) każdego ROI zostały wykonane przy użyciu mikroskopu optycznego (BX-51, Olympus, Tokio, Japonia) wyposażonego w kamerę CCD (DP-73, Olympus) i oprogramowanie do obrazowania (cellSens, Olympus). powiększenie obiektywu było 10 × dla ROI hipokampa i 4 × dla ROI korowych. W celu identyfikacji umiarkowanej do silnej immunoreaktywności FosB / ΔFosB (Rysunek 1D – G), korzystając z kilku sekcji z wyprzedzeniem, oba ustawienia akwizycji obrazu (intensywność światła, rozmiar zatrzymania pola, czas ekspozycji i balans bieli) oraz poziomy progowe dla każdego ze składników RGB zostały zoptymalizowane dla obszarów ROI hipokampa i korowego. Następującą analizę przeprowadzono następnie w zoptymalizowanych warunkach (1). ROI zostały wybrane przez wielokąt o nieregularnym kształcie (Rysunek 1A, B) (2). Obraz był progowany, co przekształciło jądra FosB / osFosB-ir w czerwony kolor (Rysunek 1C-G) (3). % ROI został następnie automatycznie obliczony w następujący sposób:% ROI = (przeliczony obszar (na czerwono) / całkowity obszar ROI) × 100.
Aby zweryfikować tę analizę progów obrazu, regiony 20 wybrano losowo z różnych obszarów mózgu o różnych rozmiarach regionu. Oprócz kwantyfikacji progu obrazu, zliczano liczbę jąder FosB / ΔFosB-ir w wybranych regionach i uzyskano gęstość jąder FosB / ΔFosB-ir przez podzielenie liczby jąder FosB / ΔFosB-ir przez zmierzoną obszar (mm2).
2.4: Oznaczanie ilościowe niedojrzałych neuronów DCX-ir w zakręcie zębatym
Niedojrzałe neurony DCX-ir w DG myszy Runner były obfite i nakładały się, co utrudniało precyzyjne zliczenie dyskretnej liczby somatów DCX-ir przy użyciu mikroskopu optycznego. Jednak w poprzednim badaniu, analiza Sholl do oceny morfologicznej wykazała, że każdy neuron DCX-ir ma średnio pojedynczy dendryt przy pomiarze w 40 μm somy [43]. Dlatego opracowano następującą oryginalną analizę, aby umożliwić specyficzną dla regionu kwantyfikację neuronów DCX-ir.
- (1) Obraz GCL był wyświetlany na ekranie komputera za pomocą oprogramowania do obrazowania i obiektywu 40 × (2). Na obrazie na żywo narysowano odcinek linii (150 ± 0.1 μm) wzdłuż środka GCL (Rysunek 2) (3). Zmieniając głębokość ogniskowania, zliczano ile razy segment linii przecinał dendryty DCX-ir (4). ROI (grzbietowy DGsp, dDGsp; grzbietowy DGip, dDGip; brzuszny DGsp, vDGsp; brzuszny DGip, vDGip) odpowiadały regionom, w których analizowano immunoreaktywność FosB / ΔFosB (5). W każdym ROI, odcinki linii 2 – 3 zostały narysowane na sekcję, a liczba skrzyżowań została uśredniona dla sekcji 2 – 3 na mysz. Ponieważ grubość GCL wynosi w przybliżeniu 60 – 80 μm, liczba skrzyżowań powinna odzwierciedlać liczbę neuronów DCX-ir w analizowanym regionie o ograniczonym dostępie.
Reprezentatywny obraz niedojrzałych neuronów DCX-ir i segment linii (150 ± 0.1 μm) nałożył się na liczenie liczby skrzyżowań z dendrytami DCX-ir.
3. Eksperymentuj 2. Identyfikacja izoformy FosB / ΔFosB indukowanej przez bieg koła
3.1: Perfuzja i obróbka tkanek
Dodatkową kohortę myszy traktowano jak powyżej w Eksperymencie 1. Po tygodniach 4 trwającej interwencji myszy poddano perfuzji przezsercowej zimną solą fizjologiczną pod głębokim znieczuleniem. Hipokamp szybko wycięto i zamrożono w ciekłym azocie i przechowywano w -80 ° C. Hipokampy każdej myszy homogenizowano w buforze RIPA (150 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 7.6, 1% NP-40, 1% deoksycholan sodu, 0.1% SDS, #8990, Thermo Scientific, IL, USA) zawierające proteazę inhibitory (cOmplete Mini, Roche, Manheim, Niemcy). Lizaty odwirowano dla 15 min przy 5000 rpm w 4 ° C i zebrano supernatanty. Stężenia białka mierzono za pomocą zestawu BCA Protein Assay (#23227, Thermo Scientific, IL, USA).
3.2: Western blotting
Równe ilości białka (30 μg / ścieżkę) poddano elektroforezie na żelu poliakrylamidowym 10%, a następnie przeniesiono na membranę PVDF (Immun-Blot, 0.2 μm, Bio-Rad, MD, USA). Wiązanie niespecyficzne blokowano przez wstępną inkubację błony dla 1 hw TBST (0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.1% Tween-20) zawierający 3% BSA. Membranę inkubowano z przeciwciałem pan-FosB (1: 1000) stosowanym powyżej do immunohistochemii, rozpuszczonym w TBST zawierającym 3% BSA. Po przemyciach TBST błonę inkubowano ze sprzężonym z HRP przeciwciałem przeciw króliczym IgG (1: 5000 w TBST, NA934, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) dla 1 h w temperaturze pokojowej. Po przemyciach TBST, prążki białkowe wizualizowano przez inkubację z Enhanced Chemiluminescence (Western Lightning Plus-ECL, PerkinElmer, MA, USA) i przechwytywano przy użyciu Image Quant LAS 4000 mini (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK). Membranę następnie ponownie przepłukano przeciwciałem przeciwko dehydrogenazie fosforanowej aldehydu glicerynowego-3 (GAPDH) (# 2275, 1: 5000 w TBS-T, Trevigen, MD, USA) jako kontrolę ładowania. Gęstość optyczną pasm białka oznaczono ilościowo za pomocą Image-J i znormalizowano do poziomu GAPDH.
4: Analiza statystyczna
Zmiany masy ciała myszy analizowano dwukierunkową ANOVA z powtarzanymi pomiarami (grupa x czas). Zastosowano niesparowany test t w celu określenia różnic statystycznych między grupami (kontrola vs. biegacz). Analizę korelacji Pearsona zastosowano do walidacji analizy immunoreaktywności FosB / ΔFosB (liczenie ręczne vs. progowanie obrazu) oraz do zbadania związku między poziomem ekspresji FosB / ΔFosB a liczbą skrzyżowań DCX w DG. Dane przedstawiono jako średnią ± SEM. Próg istotności statystycznej ustalono na P <0.05.
Efekt
1: Masa ciała i odległość biegu w Eksperymentach 1 i 2
Zmiany masy ciała myszy kontrolnych i biegaczy w eksperymentach 1 i 2 są łączone i wyświetlane w Rysunek 3. Dwukierunkowa ANOVA z powtarzanymi pomiarami wykazała znaczącą interakcję (grupa x czas, F(4, 72) = 13.6, P <0.001) i efekt główny grupy F(1, 18) = 6.07, P <0.05), co wskazuje na znacznie niższą masę ciała u myszy Runner. Odległość biegu na klatkę jest pokazana w Tabela 1. Chociaż dokładna odległość biegania każdej myszy była niepewna, ponieważ myszy były trzymane razem, regularna obserwacja potwierdziła, że wszystkie myszy często wykonywały bieganie kół. Myszy Runner w Eksperymencie 2 działały dłużej niż te w Eksperymencie 1, ale średnia odległość biegania (m / dzień / klatka) była stała w każdym eksperymencie.
2: Walidacja kwantyfikacji immunoreaktywności FosB / ΔFosB przy użyciu progowania obrazu
Istniała znacząca korelacja między obszarem FosB / ΔFosB-ir uzyskanym przez progowanie obrazu i gęstość jąder FosB / ΔFosB-ir uzyskanych przez ręczne liczenie (r = 0.941, P <00001, Rysunek 4).
3: immunoreaktywność FosB / ΔFosB w hipokampie
Reprezentatywne obrazy immunobarwienia FosB / ΔFosB w podpolach hipokampa grzbietowej i brzusznej przedstawiono w Rysunek 5. We wszystkich analizowanych ROI immunoreaktywność FosB / ΔFosB u myszy Runner (Rysunek 5, po prawej) był jakościowo wyższy niż u myszy kontrolnych (Rysunek 5, środek). U myszy Runner analiza ilościowa wykazała znaczący wzrost powierzchni FosB / ΔFosB-ir zarówno w grzbietowej (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.01; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05) i brzuszne podpola hipokampu (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.05; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05; Rysunek 6).
4: immunoreaktywność FosB / ΔFosB w korze
Reprezentatywne obrazy immunobarwienia FosB / ΔFosB w ROI korowych przedstawiono w Rysunek 7. Analiza ilościowa wykazała zależne od regionu zmiany w immunoreaktywności FosB / ΔFosB przy długotrwałym działaniu (Rysunek 8). U myszy Runner obszar FosB / ΔFosB-ir był znacznie wyższy w korze ruchowej (P <0.05) i somatosensoryczną korą beczkowatą (P <0.05), ale nie w korze wzrokowej (P = 0.662) lub opuszka węchowa (P = 0.523). W korze słuchowej obszar FosB / ΔFosB-ir dążył do wzrostu liczby myszy Runner (P =
5: Neurogeneza
Reprezentatywne obrazy barwienia immunologicznego DCX przedstawiono w Rysunek 9. W hipokampie grzbietowym immunoreaktywność DCX u myszy Runner (Rysunek 9, po prawej) było jakościowo wyższe w porównaniu z myszami kontrolnymi (Rysunek 9, lewo). W porównaniu z hipokampem grzbietowym, immunoreaktywność DCX w hipokampie brzusznym była słabsza zarówno u myszy kontrolnych, jak iu biegaczy. U myszy Runner liczba przekroczeń była znacznie wyższa w dDGsp (P <0.01) i dDGip (P <0.01; Rysunek 10). W hipokampie brzusznym liczba skrzyżowań u myszy Runner miała tendencję do wzrostu, ale nie było istotnych różnic między grupami (vDGsp, P = 0.101; vDGip, P = 0.257; Rysunek 10).
6: Korelacja między ekspresją FosB / ΔFosB a neurogenezą
Przeprowadzono analizę korelacji między obszarem FosB / ΔFosB-ir a liczbą skrzyżowań DCX (Rysunek 11). Ponieważ każdy zestaw danych (np. DGsp grzbietowy u myszy kontrolnych) składa się tylko z par 5, analizę przeprowadzono najpierw ze wszystkimi parami 40. Co ciekawe, istniała znacząca korelacja między obszarem FosB / ΔFosB-ir a liczbą przejść DCX (r = 0.885, P <0.0001). Ponadto istotne korelacje zidentyfikowano również, gdy grzbietowa DG (r = 0.762, P <0.05) i brzusznej DG (r = 0.816, P <0.01) analizowano oddzielnie.
7: Identyfikacja izoformy FosB / ΔFosB indukowanej przez długotrwałe działanie
Wreszcie, aby zidentyfikować izoformę fosB produkty genowe indukowane w hipokampie w odpowiedzi na długotrwałe bieganie, hipokamp z dodatkowej kohorty myszy poddano Western blot z użyciem tego samego przeciwciała pan-FosB. Wiele pasm 35 – 37 kDa, reprezentujących zmodyfikowane izoformy ΔFosB [44], były znacząco zwiększone u myszy Runner kontra Control (Rysunek 12, P <0.01). Z drugiej strony, izoforma 48 kDa FosB była niewykrywalna w żadnej z grup. Inny słabo widoczny prążek powyżej 25 kDa prawdopodobnie reprezentuje izoformę Δ2ΔFosB (27 kDa). Były dwa inne prążki, powyżej 50 kDa i 37 kDa, które były najprawdopodobniej spowodowane niespecyficznym wiązaniem. Po określeniu ilościowym nie znaleziono różnic w tych pasmach innych niż ΔFosB między grupami (dane niepokazane).
Dyskusja
Podsumowując, niniejsze badanie po raz pierwszy przeprowadziło analizę immunohistochemiczną w celu zbadania 1), czy długoterminowe dobrowolne prowadzenie koła indukuje ekspresję FosB / ΔFosB w hipokampie; oraz 2), czy odpowiedź specyficzna dla regionu istnieje wzdłuż jego osi grzbietowo-brzusznej.
Cztery tygodnie dobrowolnego prowadzenia koła indukowały znaczący wzrost immunoreaktywności FosB / ΔFosB we wszystkich analizowanych regionach hipokampa (tj. Subpole DG, CA1 i CA3 zarówno grzbietowych, jak i brzusznych części hipokampa). Potwierdziliśmy, że główną formą jest izoforma 35 – 37kDa ΔFosB fosB produkt genowy gromadzący się w odpowiedzi na długotrwałe działanie. Wyniki te wyraźnie potwierdzają hipotezę, że długotrwałe regularne ćwiczenia są silnym wyzwalaczem indukcji ΔFosB w hipokampie, i że jej indukcja może być nowym mechanizmem molekularnym, dzięki któremu ćwiczenia wpływają na różne typy funkcji zależnych od hipokampa grzbietowego i / lub brzusznego.
1: Walidacja i ograniczenia ilościowego oznaczania immunoreaktywności FosB / ΔFosB przy użyciu progowania obrazu
W tym badaniu przyjęto technikę progowania obrazu, szeroko stosowaną w badaniach immunohistochemicznych do zliczania liczby komórek docelowych i do oceny morfologii komórek, w celu specyficznej dla regionu kwantyfikacji immunoreaktywności FosB / ΔFosB [15,45,46]. Wykazano istotną korelację między poziomami immunoreaktywności FosB / ΔFosB oznaczoną progiem obrazu i zliczaniem ręcznym (Rysunek 4). Jednakże, ponieważ gęstość i nakładanie się uniemożliwiło zliczenie liczby jąder FosB / ΔFosB-ir w obszarach o dużej gęstości, wykazana korelacja oznacza tylko dokładność metody progowania obrazu, gdy obszary FosB / ΔFosB-ir stanowią <~ 40% całkowitego zwrotu z inwestycji powierzchnia. Dlatego wymagana jest staranna interpretacja dla obszarów FosB / ΔFosB-ir> 40% całkowitego obszaru ROI.
W szczególności w DG myszy Runner (Rysunek 4), Ekspresja FosB / ΔFosB była silnie indukowana przez bieg koła i większość jąder FosB / ΔFosB-ir zachodziła na siebie. W tych obszarach zwiększona indukcja ekspresji FosB / ΔFosB prowadzi do większego niedoszacowania poziomu ekspresji, niezależnie od zastosowanej metody kwantyfikacji (progowanie obrazu lub ręczne zliczanie). Jednakże, pomimo ryzyka niedoszacowania, ważne jest, aby zauważyć, że niniejsze badanie z powodzeniem wykazało znaczny wzrost powierzchni FosB / ΔFosB-ir w DG myszy Runner. Sugeruje to, że ograniczenia metodologiczne nie zagrażają naszym odkryciom. Zamiast tego potencjalne niedoszacowanie zwiększa wiarygodność stwierdzenia, że długotrwały bieg zwiększa immunoreaktywność FosB / ΔFosB w hipokampie.
2: Jednolita indukcja ΔFosB w hipokampie przez długotrwałą pracę
Hipokamp ma anatomiczne i funkcjonalne gradienty wzdłuż swojej osi wzdłużnej [26], więc w niniejszym badaniu immunoreaktywność FosB / ΔFosB w części grzbietowej i brzusznej hipokampa analizowano oddzielnie. Dane wykazały, że długotrwale działająca, równomiernie zwiększona ekspresja FosB / ΔFosB we wszystkich zmierzonych ROI hipokampów. Ta jednorodna indukcja immunoreaktywności FosB / ΔFosB może być niespecyficznie spowodowana ogólnoustrojowymi zmianami metabolicznymi związanymi z długotrwałym biegiem. Jednak ważne jest, aby zauważyć, że występowały specyficzne dla regionu wzrosty immunoreaktywności FosB / ΔFosB w korze. Wynik ten znajduje potwierdzenie w najnowszych odkryciach wskazujących, że ostry atak biegu na bieżni zwiększał regionalny przepływ krwi mózgowej w hipokampie, ale nie w opuszce węchowej [8]. Ponadto Rhodes i in. (2003) zademonstrował, że dni 7 dobrowolnego biegania koła indukowały ekspresję c-Fos w DG i CA2 / 3 hipokampa (CA1 nie był mierzony) oraz w korze czuciowej, ale nie w korze wzrokowej [47]. Podsumowując, badania te sugerują, że jednolita indukcja ekspresji FosB / ΔFosB w hipokampie nie jest niespecyficzną konsekwencją długotrwałego działania. Co ciekawe, Hawley i in. ostatnio doniósł, że przewlekły nieprzewidywalny stres zwiększa ekspresję FosB / ΔFosB w grzbietowej, ale nie w brzusznej, DG hipokampa szczura [48]. Przy dalszych badaniach, różne wzory indukcji FosB / ΔFosB, takie jak te wywoływane przez ćwiczenia lub stres, zapewnią ciągły wgląd w zależne od bodźca oddziaływania na hipokamp.
Wiadomo, że pierwotne przeciwciało pan-FosB stosowane w tym badaniu rozpoznaje wszystkie izoformy białek FosB. Po analizie Western blotting stwierdziliśmy, że jedynymi izoformami, które wzrosły w hipokampie po długotrwałym działaniu, były zmodyfikowane izoformy ΔFosB (35 – 37 kDa), jedyne stabilne izoformy wśród białek z rodziny Fos [11]. Odkrycie to jest zgodne z poprzednimi pracami wykorzystującymi przeciwciało pan-Fos w celu wykazania, że 35 – 37 kDa ΔFosB jest dominującym białkiem z rodziny Fos indukowanym w korze czołowej przez chroniczny stres [44]. Stąd wzrost indukowanej tu immunoreaktywności FosB / ΔFosB hipokampa przez długotrwałe działanie najprawdopodobniej odzwierciedla poziom ΔFosB.
Mniej wiadomo o specyficznych dla regionu efektach ćwiczeń na aspekty molekularne i strukturalne hipokampa. Liczne badania behawioralne wskazują jednak na ogromny potencjał poprawy aktywności wywołanej wysiłkiem zarówno w grzbietowej, jak i brzusznej funkcji hipokampa. Wykazano, że ćwiczenia poprawiają uczenie się i pamięć przestrzenną [34-38] a przetwarzanie przestrzenne i kontekstowe zależy głównie od hipokampa grzbietowego [27,28]. Wiadomo też, że ćwiczenia fizyczne wywierają właściwości przeciwlękowe i przeciwdepresyjne [24,25,38] i te reakcje emocjonalne są głównie regulowane przez brzuszny hipokamp [29,30]. Jednolita indukcja ΔFosB przez długotrwałe działanie obserwowana w tym badaniu sugeruje, że niektóre formy zmian neuroplastycznych wystąpiły w całym hipokampie. Wyjaśniłoby to, dlaczego ćwiczenia mogą wpływać na funkcje zależne od hipokampa grzbietowego i brzusznego.
3: specyficzna dla regionu analiza neurogenezy wywołanej wysiłkiem fizycznym
Coraz większą uwagę zwraca się również na funkcjonalną dysocjację neurogenezy między hipokampem grzbietowym i brzusznym [49]. W tym badaniu, wykorzystując cechy morfologiczne niedojrzałych neuronów DCX-ir [43], policzyliśmy liczbę przecięć między dendrytami DCX-ir a segmentem linii narysowanym wzdłuż środka GCL. Ten pomiar nie zapewniał całkowitej liczby neuronów DCX-ir w DG, ale umożliwiał kwantyfikację specyficzną dla regionu, niezbędną do przeprowadzenia analizy korelacji z danymi ekspresji FosB / ΔFosB (patrz poniżej). Po długotrwałej pracy liczba neuronów DCX-ir znacznie wzrosła w grzbietowej, ale nie brzusznej DG. Sugeruje to, że ćwiczenie może stymulować neurogenezę bardziej uderzająco w grzbietowej w porównaniu z brzuszną częścią DG. Wcześniejsze badania donoszą jednak o sprzecznych wynikach, w których koło napędzające neurogenezę zarówno w grzbietowej, jak i brzusznej DG [50,51]. W niniejszym badaniu liczba przejść DCX-ir w brzusznej DG miała tendencję do zwiększania się wraz z bieganiem, chociaż mała wielkość próby (myszy 5 na grupę) mogła mieć ograniczoną zdolność do wykrywania statystycznie istotnej różnicy między grupami. Dlatego prawdopodobnie przedwczesne jest wykluczenie możliwości, że dobrowolne bieganie kół może stymulować brzuszną neurogenezę hipokampa. Konieczne są dalsze szczegółowe badania, aby zrozumieć specyficzną dla regionu neurogenezę wywołaną wysiłkiem fizycznym dotyczącą jej wieloetapowego procesu (proliferacja komórek, różnicowanie, migracja i przeżycie).
4: Implikacje funkcjonalne indukowanej wysiłkiem indukcji ΔFosB do regulacji plastyczności hipokampa
Wreszcie, jako pierwszy krok w rozpoznaniu funkcjonalnych implikacji indukowanej wysiłkiem indukcji ΔFosB w hipokampie, zbadaliśmy zależność immunoreaktywności FosB / ΔFosB od skrzyżowań DCX-ir zarówno w DG grzbietowej, jak i brzusznej i stwierdziliśmy istotną, dodatnią korelację między dwie zmienne. Chociaż dokładne mechanizmy, za pomocą których ΔFosB reguluje neurogenezę wywołaną wysiłkiem fizycznym, pozostają niepewne, jak wykazały ostatnie badania fosB-null myszy, którym brak FosB, ΔFosB i Δ2ΔFosB (wszystkie fosB produkty), wykazywały deficyty podstawowej neurogenezy hipokampa, w tym zmniejszoną proliferację neuronalnych komórek progenitorowych, zwiększoną ektopową migrację noworodków neuronów i nieprawidłowe struktury DG [20]. Jednak tych zmian nie zaobserwowano w fosB(d / d) myszy, które nie mają FosB, ale nie ΔFosB / Δ2ΔFosB. Co ciekawe, w fosB-null myszy, ekspresja niektórych genów związanych z neurogenezą, w tym Vgf (Indukowalny czynnik wzrostu nerwów VGF) i Gal (Prepropeptyd galaniny) zmniejszono [20]. Ponieważ VGF i GAL są cząsteczkami wydzielniczymi, jedna z obiecujących propozycji zakłada, że neurony wyrażające ΔFosB mogą regulować neurogenezę poprzez aktywność autokrynną / parakrynną [20].
Dodatkowo, należy zauważyć, że obszar, w którym ΔFosB jest indukowany przez bieganie, pokrywa się przestrzennie z regionem, w którym aktywność neurogenna jest wysoka. Odkrycie to sugeruje, że neurogeneza indukowana wysiłkiem fizycznym jest minimalna zależna od aktywności. Aktywacja neuronów ma kluczowe znaczenie dla utrzymania i poprawy funkcjonowania ośrodkowego układu nerwowego [9], poprzez mechanizmy obejmujące ekspresję i uwalnianie neurotroficznego czynnika pochodzenia mózgowego (BDNF) [52,53], wychwyt surowicy insulinopodobnego czynnika wzrostu 1 (IGF-1) przez barierę krew-mózg [54,55], tłumienie apoptozy [56] i regulacja ruchliwości mitochondriów [57]. W związku z tym niniejsze badanie sugeruje, że długotrwałe ćwiczenia wywoływały powtarzającą się aktywację neuronów, widoczną w zwiększonej ekspresji ΔFosB, która przyczynia się do zwiększenia plastyczności hipokampa, potencjalnie przez te liczne mechanizmy opisane powyżej.
Niniejsze badanie oceniało jedynie neurogenezę wywołaną wysiłkiem fizycznym i jej związek z ekspresją FosB / ΔFosB w DG. Jednakże immunoreaktywność FosB / ΔFosB indukowano również w subpólach CA1 i CA3. Podczas gdy potrzebne są dalsze badania, aby lepiej zrozumieć funkcjonalne role ekspresji ΔFosB wywołanej wysiłkiem fizycznym w tych subpólkach, poprzednia literatura oferuje obiecującą możliwość. Guan i in. (2011) wykazali, że specyficzna ablacja kinazy zależnej od cykliny 5 (Cdk5) w neuronach piramidalnych CA1 lub CA3 osłabiała odpowiednio konsolidację lub pobieranie pamięci [58]. Co ciekawe, Cdk5 jest docelowym celem ΔFosB [59] i bierze udział w regulacji plastyczności synaptycznej [60]. Dlatego też ekspresja ΔFosB indukowana wysiłkiem fizycznym może być zaangażowana w regulację plastyczności synaptycznej poprzez aktywację Cdk5 w podpolach CA1 i CA3.
Wnioski
Podczas gdy wiadomo, że ostre ataki wysiłku indukują ekspresję wczesnych wczesnych białek genu w hipokampie, niniejsze badanie stanowi pierwszy dowód na to, że długotrwałe regularne ćwiczenia znacząco indukują ekspresję ΔFosB w całym hipokampie. Thjest jednorodną indukcją ΔFosB, co potwierdza obecne zrozumienie, że ćwiczenie jest skuteczną interwencją niefarmakologiczną, zdolną do poprawy wielu funkcji hipokampa. Wraz ze znaczącą korelacją między ekspresją FosB / ΔFosB a neurogenezą, dane te są prowokujące i wskazują na potrzebę dalszych badań określających rolę ΔFosB w pośredniczeniu w efektach ćwiczeń na funkcję hipokampa, w tym neurogenezę.
Oświadczenie o finansowaniu
Referencje
;