Źródło
Instytut Nathan Kline, Orangeburg, Nowy Jork, 10962, USA. [email chroniony]
Abstrakcyjny
Dzieci i młodzież są w coraz większym stopniu narażone na działanie środków psychostymulujących, w sposób bezprawny lub w leczeniu typowych schorzeń neuropsychiatrycznych, takich jak zespół deficytu uwagi z nadreaktywnością i bez niej. Pomimo powszechnego stosowania stymulatorów psychomotorycznych w młodszych grupach wiekowych, niewiele wiadomo na temat przewlekłych molekularnych odpowiedzi neuroadaptacyjnych na te czynniki w niedojrzałym mózgu. Tutaj pokazujemy, że po przewlekłym podawaniu środków psychostymulujących kokaina i amfetamina, czynnik transkrypcyjny DeltaFosB jest podwyższona w jądrze półleżącym periadolescent Myszy ale nie po odstawieniu od piersi ani bez opieki dorosłych Myszy. Indukcja DeltaFosB występuje również wyłącznie w skorupie ogoniastej periadolescent Myszy po amfetamina podawanie. Wyniki te pokazują wyjątkową plastyczność w mózgu nastolatka cząsteczki krytycznej, która reguluje działanie psychostymulujące i sugerują, że te zmiany neuroadaptacyjne mogą być zaangażowane w mediację wzmocnione uzależniające u nastolatków w stosunku do dorosłych.
Wprowadzenie
Środki psychostymulujące są stosowane w leczeniu powszechnych zaburzeń wieku dziecięcego, takich jak zespół nadpobudliwości psychoruchowej. Ponadto nadużywanie środków pobudzających, w tym amfetaminy i kokainy, jest powszechne wśród nastolatków, w wieku, w którym istnieją dowody na wzmożone skłonności uzależniające w stosunku do dorosłych (Estroff i wsp., 1989; Myers and Anderson, 1991). Pomimo danych wskazujących na regulowane rozwojowo efekty behawioralne, niewiele wiadomo na temat molekularnych odpowiedzi neuroadaptacyjnych w niedojrzałym mózgu, które występują w czasie podawania tych środków. Kokaina i amfetamina mogą powodować długotrwałe zmiany behawioralne częściowo poprzez stymulację dopaminy D1receptory i wzrost poziomu czynników transkrypcyjnych, w tym ΔFosB, w prążkowiu grzbietowym (tj. skorupa jądrowa ogoniasta) i prążkowiu brzusznym (tj. jądro półleżące) (Chen i wsp., 1997). Zwiększenie poziomów ΔFosB, być może poprzez stabilizację produktów białkowych, utrzymuje się przez kilka tygodni po długotrwałej ekspozycji na kokainę lub amfetaminę i jest regulowane co najmniej w części szlakiem przekazywania sygnału dopaminy (Chen i wsp., 1997; Nestler i wsp., 2001).
Centralny układ dopaminergiczny młodych zwierząt ulega znacznym zmianom w wyniku zmieniających się poziomów cząsteczek krytycznych podczas normalnego rozwoju, w tym dopaminy D1receptor DARPP-32 (fosfoproteina regulowana dopaminą i cAMP;r 32 kDa) i cAMP (Ehrlich i wsp., 1990;Teicher i wsp., 1993; Perrone-Capano i wsp., 1996; Tarazi i wsp., 1999;Andersen, 2002). Ekspozycja w tym okresie na psychostymulanty, które nasilają przekaźnictwo nerwowe dopaminergiczne, może zatem powodować ilościowe i / lub jakościowe różne odpowiedzi molekularne, w tym zmiany w ekspresji ΔFosB. Aby przetestować hipotezę, że istnieją zależne od wieku reakcje neuroadaptacyjne podczas długotrwałej ekspozycji na psychostymulanty, trzy grupy myszy analizowano w seryjnych eksperymentach: dorośli (60 d stary przy rozpoczęciu zastrzyków), periadolescent (33 d stary przy rozpoczęciu zastrzyków), i po odsadzeniu (24 d stary na początku iniekcji). Jest to pierwsze bezpośrednie porównanie molekularnych odpowiedzi neuroadaptacyjnych z przewlekłą ekspozycją na psychostymulant w tych trzech grupach wiekowych. Stwierdziliśmy, że po identycznych paradygmatach leczenia, myszy z perystolami wykazują zwiększoną regulację ΔFosB w odpowiedzi na kokainę i amfetaminę.
MATERIAŁY I METODY
Zwierzęta i podawanie leków. Samce myszy CD-1 (Charles River Laboratories, Kingston, NY) przechowywano w cyklu 12 hr światło / ciemność (6: 00 AM do 6: 00 PM) z ad libitumdostęp do żywności i wody. Zwierzęta pozostawiono do pomieszczenia dla zwierząt na minimum 10 d przed rozpoczęciem iniekcji. Zwierzęta były obsługiwane przez dwóch badaczy, którzy wykonywali wszystkie iniekcje w tym samym pomieszczeniu, w którym przebywały zwierzęta. Wszystkie zwierzęta odstawiono od piersi w wieku 21. Wstrzyknięcia rozpoczęto w 24 (po odstawieniu), 33 (periadolescent) lub 60 (dorosły) d wieku. Zwierzęta otrzymywały 20 mg / kg kokainy (Sigma, St. Louis, MO), 5 mg / kg amfetaminy (Sigma) lub taką samą objętość roztworu soli dootrzewnowej pomiędzy 4: 00 i 5: 00 PM dziennie dla 7 d. Zwierzęta zabijano przez dekapitację po krótkim wystawieniu na działanie CO2 w 10: 00 AM następnego dnia po ostatnim wstrzyknięciu. Mózgi natychmiast usunięto z czaszki, a jądra ogoniaste i jądro półleżowe szybko rozcięto na lodzie. Wszystkie cięcia wykonano z płatów czołowych mózgu przez jednego badacza, a ekstrakty białkowe przygotowano ze świeżej tkanki bez zamrażania. Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Pielęgnacji i Użytkowania Zwierząt i były zgodne z Narodowymi Instytutami Zdrowia Poradnik dotyczący opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.
Analiza Western blot. W analizach Western blot, równe ilości białka (40 μg dla skorupy ogonowej i 20 μg dla jądra półleżącego) z każdej próbki załadowano do każdej ścieżki z żelem 10% SDS-poliakryloamidowym po zmierzeniu stężenia białka za pomocą testu BCA (Pierce, Rockford, IL). Równe obciążenie białkiem weryfikowano również przez wizualizację całkowitego białka przez Ponceau Red po przeniesieniu do nitrocelulozy i / lub blottingu z przeciwciałem anty-aktynowym (1: 500, Sigma). Surowica antygenowa FRA (FRA), która rozpoznaje izoformę ΔFosB, została hojnie dostarczona przez dr M. Iadarola (National Institutes of Health, Bethesda, MD) i użyta w stężeniu 1: 4000. Poprzednie badania (Chen i wsp., 1997; Hiroi i wsp., 1997), w tym preadsorpcja surowicy odpornościowej FRA z immunogenem peptydu M, wykazała specyficzność tej surowicy odpornościowej. Przeciwciało monoklonalne DARPP-32 5a, użyte w 1: 10,000, zostało hojnie dostarczone przez Drs. Hugh Hemmings i Paul Greengard (The Rockefeller University, Nowy Jork, NY). Przeciwciało transportera dopaminy (DAT) pochodziło z Chemicon (Temecula, Kalifornia). Bloty poddano reakcji z układem chemiluminescencyjnym NEN-DuPont (Boston, MA) i wystawiono na działanie filmu. Wartości densytometryczne dla immunoreaktywności ΔFosB uzyskano za pomocą ScanAnalysis for Apple (Biosoft, Ferguson, MO). Istotność statystyczną określono przy użyciu jednoczynnikowej ANOVA, a następnie post hoc Test wielokrotnego porównania Tukeya lub niesparowany, dwustronny test ucznia t test jak wskazano w legendach figur. W przypadku eksperymentów z leczeniem farmakologicznym, analizę każdej grupy wiekowej przeprowadzono na oddzielnej blotce, a zatem każda grupa soli została arbitralnie przypisana wartości 100% dla porównania pomiędzy grupami wiekowymi. W przypadku badań ontogenicznych próbki ze wszystkich grup wiekowych analizowano razem na pojedynczej blotce.
WYNIKI
Indukcja ΔFosB po kokainie i amfetaminie występuje w jądrze półleżącym jedynie myszy periadolowych
Ekspresję ΔFosB mierzono w jądrze półleżącym i okrężnicy ogoniastej myszy po okresie odsadzenia, perystoleśności i dorosłych po podaniu 7 d amfetaminy lub kokainy. Jądro półleżowe to obszar mózgu uważany za najbardziej krytyczny dla pośredniczenia w nagradzających efektach psychostymulantów. Immunoreaktywność? FosB (35 kDa) została selektywnie indukowana w jądrze półleżącym zwierząt periadospermalnych po przewlekłym podawaniu amfetaminy (Fig. 1 A) lub kokainę (ryc. 1 B). W przeciwieństwie do tego poziomy ΔFosB (35 kDa) nie uległy istotnym zmianom w jądrze półleżącym u zwierząt po-odsadzonych lub dorosłych (ryc.1 A,B). W skorupie ogonowej poziomy ΔFosB (35 kDa) były również znacząco podwyższone po przewlekłym podawaniu amfetaminy tylko u zwierząt z periadospresją (ryc.2 A). Wszystkie trzy grupy wiekowe wykazały znaczny wzrost ekspresji ΔFosB (35 kDa) w skorupie ogonowej po przewlekłym podawaniu kokainy (ryc.2 B). Wielkość indukcji była jednak największa u zwierząt dojrzewających w okresie okołopęcherzykowym, szczególnie w porównaniu z po-odsadzonymi (ryc. 2 B). Inne izoformy FRA i Fos były niezmienione we wszystkich grupach wiekowych (dane nie pokazane).
? Immunoreaktywność FosB w jądrze półleżącym po przewlekłym podaniu środka psychostymulującego. Myszom CD-1 wstrzykiwano raz dziennie roztwór soli, amfetaminy lub kokainy do 7 d zaczynając od dnia 24 (P24; po odsadzeniu), dzień 33 (P33; periadolescent) lub dzień 60 (Dorosły). Poziomy immunoreaktywności ΔFosB (35 kDa) w jądrze półleżącym przedstawiono po przewlekłej amfetaminie (A) lub kokainę (B) administracja. Reprezentatywne immunobloty z soli fizjologicznej- (S), amfetaminy- (A) i kokaina (C) wstrzyknięto po odsadzeniu (P24), periadolescent (P33), a dorosłe myszy są pokazane na górne panele. Dolne panele pokazują średnią ± SEM procent podstawowego ekspresji ΔFosB. n wartości dla każdej grupy są pokazane w paski. Znaczące wzrosty ΔFosB stwierdzono w jądrze półleżącym tylko myszy periadolowych. *p <0.05; **p <0.01 (studenta t test; roztwór soli w porównaniu z lekiem).
ΔForebość immunologiczna w skorupie ogoniastej po przewlekłym podaniu środka psychostymulującego. Myszom CD-1 wstrzykiwano raz dziennie roztwór soli, amfetaminy lub kokainy do 7 d zaczynając od dnia 24 (P24; po odsadzeniu), dzień 33 (P33; periadolescent) lub dzień 60 (Dorosły). Poziomy immunoreaktywności ΔFosB (35 kDa) w skorupie ogoniastej przedstawiono po przewlekłej amfetaminie (A) lub kokainę (B) administracja. Reprezentatywne immunobloty z soli fizjologicznej- (S), amfetaminy- (A) i kokaina (C) wstrzykniętych myszy periadolowych (P33) są pokazane wgórne panele. Dolne panele pokazują średnią ± SEM procent podstawowego ekspresji ΔFosB. n wartości dla każdej grupy są pokazane w paski. Znaczące indukowane amfetaminą podwyższenie immunoreaktywności ΔFosB stwierdzono w skorupce ogoniastej tylko myszy periadolowych (A). Przewlekłe podawanie kokainy powodowało wzrost ΔFosB we wszystkich trzech grupach wiekowych (B). *p <0.05; **p <0.01 (studenta t test; roztwór soli w porównaniu z lekiem).
Poziomy DAT i DARPP-32 nie zmieniają się po przewlekłej kokainie lub amfetaminie
Kilka kluczowych cząsteczek ulegających ekspresji w neuronach dopaminergicznych i / lub dopaminergeptycznych, w tym DARPP-32, D1 receptor dopaminowy i DAT przyczyniają się do ostrych i przewlekłych reakcji na psychostymulanty (Moratalla i wsp., 1996; Fienberg i wsp., 1998; Sora i wsp., 1998; Gainetdinov i wsp., 2001). Dane z DARPP-32, D1 receptora, a myszy DAT null i knock-down DAT wskazują na skomplikowaną zależność między ich poziomami, regulacją aktywności dopaminergicznej i reakcjami na psychostymulanty. W rzeczywistości indukcja ΔFosB nie występuje u myszy zerowych DARPP-32, które otrzymują przewlekłą kokainę (Fienberg i wsp., 1998). Jednak u dorosłych myszy ekspozycja 7 d na 20 mg / kg kokainy nie zmienia całkowitych poziomów DARPP-32 (Fienberg i wsp., 1998). Regulacja białka DAT nie była wcześniej opisywana u myszy narażonych przewlekle na psychostymulanty, chociaż u niektórych gatunków obserwowano zmiany w wiązaniu radioliganda z transporterem dopaminy po ekspozycji na psychostymulanty (Letchworth i wsp., 2001). Mierzyliśmy poziomy białka DARPP-32 i DAT, aby określić, czy ekspresja tych białek zmienia się po przewlekłym podawaniu środka psychostymulującego w którymkolwiek z trzech grup wiekowych myszy. Nasze wyniki wskazują, że nie było istotnych zmian w poziomie całkowitego DARPP-32 lub DAT w całym skorupie jądra ogoniastego lub jądrze półleżącym po przewlekłym podawaniu kokainy lub amfetaminy w żadnej z trzech grup wiekowych (tabela 1).
Wartości względnej densytometrii dla DARPP-32 i DAT u myszy P24, P33 leczonych amfetaminą i kokainą oraz dla dorosłych myszy w stosunku do wartości kontrolnych, soli fizjologicznej, arbitralnie ustawionych na 100%
Wyjściowe poziomy ΔFosB są regulowane rozwojowo
Przebadaliśmy ontogenezę ΔFosB, ponieważ dorosłe myszy z genetycznie zmodyfikowaną ekspresją ΔFosB w prążkowiu mają podwyższoną odpowiedź behawioralną na psychostymulanty (Kelz i wsp., 1999). Stwierdziliśmy, że wyjściowe poziomy ΔFosB były istotnie niższe u młodszych zwierząt w porównaniu z dorosłymi zarówno w skorupie ogonowej, jak i jądrze półleżącym (ryc.3 A). Poziomy funkcjonalnych markerów układu dopaminowego, w tym DARPP-32 (Ehrlich i wsp., 1990), DAT (Perrone-Capano i wsp., 1996) i receptory dopaminy (Teicher i wsp., 1993; Tarazi i wsp., 1999) również podlegają regulacjom rozwojowym. Poprzednie raporty na myszach CD-1 wskazują szczyt w prążkowia DARPP-32 w dniu 28 po urodzeniu (P28) (Ehrlich i wsp., 1990). W szczupakowej skorupie ogonowej i jądrze półleżącym, D1szczytowe poziomy receptorów od P28 do P40 (Teicher i wsp., 1993; Tarazi i wsp., 1999), ale podobnych badań nie przeprowadzono u myszy. W przeciwieństwie do tego, stwierdziliśmy, że poziomy białka DAT w skorupce ogonowej i jądrze półleżącym były stałe pomiędzy dniem 24 a dorosłością (ryc. 3 B). Zatem względne stosunki między D1 receptory, DAT, DARPP-32 i ΔFosB różnią się między grupami wiekowymi, potencjalnie powodując różnice w D1 aktywność receptora, która może wpływać na stopień indukcji ΔFosB.
Ekspresja rozwojowa ΔFosB i DAT. AImmunoreaktywność ΔFosB (35-37 kDa) w skorupie jądra ogoniastego i jądrze półleżącym naiwnych myszy CD-1 w funkcji wieku. Reprezentatywne immunobloty są pokazane w górne panele.Dolne panele Pokaz oznacza ± SEM trzech myszy na grupę. *p <0.05, dorosły w porównaniu z P24; #p <0.05, dorosły w porównaniu z P36 (test wielokrotnych porównań Tukeya po ANOVA). BDensytometryczne wartości immunoreaktywności DAT w skorupie jądra ogoniastego i jądrze półleżącym dla naiwnych myszy CD-1 w funkcji wieku. Poziomy DAT nie różniły się między trzema grupami wiekowymi.
DYSKUSJA
Efekty behawioralne stymulantów psychomotorycznych zależą od wieku. Uzależniające tendencje są najwyższe w okresie dojrzewania, gdy wzrasta wykorzystanie nielegalnych substancji (Estroff i wsp., 1989; Myers and Anderson, 1991). W rzeczywistości młodsze dzieci często stają się dysforyczne po ekspozycji na środki psychostymulujące, podczas gdy dorastający i dorośli doświadczają euforii (Rapoport i wsp., 1980). W modelach gryzoni niektóre badania sugerują, że zwierzęta z dojrzałością peryferyjną mają wyższy wyjściowy poziom aktywności (Włócznia i hamulec, 1983) i zmienione odpowiedzi na psychostymulanty w stosunku do młodszych i starszych zwierząt. W związku z tym wykazują mniej stymulacji lokomotorycznej i poszukiwania nowości w odpowiedzi na ostre, niskie dawki leków psychostymulujących w stosunku do odstawiania i dorosłych zwierząt, ale zwiększoną nadaktywność po leczeniu dużymi dawkami. Przy przewlekłym podawaniu uczulenie na lokomocję wywołaną kokainą jest większe u szczurów dojrzewających w porównaniu z dorosłymi, podczas gdy uczulenie na stereotypię jest mniejsze. Ponadto, dane z mikrodializy ujawniły różnice między perystolami i dorosłymi szczurami pod względem uczulenia na indukowane amfetaminą uwalnianie dopaminy (Laviola i wsp., 1995; Adriani i wsp., 1998; Adriani i Laviola, 2000;Laviola i wsp., 2001). Istnieją jednak sprzeczne badania dotyczące długoterminowej reaktywności na kokainę po podaniu metylofenidatu u młodych szczurów (Brandon i wsp., 2001; Andersen i wsp., 2002). Te dwa ostatnie raporty podkreślają trudność w porównywaniu badań, gdy wykorzystywane są różne paradygmaty eksperymentalne. Próby porównania badań behawioralnych u młodszych zwierząt są dodatkowo mylone z wykorzystaniem różnych gatunków i szczepów.
Mysz staje się coraz ważniejszym modelem zwierzęcym w badaniu używania i nadużywania środków psychostymulujących i jest to pierwsza systematyczna analiza molekularnych odpowiedzi neuroadaptacyjnych w trzech różnych epokach rozwojowych u myszy lub dowolnego innego pojedynczego gatunku. Poprzednie badania, z których uzyskaliśmy nasze paradygmaty leczenia, wykazały wzrost ΔFosB w odizolowanym prążku grzbietowym i brzusznym dorosłych szczurów typu dzikiego po przewlekłym podawaniu kokainy i amfetaminy (Hope i wsp., 1994; Nye i wsp., 1995; Turgeon i wsp., 1997), ale tylko w połączeniu prążkowia grzbietowego i brzusznego lub izolowanego prążkowia grzbietowego dorosłych myszy typu dzikiego po przewlekłej kokainie (Fienberg i wsp., 1998; Zachariou i wsp., 2001).
Obecnie wykazujemy przestrzenną i ilościową różnicę w indukowanym psychostymulantem ΔFosB u myszy po okresie odsadzenia, perystolencji iu dorosłych. Obserwacja podwyższonej odpowiedzi u zwierząt w okresie dojrzewania w porównaniu z dorosłymi i po odsadzeniu jest wzmocniona przez fakt, że odpowiedź jest podobna u myszy leczonych kokainą i amfetaminą. Psychostymulanty kokaina i amfetamina zwiększają zarówno dopaminę synaptyczną, jak i serotoninę i norepinefrynę, ale poprzez różne mechanizmy. Kokaina wiąże się z transporterami plazma-mami na dopaminę, serotoninę i norepinefrynę i hamuje ich wychwyt zwrotny do terminali presynaptycznych. Natomiast amfetamina sprzyja uwalnianiu tych przekaźników. Selektywna indukcja ΔFosB w jądrze półleżącym tylko w grupie wiekowej po podaniu 7 d stymulanta i względnie podwyższona indukcja ΔFosB w skorupie jądra ogoniastego może być neurobiologiczną reprezentacją lub przyczyną wcześniej zauważonej zwiększonej tendencji do nadużywania środków psychostymulujących w tym Grupa wiekowa (Estroff i wsp., 1989; Myers and Anderson, 1991) i inne długoterminowe zmiany w ekspresji genów, które różnią się między grupami wiekowymi (Andersen i wsp., 2002). Co więcej, różnice te mogą być regulowane wewnętrznie przez zmiany rozwojowe poziomów kluczowych cząsteczek, w tym samego ΔFosB. Potencjalne implikacje różnic w wyjściowych poziomach ΔFosB między grupami wiekowymi są analogiczne do proponowanych różnic między szczepami szczurów (Haile i wsp., 2001). W rzeczywistości spodziewamy się, że podobne różnice między szczepami zostaną wykryte wśród myszy wsobnych. Jest również możliwe, że myszy w różnym wieku będą wykazywały różne adaptacje molekularne w obszarach mózgu innych niż jądro półleżące. Dodatkowa analiza z użyciem myszy periadolowych z genetycznie zmodyfikowanymi zmianami poziomów kluczowych cząsteczek i równoległymi obserwacjami behawioralnymi dodatkowo przetestuje te hipotezy.
Przypisy
- Odebrane Kwiecień 8, 2002.
- Otrzymano wersję Sierpień 6, 2002.
- Zaakceptowane Sierpień 8, 2002.
Praca ta została wsparta przez National Institutes of Health / National Institute of Neurological Disorders i Stroke Grant NS41871 (MEE i EMU) oraz Narodowy Instytut ds. Narkomanii Grant P30-DA13429 (EMU).
Korespondencja powinna być kierowana do Dr Michelle E. Ehrlich, Thomas Jefferson University, Curtis 310, 1025 Walnut Street, Philadelphia, PA 19107. E-mail: [email chroniony].
- Copyright © 2002 Society for Neuroscience
;