Równoważenie prążkowia w uzależnieniu od narkotyków: różne role pośrednich i pośrednich średnich neuronów kolczastych (2011)

Wprowadzenie

Narkotyki wywierają silne zmiany molekularne i komórkowe zarówno w prążkowiu grzbietowym (dStr), jak i prążkowiu brzusznym (jądro półleżące, NAc), a wiele z tych zmian występuje w neuronach kolczastych średnich (MSN), głównych neuronach projekcyjnych w dStr i NAc, które uwzględnij 90 – 95% wszystkich neuronów w tych regionach. Jednak do niedawna naukowcy nie byli w stanie jasno zdefiniować różnicowej roli dwóch podtypów MSN w zjawiskach związanych z uzależnieniem. Dwa podtypy MSN są różnicowane przez wzbogacenie receptora dopaminy 1 (D₁) lub receptor dopaminy 2 (D₂), a także kilka innych genów (Gerfen i Young, 1988; Gerfen i in., 1990; Le Moine i in., 1990, 1991; Bernard i in., 1992; Ince i in., 1997; Lobo i in., 2006, 2007; Heiman i in., 2008; gensat.org) oraz ich wyraźne projekcje na drodze zwojów korowo-podstawnych (ścieżki bezpośrednie i pośrednie; Gerfen, 1984, 1992). Wczesne prace sugerowały, że narkotyki mają największy wpływ na D₁+ MSN, z wykorzystaniem licznych agonistów i antagonistów receptora dopaminy, zapewniających ważny wgląd w funkcje funkcjonalne i molekularne każdego MSN w zachowaniach związanych z nagrodami za leki (Self, 2010). Jednak obecne metodologie specyficzne dla typu komórek, w tym myszy reporterowe fluorescencyjne, które eksprymują GFP w D₁ lub D₂ sztuczne chromosomy bakteryjne (BAC; Gong i in., 2003; Valjent i wsp., 2009; gensat.org), warunkowe modele mysie, takie jak zastosowanie regulowanych tetracykliną indukowalnych myszy transgenicznych (Chen i wsp., 1998; Kelz i wsp., 1999) i transgeniczne myszy wyrażające rekombinazę Cre przy użyciu D₁ lub D₂ BAC, sztuczne chromosomy drożdży (YAC) lub myszy knock-in (Gong i in., 2007; Lemberger i in., 2007; Heusner i in., 2008; Parkitna i in., 2009; Valjent i wsp., 2009; Bateup i in., 2010; Lobo i in., 2010; gensat.org), a także specyficzny dla komórek transfer genów za pośrednictwem wirusa (Cardin i in., 2010; Hikida i in., 2010; Lobo i in., 2010; Ferguson i wsp., 2011), dostarczyły nowych informacji na temat dokładnych podstaw molekularnych każdego podtypu MSN i ich regulacji przez narkotyki (tabela 1).

Tabela 1. Wpływ manipulacji genetycznej specyficznej dla typu komórek w D₁+ i D₂+ MSN w modelach uzależnienia od narkotyków.

Ostatnie odkrycia potwierdzają wniosek o dominującej roli D₁+ MSNs w wytwarzaniu wzmacniającego i uwrażliwiającego działania narkotyków, z najsilniejszymi zmianami molekularnymi występującymi w tych MSN. Na przykład ostra ekspozycja na psychostymulanty silnie indukuje liczne molekuły sygnałowe, w tym FosB, ERK, c-Fos i Zif268 w D₁+ MSN, podczas gdy powtarzana kokaina preferencyjnie indukuje ΔFosB i zmienia receptor GABA i inne podjednostki kanałów jonowych w tym typie komórek (Robertson i in., 1991; Young i wsp., 1991; Berretta i in., 1992; Cenci i in., 1992; Moratalla i wsp., 1992; Hope i wsp., 1994; Bertran-Gonzalez i in., 2008; Heiman i in., 2008). Ponadto, rozrywanie lub nadekspresja specyficznych cząsteczek, takich jak ΔFosB, DARPP-32 lub Nr3c1 (receptor glukokortykoidowy), w D₁+ MSN zazwyczaj naśladują zachowania związane z narkotykami obserwowane, gdy te zmiany są dokonywane w sposób nie specyficzny dla typu komórki, podczas gdy zakłócają takie geny w D₂+ MSN często wywołują odwrotną odpowiedź (Fienberg i wsp., 1998; Kelz i wsp., 1999; Deroche-Gamonet i in., 2003; Zachariou i wsp., 2006; Ambroggi i wsp., 2009; Bateup i in., 2010). Niemniej jednak nie możemy wykluczyć istotnego wkładu D₂+ MSN w adaptacjach do narkotyków, ponieważ ekspozycja na kokainę zmienia ekspresję genów w obu podtypach MSN (Heiman i in., 2008) i D₂agoniści i antagoniści receptora wywierają silne działanie w testach behawioralnych (Self, 2010). Rzeczywiście, ostatnie odkrycia pokazują, że molekularne adaptacje sygnałów w D₂+ MSN silnie modyfikują behawioralną reakcję zwierzęcia na narkotyki (Lobo i in., 2010). Ostatnie wyniki pokazały, że utrata TrkB (receptora dla BDNF) w D₂+ MSN skutkują podobnymi reakcjami behawioralnymi na kokainę jako nokaut całkowity TrkB z NAc, pokazując po raz pierwszy selektywną dominującą rolę dla szlaku molekularnego w D₂+ MSN w pośredniczeniu w skutkach nadużywania narkotyków.

Wreszcie, najnowsza literatura ujawnia, że ​​dwa MSN wywierają antagonistyczne działanie w zachowaniach związanych z narkotykami, gdzie aktywacja D₁+ MSN lub hamowanie D₂+ MSN zwiększa wrażliwość zwierzęcia na narkotyki (Hikida i in., 2010; Lobo i in., 2010; Ferguson i wsp., 2011). Odkrycia te są zgodne z przeciwstawnymi rolami dwóch MSN i ich bezpośrednich i pośrednich szlaków w zwojach podstawy mózgu w zachowaniach motorycznych (Alexander i in., 1986; Albin i in., 1989; Graybiel, 2000; Kravitz i in., 2010). Ta najnowsza literatura jest zgodna z ogólną ideą, że neurotransmisja dopaminergiczna, która jest aktywowana przez wszystkie narkotyki, ułatwia aktywację glutaminergiczną D₁+ MSN podczas hamowania aktywacji glutaminergicznej D₂+ MSN poprzez swoje działania na D₁ vs. D₂ receptory dopaminy (ryc 1). W tym przeglądzie zajmujemy się obecną wiedzą o wyraźnym sygnalizowaniu molekularnym wykazywanym przez te dwa podtypy MSN w odniesieniu do ich ról funkcjonalnych i odpowiedzi na narkotyki.

Rysunek 1. Wszystkie nadużywane leki zwiększają sygnalizację dopaminy w prążkowiu, co może różnicować modulację aktywności glutaminergicznej w dwóch podtypach MSN. W szczególności kokaina wiąże się z transporterem dopaminy, zapobiegając ponownemu wychwytowi dopaminy do końców neuronów dopaminowych VTA. Aktywacja G_s/_olf sprzężone D₁ receptory zwiększają aktywność PKA i zmieniają Ca²⁺ i K⁺ przewodnictwo wzmacniające stan podwyższenia, w którym pośredniczy glutaminian w tych sieciach MSN. W przeciwieństwie do aktywacji G._i/G_o D₂receptory zmniejszają aktywność PKA i zmieniają Ca²⁺, Na⁺i K⁺ przewodnictwo zmniejszające „stan uprzywilejowany za pośrednictwem glutaminianu”. Powoduje to przesunięcie tych MSN z powrotem do stanu spoczynku.

Sygnalizacja receptora dopaminowego w D₁ vs. D₂ MSN

Jak już wspomniano, wszystkie nadużywane leki aktywują dopaminergiczny wkład do NAc i powiązanych regionów limbicznych mózgu (Volkow i wsp., 2004; Wise, 2004; Nestler, 2005). Na przykład środki psychostymulujące, takie jak kokaina lub amfetamina, działają bezpośrednio na szlak nagrody dopaminergicznej poprzez zakłócanie transportera dopaminy: blokada kokainy transporter i amfetamina odwraca transporter, oba działania powodują nagromadzenie dopaminy w synapsie, która może aktywować dopaminę receptory na docelowych neuronach (ryc 1). Dwa MSN są najbardziej zróżnicowane dzięki wzbogaceniu D₁ vs. D₂-receptory, chociaż badania jednokomórkowe RT-PCR ujawniają, że D₁+ MSN wyrażają niskie poziomy D₂podobny do receptora, D₃ i D₂+ MSN wyrażają niskie poziomy D₁podobny do receptora, D₅ (Surmeier i in., 1996). Dwa MSN-y wymagają unerwienia glutaminergicznego do napędzania aktywności neuronalnej; dopamina przeciwnie moduluje te odpowiedzi funkcjonalne poprzez stymulację różnych podtypów receptora dopaminy: przez dodatnie modulowanie pobudzającego wejścia glutaminergicznego przez D₁ sygnalizacja receptora przez G_s lub G_olf, który stymuluje cyklazę adenylylową prowadząc do zwiększonej aktywności PKA, podczas gdy dopamina negatywnie moduluje to wejście przez D₂- sygnalizacja receptora przez G_i i G_o które hamują cyklazę adenylylową powodując zmniejszenie aktywności PKA (Surmeier i in., 2007; Gerfen i Surmeier, 2011). W rzeczywistości każdy receptor wywiera złożony wpływ na wiele dodatkowych ścieżek sygnałowych w dół. W spoczynku dwa podtypy MSN są na ogół zahamowane, znajdują się w tym, co naukowcy określili jako stan niższy. Pobudzająca aktywność synaptyczna glutaminergiczna może uwolnić MSN z tego stanu w dół i przenieść je w bardziej zdepolaryzowany stan (stan w górę). Dopamina przeciwnie moduluje pobudzające przesunięcie glutaminergiczne w górę. re₁ aktywacja PKA wzmacnia Cav1 typu L Ca.²⁺ aktywność kanału, zmniejsza somatyczny K⁺ aktywność kanału i zmniejsza Cav2 Ca²⁺ kanały kontrolujące aktywację Ca.²⁺ zależny K o małej przewodności⁺ (SK) kanały, co skutkuje zwiększonym skokiem w tych numerach MSN (Surmeier i in., 2007; Gerfen i Surmeier, 2011). Natomiast D₂ sygnalizacja hamuje przejście w górę stanu, zapobiegając w ten sposób zwiększonemu wzbogacaniu, poprzez redukcję Cav1 typu L Ca.²⁺ aktywność kanału i Nav1 Na⁺ aktywność kanału podczas zwiększania K⁺ prądy kanałowe (Surmeier i in., 2007; Gerfen i Surmeier, 2011; Postać 1). Takie przeciwne zmiany w dwóch MSN sugerują, że zwiększona sygnalizacja dopaminy wywołana przez narkotyki powinna zwiększyć aktywację D glutaminergii₁+ MSN i zmniejsz aktywację glutaminergiczną D₂+ MSN. W rzeczywistości takie odpowiedzi są znacznie bardziej zróżnicowane i złożone z powodów, które pozostają słabo poznane. Ten temat zostanie omówiony poniżej.

Rola receptorów dopaminy w nadużywaniu narkotyków jest złożona i często nieuchwytna (Self, 2010). Istnieje mnóstwo literatury na temat roli D₁ i D₂- agoniści receptora i antagoniści w modulowaniu właściwości nagradzających i samopodawaniu leków nadużywających, jednak wyniki różnią się w zależności od rodzaju stosowanego agonisty / antagonisty, rodzaju dostarczania (swoistego dla układu względem regionu mózgu) i czasu leczenia (Self, 2010). Takie wyniki są dodatkowo utrudnione przez specyficzne efekty nie prążkowia, takie jak udział pre-synaptycznego D₂-receptory z VTA lub obecność D₁ receptory w wielu innych regionach limbicznych i brak specyficzności stosowanych agonistów / antagonistów, jak również ekspresja D₁jak i D₂podobne receptory w obu podtypach MSN, jak wspomniano wcześniej. Ogólnie uważa się, że D₁ receptory odgrywają bardziej dominującą rolę w pierwotnych nagradzających właściwościach narkotyków, podczas gdy D₂receptory odgrywają rolę w mechanizmach poszukiwania narkotyków (Self i in., 1996; Self, 2010). Badania z D₁ receptor i D₂myszy z nokautem receptora dają pewien wgląd w rolę tych receptorów w dwóch MSN. re₁ myszy z nokautem wykazują tępą indukcję bezpośrednich wczesnych genów (IEG) c-Fos i Zif268 w odpowiedzi na kokainę, zmniejszoną odpowiedź na indukowaną psychostymulantem aktywność lokomotoryczną, ale bez zmian w preferencjach miejsca uzależnionych od kokainy (CPP) - pośrednia miara nagroda za lek i zmniejszyła samopodawanie kokainy i spożycie etanolu (Miner i in., 1995; Drago i in., 1996; Crawford i in., 1997; El-Ghundi i in., 1998; Caine i in., 2007). re₂ myszy z nokautem wykazują zmniejszone efekty nagradzania opiatów i kokainy, a także zmniejszone spożycie etanolu, ale nie zmniejszają przyjmowania kokainy (Maldonado i in., 1997; Cunningham i in., 2000; Risinger i in., 2000; Caine i in., 2002; Chausmer i in., 2002; Elmer i in., 2002; Welter i in., 2007). Takie dane wspierają ważne role D₁ i D₂- receptory w dwóch MSN w wielu aspektach nadużywania leków, jednak nokautom brak specyficzności prążkowia i występują na wczesnym etapie rozwoju, dlatego nie można wykluczyć innych regionów mózgu i typów komórek oraz czynników rozwojowych w pośredniczeniu w tych zachowaniach. Na koniec zmniejszono poziom D₂/D₃ receptory w prążkowiu, wizualizowane przez obrazowanie mózgu, stały się powszechnym markerem uzależnienia u pacjentów, zwłaszcza w okresach odstawienia (Volkow i wsp., 2009). Gryzonie otrzymujące transfer genów za pośrednictwem wirusa D₂receptory na wyświetlacz NAc osłabiły samopodawanie kokainy i spożycie etanolu (Thanos i in., 2004, 2008). Badania te nie zostały przeprowadzone w sposób specyficzny dla komórki, więc nie możemy wykluczyć możliwego wpływu D₂- nadekspresja receptora wpływająca na D₁+ MSN. Ten zbiór danych podkreśla potrzebę przejścia na bardziej selektywne podejścia, w tym specyficzne dla komórki, specyficzne dla regionu, a nawet czasowo specyficzne manipulacje receptorów dopaminy, aby lepiej wyjaśnić ich role funkcjonalne w dwóch podtypach MSN w uzależnieniu od narkotyków.

Wreszcie doniesiono niedawno, że D₂Transgeniczne myszy -GFP homozygoty BAC wykazują zwiększone poziomy ekspresji D₂-receptor w prążkowiu i zwiększona wrażliwość behawioralna i sygnalizacja dopaminy do D₂ agoniści. Ponadto zarówno homozygoty, jak i hemizygoty wykazują tępe reakcje behawioralne na kokainę (Kramer i in., 2011). Niniejsze badanie podkreśla potrzebę przeprowadzenia dokładnej charakterystyki D₁ i D₂ fluorescencyjny reporter i linie sterownika Cre. Jednak większość danych zebranych w tym badaniu wykorzystywała homozygoty, co nie jest idealnym genotypem eksperymentalnym, ponieważ 5 – 10% integracji transgenu skutkuje mutacjami insercyjnymi (Meisler, 1992); dlatego genotyp hemizygoty jest bardziej wiarygodnym genotypem doświadczalnym. Dodatkowo, to badanie nie wykorzystywało kontroli typu dzikiego z miotu, ale stosowało kontrole na podobnym tle (Swiss Webster) uzyskane z Taconic, podczas gdy ich transgeniczne linie otrzymano z GENSAT i MMRRC. Wreszcie inna grupa wykazała prawidłową reakcję behawioralną lokomotoryczną kokainy w D₂- hemizygoty GFP (Kim i wsp., 2011). W związku z tym należy przeprowadzić przyszłe badania z użyciem odpowiednich kontroli i odpowiednich genotypów, aby w pełni scharakteryzować różne dostępne linie transgeniczne specyficzne dla danego typu komórek.

Sygnalizacja glutaminianem i GABA w D₁ vs. D₂ MSN

Średnie kolczaste neurony otrzymują wkład glutaminergiczny z wielu obszarów mózgu, w tym kory przedczołowej, ciała migdałowatego i hipokampa, oraz wkładu GABAergicznego pochodzącego od lokalnych interneuronów i być może pobocznych wkładów z innych MSN. Bezwzględne regulowanie pobudzenia i hamowania MSN jest bez wątpienia kluczowe w regulowaniu uzależnienia od narkotyków, a obecnie rośnie liczba literatury na temat złożonych sposobów, w jakie narkotyki zmieniają neuroprzekaźnictwo glutaminergiczne, w szczególności w NAc (Pierce i in., 1996; Thomas i wsp., 2001; Beurrier i Malenka, 2002; Kourrich i in., 2007; Bachtell i Self, 2008; Bachtell i wsp., 2008; Conrad i in., 2008; Kalivas, 2009; Wolf, 2010). Chociaż uważa się, że MSN występują głównie w hamowanym stanie obniżonym w warunkach podstawowych z aktywnością glutaminianową w obu typach komórek, nadal istnieją ograniczone informacje dotyczące odrębnej regulacji występującej w D₁ vs. D₂ MSN.

Nadekspresja ΔFosB w D₁+ MSN (patrz poniżej, aby uzyskać więcej szczegółów) zwiększa satysfakcjonujące efekty kokainy i zwiększa poziom Ca.²⁺-przepuszczalna podjednostka receptora glutaminianu, GluR2, w NAc. Ponadto, transfer genów za pośrednictwem wirusa GluR2 do NAc podobnie wzmacnia nagradzające działanie kokainy (Kelz i wsp., 1999). Jednak nie wiadomo, czy indukcja GluR2 obserwowana w odpowiedzi na nadekspresję ΔFosB w D₁+ MSNs są również specyficzne dla tych neuronów, a nadekspresja wirusowa GluR2 nie jest specyficzna dla typu komórek, dlatego nie możemy wnioskować o bezpośrednich działaniach dotyczących funkcji GluR2 w tych dwóch MSN w nagrodzie leku. Heusner i Palmiter (2005) ocenili rolę przewodnictwa glutaminergicznego NMDA w zachowaniach kokainowych poprzez ekspresję podjednostki NR1, która zawiera mutację w porach, która zmniejsza przepływ wapnia, selektywnie w D₁+ MSN. Ta grupa wykazała brak przewodności NMDA w D₁+ MSN zapobiega indukowanemu kokainą CPP i uczuleniu na lokomotorę kokainy, podkreślając konieczność sygnalizacji NMDA w D₁+ MSN-y za satysfakcjonujące i uwrażliwiające działanie kokainy (Heusner i Palmiter, 2005). Ponadto ostatnio stwierdzono, że wybicie podjednostki NR1 w D₁+ MSN osłabiają uczulenie na amfetaminę i ten fenotyp został uratowany poprzez uzupełnienie podjednostki NR1 o D₁+ Numery MSN specyficznie w NAc (Beutler i in., 2011). Wreszcie, knockdown podjednostki mGluR5, z wykorzystaniem interferencji RNA, w D₁+ MSN nie mają wpływu na początkowe nagradzające właściwości kokainy, ale zmniejszają przywrócenie wznowienia poszukiwania kokainy (Novak i in., 2010). Dane te ujawniają przekonujące role sygnalizacji glutaminergicznej w D₁+ MSN, przyszłe prace są potrzebne do badania układów glutaminergicznych w D₂+ MSN. Przyszłe badania powinny również ocenić, w jaki sposób modulacja tych podjednostek receptora glutaminianu w dwóch podtypach MSN wpływa na strukturalne zmiany synaptyczne obserwowane w NAc po zażywaniu narkotyków (Dietz i in., 2009; Russo i wsp., 2010), szczególnie zmiany dendrytyczne obserwowane po ekspozycji na kokainę selektywnie w D₁+ MSN (Lee i wsp., 2006; Kim i wsp., 2011) co może być związane ze wzrostem miniaturowych pobudzających prądów postsynaptycznych obserwowanych w D₁+ MSN (Kim i wsp., 2011). Co ciekawe, indukcja ΔFosB w D₁+ MSNs były bezpośrednio związane z takimi adaptacjami dendrytycznymi po przewlekłej kokainie (Maze i wsp., 2010).

W przeciwieństwie do glutaminianu, brak jest badań nad funkcją GABA w dwóch MSN w modelach uzależnień, co jest zaskakujące, biorąc pod uwagę, że zarówno etanol, jak i benzodiazepiny wzmacniają działanie GABA, a dwa MSN otrzymują gęstą dawkę GABAergiczną, jak wspomniano powyżej. Istnieją również znaczne dowody wskazujące na zwiększone hamowanie w NAc przynajmniej po przewlekłej ekspozycji na kokainę (White i in., 1995; Peoples i in., 1998; Zhang i in., 1998; Thomas i wsp., 2001; Beurrier i Malenka, 2002). Heiman i in. (2008) przeprowadził wysokowydajne badania genetyczne w dwóch MSN po przewlekłej ekspozycji na kokainę i, co ciekawe, najbardziej zmienionym procesie biologicznym w D₁+ MSNs to sygnalizacja GABA. W szczególności nastąpiła silna regulacja GABA_A podjednostki receptora Gabra1 i Gabra4 oraz GABA_B podjednostka receptora Gabrb3, i ta grupa odkryła, że ​​przewlekła kokaina zwiększa częstotliwość małych amplitudowych GABAergicznych mini hamujących prądów postsynaptycznych (mIPSC) w D₁+ MSN (Heiman i in., 2008). Z drugiej strony, inna grupa ostatnio wykazała, że ​​przewlekła kokaina powoduje odwrotną reakcję ze zmniejszoną częstotliwością i amplitudą mIPSC w D1 + MSNs (Kim i wsp., 2011). Jednak ta druga grupa wykazywała zmniejszoną pobudliwość błony w D₁+ MSN po przewlekłej kokainie, która może być odbiciem wzmocnionego tonu GABA i jest zgodna z oceną polową zwiększonego hamowania w NAc po ekspozycji na chroniczną kokainę. Ponadto takie różnice między obiema grupami mogą po prostu wynikać z czasu narażenia na kokainę i wycofania się z niej. Ogólnie rzecz biorąc, istnieje potrzeba zbadania funkcji glutaminergicznej i GABAergicznej w dwóch MSN w odpowiedzi na nadużywanie narkotyków, a dziedzina ta jest teraz wyposażona w zasoby, które umożliwiają takie badanie typu komórek i regionów.

Inne sygnalizowanie receptora w D₁ vs. D₂ Podtypy MSN

Dwa MSN są różnie wzbogacone w inne receptory sprzężone z białkiem G oprócz receptorów dopaminy. re₁+ MSN wyrażają wyższe poziomy receptora muskarynowego acetylocholiny 4 (M₄; Bernard i in., 1992; Ince i in., 1997) i D₂+ MSN są wzbogacone zarówno w receptor adenozynowy 2A (A_2A; Schiffmann i in., 1991; Schiffmann i Vanderhaeghen, 1993) i receptor 6 sprzężony z białkiem G (Gpr6; Lobo i in., 2007; gensat.org). M₄ jest sprzężony z G_{i / o}, co dałoby przeciwną odpowiedź w porównaniu z D₁ receptory w D₁+ MSN przez hamowanie aktywności cAMP / PKA. Rzeczywiście, D₁+ MSN selektywne M₄ nokaut wykazał zwiększone uwrażliwienie behawioralne na kokainę i amfetaminę (Jeon i in., 2010). Ponadto ostatnie badania z użyciem projektowanego receptora aktywowanego wyłącznie przez lek syntetyczny (DREADD) wykazały, że aktywacja ludzkiego M DREADD Gi / o-coupled M₄ receptor (hM₄D) w D₁+ MSN zmniejszyły uczulenie behawioralne na amfetaminę, z odwrotną reakcją obserwowaną w D₂+ MSN (Ferguson i wsp., 2011). Takie dane ujawniają antagonizującą rolę M₄ receptory w D₁+ MSNs w narkomanii. Jak dobrze, od hM₄Receptor D silnie hamuje te MSN, dane dostarczają informacji na temat wpływu zmienionej aktywności tych dwóch MSN na nadużywanie leków, co zostanie omówione poniżej.

Oba A_2A a Gpr6 są dodatnio sprzężone z G_s/G_olf białka, implikując ich rolę w antagonizowaniu D₂-receptor w D₂+ MSN. Rzeczywiście, stymulacja A_2A wykazano, że receptory zmniejszają zarówno rozwój, jak i ekspresję uczulenia na kokainę (Filip i in., 2006), utrudniają inicjację kokainy do samodzielnego podawania (Knapp i in., 2001) i przeciwstawiają się przywróceniu poszukiwania kokainy wywołanego przez kokainę, D₂- stymulacja receptora lub uwarunkowane kokainą wskazówki (Bachtell i Self, 2009). Ponieważ Gpr6 jest również wzbogacony w D₂+ MSN (Lobo i in., 2007) należy ocenić jego rolę w funkcjach behawioralnych prążkowia. Do tej pory wykazano, że wpływa na uczenie się instrumentalne (Lobo i in., 2007) ale jego rola w modelach nadużywania narkotyków jest jeszcze nieznana.

Receptor kanabinoidowy 1 (CB1) ulega wszechobecnej ekspresji w centralnym układzie nerwowym (Mackie, 2008), stąd trudno jest dokładnie określić rolę specyficznych regionów mózgu i typów komórek w pośredniczeniu w uzależnieniu X9-tetrahydrokannabinol (THC). Ostatnio usunięcie CB1 z D₁Stwierdzono, że MSNs mają niewielki wpływ na reakcje behawioralne na THC, w tym stępione efekty w indukowanej THC hipolokomocji, hipotermii i analgezji (Monory i in., 2007). Interesująca byłaby ocena funkcji receptora kanabinoidowego w D₂+ MSN, ponieważ te MSN wyrażają długotrwałą depresję za pośrednictwem endokannabinoidów (eCB-LTD), która wymaga dopaminy D₂-aktywacja receptora (Kreitzer i Malenka, 2007).

Receptor glukokortykoidowy, Nr3c1, jest także szeroko wyrażany w ośrodkowym układzie nerwowym i obwodzie. Wywołane stresem wydzielanie glukokortykoidów może nasilać zachowania nieprzystosowawcze, w tym uzależnienie od narkotyków (Frank i in., 2011). W szczególności zakłócanie sygnalizacji glikokortykoidów w D₁+ MSN poprzez usunięcie Nr3c1 zmniejszyły motywację tych myszy do samodzielnego podawania kokainy, co jest zgodne z poprzednimi danymi, w których Nr3c1 został usunięty z całego mózgu (Ambroggi i wsp., 2009). Dane te są zgodne z innymi ustaleniami opisanymi w tym przeglądzie, wykazując dominującą rolę D₁+ MSN w pośredniczeniu w wielu skutkach narkotyków.

Ostatecznie, niedawno przerwaliśmy sygnalizację BDNF w dwóch MSN, usuwając jej receptor TrkB selektywnie z każdego podtypu MSN. Zaobserwowaliśmy przeciwne skutki dla zachowań wywołanych kokainą: indukowana kokainą aktywność lokomotoryczna i indukcja kokainy CPP zostały wzmocnione po usunięciu TrkB z D₁+ MSN, ale osłabione po usunięciu z D₂+ MSN (Lobo i in., 2010). Co ciekawe, usunięcie TrkB z D₂+ MSN naśladuje efekty całkowitego usunięcia TrkB z NAc, jak również zakłócenia sygnalizacji BDNF z VTA (Horger i wsp., 1999; Graham i wsp., 2007, 2009; Bahi i in., 2008; Crooks i in., 2010). Odkrycia te po raz pierwszy pokazują dominującą rolę kaskady sygnalizacyjnej w D₂+ MSN w pośredniczeniu w skutkach nadużywania narkotyków. Dominująca rola D₂+ MSN w pośredniczeniu w działaniu BDNF na zachowania wywołane kokainą nie jest zaskakujące, biorąc pod uwagę, że zarówno mRNA TrkB, jak i białko są wzbogacone w D₂+ MSN (Lobo i in., 2010; Baydyuk i in., 2011). Zmianom behawioralnym obserwowanym u tych myszy towarzyszyła zwiększona aktywność neuronalna w D₂+ MSN po selektywnym knockout TrkB. Odkrycia te skłoniły nas do wykorzystania technologii optogenetycznej do selektywnego manipulowania aktywnością MSN w nagrodzie kokainowej (patrz poniżej).

Czynniki transkrypcji w D₁ vs. D₂ MSN

Najbardziej przekonujące dowody na silniejszą rolę D₁+ MSNs w nadużywaniu narkotyków pochodzą z literatury oceniającej indukcję wewnątrzkomórkowych cząsteczek sygnałowych. Jak stwierdzono powyżej, ostre dawki psychostymulantów indukują ekspresję IEG, w tym c-Fos, Zif268 (Egr1) i FosB głównie w D₁+ MSN w NAc i dStr (Robertson i in., 1991; Young i wsp., 1991; Berretta i in., 1992; Cenci i in., 1992; Moratalla i wsp., 1992; Bertran-Gonzalez i in., 2008). Ta indukcja wymaga aktywacji D₁ receptory i swoistość komórkowa indukcji IEG w odpowiedzi na ostrą kokainę została niedawno potwierdzona przy użyciu D₁-GFP i D₂Myszy reporterskie GFP (Bertran-Gonzalez i in., 2008). Co ciekawe, potwierdzenie indukcji kokainy przez c-Fos głównie w D₁-GFP w całym prążkowiu z małą indukcją w D₂-GFP MSN tylko w dStr potwierdzono za pomocą paradygmatu zależnego od kontekstu (myszy wstrzykiwano w nowym środowisku poza klatką domową). Co więcej, poprzednie badanie wykorzystało in situ hybrydyzacja u myszy również wykazała indukcję c-Fos w D₁+ i D₂+ MSN w dStr, chociaż w tym badaniu reprezentatywne wykresy słupkowe pokazują większą liczbę D₁+ c-Fos dodatnie neurony (Ferguson i wsp., 2006). Co ciekawe, niniejsze badanie ujawnia znacznie zwiększoną indukcję c-Fos w D₂+ MSN w dStr po utracie ERK1, co odpowiada naszym wynikom zwiększonej indukcji c-Fos w D₂+ MSN specyficznie w powłoce NAc po zakłóceniu sygnalizacji BDNF, o której wiadomo, że zwiększa aktywność ERK (Lobo i in., 2010). Jednak w każdym badaniu obserwowano przeciwne reakcje behawioralne na kokainę, które mogą odzwierciedlać indukcję c-Fos w D₂+ MSN w powłoce dStr vs. NAc. Wreszcie, poprzednia literatura używa in situ hybrydyzacja / immunohistochemia u szczurów wykazała, że ​​ostre psychostymulanty mogą indukować c-Fos w równym stopniu w obu MSN, gdy lek jest podawany w nowym środowisku (Badiani i in., 1999; Uslaner i in., 2001a,b; Ferguson i Robinson, 2004) i podaje się, że przewlekłe podawanie amfetaminy selektywnie indukuje c-Fos w D₂+ MSN (Mattson i in., 2007). Te różne wyniki mogą być odzwierciedleniem stosowanych procedur eksperymentalnych (in situ hybrydyzacja z myszami reporterowymi GFP) lub nawet ze względu na gatunki zwierząt stosowane jako ostatnie eksperymenty stosowały szczury.

Niedawno badacze genetycznie wyprofilowali zależne od kokainy, aktywowane c-Fos neurony u szczurów przy użyciu immunologicznie aktywowanego sortowania komórek fluorescencyjnych (FACS) i wykazali, że neurony c-Fos + są wzbogacone w D₁+ Gen MSN, prodynorfina (Pdyn), ale mają niższe poziomy D₂ i a_2A, obie D₂+ Geny MSN (Guez-Barber i in., 2011), sugerując, że aktywowane neurony c-Fos + składają się głównie z D₁+ MSN. Ponadto grupa ta wcześniej wykazała, że ​​MSN wyrażające c-Fos są ważne dla tego zależnego od kontekstu uczulenia, ponieważ ablacja tych neuronów znosi ten fenotyp behawioralny (Koya i in., 2009). Chociaż poprzednie dane wykazały, że zależna od kokainy indukcja kontekstowa c-Fos występuje w obu D₁+ i D₂+ MSN u szczurów, nowsze wyniki odpowiadają ustaleniom, w których delecja c-Fos selektywnie z D₁+ MSNs tępi indukowane kokainą uczulenie na ruchy u myszy (Zhang i in., 2006). Ponadto ta grupa znalazła usunięcie c-Fos w D₁+ MSN osłabiają zmiany dendrytyczne kręgosłupa normalnie indukowane przez kokainę w NAc, co wskazuje na rolę c-Fos w pośredniczeniu w tych zmianach plastyczności synaptycznej. Wreszcie, grupa nie zaobserwowała zmian w indukcji CPP kokainy, ale stwierdziła, że ​​utrata c-Fos w D₁+ MSN zapobiegły wyginięciu kokainy CPP. Takie dane ilustrują dynamiczną rolę indukcji c-Fos w D₁+ MSN, jednakże, nie można wykluczyć różnicowego wpływu na poziomie behawioralnym jako pośredniczonego przez którykolwiek z kilku innych limbicznych regionów mózgu, które wyrażają D₁ receptor.

Innym IEG, który był szeroko badany w dwóch podtypach MSN, jest FosB. Ostra ekspozycja na kokainę indukuje FosB w D₁+ MSN (Berretta i in., 1992), podczas gdy chroniczne narażenie indukuje ΔFosB, stabilny produkt genu FosB generowany przez alternatywne splicing (Hope i wsp., 1994; Nestler i wsp., 2001; Nestler, 2008), w D₁+ MSN (Nye i wsp., 1995; Moratalla i wsp., 1996; Lee i wsp., 2006). Podobne odkrycia obserwuje się w przypadku wielu innych narkotyków, jak również naturalnych nagród, takich jak jedzenie, seks i bieganie kół. Na przykład przewlekłe kołowanie, które jest naturalną nagrodą (Iversen, 1993; Belke, 1997; Lett i wsp., 2000), indukuje ΔFosB w D₁+ MSN, ale nie D₂+ MSN (Werme i wsp., 2002). Aby uzyskać funkcjonalny wgląd w rolę ΔFosB w dwóch MSN, nasza grupa wygenerowała linie NSE-tTa, nazwane 11A i 11B, które kierują ekspresją transgenu do dowolnego D₁+ lub D₂+ Odpowiednio MSN (Chen i wsp., 1998; Kelz i wsp., 1999; Werme i wsp., 2002). Myszy Line 11A skrzyżowane z linią Tet-Op FFosB wykazują zwiększoną reakcję na satysfakcjonujące i lokomotoryczne działanie kokainy (Kelz i wsp., 1999), co jest zgodne z indukcją ΔFosB w D₁+ MSN (Nye i wsp., 1995; Moratalla i wsp., 1996). Co więcej, te same myszy wykazują zwiększoną nagrodę morfiny (ocenianą przez CPP), jak również zmniejszoną analgezję morfiny i zwiększoną tolerancję morfiny, podczas gdy myszy 11B Tet-Op ΔFosB nie wykazują zmiany nagrody morfiny. Nadekspresja dominującego negatywnego antagonisty ΔFosB wywiera działanie przeciwne do tych obserwowanych dla ΔFosB, chociaż ten model myszy nie rozróżnia D₁ vs. D₂ MSN (Peakman i wsp., 2003). Razem dane te potwierdzają rolę indukcji ΔFosB w D₁+ MSN jako ważny czynnik molekularny w nagradzających właściwościach narkotyków (Zachariou i wsp., 2006). Zjawisko to obserwuje się również w innych zachowaniach związanych z nagrodami, w szczególności w kołach: myszy 11A Tet-Op ΔFosB wykazują zwiększone zachowanie podczas jazdy kół, podczas gdy myszy 11B Tet-Op ΔFosB wykazują zmniejszone obroty kół (Werme i wsp., 2002). Odkrycie, że indukcja ΔFosB w D₁ MSN promuje nagrodę zgodną z ostatnimi odkryciami, że taka indukcja typu komórek selektywnych promuje również odporność na przewlekły stres (Vialou i wsp., 2010). Wreszcie, przewlekła indukcja kokainy ΔFosB w D₁+ Wykazano, że MSN towarzyszy silne, długotrwałe wzrosty gęstości kręgosłupa dendrytycznego (Lee i wsp., 2006) i ostatnio wykazano, że ΔFosB w NAc jest zarówno niezbędny, jak i wystarczający w pośredniczeniu w zwiększonej gęstości kolców dendrytycznych w tym obszarze mózgu (Maze i wsp., 2010). Takie dane wspierają rolę ΔFosB w D₁+ MSN w pośredniczeniu w nagradzaniu aspektów nadużywania narkotyków i naturalnych nagród, a także towarzyszących zmianom plastyczności strukturalnej. Dane sugerują również, że indukcja ΔFosB w D₂+ MSN nadaje negatywne konsekwencje bodźcom nagradzającym. Od indukcji ΔFosB w D₂+ MSNs obserwuje się w odpowiedzi na przewlekły stres i ekspozycję na leki przeciwpsychotyczne (Hiroi i Graybiel, 1996; Perrotti i wsp., 2004) potrzebne są dalsze badania tych ostatnich działań.

Inne wewnątrzkomórkowe cząsteczki sygnałowe w D₁ vs. D₂ MSN

Jedną cząsteczką sygnalizacyjną, która została dobrze przebadana w dwóch MSN w kontekście nadużywania narkotyków, jest kinaza białkowa ERK (kinaza związana z sygnałem zewnątrzkomórkowym). Ostra lub przewlekła ekspozycja na kokainę indukuje fosforylowaną ERK (pERK), aktywowaną formę białka, w NAc i dStr w D₁+ MSN za pomocą D₁-GFP i D₂Transgeniczne myszy reporterowe -GFP BAC (Bertran-Gonzalez i in., 2008) i ta odpowiedź jest przekazywana za pośrednictwem D₁ receptory (Valjent i wsp., 2000; Lu i wsp., 2006). Ta grupa wykazała również, że pMSK-1 (kinaza fosfo-MAP i aktywowana stresem-1) i histon H3, oba cele sygnalizacji pERK, są silnie indukowane w pERK zawierającym D₁+ MSN po ostrej ekspozycji na kokainę i nieznacznie zwiększone po przewlekłej kokainie (Bertran-Gonzalez i in., 2008). pERK jest również indukowana, jest odpowiedzią na przewlekłą morfinę, w szczególności, pERK jest silnie indukowane w D₁+ MSN i skromnie indukowane w D₂+ MSN w powłoce NAc po wycofaniu w odpowiedzi na kontekstowe skojarzenie z morfiną (Borgkvist i in., 2008). Dokładna rola funkcjonalna pERK w uzależnieniu od narkotyków pozostaje do ustalenia. Wykazano, że leczenie farmakologiczne inhibitorami ERK zmniejsza nagrodę za kokainę, jednak nokaut ERK1 nasila nagrodę za kokainę, co sugeruje, że inhibitory ERK mogą preferencyjnie wpływać na ERK2. Ostatnio pokazaliśmy, że aktywacja optogenetyczna D₁+ MSN w NAc, które zwiększają satysfakcjonujące reakcje zwierzęcia na kokainę, silnie redukują zarówno pERK1, jak i pERK2. Przyszłe badania manipulujące ekspresją ERK w sposób specyficzny dla komórek są niezbędne, aby w pełni zająć się funkcjonalną rolą sygnalizacji ERK w dwóch MSN w narkomanii.

DARPP-32 to kolejna cząsteczka sygnalizacyjna, która była szeroko badana w odpowiedzi na nadużywanie leków. Dobrze wiadomo, że ostre psychostymulanty prowadzą do fosforylacji DARPP-32 przez PKA w treoninie 34 (T34), powodując, że staje się ona silnym inhibitorem fosfatazy białkowej 1 (PP-1), która reguluje stan fosforylacji wielu białek efektorowych, w tym czynniki transkrypcyjne, receptory jonotropowe i kanały jonowe (Greengard i in., 1999). Jednak do niedawna nie było jasne, który podtyp MSN pośredniczy w tej zmianie biochemicznej. Greengard i in. (1999) wygenerował transgeniczne modele myszy BAC, które umożliwiają ocenę fosforylacji DARPP-32 w D₁+ lub D₂+ MSN, wyrażając oznaczone wersje DARPP-32 za pomocą D₁ lub D₂ BAC pozwalające na immunoprecypitację DARPP-32 z każdego podtypu MSN. Badania te wykazały, że ostre leczenie kokainą zwiększa fosforylację T34 w D₁+ MSN i indukuje fosforylację treoniny 75 (T75) przez Cdk5, która hamuje sygnalizację PKA, selektywnie w D₂+ MSN (Bateup i in., 2008). Wreszcie ta grupa pokazała, że ​​usunięcie DARPP-32 z każdego podtypu MSN przy użyciu D₁-Cre i D₂Transgeniczne myszy -Cre BAC dają przeciwną regulację indukowanej kokainą aktywności lokomotorycznej (Bateup i in., 2010). Utrata DARPP-32 z D₁+ MSN zmniejszyły lokomotoryczne działanie kokainy, co naśladuje poprzednie dane oceniające całkowity nokaut DARPP-32 (Fienberg i wsp., 1998), podczas gdy utrata DARPP-32 z D₂+ MSN poprawiły reakcje lokomotoryczne kokainy. Takie dane dostarczają konkretnych dowodów na zróżnicowane role DARPP-32 w dwóch MSN w odpowiedzi na nadużywanie leków i ilustrują znaczenie metod specyficznych dla typu komórek, aby w pełni zrozumieć wkład tych dwóch typów neuronów w narkomanię.

Aktywność modulująca D₁ lub D₂ MSN

Bezpośrednie modulowanie aktywności dwóch podtypów MSN dostarczyło ostatnio nowych informacji na temat molekularnej i funkcjonalnej roli D₁ i D₂ MSN w uzależnieniu. Zastosowaliśmy narzędzia optogenetyczne połączone z warunkowym (tj. Zależnym od Cre) wektorem wirusowym związanym z adenowirusem (AAV) wyrażającym niebieski kanał kationowy aktywowany światłem, kanałodopsyn-2 (ChR2). Wstrzyknęliśmy wektor lub kontrolkę do NAc D₁-Cre lub D₂-Cre BAC transgeniczne myszy, a następnie stymulowane wstrzykiwanym regionem niebieskim światłem, aby selektywnie aktywować D₁+ vs. D₂+ MSN w kontekście CPP kokainy. Odkryliśmy, że aktywacja D₁+ MSN zwiększają indukcję kokainy CPP, podczas gdy aktywacja D₂+ MSNs hamują tę indukcję (Lobo i in., 2010). Jak zauważono wcześniej, zaobserwowaliśmy te same efekty behawioralne, gdy TrkB został selektywnie usunięty z tych podtypów MSN: wzmocniona kokaina CPP i aktywność lokomotoryczna po usunięciu TrkB z D₁+ MSN i zmniejszona kokaina CPP i aktywność lokomotoryczna po usunięciu TrkB z D₂+ MSN. Prawdopodobne wspólne działanie nokautu TrkB i stymulacji optogenetycznej w D₂+ MSN to ich zwiększona aktywność, ponieważ usunięcie TrkB z tych komórek zwiększa ich pobudliwość elektryczną. Jak wspomniano wcześniej, znaleźliśmy także znaczną redukcję pERK po usunięciu TrkB z D₁+ MSN. pERK jest znanym docelowym celem sygnalizacji BDNF, a zatem wspólnych efektów behawioralnych obserwowanych po usunięciu TrkB z D₁+ MSN i aktywacja optogenetyczna tych komórek mogą wynikać z zbieżnych efektów na aktywność pERK. Potrzebne są jednak dalsze prace, aby określić dokładne, wspólne podstawy molekularne, które regulują efekty behawioralne obserwowane po zakłóceniu sygnalizacji BDNF i kontroli optogenetycznej tych dwóch podtypów neuronalnych.

Inne grupy wykorzystywały różne narzędzia do modulowania aktywności dwóch MSN w modelach narkomanii. Hikida i in. (2010) użyli wektorów AAV do ekspresji represyjnego czynnika transkrypcyjnego tetracykliny (tTa) przy użyciu substancji P (a D₁+ Gen MSN) lub enkefalina (a D₂+ Geny MSN). Wektory te wstrzyknięto do NAc myszy, w których lekki łańcuch toksyny tężca (TN) - toksyna bakteryjna, która rozszczepia białko związane z pęcherzykiem synaptycznym VAMP2 - była kontrolowana przez element reagujący na tetracyklinę, w celu selektywnego zniesienia transmisji synaptycznej w każdym Podtyp MSN. Zgodnie z naszym podejściem optogenetycznym dane te wykazały rolę D₁+ Aktywność MSN we wzmacnianiu CPP kokainy, jak również indukowanej kokainą aktywności lokomotorycznej, od zniesienia transmisji synaptycznej w D₁+ MSN zmniejszyły oba efekty behawioralne. W przeciwieństwie do badań optogenetycznych, autorzy nie stwierdzili żadnych zmian w CPP kokainy po zniesieniu transmisji synaptycznej w D₂+ MSN, ale zaobserwowali zmniejszoną indukowaną kokainą aktywność lokomotoryczną w odpowiedzi na pierwsze dwie ekspozycje na kokainę. Co ciekawe, grupa ta wykazała inaktywację D₂+ MSN odegrały głębszą rolę w pośredniczeniu w zachowaniach awersyjnych.

Jak stwierdziłem wcześniej, Ferguson i in. (2011) użył wektorów wirusa opryszczki zwykłej (HSV) do wyrażenia skonstruowanego GPCR (G_{i / o}muskularny ludzki M₄ receptor receptorowy aktywowany wyłącznie przez designerski lek, hM₄D), który jest aktywowany przez farmakologicznie obojętny ligand z użyciem promotorów enkefaliny i dynorfiny, aby selektywnie wyciszyć D₁+ lub D₂+ MSN w dStr. Autorzy pokazali, że przejściowo zakłóca D₂+ Aktywność MSN w dStr ułatwiała uczulenie na amfetaminę, natomiast zmniejszała pobudliwość D₁+ MSN osłabiły uporczywość uczulenia wywołanego amfetaminą. Wreszcie zniesienie D₂+ MSN w NAc w wieku dorosłym z zastosowaniem receptora toksyny błonicy wzmacnia nagradzający efekt amfetaminy (Durieux i in., 2009). Takie dane są zgodne z naszymi odkryciami optogenetycznymi i razem sugerują przeciwne role D₁+ vs. D₂+ MSN w narkomanii, z D₁+ MSN promujące zarówno nagrody, jak i uwrażliwiające reakcje na psychostymulanty i D₂+ MSNs tłumiące te zachowania.

Przyszłe kierunki

Dziedzina ta poczyniła ogromne postępy w kierunku zrozumienia selektywnej roli D₁+ i D₂+ Podtypy MSN w NAc i dStr w pośredniczeniu w skutkach nadużywania leków. W szczególności ostatnio opracowane narzędzia umożliwiające selektywną manipulację tymi typami komórek odegrały dominującą rolę w uzyskaniu większości tych informacji. Jakie są kolejne kroki? Ponieważ podstawowe molekularne adaptacje w modelach uzależnienia od narkotyków nie są statyczne, ale bardzo dynamiczne, kluczowe jest rozwinięcie zdolności do selektywnego manipulowania molekułami sygnalizacyjnymi będącymi przedmiotem zainteresowania w D₁+ vs. D₂+ MSN w sposób czasowo precyzyjny. DREADD i narzędzia optogenetyczne mogą pomóc w manipulowaniu skalą czasu. Ligandy DREADD można podawać w różnych przebiegach czasowych w ramach paradygmatów behawioralnych leków, aby rozdzielić selektywną rolę receptorów sygnałowych w dwóch MSN w modelach leków. Narzędzia optogenetyczne w szczególności zapewniają niezwykle potężne środki do czasowej regulacji nie tylko aktywności neuronalnej, ale także sygnalizacji receptora sprzężonego z białkiem G przy użyciu OptoXR (Airan i in., 2009), sygnalizacja glutaminergiczna (Volgraf i in., 2006; Numano i in., 2009), Sygnalizacja GABAergiczna, a nawet pewne wewnątrzkomórkowe cząsteczki sygnałowe (Wu i wsp., 2009; Hahn i Kuhlman, 2010). Ostatecznie możliwe jest rozszerzenie tych możliwości na optogenetyczną regulację aktywności transkrypcyjnej. Podobnie, narzędzia optogenetyczne umożliwiają po raz pierwszy zbadanie wpływu określonych danych wejściowych na prążkowie i określenie, czy takie dane wpływają w selektywny sposób na D₁+ vs. D₂+ MSN (Higley i Sabatini, 2010). Zdolność do kontrolowania takich sygnałów i właściwości molekularnych z dużą rozdzielczością czasową pozwoli na podjęcie głównych kroków w kierunku bardziej kompleksowego zrozumienia dwóch podtypów MSN i innych podtypów komórek w NAc i dStr, w pośredniczeniu przebiegu czasowego i różnych faz leku uzależnienie.

Oświadczenie o konflikcie interesów

Autorzy oświadczają, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Referencje