Proc Natl Acad Sci US A. Apr 29, 2014; 111 (17): 6455 – 6460.
Opublikowany online Apr 15, 2014. doi: 10.1073 / pnas.1404323111
PMCID: PMC4036004
Neuroscience
Ten artykuł został cytowany przez inne artykuły w PMC.
Znaczenie
Neurony dopaminowe (DA) w brzusznym obszarze nakrywkowym (VTA) reagują na bodźce awersyjne głównie przez przejściowe wyciszenie. Nie jest jasne, czy ta reakcja bezpośrednio wywołuje reakcje awersyjne u myszy zachowujących się. Przeanalizowaliśmy to pytanie przez optogenetyczną kontrolę neuronów DA w VTA i stwierdziliśmy, że inaktywacja neuronów DA skutkowała awersyjną reakcją i uczeniem się. Uważa się, że jądro półleżące (NAc), główne jądra wyjściowe neuronów VTA DA, jest odpowiedzialne za tę odpowiedź, więc zbadaliśmy, które z podstawowych szlaków w NAc były krytyczne dla tego zachowania, stosując knockdown receptora D1 lub D2, i odkrył, że szlak specyficzny dla receptora D2 był kluczowy dla tego zachowania.
Abstrakcyjny
Transmisja dopaminy (DA) z brzusznego obszaru nakrywkowego (VTA) ma kluczowe znaczenie dla kontrolowania zarówno zachowań nagradzających, jak i awersyjnych. Przejściowe wyciszanie neuronów DA jest jedną z odpowiedzi na bodźce awersyjne, ale jej konsekwencje i mechanizmy neuronalne dotyczące awersyjnych reakcji i uczenia się w dużej mierze pozostały nieuchwytne. Tutaj, donosimy, że optogenetyczna inaktywacja neuronów VTA DA natychmiast obniża poziomy DA i indukuje regulację w górę aktywności neuronalnej w jądrze półleżącym (NAc) zgodnie z oceną wyrażenia Fos. Tjego optogenetyczne tłumienie odpalania neuronów DA natychmiast wywołało awersyjne reakcje na wcześniej preferowany ciemny pokój i doprowadziło do awersyjnego uczenia się w kierunku optogenetycznie uwarunkowanego miejsca. Co ważne, niechęć do tego miejsca została zniesiona przez nokaut receptorów dopaminy D2, ale nie przez receptory D1 w NAc. Wyciszanie neuronów DA w VTA było zatem niezbędne do wywołania odpowiedzi awersyjnych i uczenia się przez receptory dopaminy D2 w NAc.
Mezolimbiczny układ dopaminergiczny odgrywa nie tylko kluczową rolę w szerokim zakresie motywacji i uczenia się (1-3), ale jego dysfunkcja jest również związana z ciężkimi zaburzeniami neuropsychiatrycznymi, czego przykładem jest choroba Parkinsona, schizofrenia i uzależnienie od narkotyków. Neurony dopaminowe (DA) w brzusznym obszarze nakrywkowym (VTA) reagują na bodźce nagradzające poprzez strzelanie fazowe, a główną funkcją tego strzelania jest teoria kodowania „błędu przewidywania nagrody”, różnicy wartości między przewidywaną nagrodą a rzeczywista nagroda (4). W przeciwieństwie do odpowiedzi na bodźce nagradzające, ich reakcje na bodźce awersyjne są dalekie od homologicznych; tj. niektóre neurony DA są aktywowane w odpowiedzi na bodźce awersyjne, podczas gdy większość innych reaguje przejściowo tłumiąc swoje odpalenia (5-9). Ostatnie badania wykazały, że aktywacja neuronów GABAergicznych i wynikająca z nich inaktywacja neuronów DA hamują konsumpcję nagrody i wywołują awersyjną reakcję (10, 11). Jednak w dużej mierze nie udało się ustalić, które mechanizmy w obwodach neuronowych są niezbędne do uzyskania awersyjnego uczenia się po inaktywacji neuronów DA w VTA i jak kontrolowane są reakcje behawioralne w kierunku tłumienia konsumpcji nagrody i wywoływania zachowań awersyjnych.
Zgromadzone dowody ujawniły, że uczenie się motywacyjne i poznawcze w odpowiedzi na pozytywne i negatywne bodźce jest w dużym stopniu regulowane przez obwody nerwowe, w tym zwoje podstawy (12), które otrzymują dużą ilość projekcji dopaminergicznej z śródmózgowia. W prążkowiu dwa podstawowe obwody nerwowe składają się z określonych średnich kolczastych neuronów (MSN), z których każdy wyraża odmienny typ receptora DA (13).
- Jeden obwód to ścieżka bezpośrednia, składająca się z MSN bezpośrednio rzutujących na jądra wyjściowe jąder podstawy, istoty czarnej siateczki siateczkowej (SNr) i głównie wyrażającej receptory dopaminy D1 (D1R).
- Drugim jest szlak pośredni, składający się z MSN, które projektują pośrednio przez globus pallidus do SNr i przede wszystkim wyrażają receptory dopaminy D2 (D2R).
Sygnały DA z śródmózgowia dynamicznie modulują te dwie równoległe ścieżki w odwrotny sposób za pomocą D1R i D2R, a ta modulacja ma ułatwić uczenie się motywacyjne (3, 14).
- Jeśli chodzi o bodźce nagradzające, uważa się, że zwiększone poziomy DA indukowane przez nagradzające sygnały aktywują D1R, a zatem głównie ułatwiają bezpośredni szlak w jądrze półleżącym (NAc).
- Z drugiej strony, tłumienie wypalania neuronów DA w odpowiedzi na bodźce awersyjne zmniejsza poziomy DA w NAc; i ta reakcja ma szczególnie promować transmisję sygnału w pośredniej ścieżce przez aktywowane D2R.
Chociaż badania z wykorzystaniem strategii farmakologicznych i metody odwracalnego blokowania neurotransmisji (RNB) wsparły ten mechanizm regulacji w NAc (15, 16) pozostaje nieznane, czy tłumienie wystrzeliwania neuronów DA jest wystarczające do promowania aktywności szlaku pośredniego, a następnie wywołania zachowania unikowego. W niniejszym badaniu zajęliśmy się tą kwestią przez selektywną dezaktywację neuronów DA w VTA przez optogenetyczne manipulowanie hiperpolaryzującym białkiem Arch (17) i wyraźnie wykazał, że tłumienie neuronów DA w VTA następnie obniżyło poziomy DA w NAc i wywołało reakcję awersyjną i uczenie się. Ponadto zbadaliśmy mechanizmy regulacji tej reakcji i ujawniliśmy, że ta reakcja awersyjna była szczególnie kontrolowana przez D2R w NAc.
Efekt
Optogenetyczna inaktywacja bloków neuronów DA Preferencje ciemnego pokoju.
Aby selektywnie inaktywować wypalanie neuronów DA, wstrzyknęliśmy indukowalny przez Cre konstrukt wirusowy związany z adenowirusem, kodujący Arch-eGFP [odwrócona otwarta ramka odczytu (DIO) -Arch] z podwójnym przepływem AAV (17) jednostronnie do VTA dorosłych myszy hydroksylazy tyrozynowej (TH) -Cre (18) i rodzeństwo typu dzikiego (WT) i umieściło światłowód powyżej VTA (Rys. S1 A i C). Dwa tygodnie po zabiegu Arch-eGFP został ograniczony w VTA (Rys. S1B). Zbadaliśmy hiperpolaryzujący efekt białka Arch przez zapis elektrofizjologiczny i zmierzono efekt stymulacji optycznej myszy VTA TH-Cre, którym wstrzyknięto AAV-DIO-Arch. Zapis elektrofizjologiczny in vivo z VTA znieczulonych myszy TH-Cre ujawnił, że stymulacja optyczna przypuszczalnych neuronów DA hamuje ich wypalanie (Rys. S2), wskazując, że stymulacja optyczna wystarczająco hiperpolaryzowała potencjał błonowy komórek DA wyrażających Arch, a tym samym hamowała ich spontaniczne odpalanie.
Używając tych myszy, zbadaliśmy następnie, czy optyczna inaktywacja neuronów DA w VTA może służyć jako awersyjny sygnał do uczenia się behawioralnego. Myszy mają wrodzoną skłonność do preferowania ciemnego środowiska (19). Zaprojektowaliśmy aparat behawioralny, w którym myszy mogą swobodnie eksplorować ciemny pokój i otwierać jasną przestrzeń (Rys. 1A). Po przyzwyczajeniu myszy WT pozostały preferencyjnie w ciemnym pokoju z lub bez stymulacji optycznej w ciemnym pokoju (Rys. S1D), zapewniając, że sama stymulacja optyczna nie miała wpływu na ich zachowanie preferujące ciemne pomieszczenie. Zaplanowaliśmy eksperyment behawioralny zwierząt, aby przetestować wpływ optycznej inaktywacji neuronów DA na ich zachowanie (Rys. S1E). Po przyzwyczajeniu i wstępnym badaniu myszy uwarunkowano optycznie stymulując neurony DA w VTA, gdy pozostały w ciemnym pokoju. Nawet podczas pierwszej kondycji 5 myszy TH-Cre pozostawały poza preferowanym wcześniej ciemnym pokojem i przez cały czas unikały ciemnego pomieszczenia (Rys. 1B). Myszy TH-Cre nie odwróciły swojego unikania przed ciemnym pokojem, mimo że nie otrzymały żadnej stymulacji optycznej podczas posttestu (Rys. 1C). Dane te wskazują, że hiperpolaryzacja neuronów DA nie tylko wywoływała przejściowe zachowanie awersyjne, ale również służyła jako sygnał do awersyjnego uczenia się w ciemnym pokoju, a także wykazała, że inaktywacja neuronów DA odgrywała przyczynową rolę zarówno w przejściowym zachowaniu awersyjnym, jak iw przedłużającym się uczeniu awersyjnym.
Optogenetyczne obniżenie poziomów DA w NAc.
Następnie zbadaliśmy, czy inaktywacja neuronów DA w VTA faktycznie zmodyfikowała stężenie DA w jego głównym regionie docelowym, NAc. Zmierzyliśmy poziomy DA w NAc za pomocą szybkiej woltamperometrii cyklicznej (FSCV) u znieczulonych myszy TH-Cre, którym wstrzyknięto AAV-DIO-Arch do ich VTA. Poziomy DA w NAc były szybko podwyższane przez stymulację elektryczną VTA, a wywołane uwalnianie DA było znacznie zmniejszone przez jednoczesną stymulację optyczną VTA (Rys. S3). Następnie przetestowaliśmy, czy stymulacja optyczna VTA może zmniejszyć toniczny poziom DA w NAc. W tych samych ustawieniach eksperymentalnych zaobserwowaliśmy, że poziom DA w NAc został przejściowo zmniejszony przez 20 s optycznej stymulacji VTA (Rys. 2), co jest zgodne z raportowaną reakcją FSCV na bodźce awersyjne (20). Dane te pokazują, że stymulacja optyczna VTA była wystarczająco skuteczna, aby inaktywować neurony VTA DA i zmniejszyć poziom DA w NAc podczas eksperymentu behawioralnego.
Regulacja w górę ekspresji genów Fos przez optyczną inaktywację neuronów DA w VTA.
Zmiana behawioralna spowodowana uwarunkowaną inaktywacją neuronów DA w VTA sugerowała, że stymulacja optyczna bezpośrednio zmieniała aktywność neuronalną i powodowała zmianę wydajności behawioralnej. Następnie zbadaliśmy regiony, w których aktywność neuronalna została podniesiona przez uwarunkowaną inaktywację neuronów DA, badając ekspresję Fos, bezpośredniego wczesnego genu. Wkrótce po przeprowadzeniu kondycjonowania w teście ciemności, myszy szybko przetworzono w celu określenia ilości ekspresji Fos za pomocą ilościowej analizy hybrydyzacji in situ (Rys. 3 i Rys. S4). NAc, region, który otrzymuje dużą ilość projekcji dopaminergicznych z VTA, wykazał znacznie zwiększoną ilość ekspresji Fos w myszach TH-Cre (Rys. 3). Ta regulacja w górę została również wykryta w kontralateralnej stronie stymulacji optycznej, która rzekomo była spowodowana niewielką ilością infekcji wirusowej na tę stronę. Jednak regulacja w górę była znacznie wyższa po stronie ipsilateralnej niż po przeciwnej stronie stymulacji optycznej, co sugeruje, że optyczna inaktywacja neuronów DA bezpośrednio regulowała aktywność neuronową NAc. Zwiększoną ekspresję Fos obserwowano również w innych obszarach mózgu, w tym w przegrodzie, obszarach okołokomorowych prążkowia, ciała podstawno-bocznego ciała migdałowatego (BLA) i bocznym podwzgórzu, ale nie w bocznej habenuli lub przyśrodkowej korze przedczołowej (mPFC; Rys. S4). Wyniki te wskazują, że regiony aktywowane przez optyczną inaktywację neuronów DA nie były ograniczone do bezpośrednich docelowych regionów neuronów VTA DA, ale raczej obejmowały regiony, które mogłyby być pośrednio aktywowane w sposób zależny od obwodu nerwowego. Ta obserwacja sugeruje, że optyczna inaktywacja neuronów DA modyfikowała aktywność neuronów w całym obwodzie i mogła nie tylko wywołać reakcję awersyjną, ale także wywołać kilka innych funkcji mózgu, takich jak lęk, strach i reakcje stresowe (21).
Sygnalizacja DA przez D2R jest krytyczna dla optogenetycznie indukowanej awersji miejsca.
Większość sygnałów dopaminergicznych z VTA jest przesyłana do MSN w receptorach NAc przez DA, D1R i D2R. D1R jest prawie wyłącznie wyrażany w substancji P (kodowanej przez gen Tac1) - eksprymującej MSN, a D2R jest wyrażany głównie w MSN-enkefalina (kodowana przez gen Penk); każdy typ MSN stanowi odpowiednio bezpośrednie i pośrednie ścieżki w NAc (3). Ponieważ powinowactwo do DA jest znacznie wyższe dla D2R (kolejność nM) niż dla D1R (kolejność µM) (22, 23) uważa się, że zmniejszenie poziomów DA powoduje inaktywację Gisprzężony D2R, ale nie ma znaczącego wpływu na D1R (3, 24), tym samym regulując aktywność neuronalną szczególnie w szlaku pośrednim. Ponadto aktywacja Fos była bardziej widoczna w komórkach wyrażających Penk lub Drd2 (D2R) niż w komórkach wyrażających Tac1- lub Drd1a (D1R) (Rys. S5). Opierając się na tych obserwacjach, postawiliśmy hipotezę, że sygnalizacja DA przez D2R może odgrywać główną rolę w obserwowanym warunkowaniu awersyjnym.
Aby przetestować tę hipotezę, przeprowadziliśmy trzykomorowy test warunkowej awersji miejsca (CPA) (Rys. S6). Przygotowaliśmy aparat behawioralny zawierający dwie komory o praktycznie identycznych okolicznościach i jeden mały korytarz. Ten obiektywny warunek środowiskowy w teście CPA umożliwił nam dalsze zbadanie, czy inaktywacja neuronów VTA DA jest zdolna do wywołania awersyjnej reakcji i uczenia się, oprócz blokowania preferencji ciemnego pokoju. Kiedy pozwolono zwierzętom na swobodne poruszanie się po całym aparacie, większość z nich pozostała w dwóch komorach bez typowej różnicy behawioralnej podczas testu wstępnego. Kondycjonowanie optyczne przeprowadzono następnie przez sparowanie stymulacji optycznej z jedną stałą komorą. Nawet gdy jedna z komór została użyta do kondycjonowania, myszy TH-Cre uporczywie i znacząco unikały przebywania w komorze kondycjonowanej optycznie podczas kondycjonowania i po zakończeniu testu (Rys. S6 B-E). Analiza statystyczna potwierdziła znaczące skrócenie czasu przebywania myszy TH-Cre w komorze kondycjonowanej optycznie w teście posttest w porównaniu z czasem przebywania myszy WT (Rys. S6F).
Następnie próbowaliśmy określić podtypy receptora DA biorące udział w tym awersyjnym zachowaniu poprzez specyficzne tłumienie każdego z receptorów DA w NAc (Rys. 4 i Rys. S7). Zaprojektowaliśmy i zwalidowaliśmy wektory lentiwirusowe zawierające krótkie RNA o strukturze spinki do włosów (shRNA) specyficzne dla każdego receptora DA z konstytutywną ekspresją mCherry. Trzy tygodnie po wstrzyknięciu lentiwirusa do NAc, silna ekspresja mCherry została zlokalizowana w NAc (Rys. 4B). Skuteczne knockdown ekspresji mRNA każdego receptora potwierdzono przez ilościową analizę PCR w czasie rzeczywistym (Fig. S7A). Pomiar poziomów białka metodą Western blot wykazał również, że wstrzyknięcie każdego z lentiwirusów selektywnie redukowało jego docelowy produkt białkowy bez wpływu na ekspresję innego podtypu receptora DA (Rys. 4C i Rys. S7 B-G). Lentiwirusy eksprymujące shD1R i shD2R zmniejszyły poziom docelowego białka odpowiednio do 46.2 ± 1.1% i 38.4 ± 4.9%, w porównaniu z poziomem dla wirusa kontrolnego (Rys. 4C). Wyniki te potwierdziły, że wektory lentiwirusowe eksprymujące shRNA specyficzne dla D1R i D2R selektywnie i wystarczająco tłumiły swoje docelowe RNA i regulowały w dół ilość odpowiednich produktów białkowych. Potwierdziliśmy również, że ekspresja mCherry za pośrednictwem wirusa nie została wykryta w VTA, wykluczając możliwość, że shRNA, w którym pośredniczy lentiwirus, bezpośrednio wpływa na VTA.
Używając tych lentiwirusów zawierających shRNA, przetestowaliśmy, który typ receptora DA był odpowiedzialny za zachowanie awersyjne indukowane przez optogenetyczną inaktywację neuronów DA. Wstrzyknęliśmy lentiwirus lub lentiwirus kontrolny zawierający shRNA do obustronnego NAc razem z AAV-DIO-Arch do lewego VTA myszy TH-Cre. Światłowód został również wstawiony powyżej VTA (Rys. 4A). Gdy trzykomorowy test CPA został przeprowadzony w trzy tygodnie po zabiegu, myszy TH-Cre, którym wstrzyknięto lenti: shD1R-mCherry, nadal wykazywały wyraźne CPA względem komory sparowanej optycznie, porównywalnej z tą dla myszy TH-Cre, którym wstrzyknięto kontrola lentiwirusa (lenti: mCherry). Natomiast myszy TH-Cre, którym wstrzyknięto lenti: shD2R-mCherry, nie wykazały wyraźnego CPA podczas kondycjonowania (Rys. 4D). Ekskluzywny deficyt uczenia się myszy TH-Cre, którym wstrzyknięto lenti: shD2R-mCherry, został dodatkowo potwierdzony przez analizę awersyjnego uczenia się na posttest (Rys. 4E). Wyniki te pokazują, że zachowanie awersyjne do miejsca uwarunkowanego inaktywacją neuronu DA było specyficznie wywoływane przez D2R, a nie przez D1R, w NAc.
Dyskusja
W prążkowiu badania wykazały, że aktywacja Gssprzężony D1R ułatwia jego strzelanie, podczas gdy aktywacja Gisprzężony D2R skutkuje zmniejszoną wydajnością zapłonu (25). Aczgodnie ze specyficznością ekspresji receptora DA, strzelanie fazowe neuronów DA aktywuje głównie bezpośrednią ścieżkę przez D1R, podczas gdy przejściowe zmniejszenie wypalania neuronów DA głównie promuje kompetencję szlaku pośredniego przez D2R (3, 26). W oparciu o ten mechanizm regulacji zaproponowano, że wyciszanie neuronów DA w odpowiedzi na bodźce awersyjne jest głównie przetwarzane przez szlak pośredni i powoduje zachowania awersyjne (3). Ostatnie badania wykazały, że blokada synaptycznej transmisji szlaku pośredniego upośledza nabywanie awersyjnego zachowania wywołanego przez porażenie prądem (15) i że to upośledzenie jest spowodowane zahamowaniem transmisji sygnału za pośrednictwem D2R (16). jaPonadto, optogenetyczna regulacja MSN wyrażających D2R w szlaku pośrednim wywołuje unikanie behawioralne (27). Jednakże, ponieważ neurony DA wykazują zarówno wzmocnione, jak i stłumione wypalania w odpowiedzi na bodźce awersyjne i ponieważ inne informacje sensoryczne związane z wstrząsem są jednocześnie przetwarzane w mózgu, nadal pozostaje do wyjaśnienia, czy wyciszenie neuronów DA może bezpośrednio wywołać awersyjną reakcję i uczenie się, i czy ta reakcja jest regulowana przez MSN wyrażające D2R w szlaku pośrednim.
W tym badaniu wykorzystaliśmy optogenetyczną kontrolę wypalania neuronów DA w dwóch testach behawioralnych: test preferencji ciemnego pomieszczenia i test trójkomorowego CPA. Nasza manipulacja optogenetyczna wykazała skuteczną supresję wypalania neuronów DA w VTA i zmniejszenie poziomów DA w NAc. Nasza precyzyjna optogenetyczna inaktywacja neuronów DA działa tylko w okresie, w którym zwierzęta pozostały w klimatyzowanej komorze, wyraźnie wywołała awersyjną reakcję i uczenie się, demonstrując, że przejściowe wyciszanie DA bezpośrednio powodowało pasywne zachowanie unikowe. Co więcej, to badanie wyjaśniło, że przetwarzanie sygnału za pośrednictwem D2R jest kluczowym wyznacznikiem indukcji tej awersyjnej reakcji i uczenia się.
Chociaż nasze dane wykazały, że D1R nie wywarł żadnego wpływu na eksperymenty behawioralne mające na celu wywołanie CPA, w kilku badaniach udokumentowano, że strzelanie fazowe neuronów DA jest wymagane do reakcji strachu i uczenia się awersyjnego (28, 29). Ta różnica wynika z ustawienia eksperymentalnego; tj. nasze podejście optogeniczne wykluczyło możliwość sygnalizacji przez aktywowane neurony DA w celu wywołania zachowania awersyjnego, wskazując, że inaktywacja neuronów DA była wystarczająca do wywołania awersyjnego zachowania i uczenia się. Funkcja i przetwarzanie sygnału aktywowanego wystrzeliwania DA wywołane przez bodźce awersyjne miałyby odmienny wpływ na zachowania awersyjne od badanych tutaj i wymagają wyjaśnienia w przyszłości.
Neurony DA rzutują również na różne inne regiony, w tym mPFC, ciało migdałowate i hipokamp. Ostatnie badania wskazały na to optogenetyczna aktywacja bocznych neuronów habenula rzutujących na neurony DA w VTA jest zdolna do indukowania zachowań awersyjnych, a te neurony DA głównie i szczególnie celują w mPFC (30), chociaż ich uwarunkowanie optogenetyczne było inne niż w naszym obecnym badaniu, ponieważ ich stymulacja optogenetyczna została przedłużona na całą sesję kondycjonującą. Ponieważ doniesiono, że dopaminergiczny wkład do mPFC jest aktywowany nie tylko przez bodźce awersyjne, ale także przez chroniczny stres (31, 32) możliwe jest, że ich ciągła aktywacja neuronów DA rzutujących mPFC byłaby postrzegana jako sygnał z wysoce stresującego środowiska; w wyniku nagromadzenia stresującego warunkowania zwierzęta wykazywałyby niechęć do klimatyzowanej komory. Przeciwnie, hamowaliśmy wypalanie neuronów DA tylko wtedy, gdy zwierzęta pozostawały w klimatyzowanej komorze. Wyniki naszych eksperymentów behawioralnych z zastosowaniem warunkowania dopasowanego do czasu wskazywały, że nagłe tłumienie sygnału DA będzie postrzegane jako nagły awersyjny sygnał wejściowy, który spowodował ich szybką reakcję awersyjną.
Neurony DA również rzutują na ciało migdałowate, region, który w dużej mierze przyczynia się do reakcji strachu. Rzeczywiście, sygnalizacja DA do ciała migdałowatego jest zaangażowana w reakcję strachu i nabywanie pamięci strachu (33, 34). W naszym badaniu oznaczenie neuronów DA w VTA zidentyfikowało zestaw neuronów DA rzutujących na BLA, ale zakres tych projekcji był znacznie niższy niż projekcja dla NAc. Chociaż nie udało nam się wykluczyć subtelnego wpływu sygnalizacji DA na rzut oka na nasze obserwowane zachowanie awersyjne, głównym efektem naszej optogenetycznej inaktywacji neuronów DA powinno być działanie NAc, ponieważ nasze eksperymenty ze specyficznym knockdownem D2R w NAc drastycznie zmalały zachowanie awersyjne. Przyszłe badania dotyczące specyficznej dla celu sygnalizacji DA są wymagane, aby wyjaśnić wpływ modyfikacji obwodowych neuronów DA na bodźce awersyjne i warunkowanie strachowe.
Materiały i Metody
Przedmioty.
Hydroksylaza tyrozynowa :: IRES-Cre (TH-Cre) myszy knock-in (EM: 00254) (18) zostały uzyskane z Europejskiego Archiwum Mutantów Myszy. Wszystkie zwierzęta doświadczalne były krzyżowane wstecznie ze szczepem C57BL / 6J dla więcej niż pokoleń 10. Myszy kojarzono z myszami C57BL / 6J WT i trzymano w standardowym ciemnym cyklu 12-h light / 12-h i podawano jedzenie i wodę ad libitum. Cre+ i Cre- do eksperymentów użyto myszy z tych samych miotów (3 – 6 mo of age). Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez komitet ds. Zwierząt Instytutu Bioscience w Osace zgodnie z wytycznymi eksperymentów na zwierzętach.
Testy behawioralne.
Podczas wszystkich testów behawioralnych myszy były połączone światłowodem i mogły poruszać się po całym aparacie. Ruch myszy był monitorowany, aby mogły poruszać się bez przeszkód, nawet gdy były połączone światłowodem na głowach. Pozycję myszy wykryto za pomocą kamery wideo zawieszonej nad aparatem behawioralnym i przeanalizowano za pomocą specjalnego programu wykorzystującego oprogramowanie Labview.
Test preferencji w ciemnych pomieszczeniach.
Wykonany na zamówienie aparat behawioralny wykorzystany w teście składał się z ciemnego pomieszczenia (15 × 9.5 cm) i jasnej otwartej przestrzeni (15 × 11 cm). Ciemny pokój miał ściany, podłogę i dach, które były w kolorze czarnym i miały wejście (długość 4.5) do otwartej jasnej przestrzeni. Otwarta, jasna przestrzeń miała kształt elipsy i miała podłogę z metalowej siatki i przezroczyste ściany bez dachu. Przed testem wszystkie myszy przyzwyczajano do 10 min w aparacie. Test składał się z trzech sesji: we wczesnej połowie dnia 1 (test wstępny: 5 min), myszy mogły badać cały aparat. Od późnej połowy dnia 1 do dnia 4 (kondycjonowanie: min. 35) myszy otrzymywały stymulację optyczną, gdy pozostawały w ciemnym pokoju. W dniu 5 przetestowano preferencje ciemnego pomieszczenia bez stymulacji optycznej (posttest: 5 min; Rys. S1E).
Trzykomorowy test CPA.
Zastosowane w teście wykonane na zamówienie trzykomorowe klimatyzowane urządzenie preferencji miejsca / CPA składało się z dwóch komór (10 × 17 cm) i korytarza łączącego. Test składał się z trzech sesji. Dzień 1 (test wstępny: 15 min): Myszy mogły swobodnie badać cały aparat. Myszy, które pozostawały 1.5 razy dłużej w jednej komorze niż w drugiej były wyłączone z testu. Dni 2 i 3 (kondycjonowanie: min. 15): Myszy otrzymały stymulację optyczną, gdy pozostały w komorze ze światłem. Wybór komory oświetlonej światłem został zrównoważony. Dzień 4 (posttest: 15 min): Test przeprowadzono w takich samych warunkach jak w teście wstępnym (Rys. S6A).
W sesji kondycjonowania stymulacja optyczna została zatrzymana dla 30 s, gdy myszy nieprzerwanie przebywały nad 30 w ciemnym pokoju lub komorze ze światłem, aby uniknąć przegrzania. We wszystkich testach behawioralnych moc lasera była kontrolowana tak, aby była w przybliżeniu 5 mW na końcu światłowodu.
Woltamperometr cykliczny In Vivo.
Eksperymenty FSCV przeprowadzono stosując metodę opisaną w poprzednich badaniach (35-37). Myszy znieczulono mieszaniną ketaminy / ksylazyny, jak opisano w Materiały i metody SI i umieszczone w ramce stereotaktycznej. Światłowód używany do stymulacji neuronów DA wyrażających łuk znajdował się w pobliżu elektrody stymulującej. Elektrodę stymulującą umieszczono następnie w VTA (z bregma: przednio-tylna, -3.2 mm; boczna, 0.5 mm; i grzbietowo-brzuszna, 3.5 mm) i obniżono w odstępach 0.25-mm. Mikroelektrodę z włókna węglowego (długość 300 µm) do zapisu woltamperometrycznego obniżono do NAc (z bregma: przednio-tylna, 1.0 mm; boczna, 1.0 mm; i grzbietowo-brzuszna, 3.5 mm). Pomiary woltamperometryczne wykonano w każdym 100 ms przez zastosowanie fali trójkątnej (−0.4 V do + 1.3 V do −0.4 V względem Ag / AgCl, przy 400 V / s) do mikroelektrody z włókna węglowego. Do izolacji fali i wzmocnienia prądu zastosowano niestandardowy potencjostat. Uwalnianie DA było wywoływane przez elektryczną stymulację neuronów DA za pomocą stymulacji impulsowej 24 (100 µA, czas trwania 5 ms, 30 Hz). Optyczną stymulację neuronów DA (532 nm, ∼5 mW moc na końcówce włókna) zastosowano dla 10 s startujących 5 przed rozpoczęciem stymulacji elektrycznej. Mikroelektrody z włókna węglowego skalibrowano w roztworze o znanych stężeniach DA (0.2 µM, 0.5 µM i 1.0 µM). Wszystkie dane woltamperometryczne analizowano za pomocą niestandardowych programów przy użyciu oprogramowania Labview i Matlab. Zmniejszenie poziomów DA za pomocą stymulacji optycznej rozwiązano za pomocą analizy głównych składowych, stosując wzory fal DA otrzymane z elektrycznych stymulacji VTA w celu oddzielenia sygnałów dopaminy (35, 36).
Analiza statystyczna.
Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą GraphPad PRISM 5.0 (oprogramowanie GraphPad). Dane analizowano za pomocą powtarzanych pomiarów ANOVA (Ryc. 1B, , 4D,4D, Rys. S6 D i E) lub jednokierunkowa ANOVA (Ryc. 1C, , 3D,3D, 4 C i E, Figi S4 K-M, S6F, S7A), a analizy post hoc wykonano za pomocą testu Bonferroniego. Wszystkie znaki / kolumny i słupki reprezentowały odpowiednio średnią i ± SEM.
Inne procedury doświadczalne, w tym przygotowanie wirusa i wstrzyknięcie, zapis elektrofizjologiczny i analiza immunohistochemiczna i mRNA są szczegółowo opisane w Materiały i metody SI.
Podziękowanie
Dziękujemy E. Boydenowi za konstrukcje Arch, R. Matsui za doradztwo techniczne w produkcji i oczyszczaniu lentiwirusów oraz Y. Hayashi za doradztwo techniczne w programowaniu analizy danych. Praca ta była wspierana przez Research Grants-in-Aid 22220005 (do SN), 23120011 (do SY i SN), 24700339 (do TD) i 25871080 (do SY) z Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologia Japonii i dotacja od Takeda Science Foundation (do SN).
Przypisy
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Ten artykuł zawiera informacje pomocnicze online na stronie www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1404323111/-/DCDodatkowe.
Referencje
;
