Proc Natl Acad Sci US A. Apr 29, 2014; 111 (17): 6455 – 6460.
Opublikowano w Internecie 15 kwietnia 2014 r. doi: 10.1073/pnas.1404323111
PMCID: PMC4036004
Neuroscience
Teruko Danjo , Kenji Yoshimi , b Kazuo Funabiki , Satoshi Yawata , a i Shigetada Nakanishi a , 1
Artykuł ten był cytowany w innych artykułach w PMC.
Znaczenie
Neurony dopaminowe (DA) w brzusznym obszarze nakrywkowym (VTA) reagują na bodźce awersyjne głównie przez przejściowe wyciszenie. Nie jest jasne, czy ta reakcja bezpośrednio wywołuje reakcje awersyjne u myszy zachowujących się. Przeanalizowaliśmy to pytanie przez optogenetyczną kontrolę neuronów DA w VTA i stwierdziliśmy, że inaktywacja neuronów DA skutkowała awersyjną reakcją i uczeniem się. Uważa się, że jądro półleżące (NAc), główne jądra wyjściowe neuronów VTA DA, jest odpowiedzialne za tę odpowiedź, więc zbadaliśmy, które z podstawowych szlaków w NAc były krytyczne dla tego zachowania, stosując knockdown receptora D1 lub D2, i odkrył, że szlak specyficzny dla receptora D2 był kluczowy dla tego zachowania.
Abstrakcja
Przekaźnictwo dopaminy (DA) z brzusznego obszaru nakrywki (VTA) jest krytyczne dla kontrolowania zarówno zachowań nagradzających, jak i awersyjnych. Przejściowe wyciszenie neuronów DA jest jedną z odpowiedzi na bodźce awersyjne, ale jego konsekwencje i mechanizmy neuronalne dotyczące reakcji awersyjnych i uczenia się w dużej mierze pozostały nieuchwytne . W niniejszym artykule donosimy, że optogenetyczna inaktywacja neuronów DA VTA natychmiast obniżyła poziomy DA i wywołała regulację w górę aktywności neuronalnej w jądrze półleżącym (NAc ), co oceniono na podstawie ekspresji Fos. To optogenetyczne tłumienie wyładowań neuronów DA natychmiast wywołało reakcje awersyjne na wcześniej preferowane ciemne pomieszczenie i doprowadziło do awersyjnego uczenia się w kierunku miejsca warunkowanego optogenetycznie. Co ważne, ta awersja do miejsca została zniesiona przez wyciszenie receptorów dopaminowych D2, ale nie przez receptory D1 w NAc . Wyciszenie neuronów DA w VTA okazało się zatem niezbędne do wywołania reakcji awersyjnych i uczenia się za pośrednictwem receptorów dopaminy D2 w NAc.
Mezolimbiczny układ dopaminergiczny nie tylko odgrywa kluczową rolę w szerokim zakresie motywacji i uczenia się ( 1 – 3 ), ale jego dysfunkcja została również powiązana z ciężkimi zaburzeniami neuropsychiatrycznymi, jak na przykład choroba Parkinsona, schizofrenia i uzależnienie od narkotyków. Neurony dopaminowe (DA) w brzusznym obszarze nakrywki (VTA) reagują na bodźce nagradzające fazowym wyładowaniem, a główną funkcją tego wyładowania jest teoretyzowanie kodowania „błędu przewidywania nagrody”, różnicy w wartości między przewidywaną nagrodą a rzeczywistą nagrodą ( 4 ). W przeciwieństwie do reakcji na bodźce nagradzające, ich reakcje na bodźce awersyjne są dalekie od homologicznych; tj. niektóre neurony DA są aktywowane w odpowiedzi na bodźce awersyjne, podczas gdy większość innych reaguje przejściowym tłumieniem swoich wyładowań ( 5 – 9 ). W rzeczywistości, ostatnie badania wykazały, że optogenetyczna aktywacja neuronów GABA-ergicznych i wynikająca z niej inaktywacja neuronów DA hamują konsumpcję nagrody i indukują reakcję awersyjną ( 10 , 11 ). Jednak w dużej mierze pozostaje nieuchwytne, które mechanizmy w obwodach neuronalnych są niezbędne do nabycia uczenia się awersyjnego po inaktywacji neuronów DA w VTA, ani w jaki sposób kontrolowane są reakcje behawioralne w kierunku tłumienia konsumpcji nagrody i indukowania zachowań awersyjnych.
Zgromadzone dowody ujawniły, że motywacyjne i poznawcze uczenie się w odpowiedzi na bodźce pozytywne i negatywne jest w dużej mierze regulowane przez obwody neuronalne, w tym jądra podstawy ( 12 ), które odbierają znaczną ilość projekcji dopaminergicznej ze śródmózgowia. W prążkowiu dwa podstawowe obwody neuronalne składają się z określonych średniej wielkości neuronów kolczastych (MSN), z których każdy ekspresjonuje odrębny typ receptora DA ( 13 ).
- Jeden obwód to ścieżka bezpośrednia, składająca się z MSN bezpośrednio rzutujących na jądra wyjściowe jąder podstawy, istoty czarnej siateczki siateczkowej (SNr) i głównie wyrażającej receptory dopaminy D1 (D1R).
- Drugim jest szlak pośredni, składający się z MSN, które projektują pośrednio przez globus pallidus do SNr i przede wszystkim wyrażają receptory dopaminy D2 (D2R).
Sygnały DA ze śródmózgowia dynamicznie modulują te dwie równoległe ścieżki w przeciwny sposób za pośrednictwem receptorów D1 i D2, a modulacja ta ma ułatwiać motywacyjne uczenie się ( 3 , 14 ).
- Jeśli chodzi o bodźce nagradzające, uważa się, że zwiększone poziomy DA indukowane przez nagradzające sygnały aktywują D1R, a zatem głównie ułatwiają bezpośredni szlak w jądrze półleżącym (NAc).
- Z drugiej strony, tłumienie wypalania neuronów DA w odpowiedzi na bodźce awersyjne zmniejsza poziomy DA w NAc; i ta reakcja ma szczególnie promować transmisję sygnału w pośredniej ścieżce przez aktywowane D2R.
Chociaż badania wykorzystujące strategie farmakologiczne i metodę odwracalnego blokowania neuroprzekaźnictwa (RNB) potwierdziły ten mechanizm regulacji w NAc ( 15 , 16 ), nie wiadomo było, czy tłumienie wyładowań neuronów DA jest wystarczające, aby promować aktywność drogi pośredniej i następnie wywołać zachowanie unikania. W niniejszym badaniu zajęliśmy się tym problemem, selektywnie inaktywując neurony DA w VTA przez optogenetyczną manipulację białkiem Arch hiperpolaryzującym błonę ( 17 ) i wyraźnie wykazaliśmy, że tłumienie neuronów DA w VTA następnie obniżyło poziomy DA w NAc i wywołało reakcję awersyjną i uczenie się. Ponadto zbadaliśmy mechanizmy regulacji tej reakcji i ujawniliśmy, że ta reakcja awersyjna była specyficznie kontrolowana przez D2R w NAc.
Efekty
Optogenetyczna inaktywacja bloków neuronów DA Preferencje ciemnego pokoju.
Aby selektywnie inaktywować wyładowania neuronów DA, wstrzyknęliśmy Cre-indukowany konstrukt wirusa adeno-stowarzyszonego kodujący Arch-eGFP [AAV-double-floxed inverted open reading frame (DIO)-Arch] ( 17 ) jednostronnie do VTA dorosłych myszy tyrozynowej hydroksylazy (TH)-Cre ( 18 ) i miotów dzikiego typu (WT) i umieściliśmy światłowód powyżej VTA ( Rys. S1 A i C ). Dwa tygodnie po zabiegu Arch-eGFP został wykryty w ograniczonym zakresie w VTA ( Rys. S1 B ). Przetestowaliśmy hiperpolaryzujący efekt białka Arch za pomocą elektrofizjologicznego zapisu i zmierzyliśmy efekt optycznej stymulacji VTA myszy TH-Cre, którym wstrzyknięto AAV-DIO-Arch. Rejestracje elektrofizjologiczne in vivo z VTA znieczulonych myszy TH-Cre wykazały, że optyczna stymulacja domniemanych neuronów DA zahamowała ich wyładowania ( ryc. S2 ), co wskazuje, że stymulacja optyczna wystarczająco hiperpolaryzowała potencjał błonowy komórek DA ekspresujących Arch, a tym samym zahamowała ich spontaniczne wyładowania.
Następnie, używając tych myszy, zbadaliśmy, czy optyczna inaktywacja neuronów DA w VTA może służyć jako sygnał awersyjny do uczenia się behawioralnego. Myszy posiadają wrodzoną tendencję do preferowania ciemnego środowiska ( 19 ). Zaprojektowaliśmy aparat behawioralny, w którym myszy mogły swobodnie eksplorować ciemny pokój i otwartą jasną przestrzeń ( Rys. 1A ) . Po habituacji myszy WT preferencyjnie pozostawały w ciemnym pokoju, z optyczną stymulacją lub bez niej ( Rys. S1D ) , zapewniając, że sama stymulacja optyczna nie miała wpływu na ich zachowanie preferujące ciemny pokój. Zaplanowaliśmy eksperyment behawioralny na zwierzętach, aby przetestować wpływ optycznej inaktywacji neuronów DA na ich zachowanie ( Rys. S1E ) . Po habituacji i teście wstępnym myszy warunkowano poprzez optyczną stymulację neuronów DA w VTA, gdy przebywały w ciemnym pokoju. Nawet podczas pierwszych 5 minut warunkowania myszy TH-Cre nie przebywały w uprzednio preferowanym ciemnym pomieszczeniu i sukcesywnie unikały ciemnego pomieszczenia przez cały okres warunkowania ( Rys. 1 B ). Myszy TH-Cre nie odwróciły swojej postawy unikania ciemnego pomieszczenia, mimo że nie otrzymały żadnej stymulacji optycznej podczas testu końcowego ( Rys. 1 C ). Dane te wskazują, że hiperpolaryzacja neuronów DA nie tylko indukowała przejściowe zachowanie awersyjne, ale także służyła jako sygnał do awersyjnego uczenia się w ciemnym pomieszczeniu i dowodzą również, że inaktywacja neuronów DA odegrała przyczynową rolę zarówno w przejściowym zachowaniu awersyjnym, jak i przedłużonym awersyjnym uczeniu się.
Optogenetyczne obniżenie poziomów DA w NAc.
Następnie zbadaliśmy, czy inaktywacja neuronów DA w VTA faktycznie modyfikowała stężenie DA w jej głównym regionie docelowym, NAc. Zmierzyliśmy poziomy DA w NAc za pomocą cyklicznej woltamperometrii szybkiego skanowania (FSCV) u znieczulonych myszy TH-Cre, którym wstrzyknięto AAV-DIO-Arch do VTA. Poziomy DA w NAc zostały natychmiast podniesione przez elektryczną stymulację VTA, a wywołane uwolnienie DA zostało znacząco zmniejszone przez jednoczesną optyczną stymulację VTA ( rys. S3 ). Następnie sprawdziliśmy, czy optyczna stymulacja VTA może zmniejszyć toniczny poziom DA w NAc. W tych samych warunkach eksperymentalnych zaobserwowaliśmy, że poziom DA w NAc został przejściowo zmniejszony przez 20 s optycznej stymulacji VTA ( rys. 2 ), co jest zgodne z opisaną reakcją FSCV na bodźce awersyjne ( 20 ). Dane te wykazują, że optyczna stymulacja VTA była wystarczająco skuteczna, aby dezaktywować neurony DA VTA i zmniejszyć poziom DA w NAc podczas eksperymentu behawioralnego.
Regulacja w górę ekspresji genów Fos przez optyczną inaktywację neuronów DA w VTA.
Zmiana zachowania spowodowana warunkową inaktywacją neuronów DA w VTA sugerowała, że stymulacja optyczna bezpośrednio zmieniała aktywność neuronalną i skutkowała zmianą w zachowaniu. Następnie zbadaliśmy obszary, w których aktywność neuronalna była podwyższona przez warunkową inaktywację neuronów DA, badając ekspresję Fos, genu wczesnego genu natychmiastowego. Wkrótce po przeprowadzeniu warunkowania w teście w ciemnym pomieszczeniu, myszy szybko poddano obróbce w celu określenia poziomu ekspresji Fos za pomocą ilościowej analizy hybrydyzacji in situ ( ryc. 3 i ryc. S4 ). NAc, region, który otrzymuje dużą ilość projekcji dopaminergicznych z VTA, wykazał znacząco zwiększoną ekspresję Fos u myszy TH-Cre ( ryc. 3 ). To zwiększenie ekspresji wykryto również po przeciwnej stronie stymulacji optycznej, co przypuszczalnie było spowodowane niewielką ilością infekcji wirusowej po tej stronie. Jednakże regulacja w górę była znacznie wyższa po stronie ipsilateralnej niż po stronie kontralateralnej stymulacji optycznej, co sugeruje, że optyczna inaktywacja neuronów DA bezpośrednio regulowała w górę aktywność neuronalną NAc. Zwiększoną ekspresję Fos obserwowano również w innych obszarach mózgu, w tym w przegrodzie, obszarach okołokomorowych prążkowia, jądrze migdałowatym boczno-podstawnym (BLA) i bocznym podwzgórzu, ale nie w bocznej habenuli ani środkowej korze przedczołowej (mPFC; ryc. S4 ). Wyniki te wskazują, że obszary aktywowane przez optyczną inaktywację neuronów DA nie były ograniczone do bezpośrednich obszarów docelowych neuronów DA VTA, ale raczej obejmowały obszary, które mogły być pośrednio aktywowane w sposób zależny od obwodu neuronalnego. Ta obserwacja sugeruje, że optyczna inaktywacja neuronów DA modyfikowała aktywność neuronalną w całym obwodzie i mogła nie tylko wywołać reakcję awersyjną, ale także uruchomić kilka innych funkcji mózgu, takich jak lęk, strach i reakcje na stres ( 21 ).
Sygnalizacja DA przez D2R jest krytyczna dla optogenetycznie indukowanej awersji miejsca.
Większość sygnałów dopaminergicznych z VTA jest przekazywana do MSN w NAc przez receptory DA, D1R i D2R. D1R jest prawie wyłącznie wyrażany w MSN wyrażających substancję P (kodowaną przez gen Tac1), a D2R jest głównie wyrażany w MSN wyrażających enkefalinę (kodowaną przez gen Penk); każdy typ MSN stanowi odpowiednio bezpośrednią i pośrednią ścieżkę w NAc ( 3 ). Ponieważ powinowactwo do DA jest znacznie wyższe dla D2R (rząd nM) niż dla D1R (rząd µM) ( 22 , 23 ), uważa się, że obniżenie poziomów DA powoduje inaktywację sprzężonego z Gi D2R, ale nie ma zauważalnego wpływu na D1R ( 3 , 24 ), tym samym zwiększając aktywność neuronalną, specyficznie w pośredniej ścieżce. Co więcej, aktywację Fos zaobserwowano wyraźniej w komórkach z ekspresją Penk lub Drd2 (D2R) niż w komórkach z ekspresją Tac1 lub Drd1a (D1R) ( ryc. S5 ). Na podstawie tych obserwacji postawiliśmy hipotezę, że sygnalizacja DA przez D2R może odgrywać istotną rolę w obserwowanym warunkowaniu awersyjnym.
Aby przetestować tę hipotezę, przeprowadziliśmy trójkomorowy test warunkowej awersji do miejsca (CPA) ( Ryc. S6 ). Przygotowaliśmy aparat behawioralny zawierający dwie komory o praktycznie identycznych okolicznościach i jednym małym korytarzu. Te obiektywne warunki środowiskowe w teście CPA pozwoliły nam na dalsze zbadanie, czy inaktywacja neuronów DA VTA jest zdolna do wywołania reakcji awersyjnej i uczenia się, oprócz blokowania preferencji ciemnego pomieszczenia. Gdy zwierzętom pozwolono swobodnie poruszać się po całym aparacie, większość z nich pozostawała w dwóch komorach bez typowych różnic w zachowaniu w teście wstępnym. Warunkowanie optyczne przeprowadzono następnie poprzez sparowanie stymulacji optycznej z jedną stałą komorą. Nawet gdy do warunkowania użyto jednej z komór, myszy TH-Cre uporczywie i znacząco unikały pozostawania w komorze warunkowanej optycznie podczas warunkowania i w teście końcowym ( Ryc. S6 B – E ). Analiza statystyczna potwierdziła istotne skrócenie czasu przebywania myszy TH-Cre w komorze kondycjonowanej optycznie w teście końcowym w porównaniu z czasem przebywania myszy WT ( ryc. S6 F ).
Następnie podjęliśmy próbę określenia podtypów receptora DA zaangażowanych w to awersyjne zachowanie poprzez specyficzne tłumienie każdego z receptorów DA w NAc ( ryc. 4 i ryc. S7 ). Zaprojektowaliśmy i zwalidowaliśmy wektory lentiwirusowe zawierające krótkie RNA o strukturze spinki do włosów (shRNA) specyficzne dla każdego receptora DA z konstytutywną ekspresją mCherry. Trzy tygodnie po wstrzyknięciu lentiwirusa do NAc, silna ekspresja mCherry została zlokalizowana w NAc ( ryc. 4 B ). Skuteczne wyciszenie ekspresji mRNA każdego receptora zostało potwierdzone ilościową analizą PCR w czasie rzeczywistym (ryc. S7 A ). Pomiar poziomów białka za pomocą Western blotting wykazał również, że wstrzyknięcie każdego z lentiwirusów selektywnie zmniejszało jego docelowy produkt białkowy bez wpływu na ekspresję drugiego podtypu receptora DA ( ryc. 4 C i ryc. S7 B – G ). Lentiwirusy ekspresujące shD1R i shD2R zmniejszyły poziom białka docelowego odpowiednio do 46.2 ± 1.1% i 38.4 ± 4.9% w porównaniu z poziomem wirusa kontrolnego ( ryc. 4 C ). Wyniki te potwierdziły, że wektory lentiwirusowe ekspresujące shRNA specyficzne dla D1R i D2R selektywnie i wystarczająco tłumiły swoje docelowe RNA i zmniejszały ilość odpowiednich produktów białkowych. Potwierdziliśmy również, że ekspresja mCherry pośredniczona przez wirusa nie została wykryta w VTA, wykluczając możliwość, że shRNA pośredniczone przez lentiwirus bezpośrednio wpływało na VTA.
Używając tych lentiwirusów zawierających shRNA, sprawdziliśmy, który typ receptora DA był odpowiedzialny za zachowanie awersyjne wywołane optogenetyczną inaktywacją neuronów DA. Wstrzyknęliśmy lentiwirus zawierający shRNA lub kontrolny lentiwirus do obustronnego NAc wraz z AAV-DIO-Arch do lewej VTA myszy TH-Cre. Włókno optyczne zostało również wprowadzone powyżej VTA ( Rys. 4A ) . Gdy przeprowadzono trójkomorowy test CPA trzy tygodnie po operacji, myszy TH-Cre, którym wstrzyknięto lenti:shD1R-mCherry, nadal wykazywały wyraźne CPA przeciwko komorze sparowanej ze stymulacją optyczną porównywalnie do myszy TH-Cre, którym wstrzyknięto kontrolny lentiwirus (lenti:mCherry). Natomiast myszy TH-Cre, którym wstrzyknięto lenti:shD2R-mCherry, nie wykazywały wyraźnego CPA podczas warunkowania ( Rys. 4D ) . Deficyt uczenia się wyłącznie u myszy TH-Cre, którym wstrzyknięto lenti:shD2R-mCherry, został dodatkowo potwierdzony analizą uczenia się awersyjnego w teście końcowym ( ryc. 4E ) . Wyniki te pokazują, że zachowanie awersyjne w miejscu warunkowanym inaktywacją neuronów DA było wywoływane specyficznie przez receptor D2R, a nie przez receptor D1R w jądrze NAc.
Dyskusja
W prążkowiu badania wykazały, że aktywacja sprzężonego z Gs receptora D1R ułatwia jego wyładowanie, podczas gdy aktywacja sprzężonego z Gi receptora D2R skutkuje stłumioną wydajnością wyładowania ( 25 ). Zgodnie ze specyficznością ekspresji receptora DA, fazowe wyładowania neuronów DA aktywują głównie drogę bezpośrednią przez D1R, podczas gdy przejściowy spadek wyładowań neuronów DA głównie promuje kompetencje drogi pośredniej przez D2R ( 3 , 26 ). Na podstawie tego mechanizmu regulacji zaproponowano, że wyciszanie neuronów DA w odpowiedzi na bodźce awersyjne jest przetwarzane głównie przez drogę pośrednią i skutkuje zachowaniem awersyjnym ( 3 ). Ostatnie badania wykazały, że blokada transmisji synaptycznej drogi pośredniej upośledza nabywanie zachowań awersyjnych wywołanych przez wstrząs elektryczny ( 15 ) i że upośledzenie to jest spowodowane przez zahamowanie przekazu sygnału za pośrednictwem receptora D2R ( 16 ). Ponadto optogenetyczne zwiększenie ekspresji receptorów MSN w drodze pośredniej wywołuje unikanie behawioralne ( 27 ). Jednakże, ponieważ neurony DA wykazują zarówno wzmocnione, jak i stłumione wyładowania w odpowiedzi na bodźce awersyjne, a inne informacje sensoryczne związane z wstrząsem są jednocześnie przetwarzane w mózgu, nadal pozostaje do wyjaśnienia, czy wyciszenie neuronów DA może bezpośrednio wywołać reakcję awersyjną i uczenie się, oraz czy reakcja ta jest regulowana przez ekspresję receptorów MSN w drodze pośredniej.
W niniejszym badaniu wykorzystaliśmy optogenetyczną kontrolę wyładowań neuronów DA w dwóch testach behawioralnych: teście preferencji ciemnego pomieszczenia oraz trójkomorowym teście CPA. Nasza manipulacja optogenetyczna wykazała skuteczne tłumienie wyładowań neuronów DA w VTA oraz obniżenie poziomu DA w NAc . Nasza precyzyjna optogenetyczna inaktywacja wyładowań neuronów DA tylko w okresie przebywania zwierząt w komorze warunkowej jednoznacznie wywołała reakcję awersyjną i uczenie się, co dowodzi, że przejściowe wyciszanie DA bezpośrednio powodowało bierne unikanie. Co więcej, niniejsze badanie wyjaśniło, że przetwarzanie sygnału za pośrednictwem receptora D2R jest kluczowym czynnikiem determinującym indukcję tej reakcji awersyjnej i uczenia się.
Chociaż nasze dane wykazały, że D1R nie miał wpływu w eksperymentach behawioralnych na wywołanie CPA, kilka badań udokumentowało, że fazowe wyładowania neuronów DA są niezbędne do reakcji strachu i uczenia się awersyjnego ( 28 , 29 ). Ta różnica wynika z warunków eksperymentalnych; tj. nasze podejście optogeniczne wykluczyło możliwość sygnalizacji poprzez aktywowane neurony DA w celu wywołania zachowania awersyjnego, wskazując, że inaktywacja neuronów DA była wystarczająca do wywołania zachowania awersyjnego i uczenia się. Funkcja i przetwarzanie sygnału aktywowanego wyładowania DA wywołanego przez bodźce awersyjne miałyby inny wkład w zachowania awersyjne niż te badane tutaj i wymagają wyjaśnienia w przyszłości.
Neurony DA projektują również do różnych innych regionów, w tym mPFC, ciała migdałowatego i hipokampa. Niedawne badanie wykazało, że optogenetyczna aktywacja neuronów uzdeczki bocznej projektujących do neuronów DA w VTA jest zdolna do wywoływania zachowań awersyjnych, a te neurony DA kierują się głównie i specyficznie do mPFC ( 30 ), chociaż ich warunkowanie optogenetyczne różniło się od tego w naszym obecnym badaniu, ponieważ ich stymulacja optogenetyczna była przedłużona przez całą sesję warunkowania. Ponieważ doniesiono, że dopaminergiczny sygnał wejściowy do mPFC jest aktywowany nie tylko przez bodźce awersyjne, ale także przez przewlekły stres ( 31 , 32 ), możliwe jest, że ciągła aktywacja neuronów DA projektujących mPFC byłaby postrzegana jako sygnały z wysoce stresującego środowiska; a w wyniku akumulacji warunkowania stresującego zwierzęta wykazywałyby zachowania awersyjne w komorze warunkowej. Natomiast my zahamowaliśmy wyładowania neuronów DA tylko wtedy, gdy zwierzęta przebywały w komorze warunkowej. Wyniki naszych eksperymentów behawioralnych, w których wykorzystano warunkowanie dopasowane czasowo, wskazały, że nagłe stłumienie sygnału DA zostanie odebrane jako nagły negatywny bodziec, co skutkowało szybką awersyjną reakcją.
Neurony DA projektują również do ciała migdałowatego, regionu, który w dużej mierze przyczynia się do reakcji strachu. Rzeczywiście, sygnalizacja DA do ciała migdałowatego jest powiązana z reakcją strachu i nabywaniem pamięci strachu ( 33 , 34 ). W naszym badaniu znakowanie neuronów DA w VTA zidentyfikowało zestaw neuronów DA projektujących do BLA, ale zakres tych projekcji był znacznie mniejszy niż ten projektujący do NAc. Chociaż nie mogliśmy wykluczyć subtelnego wpływu sygnalizacji DA projektowanej przez ciało migdałowate na obserwowane przez nas zachowanie awersyjne, główny efekt naszej optogenetycznej inaktywacji neuronów DA powinien dotyczyć NAc, ponieważ nasze eksperymenty ze specyficznym wyciszeniem D2R w NAc drastycznie zmniejszyły zachowanie awersyjne. Przyszłe badania dotyczące sygnalizacji DA specyficznej dla celu są wymagane, aby wyjaśnić efekty modyfikacji neuronów DA w całym obwodzie na bodźce awersyjne i warunkowanie strachu.
Materiały i Metody
Przedmioty.
Myszy typu knock-in z genem hydroksylazy tyrozynowej::IRES-Cre (TH-Cre) (EM:00254) ( 18 ) uzyskano z European Mouse Mutant Archive. Wszystkie zwierzęta doświadczalne zostały wstecznie skrzyżowane ze szczepem C57BL/6J przez ponad 10 pokoleń. Myszy skrzyżowano z myszami C57BL/6J WT i trzymano w standardowym cyklu 12 godzin światła/12 godzin ciemności, pobierając pokarm i wodę ad libitum. Do eksperymentów wykorzystano myszy Cre + i Cre − z tych samych miotów (w wieku 3–6 miesięcy). Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez komisję ds. zwierząt Osaka Bioscience Institute zgodnie z wytycznymi dotyczącymi eksperymentów na zwierzętach.
Testy behawioralne.
Podczas wszystkich testów behawioralnych myszy były połączone światłowodem i mogły poruszać się po całym aparacie. Ruch myszy był monitorowany, aby mogły poruszać się bez przeszkód, nawet gdy były połączone światłowodem na głowach. Pozycję myszy wykryto za pomocą kamery wideo zawieszonej nad aparatem behawioralnym i przeanalizowano za pomocą specjalnego programu wykorzystującego oprogramowanie Labview.
Test preferencji w ciemnych pomieszczeniach.
Specjalnie wykonany aparat behawioralny użyty w teście składał się z ciemnego pokoju (15 × 9.5 cm) i jasnej otwartej przestrzeni (15 × 11 cm). Ciemny pokój miał ściany, podłogę i dach, które były wszystkie w kolorze czarnym i miał wejście (o długości 4.5 cm) do otwartej jasnej przestrzeni. Otwarta jasna przestrzeń miała kształt elipsy i miała metalową kratową podłogę oraz przezroczyste ściany bez dachu. Przed testem wszystkie myszy zostały przyzwyczajone do aparatu przez 10 minut. Test składał się z trzech sesji: we wczesnej połowie dnia 1 (pretest: 5 min) myszom pozwolono eksplorować cały aparat. Od późnej połowy dnia 1 do dnia 4 (warunkowanie: łącznie 35 min) myszy otrzymywały stymulację optyczną, gdy przebywały w ciemnym pokoju. W dniu 5 preferencje dotyczące ciemnego pokoju były testowane bez stymulacji optycznej (posttest: 5 min; Rys. S1 E ).
Trzykomorowy test CPA.
Wykonany na zamówienie, trzykomorowy aparat do warunkowego badania preferencji miejsca/CPA, używany w teście, składał się z dwóch komór (10 × 17 cm) i łączącego korytarza. Test składał się z trzech sesji. Dzień 1 (test wstępny: 15 min): Myszom pozwolono na swobodne eksplorowanie całego aparatu. Myszy, które przebywały 1.5 raza dłużej w jednej komorze niż w drugiej, zostały wyłączone z testu. Dni 2 i 3 (warunkowanie: po 15 min): Myszy otrzymywały stymulację optyczną, gdy przebywały w komorze ze światłem. Wybór komory ze światłem był równoważony. Dzień 4 (test końcowy: 15 min): Test przeprowadzono w tych samych warunkach, co w teście wstępnym ( Rys. S6 A ).
W sesji kondycjonowania stymulacja optyczna została zatrzymana dla 30 s, gdy myszy nieprzerwanie przebywały nad 30 w ciemnym pokoju lub komorze ze światłem, aby uniknąć przegrzania. We wszystkich testach behawioralnych moc lasera była kontrolowana tak, aby była w przybliżeniu 5 mW na końcu światłowodu.
Woltamperometr cykliczny In Vivo.
Eksperymenty FSCV przeprowadzono przy użyciu metody opisanej w poprzednich badaniach ( 35–37 ). Myszy znieczulono mieszaniną ketaminy/ksylazyny, jak opisano w SI Materials and Methods , i umieszczono w ramie stereotaktycznej. Światłowód użyty do stymulacji neuronów DA ekspresujących Arch znajdował się blisko elektrody stymulującej. Optrodę stymulującą umieszczono następnie w VTA (od bregma: przednio-tylny, -3.2 mm; boczny, 0.5 mm; i grzbietowo-brzuszny, 3.5 mm) i obniżano w odstępach 0.25 mm. Mikroelektrodę z włókna węglowego (300 µm długości) do rejestracji woltamperometrycznej obniżono do NAc (od bregma: przednio-tylny, 1.0 mm; boczny, 1.0 mm; i grzbietowo-brzuszny, 3.5 mm). Pomiary woltamperometryczn e wykonywano co 100 ms, przykładając do mikroelektrody z włókna węglowego falę trójkątną (od -0.4 V do +1.3 V do -0.4 V względem Ag/AgCl, przy 400 V/s). Do izolacji fali i wzmocnienia prądu użyto specjalnie zaprojektowanego potencjostatu. Uwalnianie neuronów DA wywoływano poprzez elektryczną stymulację neuronów DA za pomocą 24-impulsowej stymulacji (100 µA, czas trwania 5 ms, częstotliwość 30 Hz). Optyczną stymulację neuronów DA (532 nm, moc na końcu włókna ~5 mW) stosowano przez 10 s, rozpoczynając 5 s przed rozpoczęciem stymulacji elektrycznej. Mikroelektrody z włókna węglowego kalibrowano w roztworze o znanych stężeniach DA (0.2 µM, 0.5 µM i 1.0 µM). Wszystkie dane woltamperometrii analizowano za pomocą specjalnie opracowanych programów wykorzystujących oprogramowanie Labview i Matlab. Redukcję poziomu DA w wyniku stymulacji optycznej rozwiązano za pomocą analizy składowych głównych, wykorzystując wzorcowe przebiegi DA uzyskane z elektrycznej stymulacji VTA do oddzielenia sygnałów dopaminy ( 35 , 36 ).
Analiza statystyczna.
Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu oprogramowania GraphPad PRISM 5.0 (GraphPad Software). Dane analizowano za pomocą powtarzanych pomiarów ANOVA ( rys. 1 B , 4 D , 4 D i rys. S6 D i E ) lub jednokierunkowej ANOVA ( rys. 1 C , 3 D , 3 D , 4 C i E i rys. S4 K – M , S6 F i S7 A ), a analizy post hoc wykonano przy użyciu testu Bonferroniego. Wszystkie znaczniki/kolumny i słupki przedstawiały odpowiednio średnią i ± SEM.
Inne procedury eksperymentalne, w tym przygotowanie i wstrzyknięcie wirusa, rejestrowanie elektrofizjologiczne oraz analiza immunohistochemiczna i mRNA opisano szczegółowo w publikacji SI Materials and Methods.
Podziękowanie
Dziękujemy E. Boydenowi za konstrukcje Arch, R. Matsui za doradztwo techniczne w produkcji i oczyszczaniu lentiwirusów oraz Y. Hayashi za doradztwo techniczne w programowaniu analizy danych. Praca ta była wspierana przez Research Grants-in-Aid 22220005 (do SN), 23120011 (do SY i SN), 24700339 (do TD) i 25871080 (do SY) z Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologia Japonii i dotacja od Takeda Science Foundation (do SN).
Przypisy
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
W tym artykule znajdziesz informacje pomocnicze dostępne online pod adresem www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1404323111/-/DCSupplemental.
Referencje