Nat Neurosci. Rękopis autora; dostępny w PMC 2016 Jan 15.
Opublikowany w końcowym edytowanym formularzu jako:
Nat Neurosci. 2014 May; 17 (5): 704 – 709.
Opublikowane online 2014 Apr 6. doi: 10.1038 / nn.3694
PMCID: PMC4714770
NIHMSID: NIHMS574802
Ingo Willuhn,1,2,3,* Lauren M. Burgeno,1,2 Peter A. Groblewski,2 i Paul EM Phillips1,2
Ostateczna, zredagowana wersja tego artykułu jest dostępna pod adresem Nat Neurosci
Zobacz komentarz „Utrata fazowej sygnalizacji dopaminy: nowy marker uzależnienia"W Nat Neurosci, tom 17 na stronie 644.
Zobacz inne artykuły w PMC, że cytować opublikowany artykuł.
Abstrakcyjny
Uzależnienie od narkotyków jest zaburzeniem neuropsychiatrycznym charakteryzującym się nasilającym się zażywaniem narkotyków. Neurotransmisja dopaminy w prążkowiu brzuszno-przyśrodkowym (VMS) pośredniczy w ostrych efektach wzmacniających nadużywanych leków, ale uważa się, że przy przewlekłym stosowaniu prążkowie grzbietowo-boczne (DLS) przejmuje kontrolę nad poszukiwaniem narkotyków. Zmierzyliśmy uwalnianie dopaminy z prążkowia podczas schematu samopodawania kokainy, który powodował eskalację zażywania narkotyków u szczurów. Co zaskakujące, odkryliśmy, że faza dopaminy zmniejszyła się w obu regionach wraz ze wzrostem spożycia kokainy; wraz ze spadkiem dopaminy w VMS istotnie korelował z tempem eskalacji. Podawanie prekursora dopaminy L-DOPA w dawce, która uzupełniła sygnalizację dopaminy w odwróconej eskalacji VMS, demonstrując tym samym związek przyczynowy między zmniejszoną transmisją dopaminy a nadmiernym zażywaniem narkotyków. Zatem razem te dane dostarczają mechanistycznego i terapeutycznego wglądu w nadmierne przyjmowanie leków, które pojawia się po długotrwałym stosowaniu.
WPROWADZENIE
Nadużywanie narkotyków jest ściśle związane z uwalnianiem dopaminy w prążkowiu1,2. Jednak zmiany związane z używaniem narkotyków w neuroprzekaźnictwie dopaminowym zmieniają się w czasie i podregionie3-5. Powolny wzrost pozakomórkowego stężenia dopaminy w prążkowiu brzuszno-przyśrodkowym (VMS), stymulowany przez wiele narkotyków, w tym kokainę6zakłada się, że odzwierciedlają one wzmacniające właściwości leków7, ponieważ zwierzęta regulują szybkość podawania kokainy w celu utrzymania podwyższonego poziomu otaczającego stężenia dopaminy8. W obrębie VMS odnotowano nakładające się przypuszczalne role sygnalizacji dopaminy w podregionach jądra i skorupy jądra półleżącego, ale z naciskiem na powłokę, w której pośredniczy nagroda za podstawowy lek, a rdzeń za działanie jako substrat dla wzmacniania warunkowego1. Rzeczywiście, fazowe uwalnianie dopaminy w jądrze półleżącym jądra półleżącego, trwające przez kilka sekund, jest uwarunkowane przedstawieniem bodźców środowiskowych, które były wielokrotnie łączone z lekiem9-12 i jest zdolny do kontrolowania poszukiwania i przyjmowania narkotyków9. Kodowanie takich uwarunkowanych bodźców przez uwalnianie dopaminy znajduje się również w aspektach czuciowo-ruchowych prążkowia (prążkowate grzbietowo-boczne, DLS)13, subregion prążkowia powiązany z rozwojem nawykowego i kompulsywnego poszukiwania narkotyków14-16. W związku z tym uważa się, że postęp w przyjmowaniu leków wykraczający poza wykorzystanie rekreacyjne odzwierciedla zaangażowanie sygnalizacji dopaminy w różnych podregionach prążkowia1,17, z naciskiem na przejście od limbicznego (VMS) do prążkowia sensomotorycznego (DLS) podczas rozwoju zachowań mających na celu poszukiwanie narkotyków1,18. Nie wiadomo jednak, czy kodowanie działań lub bodźców związanych z lekiem przez fazowe zmiany dopaminy nasila się w umiarkowanych zachowaniach związanych z przyjmowaniem leków.
Paradygmaty gryzoni uważane za najlepszy model przejścia od umiarkowanego używania narkotyków do uzależnienia wykorzystują przedłużony dostęp do narkotyku19,20takie jak rozszerzenie dostępu z jednego (krótki dostęp, ShA) do sześciu godzin (długi dostęp, LgA) dziennie przez okres kilku tygodni21. Taki schemat samodzielnego podawania leku jest zdolny do eskalacji21 i kompulsywne poszukiwanie narkotyków22, wśród innych głównych objawów charakteryzujących uzależnienie od substancji u ludzi23. Tutaj przetestowaliśmy, w jaki sposób LgA wpływa na regionalną dynamikę fazowej sygnalizacji dopaminy w prążkowiu wcześniej scharakteryzowanym podczas stabilnego stosowania leku ShA13 aby lepiej zrozumieć mechanizmy neurobiologiczne leżące u podstaw eskalacji zażywania narkotyków.
WYNIKI
Samce szczurów Wistar z umieszczonymi na stałe cewnikami dożylnymi przeszkolono do samodzielnego podawania kokainy podczas codziennych sesji ShA i po nabyciu zostały przełączone na sesje LgA w komorach wyposażonych w dwa porty do nosa. Wbicie nosa w aktywny port wywołało infuzję kokainy (0.5 mg / kg / infuzję) i prezentację przez 20 bodźca jasnego tonu w harmonogramie zbrojenia 20 o stałym interwale (FI). Odpowiedzi w drugim (nieaktywnym) porcie szturchania nosa lub w aktywnym porcie podczas prezentacji bodźca (limit czasu 20) nie były zaprogramowane. Dla celów raportowania, reakcje szturchania nosa w aktywnym porcie poza okresem limitu czasu (tj. Te, które wywołały infuzję kokainy) są określane jako „aktywne szturchnięcia nosem”, a te w nieaktywnym porcie poza okresem limitu czasu jako „nieaktywne nosa szturcha ”. Liczba aktywnych szturchańców nosa znacznie przewyższała nieaktywne szturchnięcia nosa (główny efekt portu nosa: F(1, 23) = 383.226, P <0.001; Rys. 1) w każdym tygodniu (P <0.001). Po przejściu z ShA na LgA spożycie kokainy z czasem znacznie wzrosło (główny efekt tygodnia: F(3, 69) = 25.504, P <0.001; Rys. 1), jak konsekwentnie zgłaszało wiele innych24.
Aby ocenić długoterminową dynamikę przenoszenia dopaminy, podłużne zapisy neurochemiczne przeprowadzono równocześnie w jądrze półleżącym w rdzeniu VMS iw DLS w przewlekle wszczepionych mikrosensorach25 przy użyciu szybkiej skanowania woltamperometrii cyklicznej (patrz Uzupełnienie Rys. 1 do weryfikacji histologicznej umiejscowienia elektrody). W pierwszym tygodniu LgA obserwowaliśmy przejściowy wzrost pozakomórkowego stężenia dopaminy w VMS po aktywnych reakcjach (P <0.001; Rys. 2a). Ten wzorzec aktywacji zmniejszył się podczas LgA, gdzie uwalnianie dopaminy w trzecim tygodniu było znacznie mniejsze niż w pierwszym (P <0.001) i drugi (P = 0.030) tygodnie (główny efekt tygodnia: F(2,72) = 10.230, P <0.001; Rys. 2b). Fazowe uwalnianie dopaminy w DLS pojawiło się w drugim tygodniu (P = 0.006; Rys. 2c) ale był nieobecny w trzecim tygodniu LgA (główny efekt tygodnia: F(2,51) = 3.474, P = 0.039; aktywna interakcja poke × week: F(2,51) = 4.021, P = 0.024; Rys. 2c, d). Dane te pokazują, że fazowe sygnały dopaminowe w VMS i DLS pojawiają się kolejno na różnych etapach przyjmowania leku, podobnie jak w przypadku schematu ShA13. Jednakże sygnalizacja ta zmniejszyła się w obu regionach w ciągu LgA, okresu, w którym wiadomo, że farmakokinetyka kokainy podawanej dożylnie nie zmienia się26,27.
Aby zbadać związek między utratą sygnalizacji dopaminy a eskalacją konsumpcji leków, wykorzystaliśmy indywidualne różnice w podatności na eskalację samopodawania leku podczas schematu LgA przez rozdzielenie zwierząt na dwie grupy w zależności od tego, czy wykazywały one znaczną eskalację na podstawie liniowej regresja konsumpcji leku w sesjach LgA lub nie (Rys. 3a, b). Walidacja tego rozdzielenia zwierząt wykazała, że nieskalowane zwierzęta nie wykazały znaczącego wzrostu aktywnych szturchańców nosa w ciągu trzech tygodni LgA (główny efekt tygodnia: F(2,18) = 0.633, P = 0.542; Rys. 3b, po lewej), podczas gdy eskalowane szczury znacznie zwiększyły ich spożycie (główny efekt tygodnia: F(2,26) = 14.826, P <0.001; Rys. 3b, dobrze; interakcja spożycie × tydzień: F(2,44) = 4.674, P = 0.014) bardziej aktywne szturchanie nosem niż nieskalowane zwierzęta podczas trzeciego tygodnia LgA (t(22) = 2.307, P = 0.031; Rys. 3b). Szczególnie eskalowane zwierzęta wykazywały zwiększoną motywację do uzyskania kokainy, jak wykazano w zadaniu progresywnym (P = 0.028; Uzupełnienie Rys. 2). U eskalowanych szczurów nastąpił znaczny spadek uwalniania dopaminy w VMS (główny efekt tygodnia: F(2,51) = 15.507, P <0.001; Rys. 3c, prawda i Uzupełnienie Rys. 3a). Jednak uwalnianie dopaminy VMS było stabilne u nieskalowanych szczurów (główny efekt tygodnia: F(2,18) = 0.057, P = 0.945; Rys. 3c, w lewo i Uzupełnienie Rys. 4a) nadając znacznie więcej dopaminy fazowej w trzecim tygodniu w porównaniu do eskalowanych szczurów (główny efekt spożycia: F(1,69) = 6.444, P = 0. 013; Rys. 3d, lewo; interakcja spożycie × tydzień: F(1,70) = 4.303, P = 0.042). Ta różnica w uwalnianiu dopaminy między eskalowanymi i nie eskalowanymi szczurami była widoczna przez całe sześć godzin samopodawania (t(43) = 2.599, P = 0.013). Co ważne, różnica ta nie wynikała z ogólnego spadku funkcji dopaminy u eskalowanych zwierząt, ponieważ uwalnianie dopaminy po warunkowych, eksperymentalnych wlewach kokainy nie różniło się między zwierzętami nieskalowanymi i eskalowanymi (P = 0. 605; Uzupełnienie Rys. 5a).
W przeciwieństwie do utrzymywanego fazowego uwalniania dopaminy w VMS nie eskalujących szczurów, wcześniej informowaliśmy, że nastąpiło zmniejszenie uwalniania dopaminy u zwierząt, które przeszły trzy tygodnie ograniczonego dostępu do kokainy (ShA) tylko o jedną godzinę dziennie13. Dlatego przeprowadziliśmy dodatkowe analizy danych uzyskanych od tych szczurów ShA, aby umożliwić szczegółową charakterystykę związku między funkcją dopaminy a przyjmowaniem leku przez zwierzęta, które poddały się samorzutnemu przyjmowaniu ShA lub kokainy LgA. Podczas gdy nie było znaczącej eskalacji średniego spożycia leku przez zwierzęta podczas ShA, występowały różnice indywidualne z podgrupą zwierząt (6 z 16) wykazujące znaczną eskalację przyjmowania leku przez trzy tygodnie samokontrolnego podawania kokainy ShA. Co ciekawe, dopaminowa faza VMS w trzecim tygodniu samodzielnego podawania kokainy ShA w grupie zwierząt, które utrzymywały stabilne spożycie narkotyków (tj. Nie wykazywały znacznej eskalacji) nie różniła się znacząco od tej dla zwierząt nieskalowanych w trzecim tygodniu LgA (P = 0.741; Uzupełnienie Rys. 5b). Zwierzęta ShA, które nasiliły przyjmowanie leku, wykazywały niższe wskaźniki spożycia leku (wlewy 32.7 ± 3.9 w porównaniu z 43.9 ± 3.1 w pierwszej godzinie, P = 0.017) i mniej atenuowane uwalnianie dopaminy (P = 0.049; Uzupełnienie Rys. 5b) niż zwierzęta, które nasiliły spożycie w warunkach LgA. Niemniej jednak istniała nieistotna tendencja do zmniejszenia dopaminy VMS w porównaniu z ich nie eskalującymi odpowiednikami (P = 0.094) i brak istotnej interakcji dla uwalniania dopaminy w czasie między szczurami ShA i LgA eskalującymi (interakcja bez przyjmowania × schemat: F(1,57) = 0.111 P = 0.740; Uzupełnienie Rys. 5b). Biorąc pod uwagę te indywidualne różnice, przeprowadziliśmy analizę regresji u wszystkich szczurów ShA i LgA, aby zbadać bezpośredni związek między poziomami dopaminy a stopniem eskalacji i stwierdziliśmy istotną ujemną korelację (szczury ShA i LgA zebrane razem; r = −0.628 , P = 0.005) z największą eskalacją u zwierząt, które miały najniższe uwalnianie dopaminy w tygodniu 3 (Rys. 3e, lewo). W związku z tym osłabienie sygnalizacji dopaminy w VMS było predykcją eskalacji samopodawania leku w schematach dostępu do leku LgA i ShA. Dane te podkreślają, że istotnym aspektem związanym ze zmianami w uwalnianiu dopaminy jest to, czy zwierzęta nasilają się, czy nie, zamiast schematu samopodawania, na jaki byli narażeni per se. Podobnie, stwierdzamy, że u wszystkich szczurów eskalacja jest istotnym predyktorem zwiększonej motywacji do kokainy (P = 0.037, Uzupełnienie Rys. 6a), ale schemat LgA / ShA nie jest zgodny z harmonogramem progresywnego stosunku (P = 0.340, Uzupełnienie Rys. 6b).
W przeciwieństwie do VMS, zależne od odpowiedzi uwalnianie dopaminy w DLS nie różniło się między eskalowanymi i nieskalowanymi zwierzętami LgA (główny efekt spożycia: F(1,48) = 0.472, P = 0. 496; Rys. 3d, dobrze i Dodatkowe rysunki. 3b i 4b), ani nie było istotnego związku między nachyleniem eskalacji a uwalnianiem dopaminy przez zwierzęta, które przeszły samorzutne podawanie kokainy ShA lub LgA (r = −0.112, P = 0.649; Rys. 3e, dobrze). Tak więc, podczas gdy dopamina w VMS korelowała z eskalacją przyjmowania leków, podobnej korelacji nie zaobserwowano w DLS, regionie mózgu, który był szeroko związany z przedłużonym samopodawaniem leku1,14,16,18.
Biorąc pod uwagę tę prowokacyjną korelację między neurochemią a zachowaniem, postawiliśmy hipotezę, że spadek fazowej sygnalizacji dopaminowej był przyczyną spowodowania eskalacji zażywania narkotyków, podobnie jak wzrost zażywania narkotyków wytwarzany przez antagonistów receptora dopaminy28-30i przywrócenie go spowodowałoby odwrócenie eskalacji (Rys. 4a). Dlatego potraktowaliśmy eskalowane zwierzęta (P = 0.024; Rys. 4b) z L-DOPA przed sesją zacznij zwiększać fazowe uwalnianie dopaminy31. L-DOPA zależna od dawki (0, 10, 30 i 90 mg / kg, dożylnie) zmniejszała przyjmowanie kokainy (główny efekt L-DOPA: F(3,53) = 5.053, P = 0.004; Rys. 4b), z 30 mg / kg powracającego spożycia do wstępnie zwiększonego poziomu. Co ważne, dawka L-DOPA w dawce 30 mg / kg była wystarczająca do całkowitego przywrócenia fazowej sygnalizacji dopaminy w VMS (patrz Uzupełnienie Rys. 7 do nagrywania witryn) podczas przyjmowania narkotyków (F(2,8) = 6.316, P = 0.023; Rys. 4c), efekt zaobserwowano również przez pełne sześć godzin samodzielnej administracji (F(2,8) = 7.610, P = 0.0141). Zatem ilość fazowego uwalniania dopaminy w VMS przewidywała ilość przyjmowanego leku podczas sesji samo-podawania kokainy (r = −0.525, P = 0.046; Rys. 4d). Ten behawioralny efekt L-DOPA nie może być wyjaśniony przez zmiany w farmakologicznej odpowiedzi na kokainę, ponieważ powolne zmiany stężenia dopaminy VMS po warunkowym wlewie leku nie zostały zmienione przez leczenie L-DOPA i w rzeczywistości nie różniły się między wcześniejszymi eskalacja, eskalacja i eskalacja stanów leczonych L-DOPA (F(2,8) = 0.020, P = 0.980; Uzupełnienie Rys. 8). Ponadto wpływ L-DOPA na spożycie leku obserwowano również, gdy L-DOPA podawano miejscowo do VMS (patrz Uzupełnienie Rys. 9 w przypadku miejsc infuzji) eskalowanych szczurów przed sesją (t(7) = 6.517, P <0.001; Rys. 4e). Podsumowując, ten zestaw badań pokazuje, że pojedyncza dawka L-DOPA podana przed dostępem do leku jest skuteczna w przywracaniu sygnalizacji dopaminy i normalizacji używania kokainy do stanu sprzed eskalacji.
Następnie zbadaliśmy, czy stosowanie L-DOPA będzie skuteczne w zmniejszaniu zwiększonego zużycia leku w długoterminowych schematach dawkowania, bardziej odpowiednich do zastosowań klinicznych. Najpierw przeprowadziliśmy eksperymenty wprowadzające powtarzaną infuzję L-DOPA w kolejnych dniach podczas indukcji eskalacji. Zwierzęta przeszkolono, aby stabilnie samodzielnie podawały kokainę, a następnie albo przestawiły się na LgA, albo pozostały na ShA, podczas których wstrzykiwano im L-DOPA (30 mg / kg, dożylnie) lub sól fizjologiczną przed każdą sesją przez dwa tygodnie (Rys. 5a). L-DOPA znacząco wpływa na przyjmowanie leku w sposób specyficzny dla schematu (główny efekt leczenia: F(1,53) = 9.297, P = 0.004; główny efekt schematu: F(1,53) = 5.968, P = 0.018; Rys. 5a) ze zmniejszonym spożyciem kokainy u zwierząt LgA (P = 0.004), ale nie zwierzęta ShA (P = 0.170; Rys. 5a) i bez wpływu na nieaktywne szturchnięcia nosa (LgA, P = 0.202; ShA, P = 0.101; dane nie pokazane). Dlatego leczenie L-DOPA było skuteczne w zapobieganiu eskalacji spożycia leku podczas LgA. Jednak po zaprzestaniu leczenia efekt ten nie trwał (P = 0.789; Rys. 5a). Po drugie, wielokrotnie podawaliśmy L-DOPA w kolejnych dniach u zwierząt z ustalonym zwiększonym spożyciem leku. Zwierzęta były szkolone, aby stabilnie samodzielnie podawać kokainę, a następnie zostały zmienione na LgA lub pozostawały na ShA przez trzy tygodnie. Zwierzęta te następnie traktowano L-DOPĄ lub solą fizjologiczną przed sesjami samodzielnego podawania w trzecim tygodniu (Rys. 5b). Zwierzęta wyszkolone w LgA wykazały znaczny wzrost zażywania kokainy w ciągu pierwszych dwóch tygodni w porównaniu ze zwierzętami wyszkolonymi w ShA (główny efekt schematu: F(1,51) = 15.706, P <0.001; dane niepokazane). Leczenie L-dopą dawało efekt specyficzny dla schematu leczenia (główny efekt leczenia: F(1,51) = 5.303, P = 0.025; główny efekt schematu: F(1,51) = 11.884, P = 0.001; Rys. 5b), zmniejszenie spożycia kokainy u zwierząt LgA (P = 0.048), ale nie zwierzęta ShA (P = 0.210; Rys. 5b) bez wpływu nieaktywnego odpowiadania (LgA, P = 0.641; ShA, P = 0.664). Co ważne, zróżnicowany wpływ L-DOPA na aktywne szturchanie nosa był bardziej silny, gdy zwierzęta były pogrupowane w eskalowane i nieskalowane, zamiast ShA i LgA (eskalowane zwierzęta, P = 0.005; nieskalowane zwierzęta, P = 0.421; Rys. 5c), wskazując, że L-DOPA preferencyjnie zmniejszała eskalację spożycia kokainy, a nie wpływała na konsumpcję narkotyków per se, interakcja, która rozwinęła się w ciągu kilku dni (interakcja przyjmowanie × leczenie (dzień 1)): F(1,51) = 0.562, P = 0.457; ale interakcja × leczenie (dzień 5): F(1,51) = 4.091, P = 0.048). Co ważne, te różnice między eskalowanymi i nieskalowanymi subpopulacjami, jak również efekty eskalacji ostrego i przewlekle podawanego L-DOPA obserwuje się również we wszystkich sześciu godzinach samopodawania (Uzupełnienie Rys. 10). Łącznie te odkrycia pokazują, że spadek fazowego uwalniania dopaminy u zwierząt, które nasilają przyjmowanie kokainy i przywracanie jej poprzez wielokrotne podawanie prekursora dopaminy, L-DOPA, zapobiega i odwraca tę eskalację, dostarczając dowodów, że zmniejszona dopamina napędza eskalację samopodawania leku.
DYSKUSJA
W niniejszym badaniu badaliśmy fazowe uwalnianie dopaminy w VMS i DLS podczas eskalacji przyjmowania leków, zjawisko, które modeluje kluczowe kryterium diagnostyczne uzależnienia od narkotyków21,23. Nasze odkrycia pokazują, że eskalacja jest związana ze zmniejszoną sygnalizacją dopaminy zarówno w VMS, jak i DLS, a spadek dopaminy w VMS jest istotnie skorelowany z szybkością eskalacji. Efekt ten wydaje się być selektywny dla fazowej dopaminy, ponieważ w obecnym badaniu nie zaobserwowano porównywalnych zmian w tonicznej dopaminie w poprzedniej pracy z zastosowaniem tego samego schematu u szczurów27 lub powiązane paradygmaty samo-podawania u naczelnych innych niż ludzie32,33. Odnotowano szereg doniesień o zmniejszonej funkcji dopaminy fazowej podczas odstawiania leku (testowane między godzinami 18 a 7 dniami od ostatniej sesji samopodawania), co wiąże się ze zmniejszoną wrażliwością na kokainę34-37. Podczas gdy obserwowaliśmy podobne zmniejszenie odpowiedzi dopaminowej na kokainę między szczurami ShA i LgA (Uzupełnienie Rys. 5a), efekt ten nie wydawał się być istotny dla eskalacji, ponieważ neurochemiczna odpowiedź na niekontencjonalną kokainę nie różni się między eskalowanymi szczurami a tymi, które nie miały (brak interakcji × spożycie × reżim: F(1,34) = 1.964 P = 0.170; Uzupełnienie Rys. 5a). Podobnie, szczytowe zmiany tonicznego stężenia dopaminy aż do 90 sekund po warunkowej kokainie, przypuszczalnie z powodu farmakologicznych działań kokainy, nie różniły się między stanem przed eskalacją i eskalacją w obrębie tych samych zwierząt (Uzupełnienie Rys. 8). Zatem jedynym aspektem transmisji dopaminy, który zaobserwowaliśmy, który przewidywał eskalację przyjmowania leku, była odpowiedź fazowa, która wystąpiła natychmiast po aktywnym szturchnięciu nosa, co jest uwarunkowaną odpowiedzią przede wszystkim na sygnały związane z narkotykami9,11,13. Ta odpowiedź neurochemiczna zmniejszyła się u zwierząt, które nasiliły przyjmowanie leków, co przypomina normalny proces uczenia się, w którym uwalnianie dopaminy w VMS wywoływane przez bodziec związany z nagrodą zmniejsza się, gdy bodziec zostaje tymczasowo przewidziany38,39. Jednak osłabienie uwalniania dopaminy podczas samopodawania występuje znacznie później w procesie uczenia się, niż można by się spodziewać w przypadku uczenia się na wypadek choroby, długo po nabyciu ustalonego zażywania narkotyków. Ponadto u zwierząt, które nie nasilają przyjmowania leku, nie następuje osłabienie fazowego uwalniania dopaminy, nawet jeśli zwierzęta te wykazują asymptotyczne dyskryminacyjne zachowanie instrumentalne.
Na pierwszy rzut oka nasze obserwacje spadającego uwalniania dopaminy w miarę postępu używania narkotyków wydają się kłócić z kilkoma współczesnymi teoriami uzależnienia. Teorie koncentrujące się na procesach uwrażliwienia zachęt indukowanych lekami postulują wzrost reaktywności układu dopaminowego VMS po wielokrotnej ekspozycji na leki, które wywołują uczuloną reakcję na ekspozycję na lek i wskazówkę40, zjawisko szczególnie silne po LgA41. Konceptualizacja roli nieprawidłowego uczenia się i tworzenia nawyków w narkomanii sugeruje, że pojawiająca się sygnalizacja dopaminowa w DLS coraz bardziej przejmuje kontrolę nad poszukiwaniem narkotyków1,14,16. Co więcej, wybitne modele obliczeniowe uzależnienia wiążą się w szczególności ze zwiększoną sygnalizacją dopaminy do sygnałów związanych z narkotykami jako siłą napędową uzależnienia42,43. Odwrotnie, nasze odkrycia wydają się być bardziej zgodne z hipotezą o uzależnieniu od dopaminy, zaproponowaną przez Dackisa i Golda44oraz powiązane teorie procesu przeciwnika21 które kładą nacisk na tłumienie procesów związanych z nagrodami wywołane przez nadużywanie narkotyków. Przypuszcza się, że taka supresja powoduje kompensacyjną samoregulację zażywania narkotyków w celu utrzymania preferowanego poziomu zatrucia lekami21. W szczególności ludzie i zwierzęta kompensują obniżone dawki jednostkowe kokainy przy zwiększonej odpowiedzi45,46. Proces ten jest regulowany przez transmisję dopaminy w VMS8 a w konsekwencji obniżenie transmisji dopaminy (np. przez antagonizm receptora dopaminy) wywołuje wzrost szybkości konsumpcji leku28,29. Dlatego zmniejszenie sygnalizacji dopaminy, które obserwowaliśmy podczas LgA, może stymulować kompensacyjną regulację w górę przyjmowania leku, aby osiągnąć preferowany poziom zatrucia. Na poparcie tej hipotezy zmniejszenie dopaminy w VMS było najbardziej wyraźne u zwierząt, które wykazywały większą eskalację przyjmowania leków.
W związku z tym stwierdziliśmy, że przywrócenie transmisji dopaminy osłabi eskalację. W rzeczywistości podawanie L-DOPA było skuteczne zarówno w zapobieganiu, jak i odwracaniu eskalacji przyjmowania leków. Warto zauważyć, że wpływ L-DOPA na zażywanie narkotyków nie trwał po zakończeniu leczenia, co sugeruje, że nie zapobiegło to neuroadaptacji. Dlatego nasze dane wskazują, że w eskalacji pośredniczy proces, który objawia się zmniejszeniem dopaminy fazowej podczas przyjmowania narkotyków. Odkrycia te dostarczają mechanistycznych informacji dotyczących stosowania L-DOPA w leczeniu klinicznym nadużywania psychostymulantów, strategii, która przyniosła pewne obiecujące, ale ogólnie mieszane wyniki w niewielkiej liczbie ostatnich badań klinicznych47. W szczególności, ponieważ L-DOPA zmniejszyła eskalację zażywania narkotyków bez wywołania abstynencji, sugerujemy, że lepiej nadaje się ona do podejścia do redukcji szkód, aw szczególności do umożliwienia osobom uzależnionym odzyskania stopnia kontroli nad używaniem narkotyków podczas wchodzenia w programy terapii behawioralnej. Ogólnie rzecz biorąc, nasze odkrycia ujawniają spadek fazowego uwalniania dopaminy, który ma miejsce podczas przedłużającego się dostępu do narkotyków, co pośredniczy w przejściu od używania narkotyków w celach rekreacyjnych do niekontrolowanych.
Metody
Zwierzęta
Dorosłe samce szczurów Wistar z Charles River (Hollister, CA, USA) ważące pomiędzy 300g i 400g trzymano pojedynczo i trzymano w cyklu 12-h light / 12-h dark (światła na 0700) z kontrolowaną temperaturą i wilgotnością z jedzeniem i woda dostępna ad libitum. Wszystkie zastosowania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu w Waszyngtonie, a procedury chirurgiczne przeprowadzono w warunkach aseptycznych. Dla eksperymentów woltamperometrycznych zwierzęta 50 przeszły operację, z której 29 utrzymywał drożność cewnika podczas eksperymentów, miał co najmniej jedną funkcjonalną i histologicznie zweryfikowaną elektrodę i przeszedł kryteria behawioralne (patrz poniżej). Do eksperymentu farmakologicznego szczury 28 z 32, które przeszły implantację cewnika, utrzymywały drożność cewnika dożylnego i były stosowane w badaniu. Zwierzęta zostały zrównoważone w grupach eksperymentalnych w oparciu o ich szybkość samodzielnego podawania podczas treningu przed eksperymentalnego ShA. Wielkości próbek są podobne do tych opisanych w poprzednich publikacjach13.
Chirurgia stereotaktyczna
Szczury znieczulano izofluranem, umieszczano w ramie stereotaktycznej, podawano z niesteroidowym karprofenem przeciwzapalnym (5 mg / kg, podskórnie) i umieszczano na izotermicznej poduszce w celu utrzymania temperatury ciała. Skórę głowy przetarto alkoholem i betadyną, skąpano mieszaniną lidokainy (0.5 mg / kg) i bupiwakainy (0.5 mg / kg) i nacięto w celu odsłonięcia czaszki. Otwory wywiercono w czaszce, a oponę twardą oczyszczono w celu namierzenia DLS (1.2-mm przedni, 3.1-mm boczny i 4.8-mm przedni, Bregma48) i jądro półleżące rdzenia VMS (1.3-mm przedni, 1.3-mm boczny i 7.2-mm przedni do Bregma). Jedna mikroelektroda z włókna węglowego wykonana we własnym zakresie25 został umieszczony w VMS, a drugi w DLS, a elektroda odniesienia Ag / AgCl została wszczepiona w oddzielną część przodomózgowia. W innym zestawie zwierząt kaniule prowadzące (miernik 26; Plastics One, Roanoke, VA, USA), zamknięte za pomocą „manekinów” o równej długości, zostały obustronnie wszczepione w celu ukierunkowania na VMS. Elektrody i kaniula prowadząca były zabezpieczone cementem korioplastycznym przymocowanym do czaszki za pomocą śrub. Po operacji szczurom podawano długo działający, niesteroidowy przeciwzapalny karprofen (5 mg / kg, podskórnie) i umieszczano na izotermicznej poduszce w celu utrzymania temperatury ciała do momentu rozpoczęcia leczenia. Wszystkim zwierzętom wszczepiono cewniki dożylne podczas oddzielnej operacji tydzień później.
Wszczepienie cewników dożylnych
Szczury znieczulono izofluranem, podano im niesteroidowy przeciwzapalny karprofen (5 mg / kg, podskórnie) i umieszczono na podkładce izotermicznej w celu utrzymania temperatury ciała. Cewniki wykonano z rurek silikonowych o średnicy zewnętrznej 0.6 mm i przymocowano do „piasty” na jednym końcu (dystalnie do wprowadzenia do żyły; Plastics One, VA, USA) w celu podłączenia do pompy infuzyjnej. Cewniki wprowadzono podskórnie przez nacięcie z tyłu między ramionami do przodu ciała i zakotwiczono w prawej żyle szyjnej za pomocą kulki z gumy silikonowej w pobliżu proksymalnego końca cewnika. Optymalne umiejscowienie cewnika zweryfikowano, wciągając do niego krew podciśnieniem. Następnie piastę zabezpieczono kawałkiem siatki teflonowej przyszytej do otaczającej tkanki i zamknięto nacięcia, pozostawiając nasadę wystającą z grzbietu szczura. Cewnik przepłukano następnie roztworem heparyny (80 U / ml w soli fizjologicznej) i napełniono lepkim roztworem poliwinylopirolidonu (PVP) i heparyny (1000 U / ml). Gniazdo cewnika zamknięto krótkim, zaciśniętym kawałkiem rurki polietylenowej, a roztwór PVP pozostał w cewniku, aby zapewnić drożność. Po operacji szczurom pozwolono wyzdrowieć przez co najmniej pięć dni.
Samokontrola kokainy
Sesje samodzielnego podawania przeprowadzono między 0900 a 1700 hr. Szczury nauczyły się samodzielnie podawać kokainę (Sigma, St. Louis, MO, USA) w modułowej komorze operacyjnej (Med Associates, VT, USA) wyposażonej w dwa urządzenia reagujące na nos (port ze zintegrowanymi światłami cue) umieszczone na sąsiednich panelach tej samej ściany, światło domu i głośniki, aby zapewnić bodźce czystego tonu i szumu białego. Komora operacyjna mieściła się w wyciszonej komorze zewnętrznej. Szczury (w wieku 3-4) zostały przeszkolone w uzyskiwaniu kokainy po odpowiedzi operacyjnej w harmonogramie wzmocnienia FI20. Wbijanie nosa w aktywny port (strona przeciwwagowa między zwierzętami) spowodowało natychmiastową dożylną infuzję kokainy (0.5 mg / kg przez około dziesięć sekund) w połączeniu z drugą prezentacją audiowizualnego bodźca 20 (oświetlenie światła w nosie poke port i tone, bodziec warunkowy, CS). Podczas prezentacji CS nałożono czas 20, podczas którego szturchanie nosa nie spowodowało dalszej infuzji leku ani żadnych innych zaprogramowanych konsekwencji. Dostępność narkotyków podczas sesji oznaczała biały szum i oświetlenie domu. Aby kontrolować swoistość odpowiedzi, monitorowano wywiercanie nosa przez drugi (nieaktywny) port, ale nigdy nie zostało wzmocnione. Po sesjach przedtreningowych z kryterium pięciu lub więcej aktywnych odpowiedzi na sesję w dwóch kolejnych sesjach w celu włączenia do badania, szczury otrzymywały codziennie dostęp do kokainy przez jedną godzinę dziennie (krótki dostęp; ShA) przez jeden tydzień, a następnie sześć godziny dziennie (długi dostęp; LgA) przez trzy tygodnie (pięć dni w tygodniu). Liczba sesji do osiągnięcia kryterium różniła się między zwierzętami od dwóch do pięciu sesji. Wyniki behawioralne z wcześniej zgłoszonej grupy kontrolnej13 zostały wykorzystane jako punkt odniesienia do porównania danych behawioralnych od szczurów poddawanych samorzutnemu podawaniu kokainy LgA szczurom wyszkolonym w schemacie ShA równej liczbie dni.
Po trzech tygodniach ShA lub LgA samo-podawania kokainy FI20, podgrupa szczurów przeszła testy progresywnego stosunku. Sesje te były identyczne z sesjami FI20, z wyjątkiem tego, że zwierzęta były zobowiązane do wykonywania rosnącej liczby odpowiedzi operantowych dla kolejnych wlewów kokainy podczas tej sesji. Wymaganie operacyjne dla każdej próby (T) była zaokrągloną liczbą całkowitą 1.4(T - 1) prasy dźwigniowe, począwszy od dźwigni 1 (czyli 1, 1, 1, 2, 3, 5, 7, 10, 14, 20, 28, 40, 56, 79, 111, 155, 217, 304, 426, XNUMX, XNUMX, XNUMX, XNUMX) . Ten wymóg pracy staje się tak wysoki, że w końcu zwierzęta przestają reagować i osiągają „punkt przerwania”. Punkt przerwania został operacyjnie zdefiniowany jako całkowita liczba naparów uzyskanych przed trzydziestominutowym okresem, w którym nie uzyskano żadnych naparów.
Podawanie L-DOPA / Benserazyd
L-DOPA (L-3,4-dihydroksyfenyloalanina) podawano w połączeniu z obwodowo działającym inhibitorem dekarboksylazy DOPA, Benserazydem, w celu zmniejszenia obwodowego rozkładu L-DOPA (oba z Sigma, St. Louis, MO, USA). Oba leki rozpuszczono w soli fizjologicznej i podano dożylnie w objętości 1 ml / kg masy ciała. L-DOPA podawano 30 minut przed rozpoczęciem sesji przy 0, 10, 30 lub 90 mg / kg, podczas gdy benserazyd podawano konsekwentnie przy 2 mg / kg niezależnie od podanej dawki L-DOPA. W pierwszym zestawie badań (odpowiedź na dawkę) szczury były leczone L-DOPA w jeden dzień (Rys. 4). Żadna z zastosowanych dawek L-DOPA nie hamowała ogólnej sprawności ani nie powodowała dyskinezy. Aby uniknąć potencjalnie zakłócających efektów powtarzanego podawania L-DOPA, szczury szkolono bez leczenia L-DOPA po „sesjach L-DOPA”. W drugim zestawie badań zwierzęta leczono L-DOPĄ przed każdą sesją samo-podania przez okres do dwóch tygodni (Rys. 5). W trzecim zestawie badań szczury, które wykazywały zwiększone samopodawanie kokainy podczas LgA, były efektem dwustronnej infuzji L-DOPA (25 – 50 µg rozpuszczony w 0.5 µl ACSF do każdej półkuli; 0.25 µl / min; Sigma, St. Louis, MO, USA) i ACSF w VMS na temat zachowań związanych z przyjmowaniem leków. W dniach infuzji kaniulę zastępczą zastąpiono kaniulą infuzyjną 33, która wystawała 1.0 mm poza kaniulę prowadzącą. Wlewy podawano dziesięć minut przed rozpoczęciem sesji. Po wlewie kaniule pozostawiono na dwie minuty przed usunięciem, aby umożliwić dyfuzję leku.
Pomiary woltamperometryczne i analiza
W celu wykrycia dopaminy za pomocą cyklicznej woltamperometrii z szybkim skanowaniem podczas sesji eksperymentalnych (nagrania wykonywane podczas dwóch sesji w tygodniu), chronicznie wszczepione mikroczujniki z włókna węglowego podłączono do zamontowanego na głowie wzmacniacza woltamperometrycznego, połączonego z systemem zbierania danych i analizy danych sterowanym przez komputer. (National Instruments, TX, USA) przez elektryczne złącze obrotowe (Med Associates, VT, USA), które zostało zamontowane powyżej komory testowej. Skany woltamperometryczne powtarzano co 100 ms, aby uzyskać częstotliwość próbkowania 10 Hz. Podczas każdego skanowania woltamperometrycznego potencjał na elektrodzie z włókna węglowego był liniowo zwiększany od −0.4 V w stosunku do Ag / AgCl do + 1.3 V (przemiatanie anodowe) i wstecz (przemiatanie katodowe) w 400 V / s (całkowity czas skanowania 8.5-ms ) i przechowywane w −0.4 V między skanami. Gdy dopamina jest obecna na powierzchni elektrody, podczas utleniania anodowego ulega utlenieniu, tworząc dopaminę-o-chinon (reakcja szczytowa wykrywana w przybliżeniu + 0.7 V), która jest redukowana z powrotem do dopaminy w przemiataniu katodowym (szczytowa reakcja wykryta w około −0.3 V). Wynikający z tego strumień elektronów jest mierzony jako prąd i jest wprost proporcjonalny do liczby cząsteczek podlegających elektrolizie. Dane woltamperometryczne były filtrowane pasmowo w 0.025 - 2,000 Hz. Oddzielony w czasie, rozdzielony w czasie prąd uzyskany z każdego skanu dostarczył charakterystykę chemiczną charakterystyczną dla analitu, umożliwiając rozdzielenie dopaminy z innych substancji49. Dopaminę izolowano z sygnału woltamperometrycznego za pomocą analizy chemometrycznej przy użyciu standardowego zestawu treningowego25 w oparciu o elektrycznie stymulowane uwalnianie dopaminy wykryte przez przewlekle wszczepione elektrody. Stężenie dopaminy oszacowano na podstawie średniej czułości elektrod po implantacji25. Przed analizą średniego stężenia wszystkie dane zostały wygładzone za pomocą punktu 5 w ramach średniej testowej. Stężenie dopaminy uśredniono w ciągu siedmiu sekund (przybliżony czas trwania obserwowanego sygnału fazowego) po odpowiedzi operanta (po odpowiedzi) lub prezentacji warunkowej CS i porównano ze średnim stężeniem w ciągu dwóch sekund przed operantem odpowiedź (linia bazowa). CS był prezentowany bezwarunkowo podczas każdej sesji nagraniowej przeprowadzanej w drugim i trzecim tygodniu (dwa razy na sesję dla każdej sesji 20), ale nie w pierwszym tygodniu, aby uniknąć zakłóceń warunkowania asocjacyjnego między dostarczaniem leku a wskazówką w okresie gdzie to stowarzyszenie prawdopodobnie nadal się rozwijało.
Analiza statystyczna
Poszczególne sygnały elektrochemiczne uśredniono w ramach sesji samorządowej, a następnie w poprzek zwierząt i tygodni, aby zwiększyć moc statystyczną. Sygnały porównywano za pomocą wieloczynnikowych analiz ANOVA z odpowiedzią, regionem mózgu, spożyciem kokainy i tygodniem jako czynnikami. Dla porównania z danymi elektrochemicznymi dane behawioralne zostały również podzielone na tygodnie. W przypadku eksperymentów L-DOPA dane behawioralne (uśrednione dla dni podawanych w kolejnych dniach) odpowiedniego leczenia lekiem (brak leczenia, dawka L-DOPA lub nośnik) analizowano za pomocą wieloczynnikowych analiz ANOVA z leczeniem lekami, schematem treningowym, spożyciem kokainy, i tydzień jako czynniki. W przypadku istotnych efektów głównych lub interakcji przeprowadzono analizy post hoc P wartości zostały skorygowane zgodnie z metodą korekcji Holma-Bonferroniego dla wielokrotnych testów50. Wykresy wykonano przy użyciu Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Analizy statystyczne przeprowadzono za pomocą SPSS, wersja 17.0 (Chicago, IL, USA) i Prism. Dane są odpowiednie do parametrycznej analizy statystycznej. Zbieranie i analiza danych nie były przeprowadzane ślepo na warunki eksperymentów.
Weryfikacja histologiczna miejsc rejestracji
Po zakończeniu eksperymentów zwierzęta znieczulono dootrzewnowym zastrzykiem ketaminy (100 mg / kg) i ksylazyny (20 mg / kg). U zwierząt z implantami elektrodowymi miejsca rejestracji oznaczono zmianą elektrolityczną (300 V) przed perfuzją przezsercową solą fizjologiczną, a następnie 4% -paraformaldehydem. Mózgi usuwano i utrwalano w paraformaldehydzie przez dwadzieścia cztery godziny, a następnie szybko zamrażano w kąpieli izopentanowej, krojono na kriostacie (sekcje koronalne 50-µm, -20 ° C) i barwiono fioletem krezolowym, aby ułatwić wizualizację struktury anatomiczne i zmiany indukowane elektrodami lub miejsca infuzji.
Materiał uzupełniający
1
8
9
10
11
2
3
4
5
6
7
Podziękowanie
Dziękujemy Scottowi Ng-Evansowi, Christinie Akers Sanford, Chadowi Zietzowi, Nicole Murray i Danielowi Hadidi za wsparcie techniczne, a Monice Arnold i Jeremy Clark za przydatne opinie. Praca ta była wspierana przez niemiecką fundację badawczą (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG) Grant WI 3643 / 1-1 (IW), nagrody przyznawane przez Instytut Alkoholu i Leków (PEMP) oraz rektora University of Washington (PEMP) i instytuty narodowe of Health udziela T32-DA027858 (LMB), F32-DA033004 (PAG), P01-DA015916 (PEMP), R21-DA021793 (PEMP) i R01-DA027858 (PEMP).
Przypisy
Autorskie Wkłady
IW i PEMP zaprojektowali badania, IW, LMB i PAG przeprowadzili badania, a IW przeanalizowali dane; IW i PEMP napisali artykuł.
Autor informacji
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Referencje