Wystarczająca stymulacja neuroleptykami dopaminowymi mezolimbiny dla progresji do uzależnienia (2015)

 

Vincent Pascoli3,Jean Terrier3,Agnes Hiver

,Christian Lüscher'Informacje o korespondencji autora Christiana Lüscherahttp://www.cell.com/templates/jsp/_style2/_marlin/images/icon_email.pngWyślij wiadomość e-mail do autora Christian Lüscher

DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.neuron.2015.10.017

Najważniejsze

• Samostymulacja neuronu dopaminowego wywołuje plastyczność synaptyczną w NAc, prowadząc do nawrotu

• Dopamina wystarcza do wywołania kompulsywnego przyjmowania

• Neurony w korze oczodołowo-czołowej są nadpobudliwe u myszy odpornych na karę

• Chemogenetyczne zahamowanie OFC zmniejsza kompulsywną autostymulację

Podsumowanie

Czynniki powodujące przejście od rekreacyjnego zażywania narkotyków do uzależnienia pozostają w dużej mierze nieznane. Nie zbadano, czy dopamina (DA) jest wystarczająca do wywołania tego procesu. Tutaj stosujemy optogenetyczną autostymulację neuronów DA okolicy nakrywkowej brzusznej (VTA), aby wybiórczo naśladować definiującą podobieństwo leków uzależniających. Wszystkie myszy łatwo nabywały autostymulację. Po tygodniach abstynencji obserwowano nawrót wywołany wskazówką równolegle ze wzmocnieniem pobudzających aferentów do neuronów jądra półleżącego (NAc) z ekspresją receptora D1. Kiedy myszy musiały znieść lekki wstrząs w stopie, aby uzyskać stymulację, niektóre zatrzymały się, a inne wytrwały. Odporność na karę była związana ze zwiększoną aktywnością neuronalną w korze oczodołowo-czołowej (OFC), podczas gdy chemogenetyczne hamowanie OFC zmniejszało kompulsywność. Wszystkie te wyniki pokazują, że pobudzanie neuronów VTA DA wywołuje behawioralne i komórkowe cechy uzależnienia, wskazujące na wystarczającą ilość do wywołania i progresji choroby.

Wprowadzenie

Uzależnienie to choroba, która ewoluuje w kilku etapach (Everitt i in., 2008, George i in., 2014). Rozpoznanie stawia się, gdy rekreacyjne używanie staje się kompulsywne, utrzymujące się pomimo negatywnych konsekwencji. Podczas gdy wiodąca hipoteza dotycząca uzależnienia zakłada, że ​​nadużywane narkotyki powodują chorobę, ponieważ nadmiernie zwiększają stężenie dopaminy (DA) w mózgu, nie jest jasne, czy wyzwolenie tego systemu jest wystarczające, aby doprowadzić do przejścia z rekreacyjnego użytku na uzależnienie (Di Chiara i Bassareo, 2007, Volkow i Morales, 2015). Dowody potwierdzające hipotezę DA o wzmacnianiu działania leków gromadziły się przez kilka dziesięcioleci i opierają się na początkowym działaniu leków. Na przykład leki uzależniające obniżają próg samostymulacji wewnątrzczaszkowej (ICSS) przyśrodkowej pęczka przodomózgowia, czyli przewodu włóknistego zawierającego m.in. wstępującą projekcję DA z śródmózgowia (Stein, 1964, Crow, 1970, Kornetsky i in., 1979). Badania farmakologiczne i badania zmian chorobowych zidentyfikowały następnie mezokortykolimbiczny układ DA jako źródło tego obwodu (Wise i Bozarth, 1982). Pod koniec lat 1980. XX wieku bezpośredni pomiar pozakomórkowego stężenia DA z zastosowaniem mikrodializy potwierdziło, że uzależniające leki mają wspólną właściwość wywoływania gwałtownego wzrostu DA w NAc (Di Chiara i Imperato, 1988). Doprowadziło to do zaproponowania mechanistycznej klasyfikacji środków uzależniających (Lüscher i Ungless, 2006).

Znacznie mniej wiadomo o tym, jak te początkowe skutki używania narkotyków ułatwiają przejście w nałóg. Rozważano mechanizmy niezależne od DA, ponieważ uzależniające leki mają inne cele farmakologiczne. Na przykład kokaina, oprócz hamowania transportera DA (DAT), wiąże się również z SERT (transporter serotoniny) i NET (transporter norepinefryny), aby zmniejszyć odpowiednio wychwyt zwrotny serotoniny i noradrenaliny, zwiększając w ten sposób stężenie wszystkich głównych monoamin (Han i Gu, 2006, Tassin, 2008). Podobne obawy mogą dotyczyć innych psychostymulantów. Ponadto istnieje twierdzenie, że opiaty są, przynajmniej w początkowej fazie, niezależne od DA (Badiani i in., 2011, Ting-A-Kee i van der Kooy, 2012). Hipoteza DA została również zakwestionowana w oparciu o genetyczne modele myszy, w których po interferencji z systemem DA niektóre formy zachowań adaptacyjnych były nadal widoczne. Na przykład, myszy z nokautem DAT, które samodzielnie przyjmowały kokainę (Rocha i wsp., 1998) i znosząc syntezę DA, zarówno farmakologicznie (Pettit i wsp., 1984), jak i genetycznie (Hnasko i wsp., 2007), nie zdołały zapobiec samopodawaniu leku. lub uwarunkowana preferencja miejsca. Podczas gdy lepsze scharakteryzowanie tych myszy transgenicznych i generowanie nokautów podwójnych transporterów monoamin rozwiązało niektóre z tych problemów (Rocha, 2003, Thomsen i in., 2009), nie jest znana wystarczalność DA do wyzwolenia głównych cech uzależnienia. Aby obejść problemy związane z niespecyficznością, zdecydowaliśmy się zatem pozwolić myszom na samostymulację neuronów VTA DA przy użyciu podejścia optogenetycznego.

Niedawne badania wykazały, że aktywacja neuronów DA w śródmózgowiu może indukować preferencję miejsca (Tsai i in., 2009) lub wzmacniać zachowania instrumentalne (Adamantidis i in., 2011, Witten i in., 2011, Kim i in., 2012, Rossi i in., 2013, McDevitt i in., 2014, Ilango i in., 2014). Chociaż ta selektywna aktywacja szlaków DA potwierdza badania autostymulacji wewnątrzczaszkowej (ICSS) przeprowadzone ponad 30 lat temu w celu określenia układu nagrody (Fouriezos i wsp., 1978), nie udaje im się wykazać indukcji zachowań adaptacyjnych na późnym etapie, które definiuje uzależnienie, ani nie identyfikuje podstawowych adaptacji neuronalnych. Tutaj zastosowaliśmy manipulację optogenetyczną nie tylko po to, aby umożliwić bezpośrednie testowanie kryterium wystarczalności dla fazowej sygnalizacji DA w inicjowaniu wzmocnienia, ale także po to, aby przetestować przejście w uzależnienie.

Uderzającą obserwacją późniejszych stadiów choroby jest to, że nawet od najbardziej uzależniających narkotyków uzależnia się tylko część użytkowników (Warner i wsp., 1995, O'Brien, 1997). Uzależnieni ludzie będą nadal zażywać narkotyki pomimo negatywnych konsekwencji (patrz „Definicja uzależnienia” Amerykańskiego Towarzystwa Medycyny Uzależnień, DSM5, Amerykańskie Towarzystwo Psychiatryczne, 2013), zazwyczaj związanych z społecznymi i psychologicznymi porażkami, które często są opóźnione w czasie. Podobnie, u gryzoni mniej więcej jedno na pięć zwierząt, które samodzielnie przyjmują kokainę, jest ostatecznie klasyfikowane jako uzależnione (Deroche-Gamonet i in., 2004, Kasanetz i in., 2010; ale patrz George i in., 2014). Wytrwałość w przyjmowaniu narkotyków pomimo negatywnych konsekwencji można również modelować u gryzoni, wprowadzając prosty bodziec awersyjny do harmonogramu spożycia. Chociaż ludzka choroba jest bardziej złożona, łączenie kary z konsumpcją jest prostym modelem podstawowego składnika uzależnienia.

Tutaj użyliśmy łagodnego szoku stopy, aby ocenić jego konsekwencje dla samopodawania kokainy, sacharozy i samo-stymulacji optogenetycznej. Dalej badamy, czy autostymulacja neuronów DA może indukować dwa zachowania uzależniające - związane z sygnalizacją poszukiwanie nagrody i kompulsywność związane z konsumpcją pomimo negatywnych konsekwencji - i scharakteryzować plastyczność neuronalną związaną z tymi zachowaniami.

Efekt

Nabycie VTA DA Neuron Self-Stimulation

 

Aby kontrolować aktywność neuronu DA, wstrzyknęliśmy indukowalny przez Cre wirus związany z adenowirusem (AAV) za pomocą odwróconej otwartej ramki odczytu (DIO) z podwójnym płynem zawierającym ChR2 połączone ze wzmocnionym żółtym białkiem fluorescencyjnym (eYFP) (Atasoy i wsp., 2008, Brown i wsp., 2010) z VTA myszy DAT-Cre. Ponadto umieszczono światłowód, aby celować w VTA (ChR2, Patrz Eksperymentalne procedury). Specyfika ChR2 ekspresję potwierdzono przez kolokalizację eYFP z hydroksylazą tyrozynową (TH), enzymem niezbędnym do syntezy DA (Rysunek 1ZA). 

Po pierwsze, aby ustalić protokół stymulacji laserowej, myszy umieszczono w pudełku z operantami, gdzie mogły nacisnąć aktywną dźwignię, która wyzwalała szereg stymulacji laserowych, które były zróżnicowane (1, 2, 8, 32, 60 lub 120 serii) co dwie sesje. Aby naśladować fazowy wzorzec odpalania (Hyland i in., 2002, Mameli-Engvall i in., 2006, Zhang i in., 2009), typowo indukowany przez naturalną nagrodę (Schultz, 1998), zastosowaliśmy stymulację typu burst. Jedna seria składała się z pięciu impulsów lasera trwających 4 ms przy 20 Hz i była powtarzana dwa razy na sekundę. Okazało się, że myszy dostosowywały swoje zachowanie polegające na naciskaniu dźwigni w funkcji wybuchów na stymulację lasera, kontrolując w ten sposób całkowitą liczbę otrzymanych błyskówRysunek 1B). Zachowanie to przypominało samodzielne podawanie leków uzależniających, gdy zmieniano dawkę na wlew (Piazza i wsp., 2000). W kolejnych eksperymentach zdecydowaliśmy się na podanie 30 impulsów na naciśnięcie dźwigni, uzyskując połowę maksymalnej liczby impulsów (Rysunek 1B). Aby naśladować opóźnienie wzrostu DA typowo obserwowane przy podawaniu leków dożylnie (Aragona i in., 2008), opóźniliśmy stymulację laserem o 5 si dodaliśmy migające światło podpowiedzi na 10 s (Rysunek 1DO).

W ciągu 12 kolejnych dni pozwolono myszom na samostymulację maksymalnie 80 razy w ciągu 2 godzin. Myszy szybko zwiększyły tempo stymulacji laserowej, osiągając 80 stymulacji laserowych (LS) przed końcem pierwszej godziny sesji (Ryciny 1D i 1E). Szybko uzyskano rozróżnienie między aktywną i nieaktywną dźwignią, a liczba aktywnych dźwigni zwiększyła się odpowiednio wraz ze wzrostem harmonogramów o stałym stosunku (FR1, 2, 3) (Ryciny 1F i 1G). W eksperymentach kontrolnych z użyciem myszy DAT-Cre- mice lub myszy, które eksprymowały ChR2 w neuronach kwasu γ-aminomasłowego (GABA) (myszy GAD-Cre +, w celu ukierunkowania na neurony hamujące VTA), tempo autostymulacji było niskie i stale zmniejszało się w ciągu sesje. Dotyczyło to również dwóch zwierząt Cre +, w których walidacja post hoc wykazała, że ​​VTA nie był zainfekowany ChR2-eYFP (nie pokazano). Ponadto nie wykryto żadnej dyskryminacji między aktywną i nieaktywną dźwignią (Ryciny S1A i S1B).

Zaobserwowaliśmy, że myszy DAT-Cre + naciskały częściej na dźwignię aktywną niż jest to wymagane do stymulacji laserowej. W rzeczywistości takie „daremne” aktywne dźwignie stanowią ponad 30% wszystkich aktywnych dźwigni (Rysunek S2A) i wystąpiły - w miarę postępów sesji - głównie między cue i początkiem stymulacji laserowej (Ryciny S2B i S2C). To wyjątkowe zachowanie rozwinęło się podczas akwizycji i może odzwierciedlać impulsywne reakcje.

Podsumowując, aktywność wybuchu w neuronach VTA DA silnie wzmacnia odpowiedź dźwigni.

 

Okluzja stymulacji neuronowej VTA DA przez kokainę

Aby sprawdzić, czy samostymulacja neuronów VTA DA opiera się na tych samych obwodach mózgowych, które są celem leków uzależniających w celu wzmocnienia zachowania, wstrzyknęliśmy kokainę dootrzewnowo (ip) bezpośrednio przed sesjami samostymulacji (bezpłatny dostęp do lasera przez 45 minut, Rysunek 2ZA). Na początku, dobrze wytresowane zwierzęta naciskały około 400 razy, aby uzyskać 85 LS w 45 minut zgodnie z harmonogramem FR3. Po wstrzyknięciu kokainy wydajność spadła znacznie w sposób zależny od dawki do około 30 LS na 100 naciśnięć dźwigni przy najwyższej dawce (Rysunek 2B). Ta okluzja była najbardziej widoczna podczas pierwszych 30 minut sesji, odzwierciedlając farmakokinetykę leku (Rysunek 2DO). Eksperyment ten wskazuje, że wzmocnienie przez samo-stymulację optogenetyczną i wzmocnienie przez kokainę współdzielą obwody neuronalne.

Plastyczność synaptyczna związana z poszukiwaniem po wycofaniu

Aby dalej porównać optogenetyczną autostymulację z uzależniającymi lekami, zapytaliśmy następnie, czy myszy nawrócą do samostymulacji neuronów VTA DA po kilku tygodniach odstawienia. Ponieważ poszukiwanie leku związane ze wskazówkami jest ustalonym modelem nawrotu (Epstein i in., 2006, Soria i in., 2008, Bossert i in., 2013), umieściliśmy myszy z powrotem w komorze operacyjnej 30 dni po ostatniej samoocenie. sesja stymulacji, w której aktywne naciśnięcie dźwigni wyzwala teraz światło podpowiedzi bez stymulacja laserowa (Rysunek 3ZA). Solidne zachowanie poszukiwania związane z cue, wykazywane przez dużą liczbę aktywnych dźwigni, było widoczne tylko u myszy z ekspresją eYFP-ChR2 w neuronach VTA DA (DAT-Cre +, ale nie myszy DAT-Cre−, Rysunek 3B).

Wcześniejsze badania wykazały związek przyczynowy między nawrotem związanym ze wskazówkami a plastycznością synaps wywołaną przez kokainę w podtypie neuronów NAc z ekspresją DA D1R (Pascoli, Terrier i wsp., 2014). Dlatego, aby ocenić tę plastyczność synaptyczną, wygenerowaliśmy myszy DAT-Cre skrzyżowane z Drd1a-tdTomato myszy do identyfikacji podtypu średnich kolczastych neuronów (MSN) w NAc. Zamiast testu poszukiwania, przygotowano wycinki NAc, w których D1R-MSN były czerwone, kontrastując z zielonymi włóknami z neuronów VTA DA zainfekowanych flox-ChR2-eYFP (Rysunek 3DO). Zapisy patch-clamp całej komórki ex vivo ujawniły zależność między napięciem prostowniczym dla prądów postsynaptycznych wywołanych przez AMPAR (AMPAR-EPSC) a zwiększonym stosunkiem AMPAR / NMDAR (Ryciny 3D i 3E), w D1R-MSN, ale nie w D2R-MSN. Podobne wyniki uzyskane wcześniej po wycofaniu się z samodzielnego podawania kokainy wykazały łączną insercję brakującego GluA2 i zawierającego GluA2 AMPAR w oddzielnych wejściach do D1R-MSN (Pascoli, Terrier i in., 2014).

 

 

 

Samostymulacja pomimo kary

Używanie substancji pomimo negatywnych konsekwencji jest kolejną kluczową cechą definiującą uzależnienie (patrz definicja DSM5, American Psychiatric Association, 2013). Stworzono modele szczurzych (Deroche-Gamonet i wsp., 2004, Pelloux i wsp., 2007, Pelloux i wsp., 2015, Chen i wsp., 2013), w których szok elektryczny wprowadzony w harmonogramie samodzielnego podawania kokainy hamuje działanie kokainy spożycie u niektórych zwierząt. Po 12 dniach początkowej ekspozycji (akwizycji), myszom pozwolono na trzy dodatkowe sesje w FR3, ale ze zredukowanym odcięciem sesji (60 minut lub maksymalnie 40 nagród). Te trzy sesje posłużyły jako punkt odniesienia dla kolejnych czterech sesji, w których co trzecia stymulacja laserowa była połączona z wstrząsem stopy (500 ms; 0.2 mA) przewidzianym przez nową wskazówkę (Rysunek 4ZA). Intensywność i czas trwania wstrząsu stopy dostosowano tak, aby całkowicie tłumić naciskanie dźwigni dla nagrody sacharozy (patrz także dane poniżej). Harmonogram kary doprowadził do dwóch przeciwnych odpowiedzi behawioralnych (Rysunek 4B). Niektóre myszy szybko przestały reagować, gdy wprowadzono karę (zwaną „wrażliwą”), podczas gdy inne nadal odpowiadały, aby uzyskać maksymalną liczbę stymulacji laserowej i można je uznać za „odporne” na karę. Dwa skupiska zwierząt w pełni pojawiły się pod koniec czterech sesji karnych (Rysunek 4DO). „Odporne myszy” utrzymywały liczbę stymulacji laserowej (mniej niż redukcja 20%), podczas gdy „wrażliwe myszy” zmniejszały autostymulację o więcej niż 80%. Przy tych kryteriach nie można przypisać tylko jednego zwierzęcia (szare kropki). Ta obserwacja pokazuje, że wymuszona eksplozja wywołana przez samostymulację neuronów VTA DA jest wystarczająca do wywołania wytrwałości konsumpcji pomimo negatywnych konsekwencji u części myszy. Jako kontrolę, w niezależnej grupie myszy, u których ustalono oporność lub wrażliwość na karę związaną z autostymulacją, oceniano nocycepcję za pomocą testu ogonem. Nie wykryto różnicy w opóźnieniu wycofania ogona zanurzonego w gorącej wodzie między wrażliwą a odporną (Rysunek S3).

Następnie zapytaliśmy post hoc, czy jakaś szczególna cecha podczas fazy nabywania samostymulacji mogła przewidzieć odporność na karę. Wrażliwe i oporne myszy wykonały identyczną liczbę aktywnych i nieaktywnych naciśnięć dźwigni podczas sesji podstawowych, a wszystkie myszy osiągnęły maksimum 80 LS (Ryciny S4A i S4B), w podobnym czasie (Ryciny S4A i S4C). Podczas gdy ułamek daremnej aktywnej prasy dźwigniowej ponownie nie różnił się w obu subpopulacjach (Ryciny 4D i S4D), liczba daremnych naciśnięć dźwigni przed początkiem stymulacji laserowej stała się znacząco wyższa u myszy opornych pod koniec sesji akwizycji (Ryciny 4E i S4MI). Ponieważ zachowanie to rozwinęło się podczas nabywania, może przyczynić się, wraz z wrodzoną impulsywnością (Economidou i in., 2009, Broos i in., 2012, Jentsch i in., 2014), do ustalenia odporności na karę. Ponadto w dniu 11 przeprowadzono próbę współczynnika progresywnego w celu ilościowego określenia motywacji do stymulacji optogenetycznej (Richardson i Roberts, 1996). Myszy oporne wykazywały punkt przerwania nie różniący się statystycznie od wrażliwych myszy (Rysunek S4FA).

Odporność na karę za kokainę, ale nie za sacharozę

Aby sprawdzić, czy paradygmat konsumpcji pomimo szkodliwych konsekwencji wraz z impulsywnym naciskaniem dźwigni może również przewidywać kompulsywne przyjmowanie uzależniającego narkotyku, nowa kohorta myszy przeszła 12 dni samodzielnego przyjmowania kokainy. Eksperymentalne parametry nabywania kokainy do samodzielnego zażywania zostały ustawione na maksymalnie 80 infuzji kokainy w ciągu 4 godzin podczas nabywania i 40 infuzji w ciągu 2 godzin podczas trzech sesji wyjściowych poprzedzających cztery sesje kar (Ryciny 5A i S5ZA). Ponownie pojawiły się dwie grupy po sparowaniu kokainy z szokami elektrycznymi. Rzeczywiście, 5 z myszy 22 został sklasyfikowany jako odporny (mniej niż 20% spadek w stosunku do wartości wyjściowej), podczas gdy 17 zakwalifikował się jako wrażliwy (więcej niż spadek 80%) i jedno zwierzę padło pomiędzy (infuzje 13 w dniu 19) (Rysunek 5B). Następnie szukaliśmy behawioralnych predyktorów odporności na karę. Między dwiema grupami liczba wlewów, szybkość infuzji oraz liczba aktywnych lub nieaktywnych pras dźwigniowych nie różniły się (Ryciny S5B – S5D), a punkty zerwania były podobne (Rysunek S5MI). Różniła się ewolucja rozkładu w czasie daremnych naciśnięć aktywnej dźwigni. W pierwszych czterech sesjach daremne naciśnięcia dźwigni regularnie zmniejszały się podczas okresów przerwy u myszy odpornych i wrażliwych, podczas gdy pod koniec nabywania tylko wrażliwe myszy zachowywały to zachowanie (Ryciny 5C i 5D i S5FA). Natomiast odporne myszy miały tendencję do zwiększania całkowitej liczby daremnych naciśnięć dźwigni (Ryciny 5C i S5D), zwłaszcza w ostatnim kwartale okresu oczekiwania (Rysunek 5RE). Chociaż jakościowo podobna do obserwacji dokonanej uprzednio przy optogenetycznej stymulacji neuronów DA (patrz powyżej), skupienie daremnych naciśnięć podczas wczesnego okresu nie było obserwowane w przypadku kokainy, najprawdopodobniej z powodu wolniejszej kinetyki, z jaką lek zwiększone poziomy DA. Niemniej jednak podobne wnioski można wyciągnąć na podstawie tej pojedynczej ewolucji daremnego rozkładu prasy dźwigniowej w krótkim okresie czasu poprzedzającym „wewnętrzne wykrycie fali DA”. Nasze obserwacje sugerują zatem, że dystrybucja daremnych aktywnych dźwigniowych dźwigni prognozuje używanie narkotyków pomimo negatywnych konsekwencji.

W końcu powtórzyliśmy eksperyment z myszami karmionymi ad libitum, które mogły wywierać nacisk na nagrodę sacharozy. Po wprowadzeniu kary wszystkie myszy przestały samodzielnie podawać sacharozę (Rysunek 5E), wykazując, że ten harmonogram powstrzymał przyjmowanie nieistotnej nagrody naturalnej, ale umożliwił wykrycie kompulsywnego przyjmowania uzależniającego leku lub silnej stymulacji neuronu DA.

Podsumowując, wyniki te pokazują, że samostymulacja VTA DA jest wystarczająca do wywołania kompulsywności, jak pokazuje oporność na karę w podgrupie myszy (68%). Podobnie, po kokainie SA, niektóre myszy stały się odporne na karę (23%), co nigdy nie miało miejsca po sacharozie SA (Rysunek 5FA).

 

 

 

Komórkowy związek oporu z karą  

Aby określić obszar mózgu, który może kontrolować decyzję o wytrwaniu w samodzielnym podawaniu pomimo negatywnych konsekwencji, najpierw monitorowaliśmy ogólną „aktywność neuronalną”, licząc liczbę neuronów, w których sesja karna wyzwoliła ekspresję wczesnego genu cFos w 15 różne regiony. Myszy poddano perfuzji wewnątrzsercowej PFA 90 minut po zakończeniu ostatniej sesji karnej. Grupy kontrolne obejmowały zwierzęta naiwne, a także myszy zaprzężone w jarzmo z myszami wrażliwymi lub opornymi w celu kontrolowania możliwego zakłócającego wpływu liczby otrzymanych wstrząsów.

Podczas gdy w większości wybranych regionów, liczba neuronów dodatnich cFos była najwyższa w skrawkach od myszy opornych w porównaniu z plastrami myszy naiwnych, pojawiły się dwa typy odpowiedzi, z których przykładami są kora prelimbiczna (PL) i boczny OFC. W PL stwierdziliśmy podobny wzrost liczby komórek cFos-dodatnich w myszach opornych i ich kontrolowanych jarzmach, podczas gdy w OFC wzrost ten był widoczny tylko u myszy opornych, a nie odpowiadających myszy z jarzmem (Ryciny 6A i 6B). Aby określić ilościowo tę różnicę, wszystkie dane najpierw znormalizowano do poziomów ekspresji u zwierząt naiwnych. Następnie obliczono stosunek między odporną na wrażliwą podzieloną przez jarzmo na oporną na jarzmie na wrażliwą (stosunekcfos = (R / S) / (YR / YS), Rysunek 6B). Procedura ta zidentyfikowała zakrętkę obręczy, OFC i VTA jako regiony, które są aktywowane u opornych, ale nie u wrażliwych myszy, i gdzie była niewielka różnica w obu grupach kontrolnych z jarzmem (w rzeczywistości podobne neurony o niskim cFos-dodatnim jarzmie) . Znalezienie VTA nie jest zaskakujące, ponieważ jest to obszar neuronów stymulowanych laserem. Jest to zgodne z poprzednim raportem pokazującym, że stymulacja ChR2 wyzwala aktywację cFos (Lobo i in., 2010, Van den Oever i in., 2013). Niski stosunekcfos znaleziono w regionach, w których aktywacja była podobna we wrażliwych i odpornych (takich jak CeA i PAG). Stosunekcfos był również niski, gdy aktywacja była połączona z dużą różnicą w sterowaniu za pomocą jarzma (np. PL, Rysunek 6C dla wskaźnika sumarycznegocfos dane). Podobna ekspresja cFos u opornych i jarzmowych myszy opornych była zatem najprawdopodobniej spowodowana liczbą wstrząsów stóp i miała niewiele wspólnego z odpornością na karę. Łącznie wysoki współczynnikcfos w OFC sugeruje, że aktywność neuronalna w tym regionie wiąże się z odpornością na karę, a zatem może sprzyjać przejściu na uzależnienie.

 

 

 

Plastyczność dla oporu wobec kary  

Aby zidentyfikować substrat zwiększonej aktywności neuronalnej w OFC u myszy opierających się karze, przygotowaliśmy skrawki PL i L-OFC 24 godziny po ostatniej sesji karnej w celu zbadania pobudliwości wewnętrznej. Te dwa regiony wybrano ze względu na ich bardzo odmienny wzór ekspresji c-Fos w poprzednich eksperymentach. Pobudliwość neuronów określano ilościowo przez zliczanie liczby potencjałów czynnościowych (AP) wywołanych przez wstrzyknięcie wzrastających ilości prądu (od 0 do 600 pA) w zapisach całych komórek. Te nagrania ujawniły utrzymującą się hipo-pobudliwość w neuronach piramidalnych PL myszy opornych (i ich sprzężonej kontroli) w porównaniu z myszami wrażliwymi lub naiwnymi (Rysunek 7ZA). Reszta potencjału błonowego (RMP) zarejestrowanych neuronów nie różniła się między grupami eksperymentalnymi (Rysunek 7B). Wyniki te silnie sugerują, że pobudliwość neuronów w PL bezpośrednio koreluje z liczbą otrzymanych wstrząsów, a być może nie z decyzją przeciwstawienia się karze. To najprawdopodobniej odzwierciedla negatywną adaptację sprzężenia zwrotnego wywołaną pobudzeniem neuronalnym wywołanym wstrząsami stopy poprzedniego dnia. Natomiast neurony z L-OFC były bardziej pobudliwe tylko u myszy opornych. Pobudliwość neuronów z jarzmowych myszy nie różniła się od pobudliwości neuronów od naiwnych myszy, wykluczając efekt samego wstrząsu stopy (Ryciny 7C i 7D). Ta zwiększona aktywność neuronów OFC prawdopodobnie leży u podstaw ekspresji cFos i może prowadzić do oporności na karę.

 

Redukcja kompulsywności z hamowaniem chemogenetycznym OFC 

Aby zbadać przyczynowość między zwiększoną pobudliwością neuronów OFC a odpornością na karę, wyrażono hamujący DREADD (receptory projektanta aktywowane wyłącznie przez dopalacze: CamKIIα-hM4D) w neuronach piramidalnych OFC myszy DAT-Cre + (Rysunek 8ZA). W ostrych wycinkach z OFC, zastosowanie kąpieli CNO (N-tlenku klozapiny) wywołało powolny prąd zewnętrzny, prawdopodobnie za pośrednictwem kanałów GIRK, który został odwrócony przez bar (Ba2+), niespecyficzny bloker kanałów potasowych (Rysunek 8B). CNO przesunęło również krzywą wejścia / wyjścia w prawo (Rysunek 8DO). Myszy DAT-Cre + zakażone AAV1 / CamKIIα-hM4D-mCherry w OFC (Rysunek 8D) nabył paradygmat samostymulacji neuronu DA, po którym następują dwa kolejne bloki z harmonogramem kar, pierwszy w obecności CNO, a drugi bez CNO. Oba bloki zostały przerwane 6 dni bez kary (Rysunek 8MI). Pod koniec pierwszego bloku kary, w obecności CNO, tylko 5 myszy 16 był odporny (Rysunek 8F, lewy panel). Natomiast bez hamowania OFC, w drugim okresie karania, 14 z 16 sklasyfikowano jako „odporne” (Ryciny 8F, prawy panel i 8SOL). Innymi słowy, frakcja myszy opornych była istotnie niższa w obecności CNO w porównaniu z pierwszą kohortą myszy 34 testowanych wcześniej w tych samych warunkach (porównanie między grupami, Rysunek 8H) i stał się podobny do pierwszej kohorty bez CNO (porównanie wewnątrz grupy). Wreszcie, dla dziewięciu myszy, które zmieniły się z wrażliwych na oporne, CNO nie zmodyfikowało opóźnienia ogona po zanurzeniu w gorącej wodzie (Rysunek 8I).

Podsumowując, eksperyment ten pokazuje, że aktywność neuronów piramidowych OFC napędza decyzję o kontynuacji auto-stymulacji pomimo negatywnych konsekwencji, które stanowią kluczową cechę przejścia na uzależnienie u gryzoni.

Dyskusja 

Niedawno zaproponowany model uzależnienia rozróżnia trzy etapy postępu choroby: sporadyczne rekreacyjne zażywanie narkotyków, po którym następuje intensywne, długotrwałe, eskalowane używanie narkotyków i ostatecznie kompulsywne używanie związane z utratą kontroli (Piazza i Deroche-Gamonet, 2013; ale zob. George i in., 2014). Nasze badanie pokazuje, że stymulacja neuronów VTA DA jest wystarczająca do napędzania tej progresji w stosunkowo krótkim czasie.

Naśladując naturalnie występujący wzorzec wystrzeliwania seriami, efektywne uwalnianie DA jest wywoływane w docelowych regionach VTA, takich jak NAc (Bass i wsp., 2010). Dlatego poziomy DA w NAc prawdopodobnie rządzą samostymulacją, tak jak gryzonie samodzielnie podają kolejną infuzję kokainy lub heroiny, gdy stężenie DA spadnie poniżej progu (Wise i in., 1995). Potwierdza to również nasza obserwacja, że ​​kokaina we wstrzyknięciu dootrzewnowym może blokować autostymulację. Zatem autostymulacja neuronu DA bardzo przypomina samopodawanie leku, chociaż jego kinetyka jest z pewnością szybsza niż jakiejkolwiek substancji farmakologicznej, w tym kokainy, jak sugeruje różna szybkość odpowiedzi obserwowana w niniejszym badaniu.

Chociaż wybiórczo celowaliśmy w neurony DA w VTA, ich optogenetyczna autostymulacja może mieć aktywowane grupy komórek o różnych funkcjach fizjologicznych. Na przykład ostatnio zasugerowano, że niektóre neurony DA kodują bodźce awersyjne (Lammel i in., 2012, Gunaydin i in., 2014). Te komórki rzutują na mPFC, podczas gdy neurony VTA DA wystające do bocznej powłoki NAc pośredniczą w dodatnim wzmocnieniu (Lammel i wsp., 2012). Interesująca byłaby ocena samostymulacji i progresji z selektywnym celowaniem (Gunaydin i in., 2014). Ponieważ nasza manipulacja aktywowała wszystkie neurony VTA DA, tak jak kokaina działa na wszystkie neurony z ekspresją DAT, można sobie wyobrazić, że niektóre neurony DA napędzałyby uczenie się ze wzmocnieniem, podczas gdy inne neurony DA powodowałyby uczenie się niechęci. Efekt netto nadal byłby wzmocnieniem zachowania; Jednak „neurony awersji” mogą przyczyniać się do indukcji procesu przeciwnika (Koob, 2013, Wise i Koob, 2014).

Po wymuszonej abstynencji, ponowna ekspozycja na kontekst wywołała poszukiwanie samostymulacji, utrwalonego modelu gryzoni nawrotu narkotyków. Co ciekawe, podstawowa plastyczność neuronów jest nie do odróżnienia od tej obserwowanej po odstawieniu kokainy na własną rękę (Pascoli, Terrier et al., 2014). To uzupełnia badanie, w którym wcześniej donoszono o identycznej plastyczności synaptycznej w neuronach VTA DA wywołanej przez pojedynczą sesję stymulacji optycznej lub pierwsze wstrzyknięcie uzależniającego leku (Brown i in., 2010). Wyłania się wzorzec adaptacji synaptycznych, który jest typowym zachowaniem adaptacyjnym dla wszystkich środków odurzających.

Uderzającą cechą naszych badań jest dychotomia w odpowiedzi na bodziec awersyjny, który jest wystarczająco silny, aby zakłócić konsumpcję nieistotnej nagrody naturalnej u wszystkich zwierząt. W naszym przypadku myszy oporne nie wykazywały znacząco wyższej motywacji do samodzielnego dostarczania nagrody, co kontrastuje z badaniem z kokainą na szczurach (Pelloux i in., 2007). Jednak behawioralnym predyktorem odporności na karę u myszy było daremne naciskanie dźwigni w ciągu 5 sekund poprzedzających rozpoczęcie stymulacji neuronu DA. Niezdolność do czekania na dostarczenie nagrody można więc postrzegać jako marker impulsywności (Dalley i in., 2011, Olmstead, 2006, Everitt i in., 2008, Winstanley, 2011, Leyton i Vezina, 2014). Zaintrygowała nas obserwacja, że ​​impulsywne branie rozwinęło się dopiero po kilku sesjach samostymulacji. Stwarza to możliwość, że odporność na karę (a co za tym idzie podatność na uzależnienie) może nie być w pełni wrodzona, ale rozwija się w początkowych fazach uzależnienia. Jeśli tak jest, to dychotomia obserwowana przez nas i innych (Deroche-Gamonet i in., 2004) nie może być determinowana wyłącznie przez czynniki genetyczne. To by również wyjaśniało, że podobna część osobników uzależnia się od genetycznie względnie jednorodnych szczepów myszy iz pewnością bardziej zróżnicowanych genetycznie populacji ludzkich.

Jeśli odporność na karę ujawnia indywidualną podatność na uzależnienie, szacowaną na najwyższe 20% u ludzi, nawet z kokainą (Warner i in., 1995, O'Brien, 1997, George i in., 2014), to znacznie wyższy odsetek znaleziony tutaj może odzwierciedlać moc bezpośredniej i selektywnej stymulacji neuronu DA. Innymi słowy, selektywna stymulacja neuronów DA może być znacznie bardziej uzależniająca niż jakikolwiek lek. Można to wyjaśnić nieselektywnym działaniem substancji farmakologicznych. Na przykład w przypadku kokainy monoaminy inne niż DA mogą w rzeczywistości opóźniać indukcję uzależnienia. Rzeczywiście, serotonina może przeciwstawiać się zachowaniom adaptacyjnym zależnym od DA, takim jak reagowanie na warunkową nagrodę, samostymulację i warunkową preferencję miejsca (Wang i in., 1995, Fletcher i Korth, 1999, Fletcher i in., 2002), ułatwiając skojarzenie wskazówek na bodźce awersyjne (Bauer, 2015, Hindi Attar i in., 2012). Alternatywnie, różnica może polegać na różnicy w kinetyce między optogenetyczną autostymulacją a farmakologiczną indukcją zewnątrzkomórkowego wzrostu DA. Taka zmienność siły uzależnienia może również występować w przypadku różnych narkotyków (George i in., 2014).

Chociaż nie możemy formalnie wykluczyć różnic w uwalnianiu DA i / lub względnej sygnalizacji, aby przyczynić się do ustanowienia odporności na karę, scenariusz ten jest mało prawdopodobny, ponieważ histologiczna walidacja zakażenia zwierząt uwzględnionych w badaniu wykazała eYFP-ChR2 wyrażenie w całej VTA. Ponadto protokół stymulacji optogenetycznej zaprojektowany do nasycania uwalniania DA doprowadził do samostymulacji, która doprowadziła do unimodalnie rozłożonych wartości punktu załamania, odzwierciedlając motywację motywacyjną.

Kolejnym zaskakującym wynikiem jest korelacja liczby wyładowań elektrycznych stopy z pobudliwością neuronów w PL. Zmniejszoną pobudliwość neuronów piramidalnych i zwiększony stosunek AMPAR / NMDAR w neuronach piramidalnych tych samych komórek zaobserwowano u „uzależnionych szczurów”, jednak badania te nie kontrolowały wpływu wstrząsów elektrycznych per se (Kasanetz i in., 2010, Kasanetz i in., 2013, Chen i in., 2013). Brak dysocjacji można zatem wyjaśnić podwójną rolą mPFC zarówno w procesach decyzyjnych, jak i integracji strachu (Peters i in., 2009). Z drugiej strony, zmiana pobudliwości neuronów piramidalnych w korze podbrzusznej koreluje ze wstrząsami stopy (Santini i in., 2008). Dowody te nie wykluczają możliwości, że mPFC odgrywa pierwszoplanową rolę przy podejmowaniu decyzji o pobraniu. Jednak nasza analiza cFos i obserwacje wewnętrznej pobudliwości wskazują na OFC i kory zakrętu obręczy. Ponadto hamowanie pobudliwości neuronalnej w OFC za pomocą DREADD zapobiegało oporności na karę. Ten związek przyczynowy stanowi ważny krok w zrozumieniu mechanizmów komórkowych odpowiedzialnych za przejście do uzależnienia. Przyszłe badania będą potrzebne, aby sprawdzić, czy dotyczy to również całej gamy środków uzależniających.

Nasze ustalenia są zgodne z obserwacjami, że dysfunkcja OFC może utrudniać podejmowanie decyzji dotyczących kosztów i korzyści (Seo i Lee, 2010, Walton i in., 2010, Fellows, 2011) i może prowadzić do zachowań kompulsywnych (Burguière et al., 2013 ). U ludzi nadużywanie narkotyków wiąże się z zaburzeniami procesu podejmowania decyzji i zmienioną funkcją OFC (Lucantonio i in., 2012, Gowin i in., 2013). Podsumowując, aktywność neuronów OFC jawi się jako kluczowy determinant przejścia do kompulsywnego używania narkotyków (Everitt i in., 2007). Nie wyklucza to roli plastyczności wywołanej lekami w pobudzających aferentach do MSN obserwowanych tutaj i w innych badaniach (Kasanetz i in., 2010). Ciekawie będzie ocenić, czy manipulacje mające na celu kontrolowanie pobudliwości OFC wpływają na motywację u osób uzależnionych.

Tutaj proponujemy autostymulację neuronu DA jako potężny model do badania etapów prowadzących do uzależnienia. Odtwarzamy podstawowe elementy uzależnienia od narkotyków, takie jak nawrót choroby, plastyczność synaps, wytrwałość w konsumpcji pomimo negatywnych konsekwencji. Chociaż model z pewnością nie nadaje się do badania efektów specyficznych dla danego narkotyku (np. Porównanie opioidów z psychostymulantami), ma kilka zalet. Pozwala na precyzyjną kontrolę czasową dostarczania nagrody, bardzo specyficznie aktywuje tylko neurony VTA DA, a także daje możliwość badania myszy przez znacznie dłuższy czas niż przy samodzielnym podawaniu leku. Koncentrując się na definiowaniu podobieństwa narkotyków, istnieje nadzieja, że ​​uda się rozwikłać neuronalne mechanizmy leżące u podstaw uzależnień, także niezależnych od substancji (Alavi i in., 2012, Robbins i Clark, 2015), a tym samym przyczynić się do powstania ogólnej teorii choroba. Modele chorób optogenetycznych umożliwiają zatem decydujący krok w kierunku dogłębnego zrozumienia dysfunkcji neuronalnej występującej w późnych stadiach uzależnienia i będą stanowić wytyczne dla nowatorskich, racjonalnych metod leczenia choroby obecnie nieuleczalnej.

Autorskie Wkłady  

VP, JT i AH przeprowadzili eksperymenty behawioralne, podczas gdy VP wykonywał zapisy elektrofizjologiczne i koordynował analizę. Badanie zostało zaprojektowane i napisane przez wszystkich autorów.

Podziękowanie  

Prace były wspierane przez dotacje ze Szwajcarskiej Fundacji Narodowej i zaawansowanej dotacji ERC (MeSSI), Carigest SA, Academic Society of Geneva i Fondation Privée des Hopitaux Universitaires de Genève. JT jest doktorantką MD opłaconą przez Konfederację Szwajcarską.

 

Informacja uzupełniająca 

Dokument S1. Uzupełniające procedury eksperymentalne i rysunki S1 – S6

Tabela S1. Analizy statystyczne