PLoS ONE. 2010; 5(10): e15401.
Abstrakcyjny
Uzupełnianie wzorca, możliwość pobierania pełnych wspomnień zainicjowanych przez częściowe sygnały, jest krytyczną cechą procesu pamięci. Jednak niewiele wiadomo na temat mechanizmów molekularnych i komórkowych leżących u podstaw tego procesu. Aby zbadać rolę dopaminy w przywoływaniu pamięci, przeanalizowaliśmy heterozygotyczne myszy knockout transportera dopaminy (DAT+/−) i odkryli, że chociaż myszy te posiadają normalne uczenie się, konsolidację i przywoływanie pamięci w warunkach pełnej cue, to wykazują specyficzne deficyty w wypełnianiu wzorca w warunkach częściowej cue. Ta forma deficytu pamięci u myszy heterozygotycznych z nokautem transportera dopaminy może zostać odwrócona przez małą dawkę antagonisty dopaminy, haloperidolu, co dodatkowo potwierdza, że niezdolność do odzyskania wzorców pamięci jest wynikiem braku równowagi dopaminy. Dlatego nasze wyniki pokazują, że delikatna kontrola poziomu dopaminy w mózgu ma kluczowe znaczenie dla uzupełnienia wzorców podczas asocjacyjnego przywoływania pamięci.
Wprowadzenie
Przywoływanie pamięci polega na podsumowaniu wcześniej zdobytych informacji [1], [2]. W zależności od stanu warunków przywołania, przywołanie pamięci może wystąpić z większością lub wszystkimi napotkanymi wcześniej wskazówkami związanymi z uczeniem się (np. Jednoczesne widzenie osoby i słyszenie jej głosu lub powrót do swojego miasta rodzinnego, które niewiele się zmieniło itp.). Z drugiej strony, w wielu przypadkach odzyskiwanie pamięci ma miejsce zwykle, gdy obecne są tylko podzbiory początkowych wskazówek (np. Rekonstrukcja starych map ulic w swoim rodzinnym mieście, gdy tylko kilka starych zabytków pozostało niezmienionych). Jest to znane jako uzupełnianie wzorców, w którym mózg rekonstruuje i odzyskuje całe wzorce pamięci z częściowych zewnętrznych sygnałów lub samodzielnie zainicjowanych procesów wewnętrznych. Obecnie niewiele wiadomo na temat faktycznych mechanizmów molekularnych i komórkowych leżących u podstaw uzupełniania wzorców przywoływania pamięci. Jednak pojawiające się badania wskazują, że sygnalizacja monoaminowa może odgrywać rolę w odzyskiwaniu pamięci [3].
W tym badaniu postanowiliśmy zbadać, w jaki sposób modulujący dopaminergiczny dopamina odgrywa rolę w regulowaniu zakończenia wzoru pamięci podczas częściowego przywoływania pamięci. Dopamina jest kluczowym neuroprzekaźnikiem, który może wpływać na funkcje poznawcze, emocje i ruch. Nieprawidłowa transmisja dopaminergiczna jest powiązana z wieloma zaburzeniami psychiatrycznymi i neurologicznymi, w tym zaburzeniami koncentracji i nadpobudliwością (ADHD), schizofrenią i chorobą Parkinsona [4]-[8]. Chociaż neurony dopaminergiczne pochodzą tylko z brzusznej strefy nakrywkowej i istoty czarnej, ich wyniki pojawiają się niemal wszędzie w mózgu, w tym w korze przedczołowej, przyśrodkowym płacie skroniowym i hipokampie, regionach, o których wiadomo, że są aktywowane podczas odzyskiwania pamięcil [3], [9]-[14].
Należy również zauważyć, że dopamina była uważana za funkcjonalnie kluczową dla uwagi i pamięci roboczej, w której pośredniczą powyżej obszary mózgu [15]-[18], z których oba były związane z procesem pobierania pamięci w warunkach częściowej pamięci [19]. Jako podstawowy mechanizm komórkowy do zakończenia sygnalizacji dopaminy, transporter dopaminy (DAT), zlokalizowany w neuronalnych końcówkach presynaptycznych, ponownie wychwytuje dopaminę z szczeliny synaptycznej z powrotem do neuronów dopaminergicznych. Jako taki, DAT jest krytyczną cząsteczką w regulacji synaptycznych poziomów dopaminy, aw konsekwencji określa czasowy czas działania dopaminy na lokalne obwody nerwowe. Istotnie, genetyczny nokaut genu transportera dopaminy powoduje głębokie upośledzenia. Homozygotyczne myszy DAT-KO cierpią z powodu jawnych nieprawidłowości, w tym opóźnienia wzrostu, silnej nadpobudliwości lokomotorycznej i wielu innych upośledzeń, w tym deficytów przyzwyczajenia i interakcji społecznych, jak również upośledzonej motoryki jelit, kontroli oddechowej itp. [6], [20], [21]. Ogólne defekty u homozygotycznych myszy DAT-KO sprawiły, że mniej nadaje się do badania roli dopaminy w regulacji procesów pamięci.
Co ciekawe, heterozygotyczne myszy z nokautem (DAT+/− myszy), wciąż posiadające allel funkcjonalnego genu DAT, wydają się być całkiem normalne w swoich ogólnych zachowaniach [6], [20], [21]. Tak więc DAT+/− myszy mogą stanowić cenny model do badania niektórych delikatnych, ale ważnych fenotypów, takich jak procesy pamięci asocjacyjnej i powiązane mechanizmy regulowane przez obwód dopaminergiczny. Tutaj użyliśmy zestawu paradygmatów behawioralnych, aby ocenić funkcjonalne konsekwencje nierównowagi dopaminy na ukończenie wzoru podczas skojarzonego przywracania pamięci.
Efekt
Aby zbadać rolę dopaminy w odzyskiwaniu pamięci, wykorzystaliśmy heterozygotyczne myszy z nokautem transportera dopaminy (DAT+/−). Zastosowaliśmy zestaw podstawowych pomiarów behawioralnych, aby ocenić ich aktywność lokomotoryczną w otwartym polu (Rysunek 1A), występy Rotarod (Rysunek 1B i 1C) i stwierdzili, że te heterozygotyczne myszy z nokautem są całkowicie normalne. Potwierdziliśmy również, że DAT+/− myszy wykazują nieodróżnialne wyniki na poziomie lęku mierzonym przez podniesiony labirynt plus (Rysunek 1D).
Ponadto oceniliśmy podstawowe funkcje uczenia się i pamięci w DAT+/− myszy. Po pierwsze, wykorzystaliśmy test nowatorskiego rozpoznawania obiektów i zaobserwowaliśmy, że myszy te wykazywały całkowicie normalne wyniki behawioralne w testach retencji 1 w porównaniu z ich kontrolą typu dzikiego współmałżonka (Rysunek 1E). Co więcej, myszy te wykazują również normalną retencję warunkującą strach 1-dni, która jest nie do odróżnienia od myszy kontrolnych typu dzikiego (Rysunek 1F). Dlatego te wyniki sugerują, że DAT+/− myszy mają normalne funkcje uczenia się i pamięci w tych dwóch formach podstawowych testów pamięci.
Przestrzenny test pamięci odniesienia był wcześniej używany do oceny zakończenia przywoływania pamięci. Poddaliśmy DAT+/− myszy i kontrolki typu dzikiego do tego zadania. Korzystając z protokołu pamięci odniesienia przestrzennego, który został opisany wcześniej [22], wyszkoliliśmy te myszy w labiryncie wodnym z ukrytą platformą. Szkolenie składało się z czterech prób dziennie, z odstępem godzinnym między próbami. Odkryliśmy, że oba DAT+/− myszy i myszy typu dzikiego wykazywały porównywalną naukę i konsolidację pamięci w trakcie sesji dziennych 10 i przy podobnych prędkościach pływania (Rysunek 2A i 2B).
Następnie zbadaliśmy ich pamięć o ukrytej lokalizacji platformy, używając testu sondy (P1) w dniu 11, dzień po zakończeniu ostatniej sesji treningowej. Zgodnie z pomiarem zajętości kwadrantu, oba DAT+/− myszy i ich kontrolne mioty były w stanie skupić swoje poszukiwania w docelowym kwadrancie w obecności pełnych sygnałów (Rysunek 3A). Co więcej, DAT+/− myszy również wykazywały silną preferencję w obszarze platformy fantomowej i nie było różnicy w porównaniu z zajętością platformy kontrolnej (Rysunek 3B). Ponadto, zgodnie z oczekiwaniami, oba DAT+/− myszy i rodzeństwo z miotu typu dzikiego wykazywały znaczny wzrost liczby przepraw (Rysunek 3C). Zatem wszystkie te pomiary sugerują, że DAT+/− myszy mogą nauczyć się tego zadania normalnie i odzyskać tę pamięć asocjacyjną normalnie w warunkach pełnej pamięci.
Aby ustalić, czy delikatna równowaga dopaminy jest niezbędna do ukończenia wzoru w warunkach częściowego cue, przeprowadziliśmy drugi test sondy (P2) następnego dnia, usuwając trzy z czterech dystalnych wskazówek (dzień 12). Aby uniknąć możliwego wyginięcia z poprzedniej sesji przywoływania, wykonano jeszcze jeden blok (testy 4) szkolenia 1 godzinę po teście sondy P1. Podczas tej częściowej próby sondującej, podczas gdy myszy kontrolne kontynuowały koncentrację czasu poszukiwania w kwadrancie docelowym, a nie w innych ćwiartkach, DAT+/− myszy wykazywały tylko wydajność na poziomie przypadkowym, mierzoną zajętością docelowego kwadrantu (Rysunek 3D). Ponadto pomiar zajętości obszarów platformy fantomowej dodatkowo potwierdził, że te DAT+/− myszy były upośledzone w zapamiętywaniu lokalizacji platformy (Rysunek 3E). Ten deficyt pobierania został również wykazany przez brak wzrostu liczby przekroczeń platformy (Rysunek 3F), podczas gdy myszy typu dzikiego z miotu były w pełni zdolne do przywrócenia pamięci częściowej. Dlatego te dane sugerują, że DAT+/− myszy nie są w stanie odzyskać pamięci odniesienia przestrzennego w warunkach częściowej pamięci.
Na koniec zapytaliśmy, czy moglibyśmy przywrócić ukończenie wzorca w tych DAT+/− myszy za pomocą metod farmakologicznych. Doniesiono, że niska dawka antagonisty dopaminy, haloperidolu, może być przydatna w łagodzeniu pewnych zaburzeń dopaminowych [20]. Uzasadnieniem jest to, że niska dawka haloperidolu może być w stanie nieco osłabić wpływ podwyższonej dopaminy u heterozygotycznych myszy, które mają niewystarczający wychwyt zwrotny dopaminy z powodu utraty jednego allelu normalnego genu transportera dopaminy. Zastosowaliśmy ten sam zestaw myszy do eksperymentu ratunkowego. W dniu 13 i dniu 14 poddaliśmy powyższe myszy trzeciej próbie próbnikowej (P3) w warunkach pełnej pamięci i czwartej próbie sondującej (P4) w warunkach częściowego wskazania. Ponownie, w celu przeciwdziałania wygaszeniu, które mogło mieć miejsce podczas próby sondującej, przeprowadziliśmy jeszcze jeden blok (próby 4) treningu 1 po zakończeniu testu P2 lub P3. Nasze pomiary zajętości kwadrantu docelowego w teście sondy P3 pokazują, że oba DAT+/− myszy i rodzeństwo kontrolne skoncentrowały swoje poszukiwania w kwadrancie docelowym w obecności pełnych sygnałów (Rysunek 4A). Co więcej, ich normalne przywołanie pamięci zostało ponownie potwierdzone przez pomiar zajętości platformy (Rysunek 4B), a także liczbę skrzyżowań platform (Rysunek 4C). Zatem te zmutowane myszy były w pełni zdolne do odzyskiwania pamięci przestrzennej w warunkach pełnej pamięci.
W dniu 14 usunęliśmy trzy z czterech dystalnych wskazówek i przeprowadziliśmy czwarte próby sondy (P4) w warunkach częściowej pamięci. Wstrzyknęliśmy DAT+/− myszy dootrzewnowo z małą dawką haloperidolu (0.002 mg / kg masy ciała) 30 minut przed testami retencji. Zwierzęta typu dzikiego z miotu otrzymywały zastrzyk soli fizjologicznej jako kontrolę. Odkryliśmy, że DAT+/− myszy skoncentrowały swój czas poszukiwania w docelowym kwadrancie i wykazały statystycznie podobne wyniki w porównaniu z odpowiednikami typu dzikiego (Rysunek 4E). Ponadto pomiar zajętości obszarów platformy fantomowej dodatkowo potwierdził, że te DAT+/− myszy mogą przypomnieć sobie lokalizację platformy (Rysunek 4F). Ich normalne przywołanie pamięci zostało ponownie potwierdzone przez wzrost liczby skrzyżowań platform, który był na tym samym poziomie, co myszy typu dzikiego (Rysunek 4G). Eksperymenty te sugerują zatem, że deficyty ukończenia wzoru pierwotnie zaobserwowano w DAT+/− myszy mogą być spowodowane brakiem równowagi dopaminy.
Aby wykluczyć możliwość, że wyniki fenotypu, do którego wstrzyknięto haloperidol w próbie sondy P4, było spowodowane przetrenowaniem podczas powtarzanych testów sondy, użyliśmy innego zestawu DAT+/− i kontroluj mioty i powtórz cały eksperyment. Zgodnie z oczekiwaniami, oba DAT+/− myszy i ich myszy typu dzikiego wykazywały dobre wskaźniki uczenia się podczas sesji treningowych 10 (Rysunek 5A). W dniu 11 poddaliśmy te myszy testom przywoływania pełnej pamięci, nie ma znaczącej różnicy w wynikach testu pamięci między DAT+/− myszy i kontrolne mioty z miotu, mierzone za pomocą kwadrantu zajętości (Rysunek 5B), obłożenie docelowego kwadrantu (Rysunek 5C), a liczba skrzyżowań platform (Rysunek 5D). Godzinę po zakończeniu pełnego testu sondy przekwalifikowaliśmy te myszy jeszcze jednym blokiem treningowym, aby zapobiec efektowi wygaszania. W dniu 12 myszy te poddano częściowym testom przywoławczym. Niską dawkę haloperidolu (lub soli fizjologicznej) dla kontroli wstrzyknięto myszom dootrzewnowo 30 minut przed próbą z częściowym wskazaniem. Stwierdziliśmy, że to leczenie rzeczywiście doprowadziło do normalnej wydajności u zmutowanych myszy. Myszy zmutowane i kontrolne wykazywały porównywalne wyniki w zajmowaniu kwadrantu (Rysunek 5E), obłożenie docelowego kwadrantu (Rysunek 5F), a liczba skrzyżowań platform (Rysunek 5G). Pomiar prędkości ich pływania również nie wykazał różnic (Rysunek 5H). Dlatego te dane wyraźnie pokazały, że uratowany niedobór częściowego odzyskiwania pamięci w DAT+/− myszy przez haloperidol nie były spowodowane powtarzającym się przetrenowaniem podczas wielu prób sondujących.
Dyskusja
Podczas gdy system dopaminy jest dobrze znany jako kluczowy element regulacji wielu procesów poznawczych [8], [16]-[18], [23]-[25], nasze obecne badanie dostarcza po raz pierwszy dowodów, że brak równowagi dopaminy, wynikający z utraty jednego allelu normalnego genu transportera dopaminy, spowodował specyficzny deficyt ukończenia wzoru podczas skojarzonego przywoływania pamięci przestrzennej. Ten deficyt przywoływania pamięci jest widoczny tylko w warunkach częściowej pamięci przestrzennej, ale nie w warunkach pełnej pamięci. Co więcej, ten deficyt przywoływania pamięci wydaje się odzwierciedlać wysoce specyficzną formę deficytu pamięci, ponieważ szerokie aspekty podstawowych zachowań (lokomocji otwartej, rotarod i lęku) oraz innych form pamięci, takich jak kontekstowe warunkowanie strachu i nowe rozpoznawanie obiektów, pozostają normalne.
Istnieje kilka potencjalnych molekuł i scenariuszy komórkowych, które łącznie mogą przyczynić się do obserwowanego przestrzennego częściowego wyzwalania deficytu przypomnienia, wśród których uważa się, że dopamina jest główną cząsteczką kandydującą leżącą u podstaw tego procesu pamięci, ponieważ jest to uwaga i pamięć robocza, głównie kontrolowana przez doniesiono, że sygnały dopaminy są krytyczne dla odzyskiwania pamięci przestrzennych [15]-[18], [26]. Powszechnie wiadomo, że neurony dopaminergiczne, pochodzące tylko z brzusznej strefy nakrywkowej i istoty czarnej zwartej, wystają prawie wszędzie w mózgu, w tym do kory przedczołowej, przyśrodkowego płata skroniowego i hipokampa [5], [19], [27]-[28], regiony, o których wiadomo, że są aktywowane podczas pobierania pamięci, jak również procesy uwagi [3], [9]-[14], [29], [30]. Biorąc pod uwagę szeroki dowód, że dopamina jest niezbędna dla uwagi i pamięci roboczej [15]-[18] i że uważa się, że polimorfizm genetyczny w genie DAT jest związany z ADHD [31]-[33], jest możliwe, że zarówno uwaga, jak i pamięć robocza mogą odgrywać rolę w uzupełnianiu wzorców przywracania pamięci w warunkach częściowej cue poprzez regulację dopaminy za pośrednictwem DAT. Zatem deficyty uzupełniania wzorców pamięci obserwowane u myszy z mutacją heterozygotyczną DAT mogą być spowodowane niezdolnością myszy do sprostania zwiększonym wymaganiom uwagi podczas częściowego przywoływania pamięci opartego na wskazówkach w wyniku synaptycznego zaburzenia dopaminy.
Nasze odkrycie, że brak równowagi dopaminowej spowodował deficyt pamięci, jest również interesujące w świetle klinicznej demencji obserwowanej u pacjentów z chorobą Parkinsona. Wydaje się, że ci pacjenci zwykle zachowują zdolność uczenia się, konsolidacji i przechowywania nowej pamięci, ale są głęboko upośledzeni w odzyskiwaniu wspomnień, szczególnie w przypadku częściowych zewnętrznych sygnałów lub przywołania z własnej inicjatywy. [34], [35]. Ten deficyt jest szczególnie głęboki, gdy brakowało wyraźnych wskazówek [8], [23], [34]-[36], co dodatkowo wskazuje, że dopamina może być zaangażowana w proces przypominania sobie. Tego typu deficyty pamięci u pacjentów z chorobą Parkinsona wyraźnie kontrastują z deficytami pamięci w innych układach neuroprzekaźnikowych [37] lub wczesna demencja u pacjentów z chorobą Alzheimera, którzy zwykle mają problemy z uczeniem się i utrwalaniem nowych wspomnień, zachowując jednocześnie zdolność do przywoływania starych wspomnień [34], [35]. To ilustruje potrzebę opracowania różnych strategii terapeutycznych ze względu na różne podatności na różne procesy molekularne i czasowe w obwodach pamięci.
Nasza demonstracja, że ukończenie wzoru można całkowicie uratować poprzez wstrzyknięcie haloperiodolu w momencie wycofania, wzmacnia koncepcję roli zrównoważonych poziomów dopaminy w odzyskiwaniu pamięci. Ten farmakologiczny eksperyment ratunkowy dostarcza dodatkowych dowodów na swoistość czasową, która powoduje częściowy deficyt przywoływania oparty na sygnalizacji. Należy zauważyć, że dysfunkcje dopaminy w DAT+/− Myszy i pacjenci z chorobą Parkinsona znacznie się od siebie różnią, ale oba prowadzą do deficytów w odzyskiwaniu wzorców. Ta wspólność zapewnia zbiorowe poparcie dla poglądu, że delikatna równowaga układu dopaminowego ma kluczowe znaczenie dla odzyskiwania pamięci, a brak równowagi w dowolnym kierunku (w górę lub w dół) może powodować deficyty w uzupełnianiu wzorców pamięci podczas przypominania. Co ważne, chcielibyśmy zwrócić uwagę, że nasza obecna analiza nie powinna być interpretowana jako dowód na wykorzystanie zmutowanych myszy DAT jako modelu choroby Parkinsona. Z drugiej strony, in vivo pomiar dopaminy w homozygotycznych myszach z nokautem DAT wykazuje znaczne zmniejszenie uwalniania dopaminy wywołane stymulacją rozerwania [38]-[40]. Wskazuje to, że zdolność do tłumaczenia wybuchu aktywności nerwowej na sygnały dopaminy w różnych obszarach mózgu myszy pozbawionych nokautu może być niewystarczająca. Można sobie wyobrazić, że zmniejszone zmiany stosunku dopaminy mogą prowadzić do zmian fizjologicznych we wzorcach wyładowań w obwodach nerwowych zaangażowanych w przetwarzanie pamięci. Obecnie nie wiadomo, czy podobna zmiana występuje również u heterozygotycznych myszy z nokautem DAT czy u pacjentów z chorobą Parkinsona.
Chociaż niewiele wiadomo na temat obwodów neuronowych aktywowanych podczas przywoływania pamięci przestrzennej, jest prawdopodobne, że rekrutuje on wiele regionów, w tym korę przedczołową, przyśrodkową korę skroniową i hipokamp. Dobrze pasuje to do anatomicznych dowodów, że dopaminergiczne wyniki z obszaru brzusznej nakrywki wywierają silny wpływ na brzuszny obszar CA1 i korę śródwęchową[13], [28]. Ta pętla przedczołowo-hipokampa-VTA może odgrywać kluczową rolę w generowaniu kontekstowej znajomości, co z kolei sprzyja zakończeniu wzorców podczas częściowego przywoływania pamięci przestrzennej opartej na sygnalizacji poprzez ułatwienie uwagi regulowanej dopaminą [3], [14], [26], [28]. W przyszłych badaniach ważne będzie dalsze zdefiniowanie loci anatomicznych, z których pochodzą obserwowane deficyty ukończenia wzoru. Szczególnie interesujące byłoby zbadanie miejsc kandydujących, takich jak przednia kora obręczy, kora skroniowa i hipokamp przy użyciu technik zapisu farmakologicznego, genetycznego i na dużą skalę in vivo [11], [41]-[44]. Ważne jest również, aby ocenić, czy kompensacja genetyczna lub powolne zmiany w zmutowanym mózgu przyczyniają się do zaobserwowanych deficytów przywoływania. Istnieją również wskazania, że inne układy neuroprzekaźników mogą być również krytycznie zaangażowane w regulację pobierania pamięci [3], [37], [45], [46]i byłoby bardzo interesujące zbadanie i porównanie ich dynamicznych interakcji między zakończeniem częściowego wyzwalania wzorca a pełnym pobieraniem pamięci opartym na pamięci. Podsumowując, nasze badanie sugeruje, że delikatna równowaga w poziomach dopaminy jest kluczowa dla ukończenia wzoru podczas skojarzonego przywoływania pamięci przestrzennej.
Materiały i Metody
Oświadczenia etyczne
Wszystkie prace na zwierzętach opisane w badaniu zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi NIH i zatwierdzone przez Institutional IACUC Committee w Medical College of Georgia (numer zatwierdzenia AUP: BR07-11-001).
Produkcja i genotypowanie zmutowanych myszy
Myszy DAT były hojnym prezentem od laboratorium dr XiaoXi Zhuang z University of Chicago. Hodowla i genotypowanie myszy heterozygotycznych DAT z heterozygotami są takie same jak opisano [6]. W naszych doświadczeniach zarówno samce, jak i samice myszy były w równym stopniu stosowane w stosunku 1![[stosunek]](http://www.ncbi.nlm.nih.gov/corehtml/pmc/pmcents/x2236.gif){kind=small}
1. PCR dla DAT+/− myszy poddano opisanemu protokołowi [6]. Wszystkie myszy utrzymywano w standardowych warunkach (23.1 ° C, wilgotność 50.5%) w Animal Facility Medical College of Georgia. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w dźwiękoszczelnym i wyspecjalizowanym pokoju. Wszyscy eksperymentatorzy byli ślepi na genotyp pojedynczego zwierzęcia.
Zadanie rozpoznawania nowych obiektów
Protokół eksperymentalny był taki sam jak opisano wcześniej [37], [47]. W skrócie, myszy przyzwyczajano indywidualnie do pudełka z otwartym polem (20 × 20 × 10 wysokie cale) dla dni 3. Podczas sesji treningowych dwa nowe obiekty zostały umieszczone w otwartym polu, a zwierzę pozwolono zbadać w 15 min. Rejestrowano czas poświęcony na eksplorację każdego obiektu. Podczas jednogodzinnych testów przywoływania zwierzę umieszczono z powrotem w tym samym pudełku, w którym jeden ze znanych przedmiotów podczas treningu został zastąpiony nowym obiektem i pozwolono mu swobodnie eksplorować przez 15 min. Do pomiaru pamięci rozpoznawania wykorzystano indeks preferencji, stosunek czasu spędzonego na eksploracji dowolnego z dwóch obiektów (sesji treningowej) lub nowatorskiego (sesji retencyjnej) przez całkowity czas spędzony na badaniu obu obiektów.
Testy Open Field i Rota-rod
Protokoły były takie same jak opisano [48]. Do pomiaru aktywności w otwartym polu myszy umieszczano w otwartym polu z czarnej skrzynki 14 × 14. Pole oznaczono małymi kwadratowymi siatkami 2 × 2 (kwadraty 7 przez kwadraty 7 łącznie z kwadratami 49). Aktywność zwierząt w otwartym polu mierzono liczbą krzyży, które przeszły myszy w okresie 3-minut. Do pomiaru testu prętów Rota myszy umieszczono w przyspieszającym obracającym się pręcie drzewnym. Wędka ma długość 12 i średnicę 1. Początkowa prędkość obrotowa wynosiła 4 rpm, a następnie stopniowo przyspieszano do 40 rpm. Wydajność mierzono przez czas (w sekundach), jaki myszy zdołały pozostać na obracającym się pręcie podczas pięciominutowych lub jednogodzinnych testów przywoływania.
Testy podwyższonego labiryntu plus
Protokoły były takie same jak opisano [49]. Podwyższony labirynt wykonany jest ze stali nierdzewnej, która jest pomalowana na czarny mat, i składa się z czterech ramion (dwa otwarte bez ścian i dwa zamknięte przez wysokie ściany 15.25 cm) 30 cm długości i 5 cm szerokości. Każde ramię labiryntu jest przymocowane do mocnych metalowych nóg, tak że jest uniesione 40 cm nad stołem, na którym spoczywa. Aktywność została zarejestrowana za pomocą aparatu cyfrowego (Logitech Camera, Model No. N231) umieszczonego 130 cm nad labiryntem. Testy odbywały się przy słabym świetle (jedna 40-W i jedna miękka biała żarówka 60-W, obie ustawione pod kątem, aby stworzyć pośrednie oświetlenie labiryntu) w fazie świetlnej cyklu dobowego (między 0900 h a 1400 h). Labirynt oczyszczono za pomocą 5% kwasu octowego między testami. Biały szum (30 dB) maskował zewnętrzne szumy tła. W dniu testu zwierzęta wprowadzano do pomieszczenia testowego w ich klatkach domowych, a następnie każdą parę zwierząt usuwano z klatki domowej i umieszczano w oddzielnej klatce trzymającej na 5 min przed umieszczeniem w labiryncie. Zwierzęta umieszczano pojedynczo w środku labiryntu, z pozycją głowy równoważoną między myszami, a zachowanie rejestrowano dla 5 min. czas spędzony na otwartym ramieniu i zamkniętym ramieniu (gdy wszystkie cztery łapy gryzonia znajdują się na otwartym lub zamkniętym ramieniu) zostały zarejestrowane i przeanalizowane.
Kontekstowe kondycjonowanie strachu
Kondycjonowanie strachu przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem [45]. Eksperyment przeprowadzono w systemie kondycjonowania strachu, komorze umieszczonej w tłumionym dźwiękiem pudełku ze światłem domowym na suficie i podłogą ze stali nierdzewnej (Coulbourn Instruments, Whitehall, PA). Podłoga siatki została podłączona do generatora uderzeń i sygnał dźwiękowy pochodzi z głośnika przymocowanego do ściany komory. Wszystkie bodźce były kontrolowane automatycznie przy użyciu komputera osobistego z programem stanu graficznego. Przed klatką umieszczono kamerę wideo, aby rejestrować zachowanie. Myszy traktowano przez 3 dni, a następnie przyzwyczajono do komory treningowej na 5 min. Zastosowanym bodźcem warunkowym (CS) był dźwięk 85 dB przy 2.8 kHz, podczas gdy bodziec bezwarunkowy (US) był ciągłym szokowym szokiem przy 0.8 mA dla 2 s. Po pojedynczym ko-zakończeniu parowania CS / US, zwierzę pozostało w komorze na kolejny 30 dla pomiaru natychmiastowego zamrożenia. Podczas testu retencji, każdą mysz umieszczono z powrotem w tej samej komorze, a reakcje zamrażania rejestrowano dla 5 min (kontekstowa reakcja zamrażania). Wszystkie testy zostały nagrane na wideo pod czerwonym światłem. Całkowity czas zamrażania mierzono jako wskaźnik pamięci strachu. Zachowanie polegające na zamarznięciu zostało zdefiniowane jako całkowity brak ruchu, z wyłączeniem oddychania. Zachowanie polegające na zamrożeniu oceniano za pomocą oprogramowania (Coulbourn Instruments) i przekształcano w reakcję zamrażania [odpowiedź zamrażania 
= (całkowity czas zamrażania / całkowity czas testowania) × 100%].
Przestrzenne testy pamięci odniesienia
Testem pamięci przestrzennej był labirynt wodny z ukrytą platformą. Przestrzegaliśmy protokołu opisanego wcześniej przez Nakazawa i in. [22]. Szkolenie składało się z czterech prób dziennie, z jedną godziną między próbami. Ruch myszy śledzono za pomocą kamery wideo i mierzono za pomocą oprogramowania (Noldul Information Technology, Holandia). Rejestrowano i analizowano opóźnienie ucieczki na platformę, a także zajętość kwadrantu i skrzyżowanie platformy. Basen ma średnicę 118 cm, a platforma ma średnicę 9.5 cm. Przeprowadzono cztery testy sondujące. Pierwszy test sondy (P1) przeprowadzono następnego dnia po ostatniej sesji treningowej w warunkach pełnej pamięci (Day 11). Drugi test sondy (P2) przeprowadzono w dniu 12 w warunkach częściowego cue (przez usunięcie trzech z czterech wizualnych wskaźników zawieszonych na czarnej ścianie kurtynowej). Dla DAT+/− Myszy, przeprowadziliśmy trzecią próbę sondującą (P3) w dniu 13 w warunkach pełnej pamięci i czwartą próbę sondującą (P4) w dniu 14 w warunkach częściowego wskazania. Kolejny blok (testy 4) szkolenia dostarczono 1 godzinę po odpowiednio testach P1, P2 i P3, w celu przeciwdziałania wygaszeniu, które mogło wystąpić podczas próby próbnej. Ponadto, aby wykluczyć efekt mieszający prawdopodobnego przetrenowania przed P4 (test sondy z częściową iniekcją cue i haloperidolu), poddaliśmy innej grupie DAT+/− myszy, jak również ich kontrolne zwierzęta z miotu typu dzikiego do dwóch dodatkowych testów sondą (próby P3 ′ i P4 ′). Test sondy P3 'przeprowadzono dzień po ostatniej sesji treningowej w warunkach full-cue (dzień 10). Test sondy P4 'przeprowadzono w dniu 11 w warunkach częściowej sygnalizacji. Podczas wszystkich naszych testów z sondą platformę usunięto, a myszy pozwolono pływać w basenie przez taki sam czas, jaki był używany podczas treningu (60 sekund). Rejestrowano czas spędzony w każdym kwadrancie. Aby przywrócić poziom dopaminy [6], [20], [21], myszy z DAT+/− a wszystkim grupom kontrolnym wstrzyknięto dootrzewnowo haloperidol (0.002 mg / kg masy ciała) lub solankę 30 minut przed próbami z sondami P4 i P4 '.
Analiza danych
Aby uwzględnić korelacje między zwierzętami między powtarzanymi pomiarami, zastosowano liniowe modele mieszane, aby oszacować zachowanie behawioralne w labiryncie wodnym Morrisa, nowe rozpoznanie obiektu, kontekstowe warunkowanie strachu i testy rotacyjne. Metoda Tukeya-Kramera została wykorzystana do określenia znaczenia tych pomiarów behawioralnych między DAT+/− myszy i inne z miotu kontrolnego. W otwartym terenie i testach z podniesionym labiryntem krzyżowym zastosowano jednokierunkową ANOVA i test post hoc Dunnetta do określenia efektów genotypowych. Zmienne ciągłe są przedstawiane jako średnia i błąd standardowy średniej (SEM). Dane analizowano za pomocą SPSS wersja 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Różnice uznawano za istotne, gdy P <0.05.
Podziękowanie
Dziękujemy dr Xiaoxi Zhuang z University of Chicago za udostępnienie DAT+/− Myszy KO i Brianna Klein za pomoc techniczną w eksperymentach.
Przypisy
Konkurujące interesy: Autorzy zadeklarowali, że nie istnieją konkurencyjne interesy.
Finansowanie: Badania te były finansowane ze środków NIMH (MH060236), NIA (AG024022, AG034663 & AG025918), USAMRA00002, Georgia Research Alliance oraz Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (10140900500) (wszystkie dla JZT). National Science Foundation of China (81000592), Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (10DZ2272200, 09DZ2200900, 10PJ1407500 i 10JC1411200), Shanghai Municipal Education Commission (11ZZ103) do FL i XMS. Finansiści nie brali udziału w projektowaniu badań, zbieraniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.
;