Optogenetyka ujawnia rolę neuronów kolczystokomórkowych o średnim poziomie ekspresji wyrażających receptory dopaminy D2 w indukowanym kokainą uczuleniu behawioralnym (2014)

Idź do:

Abstrakcyjny

Proponowano, że długotrwałe, indukowane lekami adaptacje w jądrze półleżącym (NAc) przyczyniają się do uzależniających zachowań uzależnionych od narkotyków. Tutaj zastosowaliśmy podejście optogenetyczne do zbadania roli średnich neuronów kolczystych NAc (MSN) wyrażających receptory dopaminy D2 (D2R) w indukowanym kokainą uczuleniu behawioralnym. Wektory wirusowe związane z adenowirusem kodujące kanał rodopsynę-2 (ChR2) dostarczano do NAc myszy transgenicznych D2R-Cre. Pozwoliło nam to selektywnie fotostymulować D2R-MSN w NAc. D2R-MSN tworzą lokalne obwody hamujące, ponieważ fotostymulacja D2R-MSN wywołała hamujące prądy postsynaptyczne (IPSC) w sąsiednich MSN. Fotostymulacja NAc D2R-MSN in vivo nie wpłynęło ani na inicjację, ani na ekspresję wywoływanego przez kokainę uczulenia na zachowania. Jednak fotostymulacja podczas okresu odstawienia leku osłabiała ekspresję indukowanego kokainą uczulenia behawioralnego. Wyniki te pokazują, że MSX D2R NAc odgrywają kluczową rolę w plastyczności wywołanej odstawieniem i mogą przyczyniać się do nawrotu po zaprzestaniu nadużywania leków.

Słowa kluczowe: optogenetyka, średnie neurony kolczaste, receptory dopaminy D2, kokaina, uzależnienie od narkotyków

Wprowadzenie

Sygnalizacja dopaminowa (DA) wiąże się z oczekiwaniem nagrody i zachowaniem ukierunkowanym na cel (Mądry, 2004; Goto and Grace, 2005; Berridge, 2007). Jedną z dobrze znanych patologii zaburzeń dopaminergicznych jest uzależnienie od narkotyków (Robinson i Berridge, 1993, 2003). Po wielokrotnym narażeniu na substancje uzależniające, zmiany adaptacyjne zachodzą na poziomie molekularnym i komórkowym w szlaku mezolimbicznym DA; mogą one prowadzić do uzależnienia od narkotyków, które jest przewlekłym, nawracającym zaburzeniem, w którym kompulsywne poszukiwanie narkotyków i zachowania związane z zażywaniem narkotyków utrzymują się pomimo ich poważnych negatywnych konsekwencji (Thomas i in., 2008; Baik, 2013). Charakterystyka modyfikacji zachodzących w mezolimbicznym układzie dopaminergicznym jest zatem kluczem do zrozumienia uzależnienia od narkotyków.

Receptory dopaminy D1 (D1R) i receptory D2 (D2R) są silnie eksprymowane w średnich neuronach kolczastych (MSN) prążkowia. Sugeruje się, że długotrwałe adaptacje narkotyków w prążkowiu brzusznym, lepiej znane jako jądro półleżące (NAc), przyczyniają się do rozwoju uzależnienia, jak również zachowań związanych z poszukiwaniem narkotyków i nawrotami (Lobo i Nestler, 2011; Smith i in., 2013). Ciała komórek dopaminergicznych z brzusznego obszaru nakrywkowego w większości unerwiają NAc. Ponad 95% komórek w NAc to MSN, które otrzymują pobudzające dane wejściowe z czterech głównych obszarów mózgu: kory przedczołowej, brzusznej części podrzędnej hipokampa, podstawy boczno-bocznej ciała migdałowatego i wzgórza (Sesack and Grace, 2010; Lüscher i Malenka, 2011). MSN w obrębie NAc można podzielić na dwie główne subpopulacje: bezpośrednie MSN szlaku, które wyrażają D1R i projektują bezpośrednio do obszarów DA śródmózgowia i pośrednie MSN szlaków, które wyrażają D2R i projektują do brzusznej bladości (Kreitzer i Malenka, 2008; Sesack and Grace, 2010; Lüscher i Malenka, 2011; Smith i in., 2013). Ponieważ MSN są GABAergiczne, aktywacja neuronów MSN będzie hamować ich dalsze cele, które są również GABAergiczne (Chevalier i Deniau, 1990). Dlatego aktywacja D1R-MSN pobudzi neurony DA śródmózgowia, co następnie przyczynia się do regulacji zachowań związanych z nagrodami (Lüscher i Malenka, 2011; Bocklisch i in., 2013).

Ostatnie badania z użyciem genetycznie zmodyfikowanych myszy, które eksprymują rekombinazę Cre w sposób specyficzny dla komórek, ujawniły różne role dla D1R-MSN i D2R-MSN w zachowaniach związanych z uzależnieniem od kokainy. Takie myszy umożliwiają genetyczne ukierunkowanie określonych toksyn, sond optogenetycznych lub DREADD (receptory projektowane wyłącznie przez projektowany lek) w celu selektywnego manipulowania D1R-MSN lub D2R-MSN. Podejście to doprowadziło do pewnego konsensusu co do roli MSN w zachowaniach uzależniających: D1R-MSN najwyraźniej promują zachowania uzależniające, podczas gdy dla D2R-MSNs nie zasugerowano żadnej konkretnej roli (lub roli hamującej) w rozwoju uzależnień uzależnionych od narkotyków (Hikida i in., 2010; Lobo i in., 2010; Ferguson i in., 2011; Bock i in., 2013). Ekspozycja na kokainę najwyraźniej indukuje modyfikację synaptyczną i zmiany w ekspresji genów w obu populacjach MSN (Lobo i in., 2010; Lobo i Nestler, 2011; Grueter i in., 2013). Chociaż wydaje się, że D1R-MSN i D2R-MSN odgrywają przeciwstawne role w uzależniających zachowaniach związanych z kokainą, dokładna rola MSN D2R nie jest jasna.

Wcześniej wykazano, że myszy z nokautem D2R (KO) wykazują normalne uwrażliwienie behawioralne za pośrednictwem kokainy i zachowania poszukujące kokainy, z tylko niewielkim spadkiem wrażliwości spowodowanym brakiem D2R (Baik i in., 1995; Chausmer i in., 2002; Sim i in., 2013). Jednak ekspozycja na stres podczas odstawiania leku hamuje ekspresję indukowanego kokainą uczulenia behawioralnego, jak również zachowań związanych z poszukiwaniem kokainy i nawrotami u myszy D2R KO (Sim i in., 2013). Specyficzne obniżenie D2R w NAc nie wpływa na podstawową aktywność lokomotoryczną, ani indukowaną kokainą uczuleniową behawioralność, ale nadaje zdolność stresu do hamowania ekspresji indukowanej kokainą uczulenia behawioralnego (Sim i in., 2013). Wyniki te silnie sugerują, że blokada D2R w NAc nie zapobiega uwrażliwieniu behawioralnemu za pośrednictwem kokainy. Raczej wydaje się, że D2R w NAc odgrywa wyraźną rolę w regulacji wywoływanych przez stres modyfikacji synaptycznych podczas wycofywania, co prowadzi do wzrostu zachowań związanych z poszukiwaniem kokainy i nawrotami (Sim i in., 2013).

Tutaj wykorzystaliśmy optogenetykę do dalszej oceny roli NAc D2R-MSN w indukowanym kokainą uczuleniu behawioralnym. Korzystając z wycinków mózgu, stwierdzamy, że fotostymulacja D2R-MSN aktywuje lokalne obwody hamujące w obrębie NAc z udziałem sąsiednich MSN. Fotostymulacja MSN D2R-MSN in vivo nie wpływa ani na inicjację, ani na ekspresję indukowanego kokainą uczulenia behawioralnego. Jednakże powtarzająca się aktywacja MSN NAc D2R podczas okresu odstawienia leku osłabia wywoływane przez kokainę zachowania uzależniające. Nasze wyniki pokazują, że D2R-MSN z NAc odgrywają kluczową rolę w plastyczności wywołanej odstawieniem i mogą przyczyniać się do nawrotu po zaprzestaniu nadużywania leków.

Materiały i metody

Myszy

Transgeniczne myszy D2-Cre BAC na tle C57Bl / 6 otrzymano z MMRRC (Mutant Mouse Regional Resource Centres, B6.FVB (Cg) -Tg (Drd2-cre) ER44Gsat / Mmucd). W eksperymentach behawioralnych, myszy z miotu pozbawione transgenu D2-Cre zastosowano jako kontrole dla myszy D2-Cre. Myszy utrzymywano w specyficznej, wolnej od patogenów barierze w stałych warunkach temperatury i wilgotności, oraz w ciemności 12-h light, 12-h. Opieka nad zwierzętami i obchodzenie się z nimi zostały przeprowadzone zgodnie z normami zatwierdzonymi przez Institutional Animal Care and Use Committees z Koreańskiego Uniwersytetu i KIST.

Przygotowanie wektora wirusa

pAAV-EF1a-DIO-hChR2 (H134R) -EYFP-WPRE został hojnie dostarczony przez Karl Deisseroth (Stanford Univ.). W celu przygotowania AAV, komórki HEK293T hodowano w pożywce DMEM z antybiotykami i FBS. Dzień przed transfekcją cztery płytki poza zbieżnością 90% z płytek 10-cm wysiano na pięć szalek 15-cm i inkubowano przez 18-22 h lub aż do 60 do konfluencji 70. Komórki HEK293T transfekowano pAAV-DIO-ChR2-EYFP, pAAV-DJ i pHelper stosując odczynnik do transfekcji jetPEI (QBiogene). Koktajl DNA / DMEM / PEI worteksowano i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 20 min. Po inkubacji mieszaninę transfekcyjną dodano do każdej szalki 15 cm. Transfekowane komórki zbierano 48 h po transfekcji i inkubowano z 0.5% deoksycholanem sodu (Sigma; D6750) i jednostkami 50 / ml nukleazy benzonazy (Sigma; E1014) w 37 ° C dla 1 h. Po usunięciu resztek komórkowych przez odwirowanie przy 3000 x g przez 15 min supernatant przesączono przez filtr PVDF 0.45 mm (Millipore). Oczyszczanie cząstek AAV-DJ przeprowadzono stosując kolumny powinowactwa do heparyny HiTrap (GE Healthcare). W celu zatężenia AAV zastosowano jednostki filtrów wirówkowych Amicon ultra-15 z odcięciem masy cząsteczkowej 100,000. Skoncentrowany wirus dzielono na porcje i zamrażano do przechowywania w -80 ° C. Końcowe stężenie wirusa wynosiło 3 ~ 6 × 1012 cząsteczki wirusa na ml dla każdego AAV.

Stereotaksyczny wtrysk i umieszczenie światłowodu

Zwierzęta znieczulono przez wstrzyknięcie ip 1.6 µl Zoletilu i 0.05 µl ksylazyny (Rompun, Bayer) na gram masy ciała i umieszczono w aparacie stereotaktycznym (David Kopf Instruments, Tujunga, CA). Do wstrzykiwania wirusów używano igły 31 G do strzykawki do obustronnego wlewu 2 µl wirusa do NAc pod kątem 0 ° (AP +1.7; ML ± 1.3; DV -4.5) z szybkością 0.1 ul / min. Igłę pozostawiono na miejscu przez 10 minut po wstrzyknięciu, po czym powoli ją wycofano. Kaniula światłowodowa do implantacji składała się z ferruli cyrkonowej (o średnicy 1.25 mm i długości 4.5 mm) oraz płaskiej końcówce światłowodu (o średnicy 200 µm). Wszczepienie kaniuli światłowodowej do NAc w celu naświetlenia D2-MSN przeprowadzono natychmiast po wstrzyknięciu wirusów. Współrzędne do implantacji kaniuli światłowodowej były następujące: kąt 0 ° (AP +1.7; ML ± 1.35; DV -4.2) w celu nakierowania na NAc. Aby pomóc zakotwiczyć światłowód, dwie śruby zostały zakotwiczone w czaszce z tyłu miejsca implantacji kaniuli światłowodowej. Aby zamocować kaniulę światłowodową na czaszce, na powierzchnię czaszki wokół podstawy kaniuli nałożono C&B Superbond (Sun Medical). Po stwardnieniu C&B Superbond kaniula została zwolniona z uchwytu i wokół kaniuli i śrub nałożono cement dentystyczny (Poly-F, Dentsply). Aby zamknąć nacięcie wokół miejsca kaniulacji, zastosowano klej tkankowy Vetbond (3 M, 7003449). Po wszczepieniu myszom podawano podskórne wstrzyknięcia antybiotyków (enrofloksacyna, 5 mg / kg, co 12 godzin) i znieczulenie (karprofen, 5 mg / kg, co 24 godziny) przez 3 kolejne dni.

In vivo fotostymulacja

Kabel łączący 200 µm został podłączony za pomocą rękawa do zewnętrznej części chronicznie wszczepianego światłowodu. Światłowody przyłączono za pomocą adaptera FC / PC do niebieskiej diody laserowej (473 nm, MBL-III 473-150 mW), a impulsy świetlne wygenerowano przez stymulator (BNC 575). Do fotostymulacji neuronów eksprymujących ChR2, paradygmat stymulacji stanowiła częstotliwość 20 Hz, czas trwania impulsu 5 ms i 2 – 5 mW mocy światła. Moc świetlną emitowaną z krosownicy mierzono za pomocą miernika mocy (PM100D) z czujnikiem światła S121C.

Analiza behawioralna

Doświadczenia behawioralne przeprowadzono z samcami myszy D2-Cre w wieku 11-13, z wyjątkiem myszy poddanych analizie elektrofizjologicznej, które były w wieku 5-6. Dopasowane pod względem wieku myszy D2-Cre i Cre z ujemną kontrolą wstrzyknięto wirus i trzymano osobno i pozwolono im się zaaklimatyzować do klatki do czasu testu behawioralnego. Dla każdej manipulacji myszy przenoszono do pomieszczenia doświadczalnego 60 min przed rozpoczęciem eksperymentu, aby umożliwić przyzwyczajenie i zmniejszyć stres (jasność pomieszczenia doświadczalnego wynosiła 70 lux). Każde urządzenie doświadczalne oczyszczono za pomocą 70% etanolu pomiędzy eksperymentami, aby usunąć wszelkie potencjalne sygnały zapachowe.

Uczulenie na kokainę

W celu rozpoczęcia uczulania na kokainę, myszy przyzwyczajano do zastrzyków z soli fizjologicznej (ip) przez kolejne 3 dni, a następnie wstrzykiwano im sól fizjologiczną lub kokainę (15 mg kg-1, ip) dla 5 kolejnych dni. Myszom wstrzykiwano dootrzewnowo (ip) albo chlorowodorek kokainy (Johnson Mattney, Edinburgh, UK) rozpuszczony w soli fizjologicznej (0.9% NaCl) albo roztwór soli z igłą 30 G. Natychmiast po każdym wstrzyknięciu myszy badano pod kątem poziomej aktywności lokomotorycznej w komorze otwartego pola przez 30 min. Do pomiaru wpływu fotostymulacji na inicjację i ekspresję uczulenia (ryc (Rysunekâ € <â € <â € <5), 5) myszom podawano światło niebieskie na światło obustronne przez podwójne kable światłowodowe na NAc przez cztery okresy 3-min podczas sesji 30 min w klatkach domowych. Usunięto kable krosowe z kaniuli światłowodowej znajdującej się na czaszce myszy i myszy otrzymały co najmniej 10 odpoczynku. Myszom wstrzykiwano albo kokainę albo sól fizjologiczną (coc 1d-coc 5d). Po rozpoczęciu uczulania, kokainę wycofano na dni 14 bez wstrzykiwania soli fizjologicznej. Podczas tego okresu karencji nie stosowano fotostymulacji. Ekspresję behawioralnego uczulenia na kokainę określono następnie przez wstrzyknięcie dawki prowokującej leku (10 mg kg-1, ip) po fotostymulacji NAc, jak pokazano na rysunku Figure5A.5A. Aby zmierzyć efekt fotostymulacji podczas okresu odstawienia kokainy (ryc (Figure6), 6), myszy poddano temu samemu protokołowi uczulania, jak opisano powyżej (dla rysunku Figure5) 5) z wyjątkiem fotostymulacji. Po rozpoczęciu uczulania na kokainę, fotostymulacja była stosowana do NAc codziennie dla 1 h podczas całkowitego okresu odstawienia 14 dni. Po dniach odstawienia 14 wszystkim grupom myszy wstrzyknięto dawkę prowokacyjną kokainy (10 mg kg-1).

Rysunek 1 

Selektywna fotostymulacja średnich kolczastych neuronów w jądrze półleżącym. (ZA) Selektywna ekspresja ChR2 w neuronach NAc D2R przez dostarczanie wektorów wirusowych AAV-DIO-ChR2-EYFP. paski skali: rysunek tła, 1 mm: wstaw, 200 µm. (B) Obrazy konfokalne ...
Rysunek 2 

Fotostymulacja D2RCre-MSN napędza lokalne obwody hamujące. (ZA) Obraz konfokalny wycinka żywego NAc, pokazujący neuron wypełniony barwnikiem, który nie wyraża ChR2 i sąsiednią komórkę (grot strzałki), która eksprymowała ChR2 i mogła być fotostymulowana. (B) IPSC ...
Rysunek 3 

Właściwości komórek NAc. (ZA) Obraz fluorescencji dwóch fotonów neuronów wypełnionych Alexa 594. (A1) pokazuje neuron z grupy ChR2 + / AP, podczas gdy (A3) pokazuje neuron z grupy ChR2− / IPSC. (A2) i (A4) są obrazami o dużym powiększeniu z ...
Rysunek 4 

Wpływ aktywacji optogenetycznej D2-MSN in vivo w NAc na podstawową aktywność lokomotoryczną. () Widok strzałkowy myszy D2 Cre, którym wstrzyknięto NAc za pomocą AAV-DIO-ChR2-EYFP, a następnie obustronną implantację kaniuli światłowodowej. Stymulacja niebieskim światłem 473 nm ...
Rysunek 5 

Wpływ aktywacji D2-MSN podczas uczulania na kokainę. (ZA) Schemat eksperymentalny do fotostymulacji D2-MSN podczas inicjacji i ekspresji uczulenia na kokainę. Oświetlenie niebieskie (2 ~ 5 mW, 5 ms, 20 Hz) zostało dostarczone na cztery ...
Rysunek 6 

Wpływ aktywacji D2-MSN podczas odstawienia do powtarzanej ekspozycji na kokainę. (ZA) Schemat eksperymentalny do fotostymulacji D2-MSNs podczas odstawiania kokainy. Podświetlenie niebieskim światłem (2 ~ 5 mW, 5 ms, 20 Hz) zostało dostarczone dla ośmiu okresów 3-min ...

Immunofluorescencja i konfokalna mikroskopia laserowa

W przypadku immunofluorescencji myszy znieczulano Zoletilem (Virbac, 1.6 µl / g, dootrzewnowo) i 0.05 µl / g Rompun (Bayer) i perfundowano sterylizowanym przez filtr 0.1 M PBS, a następnie utrwalano stosując roztwór 4% paraformaldehyd / PBS (Sigma). Następnie mózg usunięto i utrwalono dla 4 h utrwalaczem chłodzonym lodem, jak powyżej. Następnie mózgi odwodniono w 30% sacharoza / 0.1 M PBS dla 2 dni. Mózgi następnie zamrożono i przygotowano kolejne skrawki koronalne o grubości 40-µm na kriostacie (Leica CM 1900, Niemcy). Skrawki (40 µm) blokowano dla 1 hw 0.1 M PBS zawierającym 5% normalnej surowicy koziej i 0.2% Triton X-100 i inkubowano z króliczym poliklonalnym anty-D2R (1: 500, Millipore, AB5084P) w 4 ° C przez noc. Po przemyciu PBS zawierającym 0.2% Triton X-100, próbki inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 h z kozią anty-króliczą IgG Alexa Fluor 568 (1: 500; Molecular Probes, Eugene, OR, USA) i 0.2 µl / ml 4, 6-diamidino-2-fenyloindol HCl (DAPI; Sigma, St. Louis, MO, USA) w PBS zawierającym 1% normalnej surowicy koziej i 0.2% Triton X-100. Jako kontrolę negatywną próbki inkubowano tylko z DAPI i przeciwciałem drugorzędowym. Skrawki badano na wodnym konfokalnym laserowym systemie skaningowym C1 Plan Apo × 40 / 1.4 (LSM 700, Zeiss, Berlin, Niemcy).

Elektrofizjologia i fotostymulacja w jądrze półleżącym

Myszy użyto do eksperymentów 4 kilka tygodni po wstrzyknięciu wirusa, aby osiągnąć optymalną ekspresję ChR2-EYFP. Myszy znieczulano następnie i dekapitowano w celu przygotowania ostrych wycinków mózgu. Mózg szybko usunięto i natychmiast umieszczono w lodowatym roztworze tnącym zawierającym (w mM) 250 sacharozę, 26 NaHCO3, 10 D-Glukoza, 3 Myo-inozytol, 2.5 KCl, 2 pirogronian Na, 1.25 NaH2PO4, 0.5 Kwas askorbinowy, 1 Kynurenicowy kwas i 7 MgCl2 który został przepuszczony przez 95% O2/ 5% CO2 (pH = 7.4). Koronalne wycinki mózgu (grubość 250 µm) zawierające NAc przygotowano przy użyciu wibronomu (Leica VT 1200 S), a następnie inkubowano w zagazowanym sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym (ACSF) zawierającym (w mM): 11 D-glukoza, 125 NaCl, 25 NaHCO3, 1.25 NaH2PO4, 2.5 KCl, 1.25 MgCl2 i 2.5 CaCl2 w 34 ° C dla 1 h przed nagrywaniem. Plastry następnie przeniesiono do zanurzonej komory zapisu, w której O2nasycony roztwór ACSF był stale nadfuzowany. Komórki w NAc i VTA wizualizowano za pomocą mikroskopu fotonowego 2 (Olympus FV1000 MPE, Tokio, Japonia) wyposażonego w soczewkę zanurzeniową 25X i optykę DIC w podczerwieni. Nagrania patch clamp całej komórki uzyskano z komórek NAc za pomocą wzmacniacza Multiclamp 700B i digitizera Digidata 1440A (Molecular Devices, LLC). Dane pobierano za pomocą oprogramowania pCLAMP 10.2 i dalej analizowano przy użyciu oprogramowania Clampfit 10.2 (Molecular Devices, LLC). Elektrody krosowe z rezystancjami między 3 – 5 MΩ wypełniono roztworem wewnętrznym zawierającym (w mM): K-glukonian 130, 2 NaCl, 2 MgCl2, 20 HEPES, 4 Na2ATP, 0.4 Na3GTP, 0.5 EGTA i 10 Na2- fosfokreatyna o pH doprowadzonym do 7.3 przy użyciu 1 N KOH. W podzbiorze eksperymentów na skrawek mózgu nałożono kąpiel bikukulinę (10 µM) w celu zablokowania receptorów GABA.

Komórki NAc wyrażające ChR2-EYFP zostały fotostymulowane przez źródło światła LED (460 ± 27 nm, UHP-Mic-LED-460, Prizmatix). Niebieskie światło z diody LED było dalej filtrowane i tłumione przez kostkę filtracyjną wyposażoną w filtr wzbudzenia (470 – 495 nm); błyski światła (czas trwania 10 ms, 0.0366 – 0.354 mW / mm2) zostały dostarczone do wycinka mózgu za pomocą soczewki obiektywu 25X przy częstotliwościach 5 – 40 Hz. W podzbiorze eksperymentów fotoprądy mierzono w komórkach wyrażających ChR2 w odpowiedzi na błyski światła o czasie trwania 2.

Analiza statystyczna

Dane przedstawiono jako średnie ± sem i analizowano za pomocą dwustronnych studentów t-test lub dwukierunkowa analiza wariancji, po której następuje Bonferroniego post hoc test. ZA P-wartość <0.05 uznano za istotną statystycznie.

Efekt

Selektywna fotostymulacja średnich kolczastych neuronów w jądrze półleżącym

Aby określić rolę MSN D2R-MSN w zachowaniach uzależniających za pośrednictwem kokainy, zastosowaliśmy podejście optogenetyczne do stymulacji neuronów NAc D2R. Aby selektywnie kontrolować aktywność D2R-MSN w NAc przez światło, wektory wirusowe kodujące AAV-DIO-ChR2-EYFP wstrzyknięto stereotaktycznie do NAc myszy transgenicznych D2R-Cre BAC. 4 tygodnie po iniekcji wirusowej, silna ekspresja ChR2-EYFP była obserwowana w NAc (Figura (Figure1A) .1A). Swoistość ekspresji ChR2 w MSN D2R potwierdzono za pomocą analizy konfokalnej immunofluorescencji: ekspresja ChR2 znakowanego YFP była kolokalizowana z D2R w NAc (Figura (Figure1B), 1B), pokazując, że ChR2 ulegał ekspresji w neuronach eksprymujących D2R w NAc.

Chociaż takie podejście zostało zastosowane w innych badaniach (np. Lobo i in., 2010), szczegóły procedur iniekcji wirusa będą się różnić w zależności od laboratorium, co sprawia, że ​​ważne jest udokumentowanie kontroli optogenetycznej w naszych specyficznych warunkach eksperymentalnych. Oceniliśmy funkcjonalną ekspresję ChR2, tworząc nagrania patch-clamp całej komórki z MSN w plasterkach NAc. MSN zidentyfikowano przez: (1) stosunkowo hiperpolaryzowany spoczynkowy potencjał błonowy (RMP), zazwyczaj bardziej ujemny niż −80 mV; (2) regularny wzór wyzwalania AP w odpowiedzi na zastosowane impulsy prądowe; (3) długie opóźnienie wyzwalania pierwszego AP podczas impulsu prądu; (4) brak napięcia „sag” podczas hiperpolaryzacji spowodowanej przez prąd kationowy aktywowany hiperpolaryzacją (Ih); oraz (5) stosunkowo małe rozmiary ciał komórek (Chang i Kitai, 1985; O'Donnell and Grace, 1993; Le Moine i Bloch, 1996; Taverna i in., 2008). W całym polu widzenia zastosowano niebieskie światło (470 nm) (0.78 mm2) podczas zaciskania napięcia MSN przy potencjale utrzymywania −69 mV. Niektóre MSN wyrażały ChR2, widoczne jako fluorescencja YFP w ich somacie (strzałki na rysunkach 1C1, C3). Takie neurony wykazywały znaczne fotoprądy, z jaśniejszymi bodźcami świetlnymi wywołującymi większe fotoprądy (rysunek (Figure1D) .1D). Związek między szczytową amplitudą fotoprądu a natężeniem światła (rysunek (Figure1E) 1E) miał połowę maksymalnej czułości światła 0.054 ± 0.0023 mW / mm2 i maksymalna amplituda piku 1.16 ± 0.16 nA (średnia ± sem, n =

W warunkach prądu-zacisku MSN wyrażają niezawodnie AP ChR2 w odpowiedzi na ciągi impulsów świetlnych (czas trwania 10 ms; rysunek Figure1F) .1F). W tych warunkach natężenie światła jest większe niż 0.1 mW / mm2 były wystarczające, aby wywołać AP (rysunek (Figure1G, 1G, n = 5). AP były niezawodnie wywoływane przy częstotliwościach fotostymulacji do 20 Hz, podczas gdy w 40 Hz reakcje indukowane światłem sumowały się, aby spowodować trwałą depolaryzację, która była mniej skuteczna w wywoływaniu AP (rysunki 1F, G).

Fotostymulacja D2R-MSN napędza lokalne obwody hamujące

Aby zbadać konsekwencje aktywności D2R-MSN w obwodach lokalnych w NAc, fotostymulowaliśmy presynaptyczny MSN wyrażający ChR2 podczas pomiaru odpowiedzi postsynaptycznych w MSN z ujemnym wynikiem ChR2 (rysunek (Figure2A) .2A). Neuron pokazany na rysunku Figure2A2A nie wyraża ChR2, na co wskazuje brak fluorescencji EYFP, jak również brak fotoprądów o krótkim opóźnieniu, takich jak pokazane na rysunku Figure1D.1D. Jednak, gdy postynaptyczne MSN były utrzymywane jako potencjał −69 mV, 10 ms czas trwania błysków powodował prądy zewnętrzne po opóźnieniu 9.0 ± 0.42 ms (rysunek (Figure2B, 2B, n = 15). Aby określić charakter tych odpowiedzi, zmieniono potencjał błony postsynaptycznej między −99 mV do −39 mV, podczas gdy zastosowano błysk świetlny (rysunek (Figure2C) .2C). Odpowiedzi indukowane światłem zmieniały się wraz z potencjałem błonowym (ryc (Figure2D, 2D, n = 6) i odwrócić ich biegunowość w −81 ± 3.4 mV. Biorąc pod uwagę, że potencjał równowagi dla jonów chlorkowych wynosi −80 mV w naszych warunkach jonowych, indukowane światłem prądy zewnętrzne mogą być spowodowane strumieniem chlorków, w którym pośredniczą postsynaptyczne GABAA receptory. Aby przetestować tę możliwość, GABAA Do zewnętrznego roztworu dodano antagonistę receptora bicukulinę (10 µM). Lek ten całkowicie blokował reakcje indukowane światłem (ryc (Figure2B), 2B), potwierdzając, że reakcje indukowane światłem były GABAergicznymi hamującymi prądami postsynaptycznymi (IPSC).

W oparciu o ich reakcje na fotostymulację, MSN, które zarejestrowaliśmy, można zaklasyfikować do jednej z grup 4: (1) komórki wyrażające wystarczającą ilość ChR2 do odpalenia AP w odpowiedzi na fotostymulację (ChR2 + / AP), które opisano powyżej; (2) komórki wyrażające niewielką ilość ChR2, które wykazywały podprogową depolaryzację w odpowiedzi na światło (ChR2 + / No AP); (3) ciche komórki, które nie miały ekspresji ChR2, ale otrzymały indukowane światłem IPSC z presynaptycznych MSN wyrażających ChR2 (ChR2− / IPSC); i (4) ChR2-ujemne komórki, które nie wykazywały IPSC w odpowiedzi na fotostymulację innych MSN (ChR2− / No IPSC). Względny udział komórek w każdej z tych kategorii pokazano na rysunku Figure2E2E (n = 53). Ogółem prawie połowa komórek (45.3%) wyrażała ChR2 (suma grup (1) i (2)). Żaden z zarejestrowanych MSN nie wykazywał zarówno fotoprądów, jak i IPSC w odpowiedzi na fotostymulację; wskazuje to, że MSN-D2R-dodatnie nie unerwiają innych członków tej samej populacji komórek w NAc.

Ta klasyfikacja odpowiedzi na światło wskazuje, że fotostymulacja komórek ChR2 + / No AP (grupa 2) i komórek ChR2− / No IPSC (grupa 4) nie generuje żadnych sygnałów elektrycznych, które mogłyby przyczynić się do aktywności obwodu. Tak więc, aby zdefiniować efekty fotostymulacji na funkcję obwodu, scharakteryzowaliśmy szczegółowo właściwości ChR2 + / AP MSNs (grupa 1), które wygenerują punkty AP, gdy fotokomórkę NAc i komórki ChR2− / IPSC (grupa 3), które są postsynaptyczne dla MSN ChR2 + / AP, ponieważ otrzymują indukowane światłem IPSC. Komórki ChR2 + / AP i ChR2− / IPSC w NAc zidentyfikowano jako neurony kolczaste (rysunek (Figure3A) .3A). Nie stwierdzono istotnych różnic w morfologicznych lub elektrofizjologicznych właściwościach neuronów w tych dwóch grupach. Na przykład somata neuronów w tych dwóch grupach była podobna pod względem wielkości (rysunek (Figure3B) .3B). Ponadto, ich RMP (−83.0 ± 1.7 vs. −85.0 ± 1.8 mV; średnia ± sem; n = 10, rysunek Figure3C) 3C) i rezystancje wejściowe (113 ± 15 vs. 133 ± 13 MΩ, n = 6, rysunek Figure3D) 3D) również nie były różne (p > 0.05 dwustronny Studenta t-test), podczas gdy ich AP strzelają wzorcami w odpowiedzi na impulsy prądu (rysunki 3E, F) były również podobne (p > 0.05 dwustronny Studenta t-test, n = 6). Podsumowując, fotostymulacja D2R-MSN w NAc aktywuje lokalne obwody hamujące z neuronami postsynaptycznymi, które są bardzo podobne do MSN D2R, ale nie wyrażają D2R.

Optogenetyczna stymulacja NAc D2R-MSN w indukowanym kokainą uczuleniu behawioralnym

Następnie zbadaliśmy konsekwencje behawioralne in vivo fotostymulacja MSN D2R-MSN. Ponieważ fotostymulacja D2R-MSNs w prążkowiu grzbietowym zmniejsza aktywność lokomotoryczną (Kravitz i in., 2010), zaczęliśmy od scharakteryzowania wpływu aktywacji półleżącej D2R-MSN na podstawową aktywność lokomotoryczną. W tym celu myszom D2R-Cre wstrzyknięto dwustronnie wirus DIO-AAV-ChR2-EYFP do NAc (D2-Cre (+) NAc-ChR2). D2R-MSN zostały następnie fotostymulowane niebieskim światłem (473 nm, 5 ms, czas trwania impulsu, 20 Hz) dostarczone do NAc za pomocą światłowodu. Fotostymulatory stosowano podczas czterech okresów trwania 3-min w sesji 50 min, gdy myszy trzymano w komorze rejestracji aktywności lokomotorycznej (rysunek (Figure4A) .4A). Równolegle, jako kontrola myszom z innego miotu, które nie były rasy Cre WT, wstrzykiwano podobnie wirusy i otrzymywały podobne niebieskie oświetlenie. Myszy D2-Cre (+) NAc-ChR2 wykazywały porównywalny lub nieznacznie podwyższony poziom podstawowej aktywności lokomotorycznej w porównaniu z myszami kontrolnymi D2R-Cre (-) NAc-ChR2 (Figury 4B, C). Fotostymulacja MSN D2R w myszach D2-Cre (+) NAc-ChR2 spowodowała znaczny spadek aktywności lokomotorycznej, który powrócił po zatrzymaniu bodźca świetlnego (rysunek (Figure4B) .4B). Nie zaobserwowano takich efektów u myszy kontrolnych D2R-Cre (-) NAc-ChR2 (Figury 4B, C), wskazując, że efekty fotostymulacji były spowodowane raczej aktywacją ChR2 niż możliwymi efektami niespecyficznymi, takimi jak ogrzewanie tkanki mózgowej. Dlatego nasze dane wskazały, że fotostymulacja D2R-MSN w NAc wywołała spadek aktywności lokomotorycznej.

Wyniki te potwierdziły naszą zdolność do kontrolowania aktywności MSN D2R w ramach NAc in vivo. Następnie wykorzystaliśmy tę zdolność do zbadania wpływu aktywności D2R-MSN na uczulenie behawioralne na powtarzane podawanie kokainy. Uczulenie behawioralne odnosi się do procesu, który pozwala na początkową ekspozycję na środki psychostymulujące, takie jak kokaina, w celu zwiększenia zdolności kolejnych ekspozycji na leki w celu stymulowania aktywności lokomotorycznej. Proces ten można podzielić na fazy inicjacji i ekspresji: inicjacja opisuje bezpośrednie zdarzenia nerwowe, które indukują uczulenie behawioralne (Vanderschuren i Kalivas, 2000; Sim i in., 2013), podczas gdy ekspresja jest znana jako długotrwała forma plastyczności behawioralnej, która utrzymuje się po odstawieniu leku (Vanderschuren i Kalivas, 2000; Sim i in., 2013). W związku z tym zbadaliśmy indukowane kokainą uczulenie behawioralne podczas powtarzanych dootrzewnowych (ip) wstrzyknięć kokainy, stosując optogenetykę do kontrolowania aktywności D2R-MSN w NAc podczas każdej z tych faz.

Po przyzwyczajeniu do wstrzyknięcia soli fizjologicznej w ciągu 3, myszom wstrzykiwano kokainę (15 mg / kg) w kolejnych dniach 5 i rejestrowano odpowiedzi lokomotoryczne dla 30 min po każdym wstrzyknięciu (Figura (Figure5A) .5A). Fotostymulatory dostarczano podczas sesji 30 min przed wstrzyknięciem kokainy, przeplatając okresy oświetlenia 3 min z okresami 5 min, gdy światło było wyłączone (rysunek (Figure5A) .5A). Biorąc pod uwagę, że fotostymulacja D2R-MSN w NAc zmniejsza podstawową aktywność lokomotoryczną (Figura (Figure4), 4), fotostymulatory dostarczano bezpośrednio przed podaniem kokainy, aby uniknąć możliwej ingerencji w reakcje behawioralne na wstrzyknięcie kokainy.

Obie kontrolne myszy D2-Cre (-) NAc-ChR2 i myszy D2-Cre (+) NAc-ChR2 wykazały wyraźny wzrost aktywności lokomotorycznej w odpowiedzi na powtarzane wstrzyknięcia kokainy (Figura (Figure5B), 5B), wskazując na rozpoczęcie uczulenia. Fotostymulacja D2R-MSNs w NAc nie wydaje się wpływać na inicjację uczulenia behawioralnego, ponieważ indukowane kokainą uczulenie behawioralne było podobne u myszy D2-Cre (+) NAc-ChR2 i myszy kontrolnych D2-Cre (-) NAc-ChR2.

Po indukcji uczulenia behawioralnego przez powtarzanie takich wstrzyknięć kokainy (15 mg / kg) dla dni 5, lek wycofano na dni 14 i zbadano stopień ekspresji uczulenia przez prowokację myszy niższą dawką kokainy (10 mg /kg). Ekspresja uczulenia jest długotrwałą formą plastyczności behawioralnej, która utrzymuje się po odstawieniu leku (Steketee i Kalivas, 2011; Sim i in., 2013). Aby zbadać rolę MSN D2R w ekspresji uczulenia, NAc poddano fotostymulacji bezpośrednio przed podaniem kokainy (ryc. (Figure5A) 5A) i uczulenie mierzono jako ilość aktywności lokomotorycznej indukowanej przez wstrzyknięcie kokainy.

W obu grupach myszy wstępnie traktowanych kokainą - myszy D2-Cre (-) NAc-ChR2 (D2-Cre (-) :: coc-coc) i D2-Cre (+) NAc-ChR2 (D2-Cre (+): : coc-coc) - wystąpił silny wyraz uczulenia (ryc (Figure5C) .5C). Przebieg czasowy stymulowanych kokainą zmian lokomocji był również podobny w obu grupach (ryc (Figure5C), 5C), bez znaczącej różnicy między dwiema grupami. Podsumowując, te dwa eksperymenty fotostymulacji wskazują, że aktywacja MSN D2R w NAc nie wpływa na inicjację lub ekspresję indukowanego kokainą uczulenia behawioralnego.

Fotostymulacja MSN D2R-MSN podczas odstawiania leku

Przewlekły stres podczas wycofywania leku po wielokrotnym narażeniu na kokainę powoduje selektywną rekrutację zależnego od D2R mechanizmu adaptacji, który kontroluje wywołany stresem wzrost zachowań związanych z poszukiwaniem kokainy i nawrotami w związku ze zmianami plastyczności synaptycznej w NAc (Sim i in., 2013). Wskazuje to, że mechanizmy związane z odstawieniem narkotyków różnią się od mechanizmów zaangażowanych w uczulenie na leki. Następnie zbadaliśmy, czy fotostymulacja MSN D2R w NAc podczas odstawiania kokainy wpływa na ekspresję indukowanego kokainą uczulenia behawioralnego.

Po wywołaniu uczulenia behawioralnego przez powtarzane wstrzyknięcie kokainy jak powyżej, myszy D2-Cre (-) i D2-Cre (+) podzielono na dwie grupy w okresie karencji 14 na dzień: jedna grupa była poddawana codziennej stymulacji światłem niebieskim NAc dla 1 h (3 min × 8 razy), podczas gdy druga grupa nie była (Rysunek (Figure6A) .6A). Powtarzana fotostymulacja MSN D2R w NAc podczas odstawiania kokainy nie wpływała na ekspresję uczulenia w D2-Cre (-) :: myszy coc-coc (Figura (Figure6B) .6B). Przeciwnie, u myszy D2-Cre (+) :: coc-coc ekspresja uczulenia była znacząco osłabiona przez powtarzaną fotostymulację podczas odstawiania leku (Figura (Figure6B), 6B), chociaż przebieg czasowy indukowanej kokainą stymulacji lokomocji nie uległ zmianie (ryc (Figure6C) .6C). Zatem fotostymulacja D2R-MSN NAc podczas odstawienia leku zmniejszyła ekspresję indukowanego kokainą uczulenia behawioralnego (interakcja fotostymulacji kokainy × F(1,18) = 11.08, P = 0.0037, rysunek Figure6B) .6B). Dane te wskazują, że aktywacja MSN D2R-NAc w okresie odstawienia leku wpływa na zachowania związane z poszukiwaniem kokainy i nawrotami.

Dyskusja

Znaczące dowody wskazują, że indukowane kokainą uczulenie behawioralne jest związane ze zwiększoną transmisją dopaminergiczną w układzie mezokortykolimbicznym obejmującym brzuszną powierzchnię nakrywkową, korę przedczołową i jądro półleżące (NAc). W szczególności faza ekspresji uczulenia behawioralnego charakteryzuje się uporczywą nadreaktywnością leku po zaprzestaniu podawania leku, co jest związane z kaskadą mechanizmów adaptacyjnych (Kalivas i Duffy, 1990; Robinson and Berridge, 1993; Kalivas i in., 1998), które mogłyby przyczynić się do kompulsywnego głodu narkotykowego (Robinson i Berridge, 1993; Kalivas i in., 1998; Steketee i Kalivas, 2011). Sugerowano, że indukowane kokainą zmiany w plastyczności molekularnej, komórkowej i behawioralnej w obrębie NAc, w połączeniu z sygnalizacją receptora DA w MSN, mogą regulować uzależniające zachowania związane z lekami (Lobo i in., 2010; Schmidt i Pierce, 2010; Ferguson i in., 2011; Pascoli i in., 2011; Bocklisch i in., 2013; Grueter i in., 2013).

Ostatnie badania z wykorzystaniem genetycznie zmodyfikowanych myszy, które warunkowo wyrażają rekombinazę Cre, ujawniły rolę D1R-MSN lub D2R-MSN w zachowaniach uzależniających od kokainy. Optogenetyczna aktywacja D1R-MSN NAc po dniach 6 powtarzanego podawania kokainy zwiększa aktywność lokomotoryczną, podczas gdy aktywacja D2R-MSN podobno nie ma wpływu (Lobo i in., 2010). Dane te sugerują, że powtarzająca się ekspozycja na kokainę zwiększa wydajność D1R-MSN w NAc. Hamowanie MSN eksprymujących D1R za pomocą toksyny tężcowej (Hikida i in., 2010) zmniejsza preferencję miejsca uwarunkowaną kokainą (CPP), podczas gdy nie zaobserwowano żadnych zmian w CPP kokainy po zniesieniu transmisji synaptycznej w MSN D2R (Hikida i in., 2010). Optogenetyczna aktywacja MSN D1R w prążkowiu grzbietowym indukuje trwałe wzmocnienie, podczas gdy stymulujące neurony wyrażające receptor D2 indukują przejściową karę (Kravitz i in., 2012). Niedawne badania donoszą również, że hamowanie MSN D2R za pomocą podejścia chemikogenetycznego zwiększa motywację do uzyskania kokainy, podczas gdy aktywacja optogenetyczna D2R-MSN hamuje samopodawanie kokainy (Bock i in., 2013). Z drugiej strony, Bocklisch i in. (2013) zgłosił, że D1R-MSNs projektu NAc do VTA, szczególnie do neuronów GABAergicznych w VTA, podczas gdy MSN D2R nie wyświetlają się bezpośrednio do VTA. Ten obwód oznacza, że ​​aktywacja optogenetyczna D1R-MSNs hamuje neurony DA, co ostatecznie wzmacnia indukowane kokainą zachowania uzależniające (Bocklisch i in., 2013).

Pomimo pozornie prostej organizacji tych dwóch populacji MSN, fakt, że MSN otrzymują wiele wejść i mają różne wyjścia z / do innych obszarów mózgu, jak również tworzenie obwodów lokalnych między MSN i innymi klasami interneuronów, wynikający z tego wynik D1R- MSN i D2R-MSN mogą dawać złożone i różne konsekwencje molekularne, komórkowe i behawioralne.

Wcześniej wykazano, że D2R przyczynia się do modyfikacji synaptycznych indukowanych podczas odstawiania leku, a te wzmagają nawrót do poszukiwania kokainy, bez wpływu na początkowe nabywanie leków lub poszukiwanie narkotyków (Sim i in., 2013). Nasze obecne dane wskazują, że fotostymulacja D2R-MSN w NAc wywołuje spadek podstawowej aktywności lokomotorycznej. Lobo i in. (2010) nie wykrył żadnej zmiany w lokomocji, gdy aktywowano jeden z podtypów MSN, ale badali jedynie całkowitą aktywność lokomotoryczną, zamiast badać natychmiastowe reakcje podstawowej aktywności ruchowej na fotostymulację. Kravitz i in. (2010) odkrył również, że aktywacja optogenetyczna MSX D2R w prążkowiu grzbietowym również zmniejsza aktywność lokomotoryczną. Zatem nasze dane są pierwszymi, które wykazują, że podstawowa aktywność lokomotoryczna jest hamowana przez fotostymulację D2R-MSN z NAc i pierwszą, która systematycznie bada przebieg czasowy podstawowej aktywności lokomotorycznej podczas fotostymulacji tych neuronów.

W niniejszym badaniu zaobserwowaliśmy, że aktywacja optogenetyczna MSN D2R w NAc nie wpływa na inicjację lub ekspresję uczulenia behawioralnego. Jednak fotostymulacja MSN D2R podczas okresu odstawienia leku osłabiła ekspresję uczulenia indukowanego kokainą. Dlatego nasze dane wskazują, że MSN D2R rekrutują pewien sygnał specyficznie podczas okresu karencji, który zmienia ekspresję genu lub inne formy sygnalizacji i tym samym wyzwala zmiany w plastyczności synaptycznej, prowadząc do zmian w indukowanym kokainą uczuleniu behawioralnym. Nie wiadomo, w jaki sposób te MSN wykorzystują specyficzne dla komórki adaptacje, które mogą powodować ich wyraźne konsekwencje w zachowaniach związanych z uzależnieniem. Grueter i in. (2013) zasugerował, że ΔFosB w NAc różnie moduluje właściwości synaptyczne i zachowania związane z nagrodami w sposób typowy dla komórki i subregionu. Ostatnio Chandra i in. (2013) zgłosił, że powtarzająca się aktywacja ChR2 MSN D1R, ale nie MSN D2R spowodowała obniżenie genu Tiam1, białka zaangażowanego w rearanżację cytoszkieletu aktynowego, podobnego do działania kokainy. Dlatego, aby zrozumieć mechanizmy, które dają trwałe efekty zachowań wywołanych lekami, ważne będzie nakreślenie selektywnej komórkowo indukcji zdarzeń molekularnych w tych MSN, które kontrolują adaptację synaptyczną do powtarzalnej ekspozycji na lek.

W związku z powtarzającą się ekspozycją na lek sugerowano, że odstawienie odgrywa ważną rolę, ponieważ niektóre zmiany pojawiają się dopiero po kilku tygodniach od ostatniej ekspozycji na kokainę. Sugeruje to, że abstynencja jest ważnym mediatorem w rozwoju plastyczności (Robinson i Berridge, 2003; Boudreau i Wolf, 2005; Boudreau i in., 2007; Kourrich i in., 2007). Obserwacje te podnoszą możliwość, że samo wycofanie może być czynnikiem wyzwalającym zmiany w NAc, które są pod kontrolą sygnalizacji zależnej od D2R. Nasz wynik pokazujący, że aktywacja D2R-MSNs w NAc podczas wycofywania leku wpływa na indukowaną kokainą uczulenie behawioralne, co stanowi przekonujące poparcie dla tego pomysłu.

Wcześniej wykazano, że powtarzająca się ekspozycja na stres podczas wycofywania leku hamuje ekspresję indukowanego kokainą uczulenia behawioralnego, a także zachowań związanych z poszukiwaniem kokainy i nawrotami u myszy D2R KO (Sim i in., 2013). Jest zatem interesujące, że fotostymulacja MSN D2R podczas odstawiania leku również osłabia ekspresję uczulenia. Synchroniczna plastyczność wywołana stresem na synapsach glutaminowych zmienia się w NAc myszy D2R KO (Sim i in., 2013). Chociaż nie wiadomo jeszcze, czy fotostymulacja MSNS D2R lub przewlekły stres podczas okresu odstawienia wywołuje podobne zmiany w plastyczności synaptycznej, nasze obecne wyniki potwierdzają hipotezę, że MSN D2R-NAc odgrywają kluczową rolę w plastyczności wywołanej wycofaniem i mogą przyczyniać się do nawrót po zaprzestaniu nadużywania narkotyków. Potrzebne będą dalsze badania, aby odkryć funkcjonalne obwody nerwowe, w których uczestniczą MSN D2R podczas odstawiania leków, oraz przeanalizować i porównać konsekwencje fotostymulacji D2R-MSN i przewlekłego stresu na plastyczność synaptyczną w tym konkretnym obwodzie.

Inną możliwą rolą MSN eksprymujących D2R może być hamowanie wyjścia MSN D1R z NAc. Wcześniejsze badania wskazują, że chociaż MSN projektują długie aksony na odległe cele, zachodzi rozległe nakładanie się między obustronnymi obustronnymi obiektami a dendrytycznymi drzewami sąsiadujących neuronów projekcji kolczastej (Grofová, 1975; Preston i in., 1980; Wilson i Groves, 1980). Może to wskazywać na możliwą lokalną łączność synaptyczną dla MSN w ramach NAc. Nagrania wewnątrzkomórkowe z par neuronów projekcji kolczastej zidentyfikowały funkcjonalne połączenia hamujące między MSN w prążkowiu szczura (Czubayko i Plenz, 2002; Tunstall i in., 2002; Koos i in., 2004; Gustafson i in., 2006). Doniesiono również, że synapsy utworzone przez nawracające aksony poboczne MSN w prążkowiu nie są losowe, D2R-MSN tworzą połączenia synaptyczne zarówno z innymi MSX D2R, jak i MSN z D1R, podczas gdy D1R-MSN tworzą prawie wyłącznie połączenia synaptyczne z innymi D1R-MSNs (Taverna i in., 2008). Chociaż opisano również wzajemne powiązanie GABAergiczne przez lokalne nawracające obrzęki aksonalne między ośrodkowymi MSN (Taverna i in., 2004), nadal nie jest jasne, czy MSN D2R losowo tworzą lokalne mikroukłady lub czy przyczyniają się do mikroukładów w NA z preferencyjnym połączeniem, tak jak w prążkowiu. Nasze dane sugerują, że D2R-MSN w NAc wyrażającym ChR2 tworzą połączenia synaptyczne z sąsiednimi MSN, które eksprymują D1R, i że D2R-MSN następnie wywierają hamujący kontakt z D1-MSN w celu modulowania pośredniczonej przez D1R promocji uzależniających zachowań.

Podsumowując, wykazaliśmy, że aktywacja optogenetyczna NAc D2R-MSN zmienia plastyczność wywołaną odstawieniem występującą podczas uzależnienia od kokainy. Biorąc pod uwagę, że aktywność sygnalizacji zależnej od D2R w okresie karencji wydaje się być kluczowym regulatorem ekspresji indukowanej kokainą uczulenia behawioralnego, proponujemy, aby MSN D2R były ważnym mediatorem długotrwałej adaptacji w poszukiwaniu narkotyków i nawrotach. Identyfikacja substratów molekularnych sygnalizacji zależnej od D2R, wraz z identyfikacją specyficznego obwodu MSN D2R-NAc stosowanych przy powtarzającej się ekspozycji na lek, powinna zapewnić nowe cele dla interwencji terapeutycznej w nawrocie leku.

Oświadczenie o konflikcie interesów

Autorzy oświadczają, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Podziękowanie

Praca ta była wspierana przez grant National Research Foundation of Korea (NRF) finansowany przez Ministerstwo Nauki, ICT i Planowania Przyszłości przez Brain Research Program (dla Ja-Hyun Baik; Grant No. 2013M3C7A1056101) oraz przez Bio i Medical Technology Program rozwoju (dla Ja-Hyun Baik; Grant No. 2013M3A9D5072550) oraz program World Class Institute (WCI) National Research Foundation of Korea (NRF) finansowany przez Ministerstwo Nauki, ICT i Planowania Przyszłości (dla George J. Augustine ; WCI 2009-003), a także przez grant uniwersytetu koreańskiego (do Ja-Hyun Baik) i grant CRP od National Research Foundation of Singapore (do George'a J. Augustine'a).

Referencje

  1. Baik JH (2013). Sygnalizacja dopaminowa w zachowaniach związanych z nagrodami. Z przodu. Obwody neuronowe 7: 152 10.3389 / fncir.2013.00152 [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed] [Cross Ref]
  2. Baik JH, Picetti R., Saiardi A., Thiriet G., Dierich A., Depaulis A., i in. (1995). Zaburzenia ruchowe przypominające chorobę Parkinsona u myszy bez receptorów dopaminowych D2. Nature 377, 424 – 428 10.1038 / 377424a0 [PubMed] [Cross Ref]
  3. Berridge KC (2007). Dyskusja na temat roli dopaminy w nagrodzie: argumenty za zachętą. Psychopharmacology (Berl) 191, 391 – 431 10.1007 / s00213-006-0578-x [PubMed] [Cross Ref]
  4. Bock R., Shin JH, Kaplan AR, Dobi A., Markey E., Kramer PF, i in. (2013). Wzmocnienie pośredniej ścieżki pośredniej sprzyja odporności na kompulsywne zażywanie kokainy. Nat. Neurosci. 16, 632 – 638 10.1038 / nn.3369 [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed] [Cross Ref]
  5. Bocklisch C., Pascoli V., Wong JC, House DR, Yvon C., de Roo M., et al. (2013). Kokaina hamuje neurony dopaminowe poprzez wzmocnienie transmisji GABA w brzusznym obszarze nakrywkowym. Science 341, 1521 – 1525 10.1126 / science.1237059 [PubMed] [Cross Ref]
  6. Boudreau AC, Reimers JM, Milovanovic M., Wolf ME (2007). Receptory AMPA na powierzchni komórki w jądrze szczura zwiększają się podczas odstawienia kokainy, ale internalizują po prowokacji kokainą w połączeniu ze zmienioną aktywacją kinaz białkowych aktywowanych mitogenami. J. Neurosci. 27, 10621 – 10635 10.1523 / jneurosci.2163-07.2007 [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed] [Cross Ref]
  7. Boudreau AC, Wolf ME (2005). Uczulenie behawioralne na kokainę jest związane ze zwiększoną ekspresją powierzchni receptora AMPA w jądrze półleżącym. J. Neurosci. 25, 9144 – 9151 10.1523 / jneurosci.2252-05.2005 [PubMed] [Cross Ref]
  8. Chandra R., Lenz JD, Gancarz AM, Chaudhury D., Schroeder GL, Han MH, et al. (2013). Optogenetyczne hamowanie D1R zawierających jądra neuronów półleżących zmienia regulowaną przez kokainę regulację Tiam1. Z przodu. Mol. Neurosci. 6: 13 10.3389 / fnmol.2013.00013 [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed] [Cross Ref]
  9. Chang HT, Kitai ST (1985). Neurony projekcyjne jądra półleżącego: badanie znakowania wewnątrzkomórkowego. Brain Res. 347, 112 – 116 10.1016 / 0006-8993 (85) 90894-7 [PubMed] [Cross Ref]
  10. Chausmer AL, Elmer GI, Rubinstein M., Low MJ, Grandy DK, Katz JL (2002). Indukowana kokainą aktywność lokomotoryczna i rozróżnianie kokainy u myszy z mutacją receptora dopaminy D2. Psychopharmacology (Berl) 163, 54 – 61 10.1007 / s00213-002-1142-y [PubMed] [Cross Ref]
  11. Chevalier G., Deniau JM (1990). Odhamowanie jako podstawowy proces wyrażania funkcji prążkowia. Trendy Neurosci. 13, 277 – 280 10.1016 / 0166-2236 (90) 90109-n [PubMed] [Cross Ref]
  12. Czubayko U., Plenz D. (2002). Szybka transmisja synaptyczna między neuronami kolczastej projekcji prążkowia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 15764 – 15769 10.1073 / pnas.242428599 [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed] [Cross Ref]
  13. Ferguson SM, Eskenazi D., Ishikawa M., Wanat MJ, Phillips PE, Dong Y., et al. (2011). Przejściowe hamowanie neuronów ujawnia przeciwstawne role pośrednich i bezpośrednich szlaków w uczulaniu. Nat. Neurosci. 14, 22 – 24 10.1038 / nn.2703 [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed] [Cross Ref]
  14. Przejdź do Y., Grace AA (2005). Dopaminergiczna modulacja napędu limbicznego i korowego jądra półleżącego w zachowaniu ukierunkowanym na cel. Nat. Neurosci. 8, 805 – 812 10.1038 / nn1471 [PubMed] [Cross Ref]
  15. Grofová I. (1975). Identyfikacja neuronów prążkowia i palidiów wystających do istoty czarnej. Badanie eksperymentalne za pomocą wstecznego transportu aksonalnego peroksydazy chrzanowej. Brain Res. 91, 286 – 291 10.1016 / 0006-8993 (75) 90550-8 [PubMed] [Cross Ref]
  16. Grueter BA, Robison AJ, Neve RL, Nestler EJ, Malenka RC (2013). ΔFosB moduluje różnicowo funkcję jądra półleżącego bezpośrednio i pośrednio. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110, 1923 – 1928 10.1073 / pnas.1221742110 [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed] [Cross Ref]
  17. Gustafson N., Gireesh-Dharmaraj E., Czubayko U., Blackwell KT, Plenz D. (2006). Porównawcza analiza napięcia i prądu w sprzężeniu zwrotnym i sprzężeniu zwrotnym sprzężenia zwrotnego w mikroukładzie prążkowia in vitro. J. Neurophysiol. 95, 737 – 752 10.1152 / jn.00802.2005 [PubMed] [Cross Ref]
  18. Hikida T., Kimura K., Wada N., Funabiki K., Nakanishi S. (2010). Odrębne role transmisji synaptycznej w bezpośrednich i pośrednich ścieżkach prążkowia do zachowań nagradzających i awersyjnych. Neuron 66, 896 – 907 10.1016 / j.neuron.2010.05.011 [PubMed] [Cross Ref]
  19. Kalivas PW, Duffy P. (1990). Wpływ ostrego i codziennego leczenia kokainą na zewnątrzkomórkową dopaminę w jądrze półleżącym. Synapse 5, 48 – 58 10.1002 / syn.890050104 [PubMed] [Cross Ref]
  20. Kalivas PW, Pierce RC, Cornish J., Sorg BA (1998). Rola uwrażliwienia na głód i nawrót w uzależnieniu od kokainy. J. Psychopharmacol. 12, 49 – 53 10.1177 / 026988119801200107 [PubMed] [Cross Ref]
  21. Koos T., Tepper JM, Wilson CJ (2004). Porównanie IPSC wywołanych przez kolczaste i szybko rosnące neurony w neostriatum. J. Neurosci. 24, 7916 – 7922 10.1523 / jneurosci.2163-04.2004 [PubMed] [Cross Ref]
  22. Kourrich S., Rothwell PE, Klug JR, Thomas MJ (2007). Doświadczenie z kokainą kontroluje dwukierunkową plastyczność synaptyczną jądra półleżącego. J. Neurosci. 27, 7921 – 7928 10.1523 / jneurosci.1859-07.2007 [PubMed] [Cross Ref]
  23. Kravitz AV, Freeze BS, Parker PR, Kay K., Thwin MT, Deisseroth K., i in. (2010). Regulacja zachowań motorycznych w chorobie Parkinsona poprzez kontrolę optogenetyczną obwodów jąder podstawy. Nature 466, 622 – 626 10.1038 / nature09159 [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed] [Cross Ref]
  24. Kravitz AV, Tye LD, Kreitzer AC (2012). Wyraźne role neuronów prążkowia w szlaku bezpośrednim i pośrednim we wzmocnieniu. Nat. Neurosci. 15, 816 – 818 10.1038 / nn.3100 [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed] [Cross Ref]
  25. Kreitzer AC, Malenka RC (2008). Funkcjonalność plastyczności prążkowia i zwojów podstawy mózgu. Nature 60, 543 – 554 10.1016 / j.neuron.2008.11.005 [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed] [Cross Ref]
  26. Le Moine C., Bloch B. (1996). Ekspresja receptora dopaminy D3 w neuronach peptydergicznych jądra półleżącego: porównanie z receptorami dopaminy D1 i D2. Neuroscience 73, 131 – 143 10.1016 / 0306-4522 (96) 00029-2 [PubMed] [Cross Ref]
  27. Lobo MK, Covington HE, 3rd, Chaudhury D., Friedman AK, Sun H., Damez-Werno D. i in. (2010). Specyficzna dla komórek utrata sygnalizacji BDNF naśladuje optogenetyczną kontrolę nagrody kokainowej. Science 330, 385 – 390 10.1126 / science.1188472 [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed] [Cross Ref]
  28. Lobo MK, Nestler EJ (2011). Równoważenie prążkowia w uzależnieniu od narkotyków: odrębne role pośredniej i bezpośredniej ścieżki średnich kolczastych neuronów. Z przodu. Neuroanat. 5: 41 10.3389 / fnana.2011.00041 [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed] [Cross Ref]
  29. Lüscher C., Malenka RC (2011). Sztuczna synaptyczna plastyczność w uzależnieniu: od zmian molekularnych do przebudowy obwodu. Neuron 69, 650 – 663 10.1016 / j.neuron.2011.01.017 [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed] [Cross Ref]
  30. O'Donnell P., Grace AA (1993). Fizjologiczne i morfologiczne właściwości neuronów rdzeniowych i powłokowych półleżących rejestrowane in vitro. Synapse 13, 135 – 160 10.1002 / syn.890130206 [PubMed] [Cross Ref]
  31. Pascoli V., Turiault M., Lüscher C. (2011). Odwrócenie wywoływanego przez kokainę wzmocnienia synaptycznego resetuje wywołane lekami zachowanie adaptacyjne. Nature 481, 71 – 75 10.1038 / nature10709 [PubMed] [Cross Ref]
  32. Preston RJ, Bishop GA, Kitai ST (1980). Średnia projekcja neuronu kolczastego z neostriatum szczura: badanie wewnątrzkomórkowej peroksydazy chrzanowej. Brain Res. 183, 253 – 263 10.1016 / 0006-8993 (80) 90462-x [PubMed] [Cross Ref]
  33. Robinson TE, Berridge KC (1993). Neuralna podstawa głodu narkotykowego: teoria uzależnienia motywacyjno-uwrażliwiająca. Brain Res. Brain Res. Rev. 18, 247 – 291 10.1016 / 0165-0173 (93) 90013-p [PubMed] [Cross Ref]
  34. Robinson TE, Berridge KC (2003). Uzależnienie. Annu. Rev. Psychol. 54, 25 – 53 10.1146 / annurev.psych.54.101601.145237 [PubMed] [Cross Ref]
  35. Schmidt HD, Pierce RC (2010). Neuroadaptacje wywołane kokainą w transmisji glutaminianu: potencjalne cele terapeutyczne dla głodu i uzależnienia. Ann. NY Acad. Sci. 1187, 35 – 75 10.1111 / j.1749-6632.2009.05144.x [PubMed] [Cross Ref]
  36. Sesack SR, Grace AA (2010). Sieć wynagrodzeń zwojów podstawy Cortico: mikroukład. Neuropsychofarmakologia 35, 27 – 47 10.1038 / npp.2009.93 [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed] [Cross Ref]
  37. Sim HR, Choi TY, Lee HJ, Kang EY, Yoon S., Han PL, et al. (2013). Rola receptorów dopaminy D2 w plastyczności zachowań uzależniających wywołanych stresem. Nat. Commun. 4: 1579 10.1038 / ncomms2598 [PubMed] [Cross Ref]
  38. Smith RJ, Lobo MK, Spencer S., Kalivas PW (2013). Indukowane kokainą adaptacje w neuronach projekcji D1 i D2 accumbens (dychotomia niekoniecznie synonimiczna z bezpośrednimi i pośrednimi ścieżkami). Curr. Opin. Neurobiol. 23, 546 – 552 10.1016 / j.conb.2013.01.026 [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed] [Cross Ref]
  39. Steketee JD, Kalivas PW (2011). Brak leków: uczulenie behawioralne i nawrót do zachowania poszukującego narkotyków. Pharmacol. Rev. 63, 348 – 365 10.1124 / pr.109.001933 [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed] [Cross Ref]
  40. Taverna S., Ilijic E., Surmeier DJ (2008). Nawracające połączenia boczne średnich kolczastych neuronów prążkowia są zaburzone w modelach choroby Parkinsona. J. Neurosci. 28, 5504 – 5512 10.1523 / JNEUROSCI.5493-07.2008 [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed] [Cross Ref]
  41. Taverna S., van Dongen YC, Groenewegen HJ, Pennartz CM (2004). Bezpośrednie dowody fizjologiczne na łączność synaptyczną między średnimi kolczastymi neuronami w jądrze szczura półleżącego in situ. J. Neurophysiol. 91, 1111 – 1121 10.1152 / jn.00892.2003 [PubMed] [Cross Ref]
  42. Thomas MJ, Kalivas PW, Shaham Y. (2008). Neuroplastyczność mezolimbicznego układu dopaminowego i uzależnienia od kokainy. Br. J. Pharmacol. 154, 327 – 342 10.1038 / bjp.2008.77 [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed] [Cross Ref]
  43. Tunstall MJ, Oorschot DE, Kean A., Wickens JR (2002). Interakcje hamujące między neuronami projekcji kolczastej w prążkowiu szczura. J. Neurophysiol. 88, 1263 – 1269 10.1152 / jn.00886.2001 [PubMed] [Cross Ref]
  44. Vanderschuren LJ, Kalivas PW (2000). Zmiany w transmisji dopaminergicznej i glutaminergicznej w indukcji i ekspresji uczulenia behawioralnego: krytyczny przegląd badań przedklinicznych. Psychopharmacology (Berl) 151, 99 – 120 10.1007 / s002130000493 [PubMed] [Cross Ref]
  45. Wilson CJ, Groves PM (1980). Drobna struktura i synaptyczne połączenie wspólnego neuronu kolczastego neostriatum szczura: badanie z wykorzystaniem wewnątrzkomórkowego wstrzyknięcia peroksydazy chrzanowej. J. Comp. Neurol. 194, 599 – 615 10.1002 / cne.901940308 [PubMed] [Cross Ref]
  • Wise RA (2004). Dopamina, nauka i motywacja. Nat. Ks. Neurosci. 5, 483 – 494 10.1038 / nrn1406 [PubMed] [Cross Ref]