Dekodowanie obwodów neuronowych kontrolujących kompulsywne poszukiwanie sacharozy (2015) (MECHANIZM BINGOWY)

UWAGI: Badanie, które izoluje obwód odpowiedzialny za kompulsywne spożywanie cukru. Ten obwód jest oddzielony od normalnego obwodu konsumpcji żywności i wydaje się być „mechanizmem objadania się”. Czy kompulsywne zachowania seksualne mają swój własny obwód?


Edwarda H. Nie2 Gillian A. Matthews2 Stephen A. Allsop2 Kara N. Presbrey Christopher A. Leppla Romy Wichmann Rachael Neve Craig P. Wildes Kay M. Tyekorespondencja 2Co-pierwszy autor

Najważniejsze

  • • Neurony LH-VTA kodują działania poszukujące nagrody po przejściu na nawyki
  • • Podzbiór neuronów LH za oczekiwaniem nagrody w kodowaniu VTA
  • • Projekcje LH-VTA zapewniają dwukierunkową kontrolę nad kompulsywnym poszukiwaniem sacharozy
  • • Aktywacja projekcji GABAergicznych LH-VTA zwiększa nieadaptacyjne zachowanie podczas gryzienia

Podsumowanie

Projekcja boczna podwzgórza (LH) do brzusznego obszaru nakrywki (VTA) została powiązana z przetwarzaniem nagrody, ale obliczenia w pętli LH-VTA, które powodują określone aspekty zachowania, były trudne do wyodrębnienia. Pokazujemy, że neurony LH-VTA kodują wyuczone działanie poszukiwania nagrody, niezależnie od jej dostępności. Z kolei neurony LH poniżej VTA kodują wskazówki przewidujące nagrodę i nieoczekiwane pominięcie nagrody. Pokazujemy, że hamowanie szlaku LH-VTA zmniejsza "kompulsywne" poszukiwanie sacharozy, ale nie powoduje spożycia pokarmu u głodnych myszy. Odkrywamy, że LH wysyła ekscytację i hamuje wkład do neuronów dopaminy (DA) i GABA, oraz że projekcja GABAergiczna wywołuje zachowania związane z żywieniem. Nasze badania pokrywają informacje na temat rodzaju, funkcji i połączeń neuronów LH i identyfikują obwód nerwowy, który selektywnie kontroluje konsumpcję cukru kompulsywnego, bez zapobiegania karmieniu niezbędnemu do przeżycia, zapewniając potencjalny cel dla interwencji terapeutycznych w przypadku zaburzeń kompulsywno-przejedzających.

Wprowadzenie

W neuronach bocznego podwzgórza (LH) istnieje ogromna heterogeniczność pod względem funkcji i łączności, co można zaobserwować poprzez różnorodność zachowań związanych z nagrodą, motywacją i karmieniem związanym z tym regionem. Jednak niewiele wiadomo na temat tego, jak LH oblicza określone aspekty przetwarzania nagrody i jak te informacje są przekazywane do dalszych celów. Elektryczna stymulacja LH powoduje wewnątrzczaszkową autostymulację (ICSS) (Olds i Milner, 1954), a także zachowania związane z uwodzeniem, seksualnością i gryzieniem (Singh et al., 1996). Neurony LH kodują bodźce czuciowe (Norgren, 1970, Yamamoto i wsp., 1989), w tym sygnały związane z nagrodą (Nakamura i wsp., 1987). Neurony LH również wyzwalają się podczas zarówno karmienia (Burton i wsp., 1976, Schwartzbaum, 1988), jak i picia (Tabuchi i wsp., 2002). Jednak zrozumienie niezwykłej różnorodności funkcjonalnej obserwowanej w LH było głównym wyzwaniem w tej dziedzinie.

Chociaż LH jest połączony z wieloma regionami podkorowymi, mamy słabe zrozumienie, w jaki sposób funkcjonalna i komórkowa heterogeniczność LH jest przenoszona na te połączenia anatomiczne. Jednym z interesujących celów projekcji LH jest brzuszny obszar nakrywki (VTA), krytyczny element przetwarzania nagrody (Wise, 2004). Projekcja LH-VTA została zbadana we wczesnych badaniach, w których stosowano zapisy elektrofizjologiczne połączone ze stymulacją antydromową (Bielajew i Shizgal, 1986, Gratton i Wise, 1988). Od tego czasu potwierdzono, stosując metodę śledzenia za pośrednictwem wirusa wścieklizny, że istnieje monosynaptyczny sygnał wejściowy z neuronów LH do neuronów dopaminowych (DA) w VTA (Watabe-Uchida i wsp., 2012). VTA wysyła również wzajemne projekcje z powrotem do LH, zarówno bezpośrednio, jak i pośrednio, przez inne regiony, takie jak jądro półleżące, ciało migdałowate, hipokamp i brzuszna blada blada (Barone i in., 1981, Beckstead i in., 1979, Simon i in. , 1979).

Chociaż zarówno stymulacja elektryczna (Bielajew i Shizgal, 1986), jak i optyczna (Kempadoo i in., 2013) ustaliły przyczynową rolę projekcji LH do VTA w ICSS, kilka pytań pozostaje do odpowiedzi. Po pierwsze, jaka jest odpowiedź neuronów LH-VTA na różne aspekty zachowań związanych z nagrodą? Po drugie, jaka jest rola projekcji LH-VTA w poszukiwaniu nagrody w różnych sytuacjach związanych ze wzmocnieniem? Po trzecie, jaki jest ogólny skład szybkiej transmisji, w której pośredniczą wejścia LH do VTA i które komórki VTA otrzymują pobudzające / hamujące dane wejściowe? Wreszcie, co z pobudzających i hamujących składników szlaku LH-VTA przyczynia się do zaaranżowania dążenia do nagrody za pożądanie?

Aby odpowiedzieć na te pytania, zarejestrowaliśmy neurony LH u swobodnie poruszających się myszy i zastosowaliśmy fotoidentyfikację za pośrednictwem optogenetyki, aby nałożyć informacje o naturalnie występujących obliczeniach neuronowych podczas przetwarzania nagrody na informacje o łączności neuronów LH. Ponadto, wykorzystaliśmy eksperymenty patch-clamp ex vivo, aby zbadać skład wejść GABAergicznego i glutaminergicznego LH na neurony DA i GABA w VTA. Opierając się na naszych wynikach z eksperymentów związanych z nagrywaniem, wykorzystaliśmy zadania behawioralne do ustalenia związków przyczynowych między aspektami zarówno poszukiwania nagrody, jak i karmienia, a aktywacją odrębnych podzbiorów projekcji LH-VTA. Razem te dane pomagają nam ustalić model tego, w jaki sposób komponenty w pętli LH-VTA współpracują ze sobą w celu przetwarzania nagrody oraz jak manipulowanie poszczególnymi składnikami może mieć głęboki wpływ na zachowanie.

wyniki

Fotoidentyfikacja różnych komponentów w obwodzie LH-VTA

Aby zidentyfikować neurony LH, które zapewniają monosynaptyczny sygnał wejściowy do VTA in vivo i obserwować ich aktywność podczas swobodnie poruszających się zachowań, zastosowaliśmy strategię podwójnego wirusa do selektywnej ekspresji rodopsyny kanałowej-2 (ChR2) w neuronach LH zapewniających monosynaptyczny sygnał wejściowy do VTA (Ryciny 1A i S1). Wstrzyknęliśmy wektor wirusowy związany z adeno (AAV5) przenoszący ChR2-eYFP w zależnym od rekombinazy Cre-rekombinazie konstrukcie z podwójnie odwróconą otwartą ramką odczytu (DIO) do LH w celu zakażenia miejscowych somatów i wstrzyknięto do VTA podróżującego wstecz wirusa opryszczki pospolitej (HSV) niosącego rekombinazę Cre. Późniejsza rekombinacja pozwoliła na selektywną ekspresję opsyny i fluoroforu w neuronach LH, zapewniając monosynaptyczne wejście do VTA. Aby potwierdzić nasze podejście, przeprowadziliśmy ex vivo zapisy patch-clamp całych komórek w poziomych skrawkach mózgu zawierających LH i zarejestrowane z neuronów wyrażających ChR2-eYFP, a także sąsiednich neuronów LH, które były ujemne pod względem ChR2-eYFP (Rysunek 1B). Opóźnienia impulsów wywołanych światłem, mierzone od początku impulsu świetlnego do szczytu potencjału czynnościowego, wahały się od 3–8 ms (Rysunek 1DO). Stwierdziliśmy również, że żadna z zarejestrowanych komórek niewykazujących (ChR2-ujemnych) nie wykazywała odpowiedzi pobudzających na fotostymulację (n = 14; Rysunek 1C), pomimo ich bliskości do komórek wyrażających ChR2.

W celu przeprowadzenia optogenetycznej fotoidentyfikacji in vivo wszczepiono optrodę do LH w celu zarejestrowania aktywności neuronalnej podczas zadania polegającego na poszukiwaniu sacharozy. W tej samej sesji nagraniowej dostarczyliśmy kilka wzorców fotostymulacji w celu identyfikacji neuronów LH-VTA z ekspresją ChR2 (Ryciny 1D i S1). Przeanalizowaliśmy rozkład opóźnień reakcji fotoaktywnej we wszystkich neuronach LH, wykazując zablokowaną czasowo zmianę szybkości strzelania w odpowiedzi na oświetlenie i zaobserwowaliśmy rozkład bimodalny (Rysunek 1MI). Zaobserwowaliśmy populację neuronów podczas rejestracji in vivo z latencjami w zakresie 3–8 ms. Było to identyczne z zakresem latencji znalezionym w neuronach LH-VTA z ekspresją ChR2, gdy rejestrowaliśmy ex vivo. Te jednostki nazwaliśmy jednostkami „Typu 1” (Ryciny 1C, 1E i 1F). Ponadto istniała odrębna populacja komórek z opóźnieniami odpowiedzi foto-100 ms (Ryciny 1E i 1G), a my nazwaliśmy te urządzenia „Typ 2”. Zaobserwowaliśmy także neurony, które zostały zahamowane w odpowiedzi na fotostymulację neuronów LH-VTA (Rysunek S2), i nazwaliśmy te jednostki „Type 3”. Porównaliśmy czas trwania potencjału czynnościowego (mierzony od szczytu do dołka) i średnie szybkości odpalania jednostek Typu 1 i Typu 2, a także tych, które nie wykazały reakcji świetlnej (Rysunek 1H). Rozkład czasów trwania potencjalnego działania typu 1 (Rysunek 1I) i wpisz 2 (Rysunek 1J) pokazuje, że większość jednostek Typu 1 ma czas trwania potencjału czynnościowego mniejszy niż 500 μs (84%; n = 16/19, rozkład dwumianowy, p = 0.002).

Chociaż jednostki typu 1 spełniają standardowe kryteria klasyfikacji jako wykazujące ekspresję ChR2 (Cohen i wsp., 2012, Zhang i wsp., 2013), nie było jasne, czy dłuższe opóźnienie fotoreakcji jednostek typu 2 wskazuje na neurony z ekspresją ChR2, które odpowiedziały wolniej do fotostymulacji, czy też efekt ten był spowodowany aktywnością sieci. Biorąc pod uwagę, że neurony LH z ekspresją ChR2 (Typ 1) rzutują bezpośrednio do VTA, jedną z możliwości było to, że neurony typu 2 otrzymywały informację zwrotną z VTA (Rysunek 1K). Inną możliwością było aktywowanie neuronów typu 2 przez zabezpieczenia aksonów z neuronów typu 1 (Rysunek 1L). Aby rozróżnić te dwa możliwe modele obwodów, zahamowaliśmy VTA w połączeniu z fotoidentyfikacją w LH.

Długotrwałe fotoreakcje w neuronach LH są mediowane przez informacje zwrotne z VTA

W oparciu o nasze modele obwodów spodziewalibyśmy się, że zahamowanie dystalne nie będzie miało wpływu na fotoreakcje neuronów LH wyrażających ChR2. Jednak jeśli fotoreaktywne, ale nieeksprymujące, neurony LH opierały się na sprzężeniu zwrotnym z VTA, aby wywołać zablokowaną czasowo odpowiedź na oświetlenie (Rysunek 1K), spodziewalibyśmy się osłabienia reakcji świetlnych w tych neuronach po zahamowaniu VTA. Wyrażaliśmy ChR2 w komórkach LH-VTA jak wyżej, ale tym razem wyrażaliśmy także wzmocnioną halorodopsynę 3.0 (NpHR) w VTA i wszczepiliśmy światłowód w VTA oprócz optrody w LH (Rysunek 2ZA). Dostarczyliśmy te same wzory oświetlenia niebieskiego światła w LH dla wszystkich trzech epok, ale także fotoinhibowaliśmy VTA żółtym światłem w drugiej epoce (Rysunek 2ZA).

Na foto-reakcje jednostek typu 1 na oświetlenie światłem niebieskim w LH nie miało wpływu fotoinhibicja VTA, co jest zgodne z ekspresją ChR2 w neuronach LH-VTA typu 1 (Rysunek 2B). Z kolei większość jednostek typu 2 (87%; n = 13/15, rozkład dwumianowy, p = 0.004) wykazywała znaczące osłabienie fotoreakcji na impulsy światła niebieskiego dostarczane w LH po fotoinhibicji neuronów VTA. Odpowiedzi jednostek Typu 1 i Typu 2 podczas fotoinhibicji VTA były istotnie różne (chi-kwadrat = 7.64, p = 0.0057; Ryciny 2B i 2C). Różnice te można również zobaczyć w maksymalnych wynikach Z w poszczególnych epokach (Rysunek 2D) oraz z epoką żółtego włączenia znormalizowaną do epoki żółtego wyłączenia (Rysunek 2MI). Dane te sugerują, że neurony typu 2 LH otrzymują dane wejściowe (bezpośrednio lub pośrednio) z VTA (Rysunek 1K) zamiast przez lokalne zabezpieczenia aksonów (Rysunek 1L).

Odrębne właściwości kodowania neuronów LH Przed lub za VTA

Po zidentyfikowaniu tych dwóch różnych typów neuronów LH w pętli LH-VTA, chcieliśmy zbadać naturalnie występującą aktywność neuronową podczas zadania samodzielnego podawania sacharozy (Rysunek 3ZA). Myszy szkolono do wykonywania odpowiedzi na nos w celu przewidywania dostarczenia sacharozy do sąsiedniego portu (jak w Tye i wsp., 2008). Aby umożliwić nam rozróżnienie odpowiedzi neuronalnych na nóżkę i wskazówkę, wskazówkę i sacharozę dostarczono według schematu częściowego wzmocnienia, w którym 50% końcówek do nosa zostało sparowanych z podaniem wskazówki i sacharozy.

Jednostki typu 1 wykazały fazowe odpowiedzi na wejście do portu sacharozy, jak widać w reprezentatywnej jednostce typu 1 (Rysunek 3B), a także dane o populacji dla wszystkich jednostek typu 1 (Rysunek 3DO). Jednak reakcje fazowe jednostek typu 2 odzwierciedlały głównie odpowiedzi na wskazówkę przewidującą nagrodę (Ryciny 3D i 3E). Znormalizowane wzorce odpalania wszystkich zarejestrowanych neuronów (n = 198, podzielone na jednostki typu 1, 2, 3 i niereagujące) są wyświetlane dla każdego komponentu zadania: nosa sparowane z wskazówką, nosa przy braku wskazówki oraz wejście do portu sacharozy (Rysunek 3FA). Wszystkie jednostki typu 1, które wykazywały istotne dla zadania, fazowe zmiany aktywności (74%; n = 14/19) były albo pobudzane fazowo, albo hamowane przez wejście do portu sacharozy, przy czym niewielka liczba wykazała również fazowe zahamowanie wskazania predykcyjnego nagrody (Ryciny 3B, 3C i 3G). W przeciwieństwie do tego, jednostki typu 2 były bardziej heterogeniczne, a neurony reagujące na zadania selektywnie kodowały pamięć (35%), selektywnie wejście do portu sacharozy (26%) lub wejście do pamięci i portu (12%; Ryciny 3D, 3E i 3H). Aby zilustrować siłę odpowiedzi jednostek typu 1 i typu 2 na zdarzenia związane z zadaniem, narysowaliśmy każdą komórkę na trójwymiarowym wykresie zgodnie z wynikiem Z (Rysunek 3JA). Aby pokazać rozkład zmian fazowych w strzelaniu do wielu zdarzeń związanych z zadaniem na poziomie jakościowym, wykreśliliśmy liczbę komórek każdego typu reakcji na zdjęcie, które należą do danej kategorii (Rysunek 3JOT).

Różne elementy obwodu LH-VTA reprezentują wyraźne aspekty zachowania związanego z nagrodą

Biorąc pod uwagę dobrze zdefiniowaną rolę VTA w błędzie przewidywania nagrody (np. Fazowe zmniejszenie odpalania neuronów DA w odpowiedzi na nieoczekiwane pominięcie nagrody i fazowe wzbudzenie w odpowiedzi na nieoczekiwane dostarczenie nagrody) (Schultz et al., 1997) zbadaliśmy, czy neurony LH kodują nieoczekiwane pominięcie nagrody za sacharozę. Aby to zrobić, zarejestrowaliśmy aktywność neuronów fotoreaktywnych neuronów podczas tego samego zadania sygnał-nagroda u dobrze wytrenowanych zwierząt, ale losowo pominęliśmy 30% dostaw sacharozy podążających za wskazówką (Rysunek 4ZA).

Większość jednostek typu 1 (88%; n = 15/17, rozkład dwumianowy, p = 0.001) była niewrażliwa na pominięcie nagrody (Ryciny 4B i 4D), podczas gdy duży podzbiór jednostek Typu 2 (67%; n = 12/18) wykazywał znacząco różną reakcję na próby z nagrodą i pominięte (Ryciny 4C i 4D). Doszliśmy do wniosku, że neurony LH-VTA (typ 1) kodują działanie wejścia do portu, ponieważ odpowiedzi na wejście do portu były trwałe nawet po pominięciu nagrody (Rysunek 4D), w przeciwieństwie do jednostek typu 2 (chi-kwadrat = 10.9804, p = 0.0009).

Aby ustalić, czy odpowiedzi typu 1 na wejście do portu naprawdę kodują odpowiedź warunkową (CR), w przeciwieństwie do ogólnego zachowania polegającego na szukaniu nagrody lub eksploracji, zarejestrowaliśmy u niedoświadczonych myszy, które jeszcze nie przejęły zadania. U naiwnych myszy dostarczaliśmy sacharozę do portu przy braku wskazówki predykcyjnej (nieprzewidziane dostarczenie nagrody) i stwierdziliśmy, że jednostki typu 1 nie wykazywały fazowych odpowiedzi na wejście do portu (Ryciny 4E, 4F i 4I), zgodnie z modelem, w którym neurony typu 1 kodują CR (Rysunek 4JOT).

Następnie, aby ustalić, czy aktywność jednostki typu 2 jest zgodna z profilem odpowiedzi podobnym do błędu przewidywania nagrody, zarejestrowaliśmy te neurony u dobrze wyszkolonych zwierząt podczas nieprzewidzianego dostarczenia nagrody (Rysunek 4SOL). Okazało się, że podzbiór jednostek typu 2 zareagował na nieprzewidziane dostawy sacharozy (50%; Ryciny 4G – 4I). Podsumowując, podzestawy jednostek 2 są wrażliwe na nieoczekiwane pominięcie nagrody (Ryciny 4C i 4D) oraz nieprzewidziana dostawa nagród (Ryciny 4G – 4I), zgodny z profilem odpowiedzi podobnym do błędu przewidywania nagrody.

Fotostymulacja ścieżki LH-VTA promuje poszukiwanie sacharozy w obliczu negatywnych konsekwencji

Jak wykazaliśmy powyżej, jednostki typu 1 reprezentują neuronowy korelat CR. Co ważne, wzrost szybkości strzelania rozpoczyna się przed CR, zwiększając się aż do ukończenia CR (Ryciny 3B, 3C i 4B). Aby ustalić, czy aktywacja szlaku LH-VTA może promować CR, chcieliśmy przetestować zdolność aktywacji LH-VTA w prowadzeniu CR w obliczu negatywnych konsekwencji. U myszy typu dzikiego eksprymowaliśmy sam ChR2-eYFP lub eYFP w ciałkach komórek LH i wszczepiliśmy światłowód przez VTA (Ryciny 5A i S4). I odwrotnie, aby przetestować rolę szlaku LH-VTA w pośredniczeniu w CR lub zachowaniach związanych z karmieniem, obustronnie wyrażaliśmy NpHR-eYFP lub sam eYFP w komórkach LH i wszczepialiśmy światłowód powyżej VTA (Ryciny 5A i S4).

Zaprojektowaliśmy Pawłowskie zadanie warunkowania, w którym myszy pozbawione jedzenia musiały przekroczyć siatkę wstrząsów, aby otrzymać nagrodę z sacharozy (Rysunek 5B). W pierwszej epoce „bazowej” (z wyłączoną siatką uderzeniową), sprawdziliśmy, że każda mysz uzyskała zadanie podejścia warunkowego Pawłowa. W drugiej („szoku”) epoce siatka uderzeniowa powodowała łagodne wstrząsy stopy co sekundę. Wreszcie, w trzeciej epoce („Shock + Light”), kontynuowaliśmy dostarczanie wstrząsów stóp, ale także oświetlaliśmy zaciski LH w VTA niebieskim światłem (10 Hz) u myszy wyrażających ChR2 i dopasowanych kontrolek eYFP i żółtego światła (stałe) dla myszy wyrażające NpHR i ich kontrole eYFP (Rysunek 5B).

Zaobserwowaliśmy znacznie wyższą liczbę wejść portów na sygnał podczas epoki Shock + Light i znacznie wyższy wynik różnicy (Epoka Shock + Light - Epoka tylko Shock) u myszy ChR2 w porównaniu z myszami eYFP (Rysunek 5C i Film S1). W przeciwieństwie do tego, fotoinhibicja szlaku LH-VTA spowodowała znaczące zmniejszenie liczby wejść do portu na wskaźnik i różnicę wyników u myszy NpHR względem myszy eYFP (Rysunek 5D i Film S2). Eksperymenty wyginięcia w trakcie sesji, podczas których po prezentacji sygnałów nie nastąpiły dostawy sacharozy, wykazały podobne trendy w działaniu (Rysunek S4).

Co ważne, chcieliśmy ustalić, czy uzyskane zmiany w poszukiwaniu sacharozy były spowodowane zmianami w zachowaniu związanym z karmieniem lub wrażliwością na ból. Zauważyliśmy, że fotoaktywacja projekcji LH-VTA znacząco wydłużyła czas karmienia u dobrze karmionych myszy w grupie ChR2 (Rysunek 5MI). Jednak fotoinhibicja szlaku LH-VTA nie wpłynęła znacząco na zmniejszenie żywienia (Rysunek 5F), mimo że zwierzęta te zostały pozbawione żywności, aby zwiększyć naszą zdolność do wykrycia redukcji w stosunku do początkowej epoki (w porównaniu do zwierząt nasyconych w Rysunek 5MI). W żadnym ChR2 (Rysunek 5G) ani grupa NpHR (Rysunek 5H) czy zaobserwowaliśmy różnicę w opóźnieniu wycofania ogona z gorącej wody (Ben-Bassat i wsp., 1959, Grotto i Sulman, 1967), co wskazuje, że manipulowanie projekcją LH-VTA nie zmieniała analgezji.

LH zapewnia wejście glutaminianergiczne i GABAergiczne do neuronów VTA DA i GABA

Aby zbadać skład komponentów szybkiej transmisji wejść LH do VTA, które wywoływały te efekty, wykonaliśmy zapisy patch-clamp całych komórek z neuronów VTA w preparacie ostrego wycinka, jednocześnie aktywując optycznie wejścia LH wyrażające ChR2-eYFP (Ryciny 6A i S5). Biorąc pod uwagę, że istnieje ugruntowana heterogeniczność w obrębie VTA, obejmująca ~ 65% neuronów DA, ~ 30% neuronów GABA i ~ 5% neuronów glutaminianowych (Margolis et al., 2006, Nair-Roberts et al., 2008, Yamaguchi et al. al., 2007), podczas rejestracji wypełnialiśmy komórki biocytyną, aby umożliwić identyfikację typu komórki za pomocą immunohistochemii post-hoc dla hydroksylazy tyrozynowej (TH; Rysunek 6B), oprócz rejestrowania prądu kationowego aktywowanego hiperpolaryzacją (Ih) i mapowanie lokalizacji komórki (Ryciny 6Zespół muzyczny S5).

Po pierwsze, zarejestrowaliśmy w cęgach prądowych podczas fotostymulacji wejść LH wyrażających ChR2 i zaobserwowaliśmy, że 23 neuronów 27 wykazuje zablokowaną czasowo odpowiedź na fotostymulację wejść LH (Rysunek 6DO). Większość neuronów DA pobranych próbkami w VTA otrzymała netto pobudzający sygnał z LH (56%), podczas gdy inny podzbiór wykazał hamowanie netto (30%; Rysunek 6DO). Rozkład przestrzenny tych neuronów DA jest odwzorowany na atlas dla poziomych przekrojów zawierających VTA (Rysunek 6RE).

Aby ustalić monosynaptyczny udział wejść LH w neurony VTA DA, użyliśmy mapowania obwodu wspomaganego ChR2, w którym zapisy z zaciskami napięcia wykonano w obecności tetrodotoksyny (TTX) i 4-aminopirydyny (4AP; Petreanu i in., 2007) . Zgodnie z naszymi obserwacjami z nagrań prądowo-klamrowych, zaobserwowaliśmy, że większość zarejestrowanych neuronów VTA DA otrzymywała pobudzający sygnał monosynaptyczny wyłącznie z LH (67%), w porównaniu z neuronami VTA DA, które otrzymały wyłącznie hamujący sygnał monosynaptyczny (11%), lub oba (22%; Ryciny 6E i S6).

Zidentyfikowaliśmy neurony VTA GABA poprzez wstrzyknięcie zależnego od Cre fluoroforu (AAV5-DIO-mCherry) do VTA myszy VGAT :: Cre i wykorzystano ekspresję mCherry do kierowania rejestracją neuronów VTA GABA (n = 24; Rysunek 6FA). Czterdzieści sześć procent neuronów VTA GABA zareagowało wzbudzeniem netto, podczas gdy 54% zareagowało hamowaniem netto, na fotostymulację wejść LH wyrażających ChR2 (Rysunek 6SOL). Rozkład przestrzenny tych komórek pokazano w Rysunek 6H. Po zbadaniu monosynaptycznego wkładu z LH (jak opisano powyżej), stwierdziliśmy, że 18% próbkowanych neuronów GABA otrzymywał wyłącznie pobudzenie pobudzające, a 9% otrzymywało wyłącznie hamowanie (Rysunek 6JA). Jednak w porównaniu z neuronami VTA DA, stwierdziliśmy, że więcej neuronów VTA GABA otrzymywało pobudzające GABA, w którym pośredniczy AMPAR, i hamujące GABA.AWejście monosynaptyczne za pośrednictwem R z LH (73%; chi-kwadrat = 5.0505, p = 0.0246; Ryciny 6ja i S6).

Różne role glutaminianergiczne i GABAergiczne w szlaku LH-VTA w zachowaniu

Biorąc pod uwagę, że nasze nagrania ex vivo dostarczyły dowodów potwierdzających solidne dane wejściowe z projekcji GABAergicznego i glutaminergicznego LH do VTA, następnie zbadaliśmy rolę każdego składnika niezależnie. W tym celu wykorzystaliśmy transgeniczne linie myszy wyrażające rekombinazę Cre w neuronach, które wyrażały pęcherzykowy transporter glutaminianu 2 (VGLUT2) lub pęcherzykowy transporter GABA (VGAT). Wstrzyknęliśmy AAV5-DIO-ChR2-eYFP lub AAV5-DIO-eYFP do LH myszy VGLUT2 :: Cre i VGAT :: Cre i wszczepiono światłowód na VTA (Rysunek S7). Zwierzęta te następnie badano w każdym z testów behawioralnych pokazanych w Rysunek 5.

 

Nie zaobserwowaliśmy żadnych wykrywalnych różnic w liczbie wpisów portów dokonanych na sygnał między myszami wyrażającymi ChR2 lub eYFP w LHprzesytProjekcja VTA (Rysunek 7A) lub w LHGABAProjekcja VTA (Rysunek 7B). Jednak po analizie wideo zauważyliśmy nieprawidłowe zachowania gryzące w LHGABA-VTA: Grupa ChR2 przy oświetleniu światłem niebieskim (patrz Filmy S3 i S4). W LHprzesyt- Myszy VTA, chociaż zaobserwowano tendencję do zmniejszenia żywienia po fotostymulacji w grupie ChR2 w porównaniu z grupą eYFP, nie było to istotne statystycznie (Rysunek 7DO). Przeciwnie, zaobserwowaliśmy znaczny wzrost czasu spędzonego na karmieniu nasyconych myszy po oświetleniu w LHGABA-VTA: grupa ChR2 względem kontroli (Rysunek 7D i Film S3). W żadnej grupie zwierząt nie stwierdzono działania stymulacji światłem w teście cofania ogona (Ryciny 7E i 7F).

Podczas zadania karmienia, podobnie jak podczas zadania szukania sacharozy, ponownie zauważyliśmy nieprawidłowe sekwencje motoryczne związane z karmieniem, które nie były skierowane na jedzenie. W LH nakręciliśmy reprezentatywną myszGABA-VTA: grupa ChR2 w pustej przezroczystej komorze i po fotostymulacji 20 Hz zaobserwowaliśmy niezwykłe sekwencje ruchów apetytowych, takie jak lizanie i gryzienie podłogi lub pustej przestrzeni (Film S4). Oceniliśmy ilościowo te „gryzące” zachowania podczas zadania karmienia w LH-VTA typu dzikiego (Rysunek 7G), LHprzesyt-VTA (Rysunek 7H) i LHGABA-VTA (Rysunek 7I) grupuje i pokazuje, że LHGABA-VTA: Myszy ChR2 gryzły bardziej niż dzikie lub LHprzesyt-VTA: Myszy ChR2 po fotostymulacji w porównaniu z ich odpowiednimi grupami eYFP (Rysunek 7JOT). Zastanawialiśmy się, czy nieprawidłowe zachowania związane z karmieniem można oddzielić od odpowiednio ukierunkowanego karmienia na niższych częstotliwościach. Jednak kiedy testowaliśmy LHGABA-VTA: grupa ChR2 z ciągami 5 Hz i 10 Hz światła niebieskiego, zaobserwowaliśmy proporcjonalną zależność między częstotliwością stymulacji a zarówno karmieniem, jak i gryzieniem (Rysunek 7K).

Dyskusja

Elementy funkcjonalne pętli LH-VTA

Projekcja LH do VTA została zbadana w badaniach zderzeń stymulacji elektrycznej (Bielajew i Shizgal, 1986) i od dawna istnieje hipoteza, że ​​odgrywa rolę w przetwarzaniu nagród (Hoebel i Teitelbaum, 1962, Margules and Olds, 1962), ale wskazuje to rola była wyzwaniem. W tym miejscu szczegółowo omawiamy, w jaki sposób poszczególne elementy pętli LH-VTA przetwarzają różne aspekty zadania związanego z nagrodą.

Poprzez zastosowanie fototagowania za pośrednictwem optogenetyki (Rysunek 1), zidentyfikowaliśmy dwie odrębne populacje neuronów LH: komórki wysyłające projekcje do VTA (typ 1) i komórki, które otrzymują informacje zwrotne z VTA (typ 2; Rysunek 2) - chociaż te populacje nie muszą się wzajemnie wykluczać, ponieważ możliwe jest, że neurony LH mogą zarówno wysyłać, jak i odbierać dane wejściowe do i z VTA. Co ciekawe, odkryliśmy, że stosunkowo niewiele neuronów reagujących na światło znajduje się poza rozkładem bimodalnym obejmującym te dwie populacje (Ryciny S2Zespół muzyczny 1MI). Biorąc to pod uwagę, w połączeniu z długim opóźnieniem w fotoreakcji typu 2 (∼100 ms), spekulujemy, że może istnieć jeden dominujący szlak przyczyniający się do aktywności neuronów typu 2. Dodatkowo, ponieważ DA wiąże się z receptorami sprzężonymi z białkiem G, kinetyka jest wolniejsza niż w większości synaps glutaminergicznych (Girault i Greengard, 2004) i może wyjaśniać tę grupę 100 ms jednostek fotoreaktywnych. Możliwe jest również, że VTA może dostarczać pośredniego sprzężenia zwrotnego przez inne dystalne regiony, przez pobudzające regiony pośrednie, takie jak ciało migdałowate, lub z odhamowaniem przez jądro półleżące (NAc) lub jądro końcowe prążka końcowego (BNST).

Co ciekawe, podczas gdy fotostymulacja jednostek typu 1 wywołuje reakcje pobudzające w jednostkach typu 2, jednostki typu 1 i 2 wykazują odmienne właściwości kodowania behawioralnego. Na przykład liczby jednostek Typu 1 i Typu 2, które selektywnie kodują wskazówkę przewidującą nagrodę, są znacząco różne (n = 0/19 Typ 1 w porównaniu z n = 12/34 Typ 2, chi-kwadrat = 8.67, p = 0.003) . Ten paradoksalny wzorzec odpowiedzi może być spowodowany procesami obliczeniowymi w elemencie obwodu pośredniego, takim jak VTA, który może odgrywać aktywną rolę podczas zadania behawioralnego, ale nieaktywny podczas fototagowania. Ponadto stan zachowania zwierzęcia może wpływać na sposób przetwarzania tych danych.

 

 

Dekodowanie elementów obwodu w przetwarzaniu nagrody

Nasze eksperymenty z pominięciem nagrody umożliwiły nam rozróżnienie między neuronowym kodowaniem CR w LH a zużyciem bezwarunkowego bodźca (US). W tych eksperymentach podzbiór jednostek Typu 2 zareagował na wskazówkę przewidującą nagrodę (CS) i USA, a także wykazał spadek szybkości strzelania, gdy pominięto oczekiwane nagrody. Ponadto podzbiór jednostek typu 2 wykazuje również wzbudzanie fazowe po nieoczekiwanym dostarczeniu nagrody (Ryciny 4G i 4H). Dane te przypominają sposób, w jaki neurony DA w VTA kodują błąd przewidywania nagrody (Cohen i in., 2012, Schultz i in., 1997). Spekulujemy, że neurony VTA mogą przekazywać sygnały błędu przewidywania nagrody do podzbioru neuronów LH, które są dobrze przygotowane do integracji tych sygnałów w celu określenia odpowiedniego wyjścia behawioralnego. W szczególności LH jest silnie połączona z wieloma innymi obszarami mózgu (Berthoud i Münzberg, 2011) i została przyczynowo powiązana ze stanami homeostatycznymi, takimi jak sen / pobudzenie i głód / sytość (Carter i in., 2009, Jennings i in. , 2013).

Przyczynowa rola szlaku LH-VTA w kompulsywnym poszukiwaniu sacharozy?

Kompulsywne poszukiwanie nagrody zostało omówione przede wszystkim w kontekście uzależnienia od narkotyków, w którym klasycznym paradygmatem kompulsywnego poszukiwania narkotyków było zbadanie stopnia, w jakim zachowania związane z poszukiwaniem narkotyków utrzymują się w obliczu negatywnych konsekwencji, takich jak wstrząs (Belin i in., 2008, Pelloux i in., 2007, Vanderschuren i Everitt, 2004). Dostosowaliśmy to zadanie do sacharozy, starając się zbadać, czy aktywacja szlaku LH-VTA była wystarczająca do promowania kompulsywnego poszukiwania sacharozy. Biorąc pod uwagę, że wyraźna różnica między narkotykami a naturalną nagrodą polega na tym, że nagrody za narkotyki nie są konieczne do przeżycia, istnieją kontrowersje co do tego, jakie zachowania stanowiłyby kompulsywne zachowania związane z poszukiwaniem sacharozy lub pożywienia. Alternatywną interpretacją naszych danych jest to, że aktywacja szlaku LH-VTA po prostu zwiększa motywację lub chęć poszukiwania wzmacniaczy apetytu. Ponieważ wskaźniki otyłości wzrosły w ostatnich dziesięcioleciach (Mietus-Snyder i Lustig, 2008), kompulsywne przejadanie się i uzależnienie od cukru są powszechnymi stanami, które stanowią główne zagrożenie dla zdrowia ludzkiego (Avena, 2007). Zachowanie żywieniowe u nasyconych (w pełni karmionych) myszy po aktywacji szlaku LH-VTA przypomina zachowania żywieniowe obserwowane u ludzi, u których zdiagnozowano zaburzenie kompulsywnego objadania się (lub zaburzenia objadania się) (DSM-V).

Zaproponowano, że powtarzające się działania prowadzą do kształtowania nawyków, które same w sobie prowadzą do kompulsywnego poszukiwania nagrody, która charakteryzuje uzależnienie (Everitt i Robbins, 2005). Nasze odkrycie, że neurony LH-VTA kodują wejście do portu tylko po warunkowaniu, sugeruje, że ten szlak selektywnie koduje warunkową odpowiedź, a nie tylko działanie zmotywowane. Jest to zgodne z naszymi spostrzeżeniami, że optyczna aktywacja tej projekcji może promować kompulsywne poszukiwanie nagród w obliczu negatywnych konsekwencji (Rysunek 5C), a także w przypadku braku potrzeby (jak widać u nasyconych myszy, Rysunek 5MI). Interpretację tę potwierdza ponadto nasze ustalenie, że fotoinhibicja szlaku LH-VTA selektywnie zmniejsza kompulsywne poszukiwanie sacharozy (Rysunek 5D), ale nie ogranicza karmienia myszy z ograniczeniami żywieniowymi (Rysunek 5FA). Jednym z największych wyzwań w leczeniu kompulsywnych przejadania się lub objadania się jest ryzyko ogólnego pogorszenia zachowań żywieniowych. Z perspektywy translacyjnej mogliśmy zidentyfikować konkretny obwód nerwowy jako potencjalny cel dla rozwoju interwencji terapeutycznych w przypadku kompulsywnego objadania się lub uzależnienia od cukru bez poświęcania naturalnych zachowań żywieniowych.

Skład wkładu LH do VTA

Pokazujemy, że oprócz składnika glutaminergicznego LH-VTA (Kempadoo i in., 2013), w projekcji występuje również istotny składnik GABAergiczny (Leinninger i wsp., 2009) oraz że neurony LH są bezpośrednio synapsy zarówno na DA, jak i Neurony GABA w VTA (Rysunek 6). Istnieje jednak różnica w równowadze wkładu pobudzającego / hamującego na neurony VTA DA i GABA.

Podczas gdy używaliśmy przetwarzania immunohistochemicznego do weryfikacji tożsamości neuronów VTA, zmierzyliśmy również Ih, aktywowany hiperpolaryzacją, prostujący do wewnątrz niespecyficzny prąd kationowy (Lacey i wsp., 1989, Ungless i Grace, 2012). Obecność tego prądu była szeroko stosowana w badaniach elektrofizjologicznych do identyfikacji neuronów DA, ale wykazano, że występuje on tylko w subpopulacjach neuronów DA, wyznaczonych przez cel projekcji (Lammel i in., 2011). Chociaż wcześniej zaproponowano w przeglądzie Fieldsa i współpracowników, że „neurony LH synchronizują się z projekcjami VTA do PFC, ale nie z tymi, które rzutują do NAc” (Fields i in., 2007), nasze dane sugerują, że ta kontrowersja powinna zostać ponownie otwarta do dalszych badań. Mimo że zaobserwowaliśmy podzbiór neuronów DA, które otrzymały pobudzenie netto z LH i posiadały bardzo małe Ih (zgodnie z neuronami DA rzutującymi powłokę przyśrodkową mPFC lub NAc), zaobserwowaliśmy także podzbiór neuronów DA, które otrzymały sygnał pobudzenia netto i wykazały duże Ih (zgodny z charakterystyką neuronów DA rzutujących na boczną powłokę NAc; Rysunek S5; Lammel i in., 2011). Odwrotnie, neurony VTA DA, które otrzymały wejściowy sygnał hamujący netto, wykazywały bardzo małe Ih lub brakowało tego prądu, co jest zgodne z poglądem, że LH wysyła głównie hamujący sygnał wejściowy do neuronów VTA DA wystających do mPFC lub przyśrodkowej powłoki NAc. Pokazujemy również, że dane wejściowe LH można obserwować zarówno w środkowej, jak i bocznej VTA, co sugeruje, że LH dostarcza dane wejściowe do neuronów VTA z różnymi celami projekcji, ponieważ wiadomo, że cel projekcji VTA odpowiada nieco lokalizacji przestrzennej wzdłuż osi środkowo-bocznej ( Lammel i in., 2008).

 

 

Bilans wzbudzenia / hamowania na ścieżce LH-VTA

Rola szlaku LH-VTA w promowaniu nagrody została wcześniej przypisana transmisji glutaminergicznej w VTA (Kempadoo et al., 2013), ponieważ często uważa się, że promotor CaMKIIα jest selektywny dla neuronów projekcyjnych pobudzających. Jednak nasze dane wyraźnie pokazują, że ekspresja ChR2 pod kontrolą promotora CaMKIIα jest również ukierunkowana na neurony projekcyjne GABAergiczne w LH (Rysunek 6).

Zachowanie wywołane przez fotostymulację LHGABA- Ścieżka VTA była szalona, ​​źle ukierunkowana i nieprzystosowana (Film S4). Jedną z interpretacji jest aktywacja LHGABA- Ścieżka VTA wysyła do myszy sygnał, który powoduje rozpoznanie wzmacniacza apetytu. Alternatywną interpretacją jest to, że LHGABA- Ścieżka VTA może napędzać bodźce motywacyjne lub intensywne „pragnienie”, zgodne z sygnałem leżącym u podstaw uwarunkowanego podejścia, ale na poziomie niefizjologicznym, który powoduje takie nieprawidłowe zachowanie związane z żywieniem (Berridge i Robinson, 2003). Zgodnie z tym możliwe jest, że aktywacja LHGABA- Projekcja VTA powoduje intensywne uczucie głodu lub potrzeby jedzenia. Jednak nasze eksperymenty pokazują, że aktywacja LHGABA-VTA nie powoduje wzrostu kompulsywnego poszukiwania sacharozy, ale jest to prawdopodobnie spowodowane nadmiernym gryzieniem i nieprawidłowymi zachowaniami apetycznymi koncentrującymi się na obiektach nieżywnościowych w komorze testowej. Chociaż trudno jest określić doświadczenie myszy podczas tej manipulacji, jasne jest, że odpowiednio ukierunkowane zachowania związane z karmieniem wymagają skoordynowanej aktywacji zarówno składników GABAergicznych, jak i glutaminergicznych szlaku LH-VTA.

Wnioski

Optogenetyczne i farmakogenetyczne manipulacje są potężnymi narzędziami do ustalania związków przyczynowych, ale nie ujawniają endogennych, fizjologicznych właściwości elementów obwodu nerwowego. Nasze badanie ujednolica informacje na temat łączności synaptycznej, naturalnie występującej funkcji endogennej oraz przyczynowej roli szlaku LH-VTA, zapewniając nowy poziom wglądu w sposób integracji informacji w tym obwodzie. Wyniki te podkreślają znaczenie badania funkcjonalnej roli neuronów przez łączność, oprócz markerów genetycznych. Neurony LH-VTA selektywnie kodowały akcję poszukiwania nagrody, ale nie kodowały bodźców środowiskowych, podczas gdy bodźce nagradzające i wskazówki przewidujące nagrody były kodowane przez dyskretną populację neuronów LH poniżej VTA. Ponadto zidentyfikowaliśmy konkretną projekcję, która jest przyczynowo związana z kompulsywnymi zachowaniami polegającymi na poszukiwaniu sacharozy i karmieniu. Niejednorodność w projekcji LH-VTA jest niezbędna do zapewnienia równowagi adaptacyjnej między motywacją do prowadzenia pojazdu a regulowaniem odpowiednio ukierunkowanych zachowań apetycznych. Odkrycia te dostarczają informacji istotnych dla stanów patologicznych, takich jak kompulsywne zaburzenia objadania się, uzależnienie od cukru i otyłość

 
+

Rozszerzona dyskusja

Autorskie Wkłady

EHN i GAM wykonały zapisy elektrofizjologiczne i analizy odpowiednio do eksperymentów in vivo i ex vivo. SAA, EHN, KNP i CAL przeprowadziły eksperymenty behawioralne. RW, KNP, CAL i EHN przeprowadziły weryfikację histologiczną. RN dostarczył wirusa HSV. KMT i CPW nadzorowali eksperymenty i przeszkolili eksperymentatorów. Eksperymenty zaprojektowane przez EHN, GAM, SAA i KMT. EHN i KMT napisały manuskrypt; wszyscy autorzy przyczynili się do redagowania i weryfikacji manuskryptu.

 

 

 

Podziękowanie

Dziękujemy N. Golanowi, R. Thomasowi, M. Anahtar, G. Glober i A. Beyeler za ich pomoc w immunohistochemii. Chcielibyśmy również podziękować C. Seo i S. Kim za ich wkład podczas całego projektu oraz M. Wilson i P. Shizgal za pomocną dyskusję. KMT jest nowojorską Fundacją Komórek Macierzystych - Robertson Investigator i uznaje fundusze od JPB Foundation, PIIF, PNDRF, Whitehall Foundation, Klingenstein Foundation, NARSAD Young Investigator Award, Alfred P. Sloan Foundation, Whitehead Career Development Chair, NIH R01-MH102441- 01 (NIMH) oraz Nagroda Dyrektora NIH dla Nowego Badacza DP2-DK-102256-01 (NIDDK). EHN był wspierany przez stypendium NSF Graduate Research Fellowship, stypendium Integrative Neuronal Systems Fellowship oraz program szkoleniowy w zakresie neurobiologii uczenia się i pamięci. GAM był wspierany przez Simons Center for the Social Brain Postdoctoral Fellowship. SAA był wspierany przez Jeffrey and Nancy Halis Fellowship, a także przez Henry E. Singleton Fund. CAL był wspierany przez Integrative Neuronal Systems Fellowship i James R. Killian Fellowship. RW był wspierany przez program stypendialny RUBICON Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (NWO).

 

 

Informacja uzupełniająca

Film S1. Powiązane z rysunkiem 5 

Zwierzę typu dzikiego eksprymujące ChR2 w LH ze światłowodem wszczepionym nad VTA. Zwierzę konsekwentnie pobiera sacharozę w okresie wyjściowym, ale jest to zakłócane, gdy wstrząs pojawia się w drugiej epoce. Jednak fotostymulacja projekcji LH-VTA w trzeciej epoce powoduje, że zwierzę ponownie pobiera sacharozę. Zobacz rysunek 5.
Film S2. Powiązane z rysunkiem 5 

Zwierzę typu dzikiego wyrażające NpHR dwustronnie w LH ze światłowodem wszczepionym nad VTA. Zwierzę zachowuje się podobnie w pierwszych dwóch epokach (patrz film S1), ale dodatkowo odstrasza je przed pobieraniem sacharozy w trzeciej epoce dzięki fotohamowaniu projekcji LH-VTA. Zobacz rysunek 5.
Film S3. Powiązane z rysunkiem 7 

U zwierząt VGAT :: IRES-Cre wyrażających ChR2 w neuronach GABA-ergicznych LH z włóknem światłowodowym wszczepionym nad VTA, stymulacja zakończeń w VTA powoduje żarłoczne karmienie. Zobacz rysunek 7.
Film S4. Powiązane z rysunkiem 7 

W zwierzętach VGAT :: IRES-Cre wyrażających ChR2 w projekcjach GABAergic LH-VTA, karmieniu wywołanemu przez stymulację LHGABA-VTA często towarzyszy zachowanie „gryzienia”, które obejmowało nieprawidłowe sekwencje ruchowe związane z apetytem, ​​takie jak lizanie i gryzienie podłogi. Zaobserwowaliśmy również u wielu myszy z grupy LHGABA-VTA: ChR2 wykonywanie sekwencji ruchowej, co można by zwykle zaobserwować, gdy mysz podnosi granulkę pokarmu, trzyma ją obiema łapami i wykonuje ruchy gryzienia i żucia - z wyjątkiem tych czynności zostały wykonane przy braku jakiegokolwiek przedmiotu. Zobacz rysunek 7.

 

 

 

Miniatura rysunku fx1

H