Receptory dopaminy D2 w uzależnieniowych dysfunkcjach nagrody i kompulsywnym jedzeniu u otyłych szczurów (2010)

Zmiany receptora D2 mogą leżeć u podstaw uzależnienia od pornografiiKomentarz: To badanie pokazuje, że kiedy zwierzę ma nieograniczony dostęp, silny naturalny wzmacniacz (bardzo stymulujący pokarm) może spowodować spadek receptorów D2. Spadek ten był obserwowany u prawie wszystkich szczurów i następował dość szybko. Kiedy usunięto „wysoce smaczny” pokarm, szczury odmówiły jedzenia normalnej karmy. Szczury nadal objadały się (kiedy mogły) pomimo łączenia wstrząsów elektrycznych z konsumpcją „wysoce smacznego” jedzenia.


Nat Neurosci. 2010 May; 13(5): 635-641. Opublikowane online 2010 March 28. doi:  10.1038 / nn.2519

Abstrakcyjny

Odkryliśmy, że rozwój otyłości był połączony z pojawieniem się stopniowo pogarszającego się deficytu neuronalnych odpowiedzi nagrody. Podobne zmiany w homeostazie nagrody wywołane przez kokainę lub heroinę są uważane za kluczowe w wyzwalaniu przejścia od przypadkowego do kompulsywnego przyjmowania narkotyków. W związku z tym wykryliśmy kompulsywne zachowania żywieniowe u otyłych, ale nie szczupłych szczurów, mierzone jako smaczne spożycie pokarmu, które było odporne na zakłócenia przez awersyjny bodziec warunkowy. Receptory dopaminy D2 w prążkowiu (D2R) były obniżone u otyłych szczurów, jak donoszono u ludzi uzależnionych od narkotyków. Co więcej, powalenie prążkowia D2R za pośrednictwem lentiwirusa szybko przyspieszyło rozwój deficytów nagród podobnych do uzależnień i początek kompulsywnego poszukiwania pokarmu u szczurów z rozszerzonym dostępem do smacznego pokarmu o wysokiej zawartości tłuszczu. Dane te pokazują, że nadmierna konsumpcja smacznego jedzenia wyzwala podobne do uzależnień reakcje neuroadaptacyjne w mózgowych obwodach nagrody i napędza rozwój kompulsywnego jedzenia. Wspólne mechanizmy hedoniczne mogą zatem leżeć u podstaw otyłości i uzależnienia od narkotyków.

Wprowadzenie

Na karmienie ma wpływ przyjemność i nagroda, a otrzymanie nagrody żywnościowej może silnie motywować konsumpcję1, 2. Niemniej jednak hedoniczne mechanizmy przyczyniające się do otyłości pozostają słabo poznane. U hiperfagicznych ludzi z wrodzonym niedoborem leptyny aktywność w prążkowiu grzbietowym i brzusznym, które są podstawowymi składnikami obwodów nagrody w mózgu, znacznie wzrasta w odpowiedzi na obrazy pożywienia3, a terapia zastępcza leptyną osłabia zarówno aktywność prążkowia, jak i samo zgłaszane „lubienie” jedzenia3. Sugeruje to, że prążkowie jest ważne w hedonicznych aspektach zachowań żywieniowych. Niedawno wykazano, że aktywacja prążkowia w odpowiedzi na bardzo smaczny pokarm jest stępiona u osób otyłych w porównaniu z szczupłymi kontrolami4. Co więcej, niedoczynność prążkowia grzbietowego i długotrwały przyrost masy ciała są najbardziej widoczne u osób z allelem TaqIA locus genu DRD2 – ANKK1, co skutkuje zmniejszoną ekspresją D2R w prążkowiu i wykazano, że predysponuje osoby do zaburzeń uzależnienia od substancji4, 5. Te i podobne obserwacje doprowadziły do ​​​​propozycji, że deficyty w przetwarzaniu nagrody mogą być ważnym czynnikiem ryzyka rozwoju otyłości, a osoby otyłe mogą kompulsywnie spożywać smaczne jedzenie, aby zrekompensować nagrodę nadwrażliwość6. W szczególności nie jest jasne, czy deficyty w przetwarzaniu nagrody są konstytutywne i poprzedzają otyłość, czy też nadmierne spożywanie smacznego jedzenia może prowadzić do dysfunkcji nagrody, a tym samym przyczyniać się do otyłości wywołanej dietą.

Charakterystyczną cechą osób z nadwagą i otyłością jest to, że nadal przejadają się pomimo dobrze znanych negatywnych konsekwencji zdrowotnych i społecznych. Rzeczywiście, wiele osób z nadwagą wyraża chęć ograniczenia spożycia żywności, ale ma trudności z kontrolowaniem tego spożycia i wielokrotnie konsumuje ponad swoje zapotrzebowanie energetyczne7. Rozwój zachowań żywieniowych, które są niewrażliwe na negatywne skutki, jest analogiczny do kompulsywnego zachowania związanego z przyjmowaniem narkotyków obserwowanego u ludzi uzależnionych od narkotyków, które jest podobnie odporne na negatywne konsekwencje8. Tutaj zbadaliśmy wpływ rozszerzonego dostępu do smacznej diety wysokotłuszczowej na wrażliwość mózgowych systemów nagrody u szczurów. Zbadaliśmy również związek między rozregulowaniem hedonicznym wywołanym dietą a pojawieniem się kompulsywnego poszukiwania jedzenia. Na koniec zbadaliśmy rolę prążkowia D9R w tych uzależniających reakcjach behawioralnych.

Deficyty nagrody podobne do uzależnień u otyłych szczurów

Aby przetestować skutki ograniczonego lub rozszerzonego dostępu do smacznej diety wysokotłuszczowej, przygotowaliśmy samce szczurów Wistar (300-350 g) z dwubiegunową elektrodą stymulującą w bocznym podwzgórzu i trenowaliśmy je przez 10-14 dni w dyskretnej próbie procedurę nagrody za stymulację mózgu z aktualnym progiem (BSR), aż do ustalenia stabilnych progów nagrody4. W procedurze BSR szczury reagują energicznie, aby uzyskać satysfakcjonującą samostymulację elektryczną za pomocą znajdującej się na stałe elektrody stymulującej, przy minimalnej intensywności stymulacji, która utrzymuje zachowanie samostymulacji zwane progiem nagrody10. Ponieważ progi nagrody pozostają stabilne i niezmienione przez dłuższy czas w warunkach wyjściowych, ta procedura zapewnia czułą miarę reakcji systemów nagradzania mózgu. Po ustaleniu stabilnych progów BSR (zdefiniowanych jako <10% zmiany progów w ciągu trzech kolejnych sesji), przydzieliliśmy szczury do trzech grup, które nie wykazywały różnic w średniej masie ciała ani progach nagrody między grupami. Trzem grupom zapewniono zróżnicowany dostęp do diety „w stylu stołówki”, składającej się ze smacznej, wysokoenergetycznej żywności, łatwo dostępnej do spożycia przez ludzi (patrz Metody online). Szczury miały 0 godzin (szczury tylko z karmą; n = 9), 1 godzinę (szczury z ograniczonym dostępem; n = 11) lub 18–23 godzin (szczury o rozszerzonym dostępie; n = 11) dostęp do diety dziennie przez 40 kolejnych dni. Wiadomo, że diety stołowe powodują otyłość wywołaną dietą u szczurów11. Wszystkie szczury miały również dostęp ad libitum do standardowej karmy laboratoryjnej, z rejestrowanymi progami nagrody, przyrostem masy ciała i spożyciem kalorii.

Masa ciała znacznie wzrosła u szczurów z rozszerzonym dostępem do diety w stołówce w porównaniu z grupami tylko z karmą lub z ograniczonym dostępem (ryc. 1a). Waga również miała tendencję do wzrostu u szczurów o ograniczonym dostępie w porównaniu ze szczurami karmionymi tylko karmą, ale efekt ten nie osiągnął istotności statystycznej. Rozwój otyłości u szczurów o rozszerzonym dostępie był ściśle związany z pogarszającym się deficytem funkcji nagrody mózgu, odzwierciedlonym w stopniowo podwyższanych progach BSR (ryc. 1b). Ponieważ nie zaobserwowano różnic w opóźnieniach odpowiedzi dla BSR między trzema grupami (rysunek uzupełniający 1), deficyty w wynikach behawioralnych nie mogą wyjaśniać tej obserwacji. Podobne deficyty w funkcji nagradzania mózgu odnotowano u szczurów z rozszerzonym, ale nie ograniczonym dostępem do dożylnego podawania kokainy lub heroiny 12, 13, 14. Zatem przedłużony dostęp do smacznego, wysokotłuszczowego pokarmu może wywoływać podobne do uzależnień deficyty funkcji nagradzania mózgu, uważane za ważne źródło motywacji, które może prowadzić do przejadania się i przyczyniać się do rozwoju otyłości 1, 6.

Rycina 1: Przyrost masy ciała i dysfunkcja nagrody u szczurów z przedłużonym dostępem do diety stołowej.

( a ) Średni (± sem) przyrost masy u szczurów karmionych wyłącznie karmą, o ograniczonym dostępie i o rozszerzonym dostępie (dostęp × interakcja dnia: F39,702, 7.9 = 0.0001, 0.05, P <78,1092, 1.7; * P <0.0005, 0.05 w porównaniu z grupą tylko karm, test post-hoc). ( b ) Średnia (± sem) zmiana procentowa od podstawowych progów nagrody (interakcja dostępu × czas: FXNUMX = XNUMX, XNUMX, P <XNUMX, XNUMX; * P <XNUMX, XNUMX w porównaniu z grupą tylko z karmą, test post hoc).

Kiedy szczegółowo zbadaliśmy zachowanie żywieniowe (ryc. 2), stwierdziliśmy, że całkowite dzienne spożycie kalorii było podobne między szczurami tylko z karmą i szczurami o ograniczonym dostępie (ryc. 2a, d). Dla kontrastu, całkowite spożycie kalorii u szczurów z rozszerzonym dostępem było prawie dwukrotnie większe niż u szczurów z ograniczonym dostępem i tylko karmą (ryc. 2a, d). Chociaż szczury z ograniczonym dostępem i tylko z karmą utrzymywały w przybliżeniu takie samo dzienne spożycie kalorii (ryc. 2a, d), szczury z ograniczonym dostępem otrzymywały tylko ~ 33% swoich dziennych kalorii z karmy (ryc. 2b, d), co wskazuje, że rozwinęli zachowanie przypominające objadanie się i spożywali ~ 66% dziennego spożycia kalorii podczas 1-godzinnej sesji dostępu do diety w stołówce15 (ryc. 2d). Szczury o rozszerzonym dostępie otrzymywały tylko niewielką część (~ 5%) ich całkowitego spożycia kalorii z karmy (ryc. 2b); spożywali prawie wyłącznie dietę stołową (ryc. 2d). Zmiana preferencji żywieniowych w grupach o ograniczonym i rozszerzonym dostępie znalazła również odzwierciedlenie w wyraźnym wzroście spożycia tłuszczu w porównaniu ze szczurami tylko z karmą (ryc. 2c i ryc. Uzupełniająca 2). Zgodnie z poprzednimi doniesieniami16, istniała tendencja do zmniejszania się spożycia diety stołowej w czasie u szczurów o rozszerzonym dostępie. Może to odzwierciedlać rozwój tolerancji na smakowitość produktów żywnościowych dostarczanych w ramach diety stołowej w czasie. Niemniej jednak preferencje dla diety stołowej w porównaniu ze standardową karmą pozostały niezmiennie wysokie u tych szczurów (Uzupełniająca Ryc. 3). Dane te pokazują, że rozszerzony, ale nie ograniczony dostęp do smacznej, wysokotłuszczowej diety wywołuje podobne do uzależnień deficyty nagród, przejadanie się i utratę homeostatycznej równowagi energetycznej. Z drugiej strony, ograniczony dostęp do smacznego jedzenia prowadzi do wzorców konsumpcji przypominających objadanie się, ale nie zaburza homeostatycznej równowagi energetycznej ani funkcji nagrody mózgu. Jednak możliwe jest, że ograniczony dostęp do diety stołowej przez ponad 40 kolejnych dni spowodowałby znaczny przyrost masy ciała i zakłócenie funkcji nagradzania mózgu.

Rycina 2: Wzorce spożycia u szczurów z rozszerzonym dostępem do diety stołowej.

( a ) Średnie (± sem) dzienne spożycie kalorii u szczurów karmionych wyłącznie karmą, o ograniczonym dostępie i rozszerzonym dostępie (dostęp: F1,324 = 100.6, P <0.0001; czas: F18,324 = 7.8, P <0.0001; dostęp × interakcja czasowa: F18,324 = 4.6, P <0.0001; * P <0.05 w porównaniu z grupa spożywająca tylko karmę, test post hoc). (b) Średnie dzienne spożycie kalorii (± SEM) z chow (dostęp: f2,504 = 349.1, p <0.0001; czas: F18,504 5.9 = 0.0001, p <36,504; Dostęp × Interakcja czasowa: F3.52 = 0.0001, p <0.05; *p <2,486 w porównaniu z grupą polegającą na chow, test po hoc). ( c ) Średnie dzienne spożycie kalorii (± sem) z tłuszczu (dostęp: F118.7 = 0.0001, P <18,486; czas: F8.8 = 0.0001, P <36,486; dostęp × interakcja w czasie: F6.2 = 0.0001, P <0.05; * P <40 w porównaniu z grupą tylko z karmą, test post hoc). (d) Porównanie średniego (± sem) całkowitego spożycia kalorii i kalorii spożywanych wyłącznie z karmy, podczas całego 2,54-dniowego okresu dostępu (dostęp: F25.0 = 0.0001, P <2,54; źródło kalorii: F1235.2 = 0.0001, P <2,54; dostęp × interakcja źródła kalorii: F485.7 = 0.0001, P <0.001 0.001; ***P <XNUMX w porównaniu z całkowitą liczbą kalorii w grupie wyłącznie karmy, ###P <XNUMX w porównaniu z całkowitą liczbą kalorii w tej samej grupie szczurów, test post hoc).

Po 40 dniach szczury nie miały już dostępu do smacznej diety, ale nadal miały swobodny dostęp do standardowej karmy laboratoryjnej. Codziennie ocenialiśmy progi nagrody i spożycie karmy podczas tego wymuszonego okresu „abstynencji”. Podwyższenia progów nagrody utrzymywały się przez co najmniej 2 tygodnie u szczurów o przedłużonym dostępie, kiedy nie miały już dostępu do smacznej diety (ryc. 3a). Kontrastuje to ze stosunkowo przejściowymi (~ 48 h) deficytami funkcji nagrody zgłaszanymi u szczurów przechodzących abstynencję od samopodawanej kokainy13. Wystąpił również wyraźny spadek spożycia kalorii (ryc. 3b) i stopniowy spadek masy ciała (ryc. 3c) u szczurów o przedłużonym dostępie oraz w mniejszym stopniu u szczurów o ograniczonym dostępie, podczas tego okresu abstynencji, zgodnie z poprzednimi raportami11, 15. Po 14 dniach abstynencji szczury uśmiercono, a rozmieszczenie elektrod określono za pomocą barwienia fioletem krezylowym (ryc. 3d).

Rycina 3: Trwała dysfunkcja nagrody i hipofagia podczas abstynencji u szczurów z rozszerzonym dostępem do diety stołowej.

( a ) Średnia zmiana procentowa w stosunku do wyjściowych progów nagrody (± sem) podczas abstynencji od smacznej diety wysokotłuszczowej (dostęp: F2,112 = 3.7, P <0.05; czas: F4,112 = 2.3, P> 0.05; * P <0.05 w porównaniu z grupą tylko z karmą, test post hoc). (b) Średnie spożycie kalorii (± sem) w ostatnim dniu dostępu do diety wysokotłuszczowej (linia podstawowa) i podczas 14 dni abstynencji, gdy dostępna była tylko standardowa karma (dostęp: F2,168 = 41.7, P <0.0001; czas: F6,168 = 65.6, P <0.0001; dostęp × interakcja czasowa: F12,168 = 38.3, P < 0.0001; *P < 0.05 w porównaniu z grupą spożywającą wyłącznie karmę, test post hoc). (c) Zmiana średniej masy ciała (± sem) w porównaniu z masą ciała w ostatnim dniu dostępu do diety wysokotłuszczowej (linia wyjściowa) i podczas 14 dni abstynencji, gdy dostępna była tylko standardowa karma (dostęp: F1,126 = 37.2, P <0.0001; czas: F7,126 = 3.1, P <0.01; dostęp × czas interakcji: F7,126 = 40.9, P < 0.0001; *P < 0.05 w porównaniu z grupą spożywającą wyłącznie karmę, test post hoc). ( d ) Histologiczna rekonstrukcja lokalizacji elektrod stymulujących BSR w bocznym podwzgórzu szczurów tylko z karmą (trójkąty), o ograniczonym dostępie (kwadraty) i o rozszerzonym dostępie (kółka).

D2R prążkowia u otyłych szczurów: rola w niedoborach nagrody

Następnie przetestowaliśmy hipotezę, że nadmierne spożycie smacznej diety w stołówce może zmniejszyć gęstość prążkowia D2R, przyczyniając się do rozwoju nadwrażliwości na nagrodę podobnej do uzależnienia. Nowej kohorcie szczurów tylko z karmą, o ograniczonym dostępie i o rozszerzonym dostępie pozwolono na dostęp do diety w stołówce, dopóki nie wystąpił statystycznie istotny wzrost masy ciała u szczurów o przedłużonym dostępie w porównaniu z grupą tylko z karmą ( P <0.05, 4; Ryc. 70a). Ekspresja prążkowia podobno silnie glikozylowanej (~ 2 kDa) postaci D4R związanej z błoną była niższa u szczurów o rozszerzonym dostępie niż u szczurów o ograniczonym dostępie lub tylko dla karmy (ryc. 2b; patrz Metody online). Kiedy podzieliliśmy szczury w każdej grupie dostępu na dwie podgrupy na podstawie średniego podziału masy ciała (lekki lub ciężki), stwierdziliśmy wyraźną odwrotną zależność między masą ciała a ekspresją prążkowia D4R (ryc. 39a, c). Nie wykryliśmy żadnych statystycznie istotnych spadków ekspresji nieglikozylowanych niedojrzałych (~ 51 kDa) i pośrednio glikozylowanych cytoplazmatycznych (~ 2 kDa) form D4R (dodatkowa ryc. 17) 2, co wskazuje, że ekspresja prążkowia DXNUMXR u szczurów o rozszerzonym dostępie jest prawdopodobnie regulowana przez mechanizmy post-transkrypcyjne.

Ryc. 4: Przyrost masy ciała jest odwrotnie proporcjonalny do poziomów D2R w prążkowiu.

( a ) Szczury tylko karmione, o ograniczonym dostępie i rozszerzonym dostępie podzielono na dwie grupy według warunków dostępu w oparciu o średni podział masy ciała: lekki (L) lub ciężki (H). ( b ) Cały kompleks prążkowia zebrano od wszystkich szczurów, a poziomy D2R w każdej grupie zmierzono metodą Western blotting. Pasmo D2R związane z błoną zostało rozdzielone przy 70 kDa, a kontrola ładowania białka jest przedstawiona poniżej (β-aktyna, 43 kDa). Immunobloty pełnej długości pokazano na dodatkowym rysunku 12. ( c ) Względne ilości D2R w prążkowiu szczurów tylko z karmą, o ograniczonym dostępie i rozszerzonym dostępie określono ilościowo za pomocą densytometrii (F2,6, 5.2 = 0.05, 0.05, P <0.01, XNUMX, główny efekt dostępu; *P <XNUMX i **P <XNUMX w porównaniu z grupą tylko karmą-L).

Następnie, aby przetestować funkcjonalne znaczenie wywołanych dietą redukcji D2R prążkowia dla funkcji nagrody mózgu, zaprojektowaliśmy i zweryfikowaliśmy wektor lentiwirusowy, aby dostarczyć krótki interferujący RNA o szpilce do włosów (shRNA) w celu powalenia D2R (Lenti-D2Rsh; ryc. 5 i ryc. Uzupełniająca 5). Progi nagrody zaczęły rosnąć u szczurów leczonych Lenti-D2Rsh niemal natychmiast po uzyskaniu pozwolenia na przedłużony dostęp do diety w stołówce, podczas gdy progi nagrody pozostały niezmienione u szczurów o przedłużonym dostępie leczonych pustym wektorem lentiwirusowym (kontrola Lenti) przez stosunkowo krótki okres dostępu do diety w stołówce (14 d; ryc. 6a). Opóźnienia odpowiedzi były niezmienione w obu grupach szczurów, co pokazuje, że efekt ten nie był drugorzędny w stosunku do deficytów w wykonywaniu zadań (Uzupełniająca Ryc. 6). Progi nagrody były również niezmienione u szczurów leczonych Lenti-D2Rsh lub kontrolą Lenti, które miały dostęp do karmy tylko w tym samym okresie (ryc. 6b).

Progi pozostawały stale podwyższone podczas dodatkowych 15 dni abstynencji, gdy wszystkie szczury miały dostęp tylko do standardowej karmy (Uzupełniająca Ryc. 7). Powalenie prążkowia D2R zwiększyło zatem podatność na niedoczynność nagrody wywołaną dietą, ale nie zmieniło podstawowej aktywności systemów nagradzania mózgu.

Figura 5: Knockdown ekspresji D2R prążkowia za pośrednictwem lentiwirusa.

( a ) Graficzne przedstawienie obszarów prążkowia, w których Lenti-D2Rsh ulegało nadekspresji. Zielone kółka na lewej półkuli prążkowia reprezentują miejsca, w które kierowano infuzje wirusowe. Barwienie na zielono w prawej półkuli prążkowia jest reprezentatywnym barwieniem immunochemicznym białka zielonej fluorescencji (GFP) z mózgu szczura Lenti-D2Rsh. ( b ) Reprezentatywny immunoblot zmniejszonej ekspresji D2R w prążkowiu szczurów Lenti-D2Rsh. Immunobloty pełnej długości pokazano na dodatkowym rysunku 13. ( c ) Względne ilości D2R w prążkowiu szczurów Lenti-control i Lenti-D2Rsh, określone ilościowo za pomocą densytometrii (* P <0.05, 2 w porównaniu z grupą kontrolną Lenti, test post hoc ). ( d ) Nie wykryto zakażenia komórek glejowych w prążkowiu wektorem Lenti-D2Rsh. Zielone zabarwienie to GFP z wirusa; kolor czerwony oznacza kwaśne białko fibrylarne glejowe (GFAP) będące markerem astrocytów; jądra komórkowe są podświetlone przez barwienie DAPI na niebiesko. Białe strzałki wskazują zlokalizowany obszar glejozy występujący tylko w miejscu wstrzyknięcia wirusa w prążkowiu, a nie w otaczających tkankach, do których wirus się rozprzestrzenił. Nawet w tym obszarze żaden z astrocytów nie jest GFP-dodatni. Żółte strzałki na powiększonym obrazie podkreślają typowe wykryte astrocyty GFP-ujemne. ( e ) Wysokie poziomy infekcji neuronów w prążkowiu przez wektor Lenti-D2Rsh. Zielone zabarwienie to GFP z wirusa; czerwony to neuronalny marker jądrowy NeuN; jądra komórkowe są podświetlone przez barwienie DAPI na niebiesko. Żółte strzałki na powiększonym obrazie podkreślają neurony GFP-dodatnie i NeuN-dodatnie w prążkowiu. ( f ) Obraz w większym powiększeniu neuronu zakażonego wirusem (GFP-dodatniego) w prążkowiu szczurów Lenti-DXNUMXRsh, który pokazuje typowe cechy morfologiczne średnich neuronów kolczastych.

Rycina 6: Powalenie prążkowia D2R zwiększa podatność na dysfunkcję nagradzania u szczurów z rozszerzonym dostępem do diety w stołówce.

( a ) Średnia (± sem) zmiana procentowa w stosunku do wyjściowych progów nagrody u szczurów kontrolnych Lenti i Lenti-D2Rsh, które miały przedłużony dostęp do diety w stołówce przez 14 kolejnych dni (wirus: F1,156 = 5.9, 0.05, P <13,156, 2.2; czas: F0.05 = 13,156, 2.2, P <0.05, 0.05; wirus × interakcja czasowa: F2, 14 = 2,28, 135.6, P <0.0001, 14; # P < 2,28, efekt interakcji). ( b ) Średnia (± sem) zmiana procentowa od podstawowych progów nagrody u szczurów kontrolnych Lenti i Lenti-D96.4Rsh, które miały dostęp tylko do karmy. ( c ) Średnie (± sem) spożycie kalorii przez szczury podczas 0.0001 dni samej karmy lub przedłużonego dostępu (dostęp: F0.001, XNUMX = XNUMX, XNUMX, *** P <XNUMX, XNUMX). ( d ) Średni ( ± sem ) przyrost masy ciała podczas XNUMX dni samej karmy lub przedłużonego dostępu (dostęp: FXNUMX, XNUMX = XNUMX, XNUMX, P <XNUMX, XNUMX; *** P <XNUMX, XNUMX, główny efekt dostępu).

Stwierdziliśmy, że spożycie kalorii (ryc. 6c) i przyrost masy ciała (ryc. 6d) były podobne w Lenti-D2Rsh i odpowiednich grupach kontrolnych Lenti w warunkach tylko karmy lub rozszerzonego dostępu (rysunki uzupełniające 8 i 9). Tak więc knockdown prążkowia D2R nie zmienił ani preferencji diety w stołówce, ani całkowitego spożycia kalorii, gdy smaczne jedzenie było swobodnie dostępne do spożycia.

Kompulsywne jedzenie u otyłych szczurów: rola prążkowia D2R

Następnie przetestowaliśmy hipotezę, że kompulsywne jedzenie może pojawić się u szczurów z rozszerzonym dostępem do diety stołowej i że deficyty w sygnalizacji D2R prążkowia mogą przyczynić się do tego efektu. Nowej kohorcie szczurów tylko z karmą, o ograniczonym dostępie i rozszerzonym dostępie pozwolono na dostęp do diety w stołówce przez> 40 d, aż do wystąpienia statystycznie istotnego wzrostu masy ciała u przedłużonych szczurów (P <0.05, 30 w porównaniu ze szczurami tylko z karmą; dane nie pokazane). Wszystkim trzem grupom szczurów pozwolono następnie na dostęp tylko przez 5 minut dziennie do diety w stołówce przez 7-10 dni w komorze operacyjnej, aż do osiągnięcia stabilnego spożycia (zdefiniowanego jako <7% zmienność dziennego spożycia). Połowa szczurów w każdym stanie dostępu została następnie wystawiona na światło (bodziec warunkowy) w połączeniu z dostarczeniem wstrząsów stopy (grupa ukarana), podczas gdy pozostałe szczury w każdej grupie zostały wystawione na działanie światła ostrzegawczego przy braku wstrząsu stopy (grupa bez kary) ). W dniu testu zbadaliśmy wpływ samej ekspozycji na światło sygnalizacyjne na smaczne spożycie żywności (ryc. 30; patrz Metody online). Stwierdziliśmy, że średnie spożycie kalorii podczas 7-minutowych sesji podstawowych było wyższe u szczurów karmionych wyłącznie karmą i o ograniczonym dostępie niż u szczurów o rozszerzonym dostępie (ryc. 30a, b). Sugeruje to, że szczury karmione tylko karmą i z ograniczonym dostępem objadały się smacznym jedzeniem podczas przerywanych 40-minutowych sesji dostępu, co znalazło odzwierciedlenie w fakcie, że szczury te spożywały ~ 50-100% dziennego spożycia kalorii, zwykle ~ 7 kCal, podczas tych sesji (ryc. 40a,b). Z kolei szczury o przedłużonym dostępie wydają się odporne na rozwinięcie tego zachowania przypominającego objadanie się, być może dlatego, że ich historia prawie nieograniczonego dostępu do smacznego pożywienia przez ponad 7 kolejnych dni ustaliła wzorce jedzenia, które były stosunkowo nieelastyczne do zmiany. W dniu testu nie zaobserwowaliśmy statystycznie istotnego wpływu powtórki światła sygnalizacyjnego na spożycie pokarmu u niekaranych szczurów z grup tylko z karmą, z ograniczonym dostępem lub z rozszerzonym dostępem w porównaniu z przyjmowaniem w okresie wyjściowym (ryc. 7a). Samo światło sygnalizacyjne nie miało zatem znaczenia motywacyjnego. U ukaranych szczurów sparowane światło sygnalizacyjne znacząco zmniejszyło spożycie smacznego pokarmu u szczurów karmionych tylko karmą i szczurów o ograniczonym dostępie. Jednak światło ostrzegawcze nie miało wpływu na spożycie smacznego pokarmu u szczurów o przedłużonym dostępie, co pokazuje, że ich spożycie było niewrażliwe na awersyjne sygnały środowiskowe przewidujące przeciwności losu. Wyjściowe spożycie energii u szczurów o przedłużonym dostępie było niższe niż w innych grupach. Jednakże, ponieważ spożycie karmy w podobnych okresach było znacznie niższe (ryc. 18d), jest mało prawdopodobne, aby stanowiło to „efekt podłogi”, który zakłóca nasze ustalenia. Łącznie nasze dane potwierdzają pogląd, że kompulsywne zachowania żywieniowe mogą pojawić się u szczurów o rozszerzonym dostępie w sposób analogiczny do kompulsywnego przyjmowania kokainy obserwowanego u szczurów z historią rozszerzonego dostępu do narkotykuXNUMX.

Rysunek 7: Kompulsywne reagowanie na smaczne jedzenie.

( a ) Średnie (± sem) smaczne spożycie diety u niekaranych szczurów podczas 30-minutowych sesji podstawowych i w dniu testu, kiedy szczury były narażone na neutralny bodziec warunkowy, który nie był wcześniej połączony ze szkodliwym wstrząsem stopy (dostęp: F2,20, 5.2 = 0.05, P <0.05; # P <30 w porównaniu ze szczurami karmionymi wyłącznie karmą). ( b ) Średnie (± sem) smaczne spożycie diety u ukaranych szczurów podczas 2,21-minutowych sesji podstawowych i w dniu testu, kiedy szczury były narażone na warunkowy bodziec, który był wcześniej połączony ze szkodliwym wstrząsem stopy (dostęp: F3.9, 0.05 = 1,21, 8.6 , P <0.01; wskazówka: F2,21 = 4.7, P <0.05; interakcja dostęp × wskazówka: F0.05 = 0.05, P <30; *P <2 w porównaniu z spożyciem podczas sesji podstawowej, #P <1,26 w porównaniu z szczury jedzące tylko karmę). ( c ) Średnie (± sem) smaczne spożycie diety podczas 29.7-minutowych sesji podstawowych i w dniu testu u szczurów Lenti-control i Lenti-D0.0001Rsh, które wcześniej miały tylko karmę lub rozszerzony dostęp do diety w stołówce (cue: F0.05, 0.01 = 30, P < 2; * P < 1,26, ** P < 44.9 w porównaniu ze spożyciem podczas sesji podstawowych, test post hoc). ( d ) Średnie (± sem) spożycie karmy podczas 0.0001-minutowych sesji podstawowych iw dniu testu u szczurów Lenti-control i Lenti-D0.05Rsh, które wcześniej miały tylko karmę lub rozszerzony dostęp do diety w stołówce (wskazówka: F0.01, XNUMX = XNUMX, P < XNUMX; *P < XNUMX, **P < XNUMX w porównaniu ze spożyciem podczas sesji wyjściowych, test post hoc).

Na koniec zbadaliśmy wpływ warunkowego bodźca sparowanego z karą na przyjmowanie pokarmu u szczurów kontrolnych Lenti i Lenti-D2Rsh, które wcześniej miały dostęp tylko do karmy lub rozszerzony dostęp do diety w stołówce (szczury z ryc. 6). Stwierdziliśmy, że podstawowe spożycie smacznego jedzenia podczas 30-minutowych sesji podstawowych było podobnie wysokie (~ 40 kCal) we wszystkich czterech grupach (ryc. 7c). Ponadto całkowite dzienne spożycie karmy (w klatce domowej) było podobne we wszystkich czterech grupach szczurów podczas sesji kondycjonowania iw dniu testu (Uzupełniająca Ryc. 10). 14 d wcześniejszego dostępu do diety w stołówce nie było zatem wystarczające, aby zablokować zachowania przypominające objadanie się w sposób podobny do obserwowanego u szczurów, które miały> 40 d rozszerzony dostęp do diety w stołówce (ryc. 7a, b). Awersyjny bodziec świetlny zakłócił przyjmowanie smacznego pokarmu u szczurów Lenti-control i Lenti-D2Rsh, które wcześniej miały dostęp tylko do karmy (ryc. 7c). Podobnie awersyjny bodziec warunkowy zakłócił przyjmowanie smacznego pokarmu u szczurów kontrolnych Lenti, które wcześniej miały 14-dniowy przedłużony dostęp do diety w stołówce. Natomiast awersyjny bodziec warunkowy nie miał wpływu na smaczne spożycie pokarmu u szczurów Lenti-D2Rsh, które wcześniej miały 14-dniowy przedłużony dostęp do diety w stołówce (ryc. 7c). Progi BSR pozostały znacząco podwyższone u tych szczurów, gdy zarejestrowano je 48 godzin po sesji testowej, podczas gdy progi pozostały stabilne i niezmienione w pozostałych trzech grupach szczurów

(Uzupełniająca ryc. 11). Aby sprawdzić, czy oporność na wywołane bodźcem warunkowym tłumienie przyjmowania smacznego pokarmu u szczurów Lenti-D2Rsh o przedłużonym dostępie nie była wtórna do upośledzenia klasycznych procesów warunkowania, przetestowaliśmy wpływ awersyjnego bodźca warunkowego na spożycie mniej smaczna standardowa karma w wszystkie cztery grupy szczurów. W przeciwieństwie do objadania się smacznym jedzeniem, odkryliśmy, że wszystkie cztery grupy szczurów spożywały małą karmę (~ 2 kCal) podczas 30-minutowych sesji podstawowych (ryc. 7d) i że spożycie karmy zostało zakłócone we wszystkich czterech grupy przez podobna wielkość po ekspozycji na awersyjny bodziec warunkowy (ryc. 7d). Dane te pokazują, że knockdown prążkowia D2R znacznie przyspieszył pojawienie się kompulsywnego jedzenia smacznego jedzenia, ale tylko u szczurów z historią rozszerzonego dostępu. Ponadto, ponieważ kompulsywne jedzenie wykryto tylko u szczurów Lenti-D2Rsh, które miały podwyższone progi BSR, wywołana dietą niedoczynność nagrody może być koniecznym poprzedzającym pojawienie się kompulsywnego poszukiwania pożywienia.

Dyskusja

Łatwość dostępu do smacznej, wysokotłuszczowej żywności jest uważana za ważny środowiskowy czynnik ryzyka otyłości19. Odkryliśmy, że przedłużony dostęp do bardzo smacznej diety w stylu stołowym powodował przejadanie się i przyrost masy ciała w połączeniu ze stopniowym podnoszeniem progów BSR u szczurów. Ten wpływ na progi BSR można wytłumaczyć stopniowym zmniejszaniem się reakcji obwodów nagrody w mózgu, co jest interpretacją zgodną z faktem, że ograniczenie pokarmu i utrata masy ciała mogą wzrosnąć20, podczas gdy ostre przekarmienie może przejściowo zmniejszyć21, odpowiadając na BSR u szczurów. To odkrycie stanowi rozszerzenie pracy pokazujące, że ostre przekarmienie szczurów przez sondę do karmienia21 i rozdęcie żołądka lub dożylny wlew glukagonu, który naśladuje sytość poposiłkową22, zmniejsza odpowiedź na nagradzanie bocznego podwzgórza BSR i zwiększa reakcje podobne do awersji na stymulację23. Poprzednie prace wykazały również, że wielokrotne karmienie szczurów na siłę przez sondy dożołądkowe, aż ich waga wzrośnie o ~ 24 g, podobnie zmniejsza wskaźniki odpowiedzi na BSR, efekt, który utrzymuje się do czasu normalizacji masy ciała25. Podobnie jak w tych odkryciach u szczurów, odpowiedź u kotów na BSR bocznego podwzgórza była hamowana przez wcześniejsze karmienie do nasycenia200, co pokazuje, że interakcje między funkcją nagrody mózgu a stanem metabolicznym są zachowane, a zatem prawdopodobnie występują również u ludzi. Łatwość dostępu i wynikające z tego przejadanie się diet kafeteryjnych u ludzi jest uważane za ważny środowiskowy czynnik przyczyniający się do obecnej epidemii otyłości w społeczeństwach zachodnich23. Nasze dane pokazują, że niedoczynność nagrody pojawia się u szczurów, które dobrowolnie przejadają się smaczną dietą stołową podobną do tej spożywanej przez ludzi i że efekt ten staje się coraz gorszy, gdy przybierają na wadze. Warto zauważyć, że wszystkie szczury z podwyższeniem progu nagrody ≥ 26% miały elektrody BSR umieszczone w odległości ~ 19 μm od sklepienia grzbietowo-bocznego. Wrażliwość neuronów związanych z nagrodą w tym obszarze jest zwiększona przez ograniczenie jedzenia w sposób, który jest wrażliwy na leptynę pochodzącą z tłuszczu, a ten obszar mózgu jest uważany za ważny substrat dla nagrody za jedzenie20. Obwody mózgowe, które regulują hedonikę pokarmową, są zatem hamowane przez sygnały postestive, które przewidują sytość, zgodnie z ostatnimi badaniami obrazowania ludzi pokazującymi, że rozdęcie żołądka500 i pochodzący z jelit peptyd czynnika poposiłkowego YY27-28 (PYY)3 modulują aktywność regionów mózgu zaangażowanych w przetwarzanie nagrody. Ponadto układy nagrody są również hamowane przez nadmierny przyrost masy ciała. Ostatnie doniesienia wskazują, że krążąca leptyna, kluczowy regulator równowagi energetycznej, może przenikać do tkanek mózgu i hamować aktywność obwodów nagrody36.

Deficyty nagrody u szczurów z nadwagą mogą odzwierciedlać przeciwstawne spadki podstawowej wrażliwości obwodów nagrody w mózgu, aby przeciwstawić się ich nadmiernej stymulacji przez smaczne jedzenie. Taka niedoczynność nagrody wywołana dietą może przyczynić się do rozwoju otyłości poprzez zwiększenie motywacji do spożywania diet „otyłych” o wysokich nagrodach w celu uniknięcia lub złagodzenia tego stanu negatywnej nagrody6, 32. Może to wyjaśniać hipofagię, którą obserwowaliśmy u szczurów o rozszerzonym dostępie iw mniejszym stopniu u szczurów o ograniczonym dostępie, gdy smaczne jedzenie zostało wycofane i dostępna była tylko mniej smaczna karma. Taki scenariusz jest również zgodny z danymi z badań obrazowania ludzkiego mózgu, w których stępiona aktywacja prążkowia w odpowiedzi na bardzo smaczny pokarm, szczególnie u osób z polimorfizmami genetycznymi, o których uważa się, że zmniejszają ekspresję prążkowia D2R, wiąże się z długotrwałym przyrostem masy ciała4. Nie jest jasne, czy taka nadwrażliwość na nagrody u osób otyłych objawia się przed rozwojem otyłości i jest związana wyłącznie z czynnikami genetycznymi („zespół niedoboru nagrody”), czy też przejadanie się może powodować zakłócenia w przetwarzaniu nagrody. Nasze dane pokazują, że rozszerzony dostęp do smacznego, wysokoenergetycznego jedzenia i późniejsze przejadanie się blantów nagradzają wrażliwość i dlatego mogą stanowić ważny mechanizm hedoniczny, który sprzyja rozwojowi otyłości. Podobną dysfunkcję nagrody do tej zgłaszanej tutaj u otyłych szczurów wykrywa się również u szczurów z historią rozszerzonego dostępu do samopodawania dożylnej kokainy lub heroiny, ale nie u tych z historią ograniczonego dostępu12, 13, 14. Ponadto zaproponowano, że przejście od przypadkowego do kompulsywnego poszukiwania narkotyków wynika z próby złagodzenia uporczywego stanu zmniejszonej nagrody wywołanej tą wywołaną przez narkotyki dysfunkcją nagrody12, 32, 33. Zatem nasze dane wskazują, że otyłość i uzależnienie od narkotyków mogą się dzielić podstawowe mechanizmy hedoniczne.

Zmniejszenie ekspresji prążkowia D2R jest godną uwagi reakcją neuroadaptacyjną na nadmierne spożycie smacznego jedzenia. Rzeczywiście, zmniejszenie gęstości D2R w prążkowiu obserwuje się u osób z nadwagą4, 34 i gryzoni35, 36. I odwrotnie, osoby z jadłowstrętem psychicznym mają podwyższoną gęstość D2R37 w prążkowiu, a utrata masy ciała u osób otyłych po operacji bariatrycznej (bypass żołądka) jest związana z podwyższoną gęstością prążkowia D2R28. Polimorfizm genu określany jako allel TaqIA A1 skutkuje zmniejszoną gęstością prążkowia D2R, a osoby posiadające ten allel są nadreprezentowane w populacjach otyłych4. Allel TaqIA zwiększa również podatność na uzależnienie od alkoholu, opioidów i stymulantów psychomotorycznych38. Zmniejszenie gęstości prążkowia D2R występujące albo przez konstytutywne czynniki genetyczne, albo w wyniku przejadania się, może zatem przyczyniać się do neurobiologicznych mechanizmów otyłości. Stwierdziliśmy, że poziomy prążkowia izoformy 70 kDa D2R, uważane za odzwierciedlające D2R związane z błoną, były odwrotnie proporcjonalne do masy ciała u szczurów z grup tylko z karmą, o ograniczonym dostępie i rozszerzonym dostępie (ryc. 4). Powalenie ekspresji prążkowia D2R, najbardziej widoczne w prążkowiu grzbietowo-bocznym (ryc. 5), spowodowało wzrost progów BSR niemal natychmiast po ekspozycji na dietę stołową. Zmniejszenie ekspresji prążkowia D2R w związku z tym szybko przyspieszyło pojawienie się niedoczynności nagrody u szczurów z rozszerzonym dostępem do bardzo smacznego pokarmu, co jest zgodne z danymi obrazowania ludzkiego mózgu, które wskazują, że deficyty w gęstości prążkowia D2R przyczyniają się do niedoczynności nagrody u osób otyłych4.

Godne uwagi są również trzy cechy szczurów Lenti-D2Rsh. Po pierwsze, chociaż knockdown prążkowia D2R w połączeniu z rozszerzonym dostępem do smacznej diety spowodował podniesienie progów BSR, nie było różnic w spożyciu kalorii ani przyroście masy u tych szczurów w porównaniu ze szczurami kontrolnymi. Może to odzwierciedlać fakt, że szczury miały dostęp do diety stołowej tylko przez 14 dni; dłuższe okresy dostępu mogły skutkować większym przyrostem masy ciała w czasie, podobnie jak większa podatność na przyrost masy ciała obserwowana u ludzi z deficytami sygnalizacji D2R w prążkowiu4. Jednak zaletą ograniczenia dostępu do diety w stołówce tylko do 14 dni jest to, że szczury knockdown z rozszerzonym dostępem były jedyną grupą, która wykazywała podwyższone progi BSR, co pozwoliło nam ocenić potencjalną rolę niedoczynności nagrody w rozwoju kompulsywne jedzenie (patrz poniżej). Po drugie, progi BSR pozostały stabilne i niezmienione u szczurów z powaleniem, które miały dostęp tylko do karmy. Wskazuje to, że sama zmniejszona ekspresja D2R w prążkowiu nie była wystarczająca do wywołania nadwrażliwości na nagrodę; zamiast tego wydawało się, że wchodzi w interakcję z nadmierną konsumpcją smacznego jedzenia, aby przyspieszyć pojawienie się tego stanu zmniejszonej wrażliwości na nagrodę. Inne reakcje adaptacyjne w obwodach nagrody w mózgu mogą zatem wywołać nadwrażliwość na nagrodę u szczurów z rozszerzonym dostępem do diety w stołówce. Mając to na uwadze, zauważamy, że agonista D2R, bromokryptyna, zmniejsza poziom krążącej leptyny39, a leptyna hamuje odżywianie przynajmniej częściowo poprzez hamowanie regionów prążkowia, które kontrolują reakcje hedoniczne na pokarm3. Zatem możliwe jest, że obniżenie poziomu prążkowia D30R w odpowiedzi na rosnącą masę ciała zwiększa sygnalizację leptyny, a tym samym wzmacnia hamujące działanie tej adipokiny na mózgowe układy nagrody. Na koniec zauważamy, że skierowaliśmy nasze wektory lentiwirusowe w stronę prążkowia grzbietowo-bocznego. Było to przede wszystkim spowodowane względami technicznymi, ponieważ boczne umieszczenie kaniul w celu dostarczenia wirusa do prążkowia umożliwiło nam również umieszczenie założonej na stałe elektrody stymulującej podwzgórze w celu określenia progu BSR. Zatem możliwe jest, że celowanie w D31R w celu powalenia w innych obszarach prążkowia, szczególnie w obszarach grzbietowo-przyśrodkowych i brzusznych (rdzeń i skorupa jądra półleżącego), może mieć podwyższone progi BSR nawet przy braku smacznej diety.

Prążkowie grzbietowo-boczne było mocno zaangażowane w uczenie się nawyków typu bodziec-reakcja, co znajduje odzwierciedlenie w rozwoju zachowań konsumpcyjnych, które są niewrażliwe na dewaluację przez wcześniejsze karmienie do nasycenia lub parowanie ze szkodliwymi bodźcami40. Celując głównie w prążkowie grzbietowo-boczne, mogliśmy powalić populacje D2R, które regulują podatność szczura na rozwój kompulsywnego jedzenia. Zgodnie z rolą D2R prążkowia w zachowaniach kompulsywnych, allel TaqIA ludzkiego locus genu DRD2 – ANKK1 - który skutkuje niską gęstością D2R prążkowia5, osłabia aktywację prążkowia w odpowiedzi na smaczny pokarm4 i zwiększa podatność na otyłość4 - jest również związany z deficytami w uczeniu się unikania działań o negatywnych konsekwencjach41. Utrata hamującej kontroli nad zachowaniami, które mogą mieć negatywny skutek, jest charakterystyczną cechą zarówno otyłości, jak i narkomanii, w których zachowania konsumpcyjne utrzymują się pomimo negatywnych konsekwencji społecznych, zdrowotnych czy finansowych. Zachowania związane z przyjmowaniem kokainy u szczurów z historią intensywnego przyjmowania narkotyków mogą stać się nieelastyczne i odporne na zakłócenia przez awersyjny bodziec warunkowy, który przewiduje negatywny wynik (wstrząs stopy)18. Podobnie myszy, które wcześniej miały dostęp do smacznej, wysokotłuszczowej diety, będą spędzały więcej czasu w awersyjnym środowisku (jasno oświetlonym), aby uzyskać smaczny pokarm niż myszy, które nie miały doświadczenia z tą dietą42. Odkryliśmy, że spożywanie smacznego pokarmu u szczurów z przedłużonym dostępem do diety w stołówce było podobnie niewrażliwe na awersyjny bodziec warunkowy. Zgodnie z rolą prążkowia D2R w tym efekcie, kompulsywne jedzenie stwierdzono u prążkowiowych szczurów knockdown D2R, które wcześniej miały 14-dniowy rozszerzony dostęp do diety w stołówce, ale nie w grupach kontrolnych. Z punktu widzenia układu nerwowego, rozszerzony dostęp do smacznego pożywienia może wywołać plastyczność w szlakach korowo-prążkowiowych, czyniąc w ten sposób zwierzęta bardziej podatnymi na rozwój zachowań kompulsywnych, z deficytami sygnalizacji D2R prążkowia wzmacniającymi ten proces. Rzeczywiście, zmniejszona gęstość prążkowia D2R u osób otyłych jest skorelowana ze zmniejszonym metabolizmem w obszarach kory przedczołowej i oczodołowej43, które wywierają hamującą kontrolę nad zachowaniem44.

Warto zauważyć, że kompulsywne spożywanie smacznego jedzenia wykryto tylko u szczurów z powaleniem, które wcześniej miały rozszerzony dostęp do diety w stołówce, a nie u szczurów kontrolnych, które miały rozszerzony dostęp do diety w stołówce przez ten sam okres, ani u szczurów z powaleniem, które miały dostęp tylko do jedzenia. Główną różnicą między szczurami knockdown z wcześniejszym rozszerzonym dostępem a innymi grupami były ich stale podwyższone progi BSR. Może to odzwierciedlać wspólne neurobiologiczne pochodzenie niedoczynności nagrody i pojawienie się kompulsywnego jedzenia, które są czasowo zbieżnymi, ale niezależnymi zjawiskami. Alternatywnie, wywołana dietą niedoczynność nagrody może służyć jako podłoże dla negatywnego wzmocnienia, które ułatwia rozwój kompulsywnego jedzenia14, 32, 33. Niezależnie od podstawowych mechanizmów, nasze odkrycia pokazują, że podobne do uzależnienia kompulsywne reagowanie na smaczne jedzenie może pojawić się u otyłych szczurów i wskazują, że deficyty w sygnalizacji prążkowia D2R zwiększają podatność na rozwój tego zachowania.

Podsumowując, stwierdziliśmy, że nadmierna stymulacja mózgowych systemów nagrody poprzez nadmierne spożywanie smacznego, wysokoenergetycznego jedzenia wywołuje głęboki stan nadwrażliwości na nagrodę i rozwój kompulsywnego jedzenia. Te nieprzystosowawcze reakcje behawioralne u otyłych szczurów prawdopodobnie wynikają z wywołanych dietą deficytów sygnalizacji D2R prążkowia. Nadmierne spożywanie narkotyków podobnie zmniejsza gęstość prążkowia D2R, wywołuje głęboki stan niedoczynności nagrody i wyzwala pojawienie się kompulsywnych zachowań związanych z przyjmowaniem narkotyków. Nasze odkrycia wspierają zatem poprzednie prace 4, 19, 42, 45, 46, 47, wskazując, że otyłość i uzależnienie od narkotyków mogą wynikać z podobnych odpowiedzi neuroadaptacyjnych w obwodach nagradzania mózgu.

Metody

Szczury.

Samce szczurów Wistar o wadze 300–350 g na początku eksperymentów uzyskano z Charles River. Po przybyciu szczury trzymano pojedynczo w stałej temperaturze w 12-godzinnym cyklu światło-ciemność (światła włączane o 2200). Szczurom pozwolono na swobodny dostęp do standardowej karmy laboratoryjnej i wody na czas trwania eksperymentu. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee of Scripps Florida, a szczury leczono zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi zasad opieki nad zwierzętami.

Zabiegi chirurgiczne.

Szczury przygotowane za pomocą elektrod stymulujących BSR były najpierw znieczulane przez inhalację 1–3% izofluranu w tlenie i umieszczane w ramie stereotaktycznej (Kopf). Bipolarne elektrody BSR (długość 11 mm) wszczepiono w tylne boczne podwzgórze (przednio-tylne, -0.5 mm od brgma; przyśrodkowo-boczne, ±1.7 mm od linii środkowej; grzbietowo-brzuszne, 8.3 mm od opony twardej; siekacze ustawiono na 5 mm powyżej linii międzyusznej)47. Szczury otrzymujące zastrzyki wirusa były również przygotowane z obustronnymi kaniulami prowadzącymi (23, 14 mm długości) umieszczonymi powyżej prążkowia (przednio-tylny, 2.8 mm od bregmy; przyśrodkowo-boczny, ± 3.1 mm od linii środkowej; grzbietowo-brzuszny, -2.4 mm od opony twardej)48 i wypełniony 14-mm mandrynami. Cztery śruby czaszkowe ze stali nierdzewnej i akryl dentystyczny utrzymywały elektrodę i kaniule na miejscu. Ranę operacyjną leczono miejscowo antybiotykiem raz na 12 godzin przez 5 dni po operacji. Szczurom pozwolono 7–10 dni na powrót do zdrowia po operacji, a następnie przeszkolono w procedurze progowej BSR.

procedura BSR.

Szczury szkolono, aby odpowiadały na stymulację BSR zgodnie z dyskretną procedurą progową prądu próbnego, podobną do opisanej gdzie indziej 10, 14. W skrócie, poziomy prądu BSR zmieniano w naprzemiennych seriach malejących i rosnących w krokach 5 μA. W każdej sesji testowej prezentowane były cztery naprzemienne serie malejąco/rosnąco. Próg dla każdej serii zdefiniowano jako punkt środkowy między dwoma kolejnymi natężeniami prądu, na które szczury reagowały w co najmniej trzech z pięciu prób, a dwoma kolejnymi natężeniami prądu, na które szczury nie reagowały w trzech lub więcej z pięciu prób. Ogólny próg sesji zdefiniowano jako średnią progów dla czterech poszczególnych serii. Każda sesja testowa trwała około 30 minut. Stabilne progi BSR zdefiniowano jako ≤10% zmiany progów w ciągu 5 kolejnych dni, zwykle ustalane po 10–14 dniach treningu. Opóźnienie odpowiedzi dla każdej sesji testowej zdefiniowano jako średnie opóźnienie odpowiedzi ze wszystkich prób, podczas których wystąpiła pozytywna odpowiedź.

Wirusowe pakowanie i dostawa.

Dostarczono RNA o strukturze spinki do włosów i poddano konstytutywnej ekspresji przy użyciu systemu wektorów pRNAT-U6.2/Lenti (GenScript). Cząsteczki wirusowe przygotowano zgodnie z protokołem producenta. W skrócie, komórki HEK 293FT transfekowano wektorem zawierającym wstawkę shRNA (5′-GGATCCCGCGCAGCAGTCGAGCTTTCTTCAAGAGAGAAAGCTCGACTGCTGCGCTTTTTTCCAACTCGAG-3′) lub pustym wektorem plus ViraPower Packaging Mix (Invitrogen) przez 72 godziny (pożywka wymieniona po 24 godzinach). Następnie zebrano supernatant i zatężono przez ultrawirowanie (76,755 g, rotor Beckman Coulter SW 32 TI, 90 min, 4°C) i określono miano wirusów przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją zgodnie z instrukcjami producenta. Wirus podzielono na porcje i przechowywano w pudełkach chronionych przed światłem w temperaturze -80 ° C do czasu użycia.

Szczury ze stabilnymi progami BSR otrzymały obustronne zastrzyki wirusowe w trzech miejscach w prążkowiu każdej półkuli mózgu (2 μl na wstrzyknięcie, 1 μl min-1, 1 min między wstrzyknięciami, w sumie sześć wstrzyknięć na szczura). Szczurom pozwolono na co najmniej 2-3 dni regeneracji po wstrzyknięciach do prążkowia przed wznowieniem oceny progu BSR. Codzienna ocena progu BSR była kontynuowana przez 33 dni po wstrzyknięciu wirusa, aby zapewnić osiągnięcie maksymalnego powalenia prążkowia D2R przed zezwoleniem szczurom na dostęp do diety w stołówce. Nie było różnic w progach BSR między szczurami kontrolnymi Lenti i Lenti-D2Rsh podczas tych 33 dni (dane nie pokazane).

Immunoblot.

Szczury zabijano około 1 godzinę po ich regularnym dostępie do diety w stołówce, a mózgi szybko usuwano. Skrawki mózgu o grubości ~ 1–2 mm przygotowano przy użyciu koronalnej matrycy mózgu (odstęp między plasterkami 1 mm; Plastics One) na bloku lodu i wykonano stemple tkanki prążkowia grzbietowego (bregma: ~ 2.2, 0.26 do -80, 7 mm). Szybko zebrano stemple tkanki prążkowia, szybko zamrożono i przechowywano w temperaturze -10 ° C aż do użycia. Poszczególne próbki rozmrożono na lodzie i połączono równe ilości tkanki prążkowia na podstawie zależnego od masy mediany podziału grup dostępu (500–1 szczurów na pulę). Tkankę ponownie zawieszono w 2 μl lodowatego buforu RIPA (Thermo Scientific) zawierającego ortowanadan sodu, koktajl inhibitorów fosfatazy 10 i 4 (Sigma-Aldrich), leupeptynę i pepstatynę przed homogenizacją. Lizaty tkankowe gotowano przez 20 minut w buforze do próbek i ładowano na 10–1% lub 23% żele Tris-glicyna SDS (Invitrogen). Białko przenoszono na membrany nitrocelulozowe, blokowano przez 25 godzinę w ~5–0.2 ° C (20% odtłuszczonego mleka w proszku i 7.4% Tween-4 w PBS, pH 2) i inkubowano z pierwszorzędowym przeciwciałem przez noc w 1 ° C. Następujące pierwszorzędowe przeciwciała rozcieńczono w roztworze blokowym: mysie monoklonalne D100R (Santa Cruz, 1:200) lub mysie monoklonalne β-aktyny (Santa Cruz, 1:2,000). Chemiluminescencyjny odczynnik ECL dodano po inkubacji z drugorzędowymi przeciwciałami skoniugowanymi z peroksydazą chrzanową (Amersham, 2:70). Dojrzałą postać D17DR związaną z błoną (~ 49 kDa) 43, XNUMX znormalizowano do kontroli obciążenia białkiem (β-aktyna; XNUMX kDa) i oznaczono ilościowo za pomocą densytometrii przy użyciu oprogramowania NIH Image J.

Analiza immunochemiczna.

Szczury znieczulono i perfundowano przezsercowo 4% paraformaldehydem w PBS (pH 7.6). Mózgi usunięto, utrwalono przez noc i przechowywano w sacharozie (30% roztwór w PBS, pH 7.4) przez co najmniej 72 godziny. Zamrożone skrawki tkanek (grubość 30 μm) pobrano z mikrotomu i zablokowano (3% BSA, 5% normalnej surowicy koziej i 0.3% Triton X-100 w PBS) przez 1 godzinę w ~ 23–25 ° C. Do roztworu blokowego dodano następujące pierwszorzędowe przeciwciała i inkubowano przez noc w temperaturze 4°C: kurczak poliklonalny wobec GFP (Abcam, 1:1,000); królicze monoklonalne względem GFAP (Millipore, 1:1,000); myszy monoklonalne do NeuN (Millipore, 1:1,000). Skrawki inkubowano z drugorzędowymi przeciwciałami skoniugowanymi z barwnikiem fluorescencyjnym w ~ 23–25 ° C: barwnik przeciw kurczakowi – 488 nm (Jackson ImmunoResearch, 1: 1,000), barwnik przeciw królikowi – 594 nm (Invitrogen, 1: 1,000) i barwnik przeciw myszowi – 594 nm (Invitrogen, 1: 1000). Skrawki zamontowano z nośnikiem montażowym Vectashield zawierającym DAPI (Vector Labs) i przykryto szkiełkami nakrywkowymi. Zdjęcia wykonano przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego Olympus BX61 (obiektyw × 2) lub mikroskopu konfokalnego Olympus (obiektyw × 10 i × 100).

Procedura karmienia.

Szczury trzymano pojedynczo na papierowych ściółkach (podkładki alfa; Shepherd Specialty Papers), aby zapobiec zanieczyszczeniu produktów żywnościowych luźnymi materiałami ściółkowymi. Dieta w stołówce składała się z bekonu, kiełbasy, sernika, babki, lukru i czekolady, które były indywidualnie ważone przed udostępnieniem szczurom. Dietetyczne artykuły spożywcze w stołówce były dostarczane w małych metalowych pojemnikach. Wszystkie artykuły spożywcze, w tym standardową karmę laboratoryjną, ponownie zważono po zakończeniu sesji karmienia. Spożycie kalorii z różnych makroskładników zostało obliczone na podstawie informacji żywieniowych dostarczonych przez producenta.

Stłumienie zachowań żywieniowych wywołane sygnałem.

Procedury karmienia odbywały się w dźwiękochłonnych komorach operantów o wymiarach identycznych z tymi używanymi w eksperymentach BSR. Szczury umieszczono w komorze operacyjnej i miały dostęp do diety stołowej lub karmy przez 30 minut. Produkty spożywcze dostarczano w małych metalowych pojemnikach. Wszystkie produkty żywnościowe ważono przed i po sesjach karmienia, które przeprowadzono podczas normalnego okresu karmienia szczurów. Zużycie karmy oceniano na podstawie spożycia 45-mg granulek karmy identycznych pod względem składu z karmą dostarczoną w domowych klatkach szczurów. Szczurom pozwolono następnie na 30-minutowy dostęp dziennie do diety w stołówce, aż do osiągnięcia stabilnego spożycia (zdefiniowanego jako <10% zmienność dziennego spożycia), co wymagało 5–7 dni. Po ustabilizowaniu się przyjmowania smacznego pokarmu w tym okresie wyjściowym, szczury w każdym stanie dostępu podzielono na dwie grupy: ukarane (te otrzymujące wstrząs stopą) i nieukarane (nieotrzymujące szoku stopy). Następnie szczury poddano czterem sesjom kondycjonowania w kolejnych dniach w tej samej komorze operanta, w której wcześniej miały dostęp do smacznego pokarmu. Podczas 30-minutowych sesji warunkowania aktywowano światło ostrzegawcze (bodziec warunkowy) na 10 minut, wyłączono na 10 minut, a następnie ponownie włączono na 10 minut. Ukarane szczury otrzymały wstrząs stopy tylko podczas prezentacji światła wskazującego (0.5 mA przez 1.0 s; 10 stymulacji w odstępach ~ 1-minutowych). Niekaranym szczurom pokazywano światło sygnalizacyjne w ten sam sposób, ale bez wstrząsu stopy. W dniu testu, dzień po końcowej sesji kondycjonowania, szczury w ukaranych grupach otrzymały przerywany wstrząs stopy (w sumie pięć stymulacji) połączony z aktywacją światła ostrzegawczego na 5 minut. Niekarane szczury ponownie wystawiano na światło sygnalizacyjne przy braku wstrząsu stopy. Po 5-minutowym okresie kary, wszystkim szczurom pozwolono na dostęp do smakowitego pokarmu na 30-minutową sesję z bodźcem warunkowym aktywowanym z przerwami (10 minut włączone światło, 10 minut wyłączone światło, 10 minut włączone światło).

Analizy statystyczne.

Wyjściowe progi nagrody zdefiniowano jako średnią wartość progową dla 5 dni przed dostępem do diety w stołówce dla każdego podmiotu. Progi nagrody wyrażono jako zmianę procentową w stosunku do podstawowej wartości progowej. Dane dotyczące procentu podstawowych wartości progowych nagrody, przyrostu masy ciała, spożycia kalorii i spożycia kalorii z tłuszczu zostały przeanalizowane za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji z powtarzanymi pomiarami, z dostępem (tylko karma, ograniczony dostęp lub rozszerzony dostęp), źródłem kalorii (standardowa karma lub dieta w stołówce), wirusem (Lenti-kontrola lub Lenti-D2Rsh) i sygnałem (sparowanym lub niesparowanym z karą) jako czynnikami międzyobiektowymi i czasem jako czynnikiem wewnątrzobiektowym. W stosownych przypadkach efekty główne w analizach wariancji były dalej analizowane za pomocą testów post hoc Bonferroniego. Wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu oprogramowania GraphPad Prism.

Referencje

Referencje

1. Saper CB, Chou TC, Elmquist JK. Potrzeba karmienia: homeostatyczna i hedoniczna kontrola jedzenia. Neuron. 2002;36: 199-211. [PubMed]
2. Zheng H, Berthoud HR. Jedzenie dla przyjemności lub kalorii. Curr Opin Pharmacol. 2007;7: 607-612. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
3. Farooqi IS i in. Leptyna reguluje regiony prążkowia i zachowania żywieniowe ludzi. Science. 2007;317: 1355. [PubMed]
4. Patyk
E, Spoor S, Bohon C, Mały DM. Związek między otyłością a stępieniem
odpowiedź prążkowia na pokarm jest moderowana przez allel TaqIA A1. Science. 2008;322: 449-452. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
5. Szlachetna EPka. Uzależnienie i jego proces nagradzania poprzez polimorfizmy genu receptora dopaminy D2: przegląd. Eur Psychiatrii. 2000;15: 79-89. [PubMed]
6. Wang GJ, Volkow ND, Fowler JS. Rola dopaminy w motywacji do jedzenia u ludzi: implikacje dla otyłości. Eksperci Opinia Ther Cele. 2002;6: 601-609. [PubMed]
7. Stoisko
ML, Wilkenfeld RL, Pagnini DL, Booth SL, King LA. Postrzeganie
młodzieży na nadwagę i otyłość: badanie wagi opinii. J Paediatr Child Health. 2008;44: 248-252. [PubMed]
8. Puhl
RM, Moss-Racusin CA, Schwartz MB, Brownell KD. Stygmatyzacja wagi
i redukcja uprzedzeń: perspektywy dorosłych z nadwagą i otyłością. Edukacja zdrowotna Res. 2008;23: 347-358. [PubMed]
9. Amerykańskie Stowarzyszenie Medyczne. Podręcznik diagnostyczny i statystyczny zaburzeń psychicznych. Wydanie czwarte (DSM-IV) 1994.
10. Markou
A, Koob GF. Skonstruuj trafność progu samostymulacji
paradygmat: efekty manipulacji nagrodami i wynikami. Physiol Behav. 1992;51: 111-119. [PubMed]
11. Rolls BJ, Rowe EA, Turner RC. Utrzymująca się otyłość u szczurów po okresie spożywania mieszanej, wysokoenergetycznej diety. J Physiol. 1980;298: 415-427. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
12. Ahmed SH, Kenny PJ, Koob GF, Markou A. Neurobiologiczne dowody na hedoniczną allostazę związaną z eskalacją używania kokainy. Nat Neurosci. 2002;5: 625-626. [PubMed]
13. Markou A, Koob GF. Anhedonia pokokainowa. Zwierzęcy model odstawienia kokainy. Neuropsychopharmacology. 1991;4: 17-26. [PubMed]
14. Kenny'ego
PJ, Chen SA, Kitamura O, Markou A, Koob GF. Wycofanie warunkowe
napędza konsumpcję heroiny i zmniejsza wrażliwość na nagrody. J Neurosci. 2006;26: 5894-5900. [PubMed]
15. Bawełna
P, Sabino V, Steardo L, Zorrilla EP. Antycypacyjne zależne od opioidów
negatywny kontrast i objadanie się u szczurów z ograniczonym dostępem
wysoce preferowane jedzenie. Neuropsychopharmacology. 2008;33: 524-535. [PubMed]
16. Lado
ja i in. Wpływ karmienia dietą stołową na receptor beta3-adrenergiczny
ekspresja i aktywność lipolityczna w białej tkance tłuszczowej samców i
samice szczurów. Int J Obes Relat Metab Disord. 2000;24: 1396-1404. [PubMed]
17. Rybie oparzenia
CS, Elazar Z, Fuchs S. Glikozylacja różnicowa i wewnątrzkomórkowa
handel długimi i krótkimi izoformami receptora dopaminy D2.
J Biol Chem. 1995;270: 29819-29824. [PubMed]
18. Vanderschuren LJ, Everitt BJ. Poszukiwanie narkotyków staje się kompulsywne po długotrwałym samodzielnym podawaniu kokainy. Science. 2004;305: 1017-1019. [PubMed]
19. Volkow ND, Wise RA. Jak uzależnienie od narkotyków może pomóc nam zrozumieć otyłość? Nat Neurosci. 2005;8: 555-560. [PubMed]
20. Blundella
JE, Herberg LJ. Względne skutki deficytu żywieniowego i deprywacji
okres na tempo samostymulacji elektrycznej bocznego podwzgórza. Natura. 1968;219: 627-628. [PubMed]
21. Hoebel BG, Teitelbaum P. Podwzgórzowa kontrola karmienia i samostymulacja. Science. 1962;135: 375-377. [PubMed]
22. Góra G, Hoebel BG. Boczna samostymulacja podwzgórza: samodzielnie określony próg zwiększany przez przyjmowanie pokarmu. Nauka o psychonie. 1967;9: 265-266.
23. Hoebel BG. Karmienie i autostymulacja. Ann NY Acad Sci. 1969;157: 758-778. [PubMed]
24. Hoebel BG, Balagura S. Samostymulacja bocznego podwzgórza modyfikowana insuliną i glukagonem. Physiol Behav. 1967;2: 337-340.
25. Hoebel BG, Thompson RD. Niechęć do bocznej stymulacji podwzgórza spowodowana karmieniem dożołądkowym lub otyłością. J Comp Physiol Psychol. 1969;68: 536-543. [PubMed]
26. Wilkinson HA, Peele TL. Modyfikacja samostymulacji wewnątrzczaszkowej przez sytość głodową. Am J Physiol. 1962;203: 537-540. [PubMed]
27. Fulton S, Woodside B, Shizgal P. Modulacja obwodów nagradzania mózgu przez leptynę. Science. 2000;287: 125-128. [PubMed]
28. Wang GJ i in. Rozdęcie żołądka aktywuje obwody sytości w ludzkim mózgu. Neuroimage. 2008;39: 1824-1831. [PubMed]
29. Batterham RL i in. Modulacja PYY korowych i podwzgórzowych obszarów mózgu przewiduje zachowania żywieniowe u ludzi. Natura. 2007;450: 106-109. [PubMed]
30. Hommel JD i in. Sygnalizacja receptora leptyny w neuronach dopaminowych śródmózgowia reguluje odżywianie. Neuron. 2006;51: 801-810. [PubMed]
31. Fulton S. i in. Regulacja leptyny szlaku dopaminy mesoaccumbens. Neuron. 2006;51: 811-822. [PubMed]
32. Kenny PJ. Systemy nagradzania mózgu i kompulsywne zażywanie narkotyków. Trends Pharmacol Sci. 2007;28: 135-141. [PubMed]
33. Wang GJ i in. Dopamina w mózgu i otyłość. Lancet. 2001;357: 354-357. [PubMed]
34.Huang
XF i in. Transporter dopaminy i gęstość wiązania receptora D2 w
myszy podatne lub odporne na przewlekłą otyłość wywołaną dietą wysokotłuszczową. Behav Brain Res. 2006;175: 415-419. [PubMed]
35. Thanosa
PK, Michaelides M, Piyis YK, Wang GJ, Volkow ND. Ograniczenie żywności
znacznie zwiększa receptor dopaminy D2 (D2R) w szczurzym modelu otyłości
jak oceniano za pomocą obrazowania muPET in vivo (raklopryd [11C]) i in vitro
([3H] spiperon) autoradiografia. Synapse. 2008;62: 50-61. [PubMed]
36.Frank
GK i in. Zwiększone wiązanie receptora dopaminy D2/D3 po wyzdrowieniu
od jadłowstrętu psychicznego mierzonego za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej i
[11c]raklopryd. Biol Psychiatry. 2005;58: 908-912. [PubMed]
37. Neville'a
MJ, Johnstone EC, Walton RT. Identyfikacja i charakterystyka
ANKK1: nowy gen kinazy blisko związany z DRD2 na prążku chromosomu
11q23.1. Hum Mutat. 2004;23: 540-545. [PubMed]
38. Mastronardi CA, Yu WH, Srivastava VK, Dees WL, McCann SM. Uwalnianie leptyny indukowane lipopolisacharydem jest kontrolowane neuronalnie. Proc Natl Acad Sci US A. 2001;98: 14720-14725. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
39. Yin
HH, Knowlton BJ, Balleine BW. Inaktywacja prążkowia grzbietowo-bocznego
zwiększa wrażliwość na zmiany w przypadkowości działania i wyniku
warunkowanie instrumentalne. Behav Brain Res. 2006;166: 189-196. [PubMed]
40. Klein TA i in. Genetycznie uwarunkowane różnice w uczeniu się na błędach. Science. 2007;318: 1642-1645. [PubMed]
41. Teegarden SL, Bale TL. Zmniejszenie preferencji żywieniowych powoduje zwiększoną emocjonalność i ryzyko nawrotu diety. Biol Psychiatry. 2007;61: 1021-1029. [PubMed]
42. Wołków
ND i in. Niskie receptory dopaminy prążkowia D2 są związane z
metabolizm przedczołowy u osób otyłych: możliwe czynniki przyczyniające się. Neuroimage. 2008;42: 1537-1543. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
43. Clarke HF, Dalley JW, Crofts HS, Robbins TW, Roberts AC. Sztywność poznawcza po wyczerpaniu serotoniny przedczołowej. Science. 2004;304: 878-880. [PubMed]
44. Owies
NM, Rada P, Hoebel BG. Dowody na uzależnienie od cukru: behawioralne i
neurochemiczne skutki przerywanego, nadmiernego spożycia cukru. Neurosci Biobehav Rev. 2008;32: 20-39. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
45. Volkow ND, O'Brien CP. Kwestie związane z DSM-V: czy otyłość należy uwzględnić jako zaburzenie mózgu? Am J Psychiatry. 2007;164: 708-710. [PubMed]
46. ​​Cottone P. i in. Rekrutacja systemu CRF pośredniczy w ciemnej stronie kompulsywnego jedzenia. Proc Natl Acad Sci US A. 2009;106: 20016-20020. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
47. Pellegrino LJ, Pellegrino AS, Cushman AJ. Stereotaktyczny atlas mózgu szczura. Nowy Jork: Plenum Press; 1979.
48. David C, Fishburn CS, Monsma FJ, Jr, Sibley DR, Fuchs S. Synteza i przetwarzanie receptorów dopaminy D2. Biochemia. 1993;32: 8179-8183. [PubMed]

Korespondencja do:

· Paul J. Kenny ([email chroniony])