Receptory dopaminy D2 w uzależnieniowych dysfunkcjach nagrody i kompulsywnym jedzeniu u otyłych szczurów (2010)

Zmiany receptora D2 mogą leżeć za uzależnieniem od pornografiiKomentarz: To badanie pokazuje, że gdy zwierzę ma nieograniczony dostęp, silny naturalny wzmacniacz (bardzo stymulujący pokarm) może spowodować spadek receptorów D2. Spadek ten był widoczny u prawie wszystkich szczurów i nastąpił dość szybko. Po usunięciu „bardzo smacznego” pokarmu szczury odmówiły jedzenia normalnej karmy. Szczury nadal objadały się (kiedy tylko mogły) pomimo łączenia wstrząsów elektrycznych z „bardzo smacznym” spożyciem pokarmu.


Nat Neurosci. 2010 May; 13(5): 635-641. Opublikowane online 2010 March 28. doi:  10.1038 / nn.2519

Abstrakcyjny

Odkryliśmy, że rozwój otyłości był połączony z pojawieniem się stopniowo pogarszającego się deficytu w neuronalnych reakcjach nagrody. Podobne zmiany w homeostazie nagród wywołanej przez kokainę lub heroinę są uważane za kluczowe w wyzwalaniu przejścia od codziennego do kompulsywnego przyjmowania narkotyków. W związku z tym wykryliśmy kompulsywne zachowania żywieniowe u otyłych, ale nie szczupłych szczurów, mierzone jako smaczne spożycie żywności, które było odporne na zakłócenia przez awersyjny bodziec warunkowy. Receptory dopaminy D2 w prążkowiu (D2R) ulegały obniżeniu u otyłych szczurów, jak to opisano u ludzi uzależnionych od leków. Co więcej, obniżenie prążkowia D2R za pośrednictwem lentiwirusa przyspieszyło gwałtownie rozwój uzależnienia od uzależnienia, a także pojawienie się kompulsywnego poszukiwania pożywienia u szczurów z rozszerzonym dostępem do smacznego, wysokotłuszczowego pokarmu. Dane te pokazują, że nadmierna konsumpcja smacznych pokarmów wywołuje uzależniające odpowiedzi neuroadaptacyjne w obwodach nagradzania mózgu i napędza rozwój kompulsywnego jedzenia. Wspólne mechanizmy hedoniczne mogą zatem leżeć u podstaw otyłości i narkomanii.

Wprowadzenie

Na karmienie wpływa przyjemność i nagroda, a otrzymanie nagrody pożywienia może silnie motywować do konsumpcji1, 2. Niemniej jednak mechanizmy hedoniczne przyczyniające się do otyłości pozostają słabo poznane. U ludzi z hiperfagią i wrodzonym niedoborem leptyny, aktywność w prążkowiu grzbietowym i brzusznym, które są podstawowymi składnikami obwodów nagrody w mózgu, znacznie wzrasta w odpowiedzi na obrazy pokarmu3, a zastępcza terapia leptyną osłabia zarówno aktywność prążkowia, jak i zgłaszane przez samych siebie „lubienie” jedzenia3 . Sugeruje to, że prążkowie jest ważne w hedonicznych aspektach zachowań żywieniowych. Niedawno wykazano, że u osób otyłych aktywacja prążkowia w odpowiedzi na bardzo smaczny pokarm jest osłabiona w porównaniu z chudymi zwierzętami kontrolnymi4. Ponadto niedoczynność prążkowia grzbietowego i długotrwały przyrost masy ciała są najbardziej widoczne u osób z allelem TaqIA w locus genu DRD2 – ANKK1, co skutkuje zmniejszoną ekspresją D2R w prążkowiu i jak wykazano, predysponuje osoby do zaburzeń uzależnienia od substancji4 Te i podobne obserwacje doprowadziły do ​​wniosku, że deficyty w przetwarzaniu nagrody mogą być ważnym czynnikiem ryzyka rozwoju otyłości, a osoby otyłe mogą kompulsywnie spożywać smaczny pokarm w celu skompensowania nadwrażliwości na nagrodę5. W szczególności nie jest jasne, czy deficyty w przetwarzaniu nagrody są konstytutywne i poprzedzają otyłość, czy też nadmierne spożywanie smacznej żywności może prowadzić do dysfunkcji nagrody i tym samym przyczyniać się do otyłości wywołanej dietą.

Charakterystyczną cechą osób z nadwagą i otyłością jest to, że nadal przejadają się pomimo znanych negatywnych konsekwencji zdrowotnych i społecznych. Rzeczywiście, wiele osób z nadwagą wyraża chęć ograniczenia spożycia żywności, a jednocześnie stara się kontrolować swoje spożycie i wielokrotnie konsumuje ponad zapotrzebowanie na energię 7, 8. Rozwój zachowania żywieniowego, które jest niewrażliwe na negatywny wynik, jest analogiczny do kompulsywnego zachowania związanego z przyjmowaniem narkotyków obserwowanego u ludzi uzależnionych od narkotyków, który jest podobnie odporny na negatywne konsekwencje. Tutaj zbadaliśmy wpływ rozszerzonego dostępu do smacznej wysokotłuszczowej diety na wrażliwość mózgowych systemów nagradzania u szczurów. Zbadaliśmy również związek między zaburzeniami hedonicznymi wywołanymi dietą a pojawieniem się kompulsywnego poszukiwania pożywienia. Na koniec zbadaliśmy rolę prążkowia D9R w tych uzależniających reakcjach behawioralnych.

Niedobory nagrody uzależniające u otyłych szczurów

Aby przetestować skutki ograniczonego lub rozszerzonego dostępu do smacznej diety wysokotłuszczowej, przygotowaliśmy samce szczurów Wistar (300-350 g) z dwubiegunową elektrodą stymulującą w bocznym podwzgórzu i trenowaliśmy je przez 10-14 dni w dyskretnej próbie procedura aktualnej progowej stymulacji mózgu (BSR) aż do ustalenia stabilnych progów nagrody4. W procedurze BSR szczury reagują energicznie, aby uzyskać satysfakcjonującą autostymulację elektryczną przez znajdującą się na stałe elektrodę stymulującą, z minimalną intensywnością stymulacji, która utrzymuje zachowanie samostymulacyjne, określaną jako próg nagrody10. Ponieważ progi nagrody pozostają stabilne i niezmienione przez dłuższy czas w warunkach wyjściowych, procedura ta zapewnia czułą miarę odpowiedzi mózgowych systemów nagrody. Po ustaleniu stabilnych progów BSR (zdefiniowanych jako <10% zmiany progów w trzech kolejnych sesjach), przypisaliśmy szczury do trzech grup, które nie wykazały różnic w średniej masie ciała lub progach nagrody między grupami. Trzy grupy otrzymały zróżnicowany dostęp do diety „kafeteryjnej” składającej się z smacznej, gęstej żywności łatwo dostępnej do spożycia przez ludzi (patrz Metody online). Szczury miały 0 godzin (szczury karmione tylko karmą; n = 9), 1 godzinę (szczury o ograniczonym dostępie; n = 11) lub 18–23 godzin (szczury o przedłużonym dostępie; n = 11) dziennie przez 40 kolejnych dni. Wiadomo, że diety kafeteryjne powodują otyłość wywołaną dietą u szczurów11. Wszystkie szczury miały również dostęp ad libitum do standardowej karmy laboratoryjnej, z progami nagrody, przyrostem masy ciała i spożyciem kalorii przez cały czas.

Masa ciała znacznie wzrosła u szczurów z rozszerzonym dostępem do diety w stołówce w porównaniu z grupami wyłącznie karmionymi lub z ograniczonym dostępem (ryc. 1a). W przypadku szczurów o ograniczonym dostępie masa ciała również miała tendencję do zwiększania się w porównaniu ze szczurami tylko karmionymi wyłącznie karmą, ale efekt ten nie osiągnął znaczenia statystycznego. Rozwój otyłości u szczurów o przedłużonym dostępie był ściśle związany z pogarszającym się deficytem funkcji nagrody w mózgu, odzwierciedlonym w progresywnie podwyższonych progach BSR (ryc. 1b). Ponieważ nie zaobserwowano różnic w opóźnieniach odpowiedzi dla BSR w trzech grupach (Uzupełnienie Ryc. 1), deficyty w wydajności behawioralnej nie mogą wyjaśnić tej obserwacji. Podobne deficyty w funkcji nagradzania mózgu odnotowano u szczurów z rozszerzonym, ale nie ograniczonym dostępem do dożylnego podawania kokainy lub heroiny. 12, 13, 14. Tak więc, rozszerzony dostęp do smacznego, wysokotłuszczowego pokarmu może wywołać podobne do uzależnienia niedobory funkcji nagrody mózgu, uważane za ważne źródło motywacji, które może napędzać przejadanie się i przyczyniać się do rozwoju otyłości 1, 6.

Rysunek 1: dysfunkcja przyrostu masy ciała i nagrody u szczurów z rozszerzonym dostępem do diety w stołówce.

(a) Średni (± sem) przyrost masy ciała u szczurów karmionych wyłącznie karmą, o ograniczonym dostępie i o rozszerzonym dostępie (interakcja dostęp × dzień: F39,702 = 7.9, P <0.0001; * P <0.05 w porównaniu z grupą otrzymującą tylko karmę, test post hoc). (b) Średnia (± sem) procentowa zmiana w stosunku do wartości wyjściowych progów nagrody (interakcja dostęp x czas: F78,1092 = 1.7, P <0.0005; * P <0.05 w porównaniu z grupą zawierającą tylko karmę, test post hoc).

Kiedy szczegółowo zbadaliśmy zachowanie żywieniowe (ryc. 2), stwierdziliśmy, że całkowite dzienne spożycie kalorii było podobne u szczurów z chow tylko i szczurami o ograniczonym dostępie (ryc. 2a, d). Natomiast całkowite spożycie kalorii u szczurów z rozszerzonym dostępem było prawie dwukrotnie większe niż u szczurów z ograniczonym dostępem i szczurów (ryc. 2a, d). Chociaż szczury o ograniczonym dostępie i szczury wyłącznie karmiące utrzymywały w przybliżeniu takie samo dzienne spożycie kalorii (ryc. 2a, d), szczury z ograniczonym dostępem otrzymywały tylko ~ 33% dziennych kalorii z karmy (ryc. 2b, d), wskazując, że rozwinęły się podobne do żarłoczności zachowania żywieniowe i konsumowały ~ 66% ich dziennego spożycia kalorii podczas sesji dostępu 1 do kafeterii diet15 (ryc. 2d). Szczury o wydłużonym dostępie otrzymały tylko niewielką frakcję (~ 5%) ich całkowitego spożycia kalorii z chow (Fig. 2b); prawie wyłącznie spożywali dietę w stołówce (ryc. 2d). Zmiana preferencji żywieniowych w grupach o ograniczonym dostępie i rozszerzonym dostępie znalazła także odzwierciedlenie w wyraźnym wzroście spożycia tłuszczu w porównaniu ze szczurami tylko karmionymi (Ryc. 2c i suplementarny Ryc. 2). Zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami 16, występowała tendencja do konsumpcji diety w stołówkach, która z czasem zmniejszała się u szczurów o wydłużonym dostępie. Może to odzwierciedlać rozwój tolerancji na walory smakowe produktów spożywczych dostarczanych w ramach diety stołowej w miarę upływu czasu. Niemniej jednak preferowana dieta w stołówce w porównaniu ze standardową karmą pozostawała niezmiennie wysoka u tych szczurów (rys. Uzupełniająca 3). Dane te pokazują, że rozszerzony, ale nie ograniczony dostęp do smacznej, wysokotłuszczowej diety powoduje niedobory wynagrodzeń uzależniających, przejadanie się i utratę homeostatycznego bilansu energetycznego. Z drugiej strony ograniczony dostęp do smacznego jedzenia powoduje podobne do upodobań wzorce konsumpcji, ale nie zakłóca homeostatycznego bilansu energetycznego ani funkcji nagradzania mózgu. Jednak możliwe jest, że ograniczony dostęp do diety w stołówce przez kolejne dni 40 spowodowałby znaczny przyrost masy ciała i zakłócenia funkcji nagrody w mózgu.

Rysunek 2: Wzorce konsumpcji u szczurów z rozszerzonym dostępem do diety w stołówce.

(a) Średnie (± sem) dzienne spożycie kalorii u szczurów karmionych wyłącznie karmą, o ograniczonym dostępie i o rozszerzonym dostępie (dostęp: F1,324 = 100.6, p <0.0001; czas: F18,324 = 7.8, p <0.0001; dostęp Interakcja z czasem: F18,324 = 4.6, P <0.0001; * P <0.05 w porównaniu z grupą zawierającą tylko karmę, test post hoc). (b) Średnie dzienne spożycie kalorii (± sem) z pożywienia (dostęp: F2,504 = 349.1, P <0.0001; czas: F18,504 = 5.9, P <0.0001; dostęp × czas interakcja: F36,504 = 3.52, P <0.0001; * P <0.05 w porównaniu z grupą zawierającą tylko karmę, test post hoc). (c) Średnie dzienne spożycie kalorii (± sem) z tłuszczu (dostęp: F2,486 = 118.7, P <0.0001; czas: F18,486 = 8.8, P <0.0001; dostęp x czas interakcja: F36,486 = 6.2, P <0.0001; * P <0.05 w porównaniu z grupą zawierającą tylko karmę, test post hoc). (d) Porównanie średniego (± sem) całkowitego spożycia kalorii i kalorii spożytych wyłącznie z pożywienia podczas całego 40-dniowego okresu dostępu (dostęp: F2,54 = 25.0, P <0.0001; źródło kalorii: F2,54 = 1235.2, P <0.0001; interakcja dostęp × źródło kalorii: F2,54 = 485.7, P <0.0001; *** P <0.001 w porównaniu z całkowitą liczbą kalorii w grupie zawierającej tylko karmę, ### P <0.001 w porównaniu z całkowitą liczbą kalorii w grupie ta sama grupa szczurów, test post hoc).

Po 40 dniach szczury nie miały już dostępu do smacznej diety, ale nadal miały dostęp ad libitum do standardowej karmy laboratoryjnej. Ocenialiśmy progi nagród i codzienne spożycie karmy w okresie wymuszonej „abstynencji”. Podwyższenie progów nagrody utrzymywało się przez co najmniej 2 tygodnie u szczurów z przedłużonym dostępem, kiedy nie miały one już dostępu do smacznej diety (ryc. 3a). Kontrastuje to ze stosunkowo przemijającymi (~ 48 h) deficytami funkcji nagrody opisywanymi u szczurów odstawiających kokainę samodzielnie13. Wystąpił również wyraźny spadek spożycia kalorii (ryc. 3b) i stopniowy spadek masy ciała (ryc. 3c) u szczurów o przedłużonym dostępie oraz w mniejszym stopniu u szczurów z ograniczonym dostępem, w tym okresie abstynencji, zgodnie z wcześniejsze doniesienia11, 15. Po 14 dniach abstynencji szczury uśmiercano i określano rozmieszczenie elektrod za pomocą barwienia fioletem krezylowym (ryc. 3d).

Rysunek 3: Uporczywe dysfunkcje nagrody i hipofagia podczas abstynencji u szczurów z rozszerzonym dostępem do diety w stołówce.

(a) Średnia procentowa zmiana w stosunku do wyjściowych progów nagrody (± sem) podczas abstynencji od smacznej diety wysokotłuszczowej (dostęp: F2,112 = 3.7, P <0.05; czas: F4,112 = 2.3, P> 0.05; * P <0.05 w porównaniu z grupą zawierającą tylko karmę, test post hoc). (b) Średnie spożycie kalorii (± sem) w ostatnim dniu dostępu do diety wysokotłuszczowej (stan wyjściowy) oraz w ciągu 14 dni abstynencji, kiedy dostępna była tylko standardowa karma (dostęp: F2,168 = 41.7, P <0.0001 ; czas: F6,168 = 65.6, P <0.0001; interakcja dostęp × czas: F12,168 = 38.3, P <0.0001; * P <0.05 w porównaniu z grupą tylko chow, test post hoc). (c) Zmiana średniej masy ciała (± sem) w porównaniu z masą ciała w ostatnim dniu dostępu do diety wysokotłuszczowej (stan wyjściowy) oraz w ciągu 14 dni abstynencji, kiedy dostępna była tylko standardowa karma (dostęp: F1,126 = 37.2, P <0.0001; czas: F7,126 = 3.1, P <0.01; interakcja dostęp × czas: F7,126 = 40.9, P <0.0001; * P <0.05 w porównaniu z grupą tylko chow, test post hoc). (d) Histologiczna rekonstrukcja umiejscowienia elektrod stymulujących BSR w bocznym podwzgórzu szczurów typu chow-only (trójkąty), o ograniczonym dostępie (kwadraty) io dużym dostępie (kółka).

Striatal D2R u otyłych szczurów: rola w deficytach nagrody

Następnie przetestowaliśmy hipotezę, że nadmierne spożycie smacznej diety kafeteryjnej może zmniejszyć gęstość D2R w prążkowiu, przyczyniając się do rozwoju podobnej do uzależnienia nadwrażliwości na nagrodę. Nowej kohorcie szczurów karmionych wyłącznie karmą, szczurów z ograniczonym dostępem i szczurów o rozszerzonym dostępie zezwolono na dostęp do diety kafeteryjnej do czasu statystycznie istotnego wzrostu masy ciała u szczurów z przedłużonym dostępem w porównaniu z grupą otrzymującą tylko karmę (P <0.05 ; Rys. 4a). Ekspresja prążkowia rzekomo silnie glikozylowanej (~ 70 kDa) postaci D2R związanej z błoną była niższa u szczurów z przedłużonym dostępem niż u szczurów z ograniczonym dostępem lub tylko do karmienia (Fig. 4b; patrz Metody Online). Kiedy podzieliliśmy szczury z każdej grupy dostępowej na dwie podgrupy na podstawie mediany masy ciała (lekkie lub ciężkie), znaleźliśmy wyraźną odwrotną zależność między masą ciała a ekspresją D2R w prążkowiu (ryc. 4a, c). Nie wykryliśmy żadnych statystycznie istotnych spadków w ekspresji nieglikozylowanych niedojrzałych (~ 39 kDa) i pośrednio glikozylowanych cytoplazmatycznych (~ 51 kDa) form D2R (uzupełniający ryc. 4) 17, co wskazuje, że ekspresja D2R w prążkowiu u szczurów o rozszerzonym dostępie jest prawdopodobnie regulowane przez mechanizmy potranskrypcyjne.

Rysunek 4: Przyrost masy ciała jest odwrotnie proporcjonalny do poziomów prążkowia D2R.

(a) Szczury karmione tylko karmą, szczury o ograniczonym dostępie i szczury o rozszerzonym dostępie podzielono na dwie grupy dla każdego warunku dostępu w oparciu o medianę podziału masy ciała: lekkie (L) lub ciężkie (H). (b) Cały kompleks prążkowia zebrano od wszystkich szczurów, a poziomy D2R w każdej grupie zmierzono metodą western blot. Prążek D2R związany z błoną został rozdzielony przy 70 kDa, a poniżej przedstawiono kontrolę obciążenia białkiem (β-aktyna, 43 kDa). Immunobloty o pełnej długości przedstawiono na dodatkowej rycinie 12. (c) Względne ilości D2R w prążkowiu szczurów tylko do karmienia, szczurów o ograniczonym dostępie i o rozszerzonym dostępie określono ilościowo za pomocą densytometrii (F2,6 = 5.2, P <0.05, główne efekt dostępu; * P <0.05 i ** P <0.01 w porównaniu z grupą L-only chow).

Następnie, aby przetestować funkcjonalne znaczenie indukowanej dietą redukcji prążkowia D2R w funkcji nagrody mózgowej, zaprojektowaliśmy i zwalidowaliśmy wektor lentiwirusowy, aby dostarczyć krótki interferujący RNA o strukturze spinki do włosów (shRNA) w celu zniszczenia D2R (Lenti-D2Rsh; Ryc. 5 i rys. Uzupełniająca 5). Progi nagród zaczęły wzrastać u szczurów leczonych Lenti-D2Rsh niemal natychmiast po uzyskaniu dostępu do diety stołówki, podczas gdy progi nagrody pozostały niezmienione u szczurów o wydłużonym dostępie leczonych pustym wektorem lentiwirusa (kontrola Lenti) przez względnie krótki okres dostępu do diety w stołówce (14 d; ryc. 6a). Opóźnienia odpowiedzi były niezmienione w obu grupach szczurów, co pokazuje, że efekt ten nie był drugorzędny w stosunku do deficytów w wykonywaniu zadań (rys. Uzupełniająca 6). Progi nagród były również niezmienione u szczurów leczonych Lenti-D2Rsh lub kontrolą Lenti, które miały dostęp do karmy tylko w tym samym okresie (ryc. 6b).

Progi pozostawały stale podwyższone podczas dodatkowego 15 d abstynencji, gdy wszystkie szczury miały dostęp tylko do standardowej karmy (rys. Uzupełniająca 7). Powalenie prążkowia D2R zwiększyło zatem podatność na indukowaną dietą niedoczynność nagrody, ale nie zmieniło podstawowej aktywności mózgowych systemów nagrody.

Figura 5: knockdown prążkowia D2R za pośrednictwem lentiwirusa.

(a) Graficzne przedstawienie obszarów prążkowia, w których nastąpiła nadekspresja Lenti-D2Rsh. Zielone kółka na lewej półkuli prążkowia reprezentują miejsca, w które kierowano infuzje wirusowe. Barwienie na zielono w prawej półkuli prążkowanej jest reprezentatywnym barwieniem immunochemicznym dla zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) z mózgu szczura Lenti-D2Rsh. (b) Reprezentatywny immunoblot zmniejszonej ekspresji D2R w prążkowiu szczurów Lenti-D2Rsh. Immunobloty pełnej długości przedstawiono na dodatkowej rycinie 13. (c) Względne ilości D2R w prążkowiu szczurów kontrolnych Lenti-D2Rsh i Lenti-D0.05Rsh, określone ilościowo za pomocą densytometrii (* P <2 w porównaniu z grupą kontrolną Lenti, test post hoc ). (d) Nie wykryto zakażenia komórek glejowych w prążkowiu przez wektor Lenti-D2Rsh. Barwienie na zielono to GFP wirusa; kolor czerwony to kwaśne białko włókniste glejowe markera astrocytów (GFAP); jądra komórkowe zaznaczono przez barwienie DAPI na niebiesko. Białe strzałki wskazują zlokalizowany obszar glejozy występujący tylko w miejscu wstrzyknięcia wirusa w prążkowiu, a nie w otaczających tkankach, do których wirus przedostał się. Nawet w tym obszarze żaden z astrocytów nie jest GFP-dodatni. Żółte strzałki na powiększonym obrazie wskazują typowe astrocyty GFP-ujemne, które zostały wykryte. (e) Wysoki poziom infekcji neuronalnej w prążkowiu przez wektor Lenti-D2Rsh. Barwienie na zielono to GFP wirusa; czerwony to neuronalny marker jądrowy NeuN; jądra komórkowe zaznaczono przez barwienie DAPI na niebiesko. Żółte strzałki na powiększonym obrazie podkreślają neurony GFP-dodatnie i NeuN-dodatnie w prążkowiu. (f) Obraz w większym powiększeniu neuronu zakażonego wirusem (GFP-dodatni) w prążkowiu szczurów Lenti-DXNUMXRsh, który przedstawia typowe cechy morfologiczne średnich neuronów kolczastych.

Rysunek 6: Powalenie prążkowia D2R zwiększa podatność na dysfunkcję nagrody u szczurów z rozszerzonym dostępem do diety w stołówce.

(a) Średnia (± sem) procentowa zmiana w stosunku do wartości wyjściowych progów nagrody u szczurów Lenti-kontrolnych i Lenti-D2Rsh, które miały przedłużony dostęp do diety w kafeterii przez 14 kolejnych dni (wirus: F1,156 = 5.9, P <0.05; czas: F13,156 = 2.2, P <0.05; interakcja wirus x czas: F13,156 = 2.2, P <0.05; #P <0.05, efekt interakcji). (b) Średnia (± sem) procentowa zmiana od wartości wyjściowych progów nagrody u szczurów kontrolnych Lenti i Lenti-D2Rsh, które miały dostęp tylko do karmienia. (c) Średnie (± sem) spożycie kalorii przez szczury w ciągu 14 dni samej karmy lub przy dłuższym dostępie (dostęp: F2,28 = 135.6, *** P <0.0001). (d) Średni (± sem) przyrost masy ciała w ciągu 14 dni wyłącznie karmienia lub rozszerzonego dostępu (dostęp: F2,28 = 96.4, P <0.0001; *** P <0.001, główny efekt dostępu).

Stwierdziliśmy, że spożycie kalorii (Ryc. 6c) i przyrost masy ciała (Ryc. 6d) były podobne w Lenti-D2Rsh i odpowiadających grupach kontrolnych Lenti w warunkach tylko chow lub rozszerzonego dostępu (Dodatkowe Fig. 8 i 9). Tak więc porażenie prążkowia D2R nie zmieniło preferencji diety w stołówce ani całkowitego spożycia kalorii, gdy smaczne jedzenie było swobodnie dostępne do spożycia.

Kompulsywne jedzenie u otyłych szczurów: rola prążkowia D2R

Następnie przetestowaliśmy hipotezę, że kompulsywne jedzenie może pojawić się u szczurów z rozszerzonym dostępem do diety w kafeterii i że deficyty w sygnalizacji D2R w prążkowiu mogą przyczyniać się do tego efektu. Nowa kohorta szczurów karmionych tylko karmą, szczurów o ograniczonym dostępie i szczurach o rozszerzonym dostępie otrzymała pozwolenie na dostęp do diety w kafeterii przez> 40 dni, aż do wystąpienia statystycznie znaczącego wzrostu masy ciała u szczurów o przedłużonym dostępie (p <0.05 w porównaniu ze szczurami wyłącznie karmionymi pokazane). Wszystkim trzem grupom szczurów umożliwiono następnie jedynie 30 minutowy dostęp dziennie do diety kafeterii przez 5–7 dni w komorze operacyjnej, aż do osiągnięcia stabilnego spożycia (zdefiniowanego jako <10% zmiany dziennego spożycia). Połowę szczurów w każdych warunkach dostępu wystawiano następnie na działanie światła (bodziec warunkowy) w połączeniu z wyładowaniami stóp (grupa ukarana), podczas gdy pozostałe szczury w każdej grupie były eksponowane na światło sygnalizacyjne przy braku wstrząsu w łapie (grupa bez kary ). W dniu testu zbadaliśmy wpływ samej ekspozycji na światło sygnalizacyjne na smaczne spożycie żywności (ryc. 7; patrz Metody online). Okazało się, że średnie spożycie kalorii podczas 30-minutowych sesji wyjściowych było wyższe u szczurów karmionych tylko karmą i szczurów z ograniczonym dostępem niż u szczurów o rozszerzonym dostępie (ryc. 7a, b). Sugeruje to, że szczury karmione wyłącznie karmą i szczury o ograniczonym dostępie objadały się smacznym pokarmem podczas przerywanych 30-minutowych sesji dostępu, co odzwierciedla fakt, że te szczury spożywały ~ 40-50% ich dziennego spożycia kalorii, zazwyczaj ~ 100 kcal, podczas tych sesji (ryc. 7a, b). Z drugiej strony szczury o rozszerzonym dostępie wydają się oporne na rozwinięcie tego podobnego do napadowego zachowania żywieniowego, być może dlatego, że ich historia prawie nieograniczonego dostępu do smacznego pożywienia przez ponad 40 kolejnych dni ustanowiła wzorce jedzenia, które były stosunkowo nieelastyczne do zmiany. W dniu testu nie zaobserwowaliśmy żadnego statystycznie istotnego wpływu ponownego odtwarzania światła sygnalizacyjnego na spożycie pokarmu u bezkarnych szczurów z grup tylko karmy, z ograniczonym dostępem lub z przedłużonym dostępem w porównaniu z przyjmowaniem w okresie odniesienia (ryc. 7a). Dlatego samo światło sygnalizacyjne nie miało motywacji. U karanych szczurów światło sygnalizacyjne sparowane ze wstrząsem znacząco zmniejszyło spożycie smacznego pokarmu u szczurów karmionych tylko karmą i szczurów z ograniczonym dostępem. Jednak światło sygnalizacyjne nie miało wpływu na spożycie smacznego pokarmu u szczurów o rozszerzonym dostępie, co pokazuje, że ich spożycie było niewrażliwe na awersyjne sygnały środowiskowe przewidujące niekorzystne skutki. Podstawowe spożycie energii u szczurów o rozszerzonym dostępie było niższe niż w pozostałych grupach. Jednakże, ponieważ spożycie karmy w podobnych okresach czasu było znacznie niższe (ryc. 7d), jest mało prawdopodobne, aby stanowiło to „efekt dolny”, który zakłóca nasze wyniki. Wszystkie nasze dane potwierdzają tezę, że kompulsywne zachowania żywieniowe mogą pojawiać się u szczurów o rozszerzonym dostępie w sposób analogiczny do kompulsywnego zażywania kokainy obserwowanego u szczurów z historią rozszerzonego dostępu do narkotyku18.

Rysunek 7: Kompulsywne odpowiadanie na smaczne jedzenie.

(a) Średnie (± sem) smaczne spożycie pokarmu u bezkarnych szczurów podczas 30-minutowych sesji wyjściowych oraz w dniu testu, kiedy szczury były narażone na obojętny bodziec warunkowy, który nie był wcześniej sparowany z szkodliwym wstrząsem stopy (dostęp: F2,20 = 5.2, P <0.05; #P <0.05 w porównaniu ze szczurami karmionymi tylko karmą). (b) Średnie (± sem) smaczne spożycie pokarmu u karanych szczurów podczas 30-minutowych sesji wyjściowych oraz w dniu testu, kiedy szczury były narażone na warunkowy bodziec, który był wcześniej sparowany z szkodliwym wstrząsem łapą (dostęp: F2,21 = 3.9 , P <0.05; wskazówka: F1,21 = 8.6, P <0.01; interakcja dostęp × cue: F2,21 = 4.7, P <0.05; * P <0.05 w porównaniu z przyjęciem podczas sesji wyjściowej, #P <0.05 w porównaniu z szczury karmione tylko karmą). (c) Średnie (± sem) spożycie smacznej diety podczas 30-minutowych sesji wyjściowych oraz w dniu badania u szczurów kontrolnych Lenti-Control i Lenti-D2Rsh, które poprzednio miały wyłącznie karmę lub rozszerzony dostęp do diety kafeteryjnej (wskazówka: F1,26, 29.7 = 0.0001, P <0.05; * P <0.01, ** P <30 w porównaniu z spożyciem podczas sesji wyjściowych, test post hoc). (d) Średnie (± sem) spożycie karmy podczas 2-minutowych sesji wyjściowych oraz w dniu testu u szczurów kontrolnych Lenti-Control i Lenti-D1,26Rsh, które poprzednio miały tylko karmę lub rozszerzony dostęp do diety w kafeterii (wskazówka: F44.9 = 0.0001, P <0.05; * P <0.01, ** P <XNUMX w porównaniu z spożyciem podczas sesji wyjściowych, test post hoc).

Wreszcie, zbadaliśmy wpływ warunkowego bodźca sparowanego z karą na przyjmowanie pokarmu u szczurów kontrolnych Lenti-D2Rsh i Lenti-D6Rsh, które wcześniej miały dostęp tylko do karmy lub rozszerzony dostęp do diety kafeteryjnej (szczury z ryc. 30). Stwierdziliśmy, że wyjściowe spożycie smacznego pokarmu podczas 40-minutowych sesji wyjściowych było podobnie wysokie (~ 7 kCal) we wszystkich czterech grupach (ryc. 10c). Ponadto całkowite dzienne spożycie karmy (w klatce domowej) było podobne we wszystkich czterech grupach szczurów podczas sesji kondycjonujących iw dniu testu (ryc. Uzupełniający 14). 40 dni wcześniejszego dostępu do diety kafeteryjnej nie było zatem wystarczające, aby zablokować zachowania związane z napadami objadania się w sposób podobny do tego obserwowanego u szczurów, które miały> 7 dni przedłużony dostęp do diety kafeteryjnej (ryc. 2a, b). Awersyjny bodziec świetlny zakłócił spożycie smacznego pokarmu u szczurów kontrolnych Lenti-Control i Lenti-D7Rsh, które wcześniej miały dostęp tylko do karmy (ryc. 14c). Podobnie, awersyjny bodziec warunkowy zakłócił spożycie smacznego pokarmu u szczurów kontrolnych Lenti, które wcześniej miały 2 dni dłuższy dostęp do diety w kafeterii. W przeciwieństwie do tego, awersyjny bodziec warunkowy nie miał wpływu na smaczne spożycie pokarmu u szczurów Lenti-D14Rsh, które wcześniej miały 7-dniowy dłuższy dostęp do diety kafeteryjnej (ryc. 48c). Progi BSR pozostawały znacznie podwyższone u tych szczurów, gdy zostały zarejestrowane XNUMX godzin po sesji testowej, podczas gdy progi pozostały stabilne i niezmienione w pozostałych trzech grupach szczurów

(Rys. Uzupełniający 11). Aby sprawdzić, czy oporność na warunkowane wywołane bodźcem tłumienie spożywania smacznego pokarmu u szczurów o wydłużonym dostępie Lenti-D2Rsh nie była drugorzędna wobec upośledzeń w klasycznych procesach kondycjonowania, przetestowaliśmy wpływ awersyjnego bodźca warunkowego na konsumpcję mniej smacznej karmy standardowej w wszystkie cztery grupy szczurów. W przeciwieństwie do apetytowej konsumpcji smacznego pokarmu, odkryliśmy, że wszystkie cztery grupy szczurów spożywały małą karmę (~ 2 kCal) podczas sesji bazowych 30 min (Ryc. 7d) i że spożycie karmy zostało przerwane we wszystkich czterech grupach przez podobna wielkość po ekspozycji na awersyjny bodziec warunkowy (rys. 7d). Dane te pokazują, że powalenie prążkowia D2R znacznie przyspieszyło pojawienie się kompulsywnego jedzenia smacznego pożywienia, ale tylko u szczurów z historią przedłużonego dostępu. Ponadto, ponieważ kompulsywne jedzenie było wykrywane tylko u szczurów Lenti-D2Rsh, które miały podwyższone progi BSR, niedoczynność nagrody indukowana dietą może być koniecznym czynnikiem poprzedzającym pojawienie się kompulsywnego poszukiwania pożywienia.

Dyskusja

Łatwość dostępu do smacznego, wysokotłuszczowego pokarmu jest uważana za ważny czynnik ryzyka dla otyłości 19. Odkryliśmy, że wydłużony dostęp do bardzo smacznej diety w stołówce spowodował przejadanie się i przyrost masy ciała w połączeniu ze stopniowym podwyższaniem progów BSR u szczurów. Ten wpływ na progi BSR można wyjaśnić stopniowo zmniejszającą się reaktywnością obwodów nagrody mózgowej, interpretacją zgodną z faktem, że ograniczenie jedzenia i utrata masy ciała mogą zwiększyć 20, podczas gdy ostre przekarmianie może przejściowo zmniejszyć 21, odpowiadając na BSR u szczurów. Odkrycie to stanowi rozszerzenie prac pokazujących, że ostre przekarmianie szczurów przez dożołądkowe podawanie rurki 21 i rozdęcie żołądka lub dożylny wlew glukagonu, który naśladuje poposiłkowe satiety22, 23, 24, zmniejsza odpowiedź na nagradzające boczne podwzgórze BSR i zwiększa odpowiedzi podobne do niechęci do stymulacja25. Wcześniejsze prace wykazały również, że wielokrotne wymuszanie karmienia szczurów przez rurki dożołądkowe aż do zwiększenia ich masy o ~ 200 g podobnie zmniejsza szybkość odpowiedzi na BSR, efekt, który utrzymuje się do momentu, gdy masa ciała normalizuje się 23. Podobnie jak w przypadku tych wyników u szczurów, reakcja u kotów na boczne podwzgórze BSR była hamowana przez wcześniejsze karmienie satiation26, co pokazuje, że interakcje między funkcją nagrody mózgu a stanem metabolicznym są zachowane, a zatem mogą wystąpić również u ludzi. Łatwość dostępu i wynikające z tego przejadanie się diety w stołówce u ludzi uważa się za ważny czynnik środowiskowy w obecnej epidemii otyłości w społeczeństwach zachodnich 19. Nasze dane pokazują, że niedoczynność nagród pojawia się u szczurów, które dobrowolnie przejadają smaczną dietę w stołówce podobną do tej spożywanej przez ludzi i że efekt ten staje się coraz gorszy, gdy przybierają na wadze. Warto zauważyć, że wszystkie szczury z podwyższonym progiem nagrody ≥20% miały elektrody BSR umiejscowione w ~ 500 μm fornoksa grzbietowo-bocznego. Wrażliwość neuronów związanych z nagrodą w tym obszarze jest zwiększona przez ograniczenie pokarmu w sposób, który jest wrażliwy na tłuszczową leptynę pochodzącą z hormonu, a ten region mózgu jest uważany za ważny substrat dla nagrody pokarmowej 27. Obwody mózgowe, które regulują hedonikę pokarmową, są zatem hamowane przez sygnały postestestacyjne, które przewidują sytość, zgodnie z najnowszymi badaniami obrazowymi u ludzi, wykazującymi, że rozdęcie żołądka 28 i pochodzący z jelita czynnik poposiłkowy YY3-36 (PYY) 29 modulują aktywność regionów mózgu zaangażowany w przetwarzanie wynagrodzeń. Ponadto systemy nagród są również hamowane przez nadmierny przyrost masy ciała. Ostatnie doniesienia wskazują, że krążąca leptyna, kluczowy regulator równowagi energetycznej, może przenikać do tkanek mózgu i hamować aktywność obwodów nagrody 3, 27, 30, 31.

Niedobory nagród u szczurów z nadwagą mogą odzwierciedlać przeciwadaptacyjne zmniejszenie podstawowej wrażliwości obwodów nagrody w mózgu na przeciwdziałanie ich nadmiernej stymulacji przez smaczny pokarm. Taka niedoczynność nagrody wywołana dietą może przyczyniać się do rozwoju otyłości poprzez zwiększanie motywacji do spożywania wysoko nagradzanych diet „otyłych” w celu uniknięcia lub złagodzenia tego stanu negatywnej nagrody6. Może to wyjaśniać hipofagię, którą obserwowaliśmy w przypadku osób z przedłużonym dostępem. szczury i w mniejszym stopniu u szczurów o ograniczonym dostępie, gdy usunięto smaczny pokarm i dostępna była tylko mniej smaczna karma. Taki scenariusz jest również zgodny z danymi z badań obrazowania mózgu człowieka, w których stępiona aktywacja prążkowia w odpowiedzi na bardzo smaczny pokarm, szczególnie u osób z polimorfizmami genetycznymi, o których sądzi się, że zmniejsza ekspresję D32R w prążkowiu, wiąże się z długotrwałym przyrostem masy ciała2. Nie było jasne, czy taka nadwrażliwość na nagrodę u osób otyłych objawia się przed rozwojem otyłości i jest związana wyłącznie z czynnikami genetycznymi („zespół niedoboru nagrody”), czy też przejadanie się może powodować zakłócenia w przetwarzaniu nagrody. Nasze dane pokazują, że szerszy dostęp do smacznego, wysokoenergetycznego jedzenia i późniejsze przejadanie się osłabia wrażliwość i dlatego może stanowić ważny mechanizm hedoniczny, który sprzyja rozwojowi otyłości. Podobną dysfunkcję nagrody do tej opisywanej tutaj u otyłych szczurów wykrywa się również u szczurów z historią rozszerzonego dostępu do dożylnego samodzielnego podawania kokainy lub heroiny, ale nie u tych z historią ograniczonego dostępu4. sugerowano, że przypadkowe lub kompulsywne poszukiwanie narkotyków jest wynikiem próby złagodzenia uporczywego stanu obniżonej nagrody wywołanego przez tę wywołaną narkotykami dysfunkcję nagrody12, 13, 14. Zatem nasze dane wskazują, że otyłość i narkomania mogą mieć wspólne mechanizmy hedoniczne.

Obniżenie ekspresji prążkowia D2R jest godną uwagi neuroadaptacyjną odpowiedzią na nadmierne spożycie smacznego pokarmu. Rzeczywiście, zmniejszenie gęstości prążkowia D2R obserwuje się u osób z nadwagą 4, 34 i rodents35, 36. Odwrotnie, osoby z jadłowstrętem psychicznym mają podwyższony poziom prążkowia D2R37, a utrata masy ciała u osób otyłych po zabiegu bariatrycznym (pomostowanie żołądka) jest związana ze zwiększoną prążkowością D2R gęstość 28. Polimorfizm genu określany jako allel TaqIA A1 powoduje zmniejszenie gęstości D2R prążkowia, a osobniki niosące ten allel są nadmiernie reprezentowane w otyłych populacjach 4. Allel TaqIA zwiększa także podatność na alkohol, opioidy i środki pobudzające psychomotorykę. Zmniejszenie gęstości D38R prążkowia występujące albo przez konstytutywne czynniki genetyczne, albo jako konsekwencja przejadania się, może zatem przyczyniać się do neurobiologicznych mechanizmów otyłości. Stwierdziliśmy, że poziomy prążkowia izoformy 2 kDa D70R, uważane za odzwierciedlające związane z błoną D2R, były odwrotnie proporcjonalne do masy ciała u szczurów z grup wyłącznie chow, z ograniczonym dostępem i rozszerzonego dostępu (ryc. 2). Knockdown prążkowia ekspresji D4R, szczególnie w grzbietowo-bocznym prążkowiu (ryc. 2), spowodował wzrost progów BSR niemal natychmiast po ekspozycji na dietę w stołówce. Zmniejszenie ekspresji D5R w prążkowiu przyspieszyło zatem gwałtownie pojawienie się niedoczynności nagrody u szczurów z wydłużonym dostępem do bardzo smacznego pokarmu, co jest zgodne z danymi z obrazowania ludzkiego mózgu, które wskazują, że deficyty w gęstości D2R prążkowia przyczyniają się do niedoczynności nagrody u osób otyłych2.

Godne uwagi są również trzy cechy szczurów Lenti-D2Rsh. Po pierwsze, chociaż powalenie D2R prążkowia w połączeniu z rozszerzonym dostępem do smacznej diety spowodowało podniesienie progów BSR, nie było różnic w przyjmowaniu kalorii lub przyroście masy u tych szczurów w porównaniu ze szczurami kontrolnymi. Może to odzwierciedlać fakt, że szczury miały tylko 14 d dostępu do diety w stołówce; dłuższe okresy dostępu mogły spowodować większy przyrost masy ciała w czasie, podobnie jak większa podatność na przyrost masy ciała u ludzi z deficytem prążkowia D2R signaling4. Jednak zaletą ograniczenia dostępu do diety bufetowej tylko do 14 d jest to, że knockdown szczury o rozszerzonym dostępie były jedyną grupą wykazującą podwyższone progi BSR, co pozwoliło nam ocenić potencjalną rolę niedoczynności nagrody w rozwoju kompulsywnego jedzenie (patrz poniżej). Po drugie, progi BSR pozostały stabilne i niezmienione u szczurów z nokautem, które miały dostęp tylko do karmy. Wskazuje to, że sama zmniejszona ekspresja D2R w prążkowiu nie była wystarczająca do wywołania nadwrażliwości nagrody; zamiast tego wydawało się, że oddziałuje z nadmierną konsumpcją smacznego jedzenia, aby przyspieszyć pojawienie się tego stanu zmniejszonej wrażliwości na nagrody. Inne reakcje adaptacyjne w obwodach nagradzania mózgu mogą zatem wywoływać nadwrażliwość nagrody u szczurów z rozszerzonym dostępem do diety w stołówce. Mając to na uwadze, zauważamy, że agonista D2R, bromokryptyna, obniża poziomy leptin39 w krążeniu, a leptyna hamuje karmienie przynajmniej częściowo przez hamowanie regionów prążkowia, które kontrolują odpowiedzi hedoniczne na żywność 3, 30, 31. Zatem możliwe jest, że obniżenie poziomu prążkowia D2R w odpowiedzi na zwiększenie masy ciała zwiększa sygnalizację leptyny, a tym samym zwiększa hamujące działanie tej adipokiny na układy nagrody w mózgu. Na koniec zauważamy, że kierowaliśmy nasze wektory lentiwirusa w kierunku grzbietowo-bocznego prążkowia. Było to głównie ze względów technicznych, ponieważ boczne umieszczenie kaniul do dostarczania wirusa do prążkowia umożliwiło nam również umieszczenie na stałe pobudzającej elektrody stymulującej do określenia progu BSR. Tak więc możliwe jest, że celowanie w D2R w knockdown w innych obszarach prążkowia, szczególnie w okolice grzbietowo-przyśrodkowe i brzuszne (jądro półleżące i rdzeń skorupy), może mieć podwyższone progi BSR nawet przy braku smacznej diety.

Prążkowie grzbietowo-boczne są silnie zaangażowane w uczenie się nawyków typu bodziec-reakcja, co znajduje odzwierciedlenie w rozwoju zachowań konsumpcyjnych, które są niewrażliwe na dewaluację poprzez wcześniejsze karmienie do nasycenia lub łączenie się z bodźcami szkodliwymi40. Celując głównie w grzbietowo-boczne prążkowie, moglibyśmy zniszczyć populacje D2R, które regulują podatność szczurów na rozwój kompulsywnego jedzenia. Zgodnie z rolą prążkowia D2R w zachowaniach kompulsywnych, allel TaqIA ludzkiego locus genu DRD2 – ANKK1 - który skutkuje niską gęstością D2R w prążkowiu5, stępia aktywację prążkowia w odpowiedzi na smaczny pokarm4 i zwiększa podatność na otyłość4 - jest również powiązany z deficyty w nauce unikania działań niosących negatywne konsekwencje 41. Utrata hamującej kontroli nad zachowaniami mogącymi mieć negatywny skutek jest charakterystyczną cechą zarówno otyłości, jak i narkomanii, w której zachowania konsumpcyjne utrzymują się pomimo negatywnych konsekwencji społecznych, zdrowotnych czy finansowych. Zachowania związane z przyjmowaniem kokainy u szczurów, które w przeszłości intensywnie przyjmowały narkotyki, mogą stać się nieelastyczne i odporne na zakłócenia spowodowane awersyjnym bodźcem warunkowym, który przewiduje negatywny wynik (wstrząs łapy) 18. Podobnie myszy, które wcześniej miały dostęp do smacznej diety wysokotłuszczowej, będą spędzać więcej czasu w niekorzystnym środowisku (jasno oświetlonym), aby uzyskać smaczny pokarm, niż myszy, które nie miały żadnego doświadczenia z tą dietą42. Stwierdziliśmy, że spożycie smacznego pokarmu u szczurów z przedłużonym dostępem do diety w kafeterii było podobnie niewrażliwe na awersyjny bodziec warunkowy. Zgodnie z rolą prążkowia D2R w tym efekcie, kompulsywne jedzenie stwierdzono u szczurów prążkowia z knockdown D2R, które wcześniej miały 14 dni dłuższy dostęp do diety kafeteryjnej, ale nie w grupach kontrolnych. Z punktu widzenia obwodów neurologicznych, rozszerzony dostęp do smacznego pożywienia może wywołać plastyczność szlaków kortykostriatalnych, przez co zwierzęta będą bardziej podatne na rozwój zachowań kompulsywnych, z deficytem sygnalizacji D2R prążkowia wzmacniającym ten proces. Rzeczywiście, zmniejszona gęstość D2R w prążkowiu u osób otyłych jest skorelowana ze zmniejszonym metabolizmem w przedczołowych i oczodołowo-czołowych obszarach korowych43, które wywierają hamującą kontrolę nad zachowaniem44.

Warto zauważyć, że kompulsywne spożywanie smacznego pokarmu wykryto tylko u szczurów z nokautem, które wcześniej miały rozszerzony dostęp do diety w stołówce, nie u szczurów kontrolnych, które miały dłuższy dostęp do diety w stołówce przez ten sam okres, ani u szczurów z nokautem, które miały dostęp tylko do chow. Główną różnicą między knockdown szczurami z wcześniejszym rozszerzonym dostępem i innymi grupami było ich stale podwyższone progi BSR. Może to odzwierciedlać wspólne neurobiologiczne przyczyny niedoczynności nagrody i pojawienie się kompulsywnego jedzenia, które są czasowo zbieżnymi, ale niezależnymi zjawiskami. Alternatywnie, niedoczynność nagrody indukowana dietą może służyć jako podłoże dla negatywnego wzmocnienia, które ułatwia rozwój kompulsywnego jedzenia 14, 32, 33. Niezależnie od mechanizmów leżących u podstaw, nasze odkrycia pokazują, że kompulsywne reakcje uzależniające przypominające uzależnienie od smakowitych pokarmów mogą pojawić się u otyłych szczurów i wskazują, że deficyty w sygnale D2R prążkowia zwiększają podatność na rozwój tego zachowania.

Podsumowując, stwierdziliśmy, że nadmierna stymulacja mózgowych systemów nagradzania poprzez nadmierne spożywanie smacznego, gęstego energetycznie pożywienia wywołuje głęboki stan nadwrażliwości nagrody i rozwój kompulsywnego jedzenia. Te nieprzystosowawcze reakcje behawioralne u otyłych szczurów prawdopodobnie wynikają z niedoborów wywołanych dietą w prążkowiu sygnalizującym D2R. Nadmierne spożycie narkotyków podobnie zmniejsza gęstość prążkowia D2R, wywołuje głęboki stan niedoczynności nagrody i wywołuje pojawienie się zachowań związanych z zażywaniem narkotyków. Nasze odkrycia popierają zatem wcześniejsze work4, 19, 42, 45, 46, 47, wskazując, że otyłość i uzależnienie od narkotyków mogą wynikać z podobnych reakcji neuroadaptacyjnych w obwodach nagrody mózgu.

Metody

Szczury.

Samce szczurów Wistar o wadze 300 – 350 g na początku eksperymentów uzyskano z Charles River. Po przybyciu szczury trzymano pojedynczo w stałej temperaturze w cyklu 12-h światło-ciemność (światła włączone w 2200 h). Szczurom zezwolono na swobodny dostęp do standardowej karmy laboratoryjnej i wody na czas trwania eksperymentu. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee Scripps Florida, a szczury były leczone zgodnie z wytycznymi określonymi przez National Institutes of Health dotyczącymi zasad opieki nad zwierzętami.

Zabiegi chirurgiczne.

Szczury przygotowane za pomocą elektrod stymulujących BSR najpierw znieczulono przez inhalację 1-3% izofluranu w tlenie i umieszczono w ramce stereotaktycznej (Kopf). Bipolarne elektrody BSR (długość 11 mm) wszczepiono w tylne boczne podwzgórze (przednio-tylne, -0.5 mm od bregmy; mediolateralne, ± 1.7 mm od linii środkowej; dorsoventralne, 8.3 mm od opony twardej; pasek siekacza dostosowano do 5 mm powyżej linii międzyzębowej). ) 47. Szczury otrzymujące iniekcje wirusa przygotowano również z obustronnymi kaniulami prowadzącymi (miernik 23, długość 14 mm) umieszczonymi powyżej prążkowia (przednio-tylne, 2.8 mm od bregmy; mediolateralne, ± 3.1 mm od linii środkowej; dorsoventralne, -2.4 mm od linii środkowej; dorsoventralne, -48 mm od opony twardej) 14 i wypełnione z mandrynami 12. Cztery śruby ze stali nierdzewnej i akrylowy uchwyt trzymały elektrodę i kaniule na miejscu. Rana chirurgiczna była leczona miejscowo antybiotykiem raz na 5 h dla 7 d po operacji. Szczurom pozwolono 10-XNUMX d odzyskać siły po operacji, a następnie przeszkolono ich w procedurze progowej BSR.

Procedura BSR.

Szczury szkolono, aby odpowiadały na stymulację BSR według dyskretnej procedury progowej prądu podobnej do tej opisanej w innym miejscu 10, 14. W skrócie, poziomy prądu BSR zmieniały się naprzemiennie w malejącej i rosnącej serii w krokach 5-μA. W każdej sesji testowej przedstawiono cztery naprzemienne serie zstępujące / rosnąco. Próg dla każdej serii zdefiniowano jako punkt środkowy między dwoma kolejnymi natężeniami prądu, dla których szczury odpowiedziały w co najmniej trzech z pięciu prób i dwie kolejne natężenia prądu, dla których szczury nie odpowiedziały w trzech lub więcej z pięciu prób. Ogólny próg sesji został zdefiniowany jako średnia progów dla czterech poszczególnych serii. Każda sesja testowa trwała w przybliżeniu 30 minut. Stabilne progi BSR zdefiniowano jako ≤10% zmienności progów w ciągu 5 kolejnych dni, zwykle ustalone po treningu 10 – 14 d. Opóźnienie odpowiedzi dla każdej sesji testowej zdefiniowano jako średnią latencję odpowiedzi dla wszystkich prób, podczas których wystąpiła pozytywna odpowiedź.

Pakowanie wirusowe i dostawa.

Dostarczono RNA o strukturze spinki do włosów i uzyskano konstytutywną ekspresję przy użyciu systemu wektorów pRNAT-U6.2 / Lenti (GenScript). Cząsteczki wirusa przygotowano zgodnie z protokołem producenta. W skrócie, komórki HEK 293FT transfekowano wektorem zawierającym wstawkę shRNA (5′-GGATCCCGCGCAGCAGTCGAGCTTTCTTCAAGAGAGAAAGCTCGACTGCTGCGCTTTTTCCAACTCGAG-3 ′) lub pustym wektorem plus ViraPower Packaging Mix (zastąpiono pożywkę Invitrogen) po 72 godzinach. Następnie zebrano supernatant i zatężono przez ultrawirowanie (24 g, rotor Beckman Coulter SW 76,755 TI, 32 min, 90 ° C) i określono miano wirusa przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją zgodnie z instrukcjami producenta. Wirusa podzielono na porcje i przechowywano w chronionych przed światłem pudełkach w -4 ° C do momentu użycia.

Szczury ze stabilnymi progami BSR otrzymywały obustronne wstrzyknięcia wirusa w trzech miejscach prążkowia każdej półkuli mózgu (2 μl na zastrzyk, 1 μl min-1, 1 min między wstrzyknięciami, w sumie sześć wstrzyknięć na szczura). Szczurom pozwolono na odzyskanie przynajmniej 2-3 z zastrzyków wewnątrzratowych przed wznowieniem oceny progu BSR. Codzienna ocena progu BSR była kontynuowana w przypadku 33 d po wstrzyknięciach wirusa, aby zapewnić osiągnięcie maksymalnego prążkowia D2R przed zezwoleniem szczurom na dostęp do diety w stołówce. Podczas tych 2 d nie było różnic w progach BSR pomiędzy szczurami kontrolnymi Lenti i Lenti-D33Rsh (dane nie pokazane).

Immunoblotting.

Szczury zabijano około 1 po ich regularnym dostępie do diety w stołówce, a mózgi szybko usuwano. Skrawki mózgu o grubości ~ 1 – 2 mm przygotowano przy użyciu koronowej macierzy mózgowej (odstęp 1-mm; Plastics One) na bloku lodu i pobrano wycinki tkanki prążkowia grzbietowego (bregma: ~ 2.2 do -0.26 mm). Stemple prążkowia szybko zebrano, zamrożono i przechowywano w -80 ° C do momentu użycia. Poszczególne próbki rozmrożono na lodzie i równe ilości tkanki prążkowia zebrano na podstawie zależnej od masy mediany podziału grup dostępu (szczury 7 – 10 na pulę). Tkankę ponownie zawieszono w lodowatym buforze RIPA 500 μl (Thermo Scientific) zawierającym ortowanadan sodu, inhibitory koktajlu fosfatazy 1 i 2 (Sigma-Aldrich), leupeptynę i pepstatynę przed homogenizacją. Lizaty tkankowe gotowano przez 10 min w buforze do próbek i załadowano na żele 4% -20% lub 10% Tris-glicyna SDS (Invitrogen). Białko przeniesiono na membrany nitrocelulozowe, zablokowano dla 1 h w ~ 23 – 25 ° C (5% beztłuszczowe mleko w proszku i 0.2% Tween-20 w PBS, pH 7.4) i inkubowano w pierwotnym przeciwciele przez noc w 4 ° C. Następujące przeciwciała pierwotne rozcieńczono w roztworze blokowym: monoklonalne myszy monoklonalne D2R (Santa Cruz, 1: 100) lub β-aktyny (Santa Cruz, 1: 200). Chemiluminescencyjny odczynnik ECL dodano po inkubacji z wtórnymi przeciwciałami sprzężonymi z peroksydazą chrzanową (Amersham, 1: 2,000). Dojrzała postać D2DR związana z błoną (~ 70 kDa) 17, 49 została znormalizowana do kontroli ładowania białka (β-aktyny; 43 kDa) i oznaczona ilościowo za pomocą densytometrii przy użyciu oprogramowania NIH Image J.

Analiza immunochemiczna.

Szczury znieczulono i poddano perfuzji przezsercowej za pomocą 4% paraformaldehydu w PBS (pH 7.6). Mózgi usunięto, utrwalono przez noc i przechowywano w sacharozie (roztwór 30% w PBS, pH 7.4) przez co najmniej 72 h. Zamrożone skrawki tkanki (grubość 30 μm) zebrano z mikrotomu i zablokowano (3% BSA, 5% normalnej surowicy koziej i 0.3% Triton X-100 w PBS) dla 1 h w ~ 23 – 25 ° C. Następujące przeciwciała pierwotne dodano do roztworu blokowego i inkubowano przez noc w 4 ° C: kurczak poliklonalny do GFP (Abcam, 1: 1,000); królik monoklonalny do GFAP (Millipore, 1: 1,000); mysz monoklonalna do NeuN (Millipore, 1: 1,000). Skrawki inkubowano z przeciwciałami drugorzędowymi skoniugowanymi z barwnikiem fluorescencyjnym w ~ 23 – 25 ° C: barwniku anty-kurczak-488-nm (Jackson ImmunoResearch, 1: 1,000), barwnik anty-królik-594-nm (Invitrogen, 1: 1,000 ) i barwnik anty-mysi-594-nm (Invitrogen, 1: 1000). Sekcje zostały zamontowane za pomocą nośników montażowych Vectashield zawierających DAPI (Vector Labs) i szkiełka nakrywkowe. Obrazy wykonano przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego Olympus BX61 (cel × 2) lub mikroskopu konfokalnego Olympus (cele × 10 i × 100).

Procedura karmienia.

Szczury trzymano pojedynczo na papierowej pościeli (wkładki alfa; Shepherd Specialty Papers), aby zapobiec zabrudzeniu produktów spożywczych przez luźne materiały pościelowe. Dieta w stołówce składała się z bekonu, kiełbasy, sernika, ciasta funtowego, lukieru i czekolady, które były indywidualnie ważone przed udostępnieniem ich szczurom. Produkty dietetyczne w stołówkach były dostarczane w małych metalowych pojemnikach. Wszystkie produkty żywnościowe, w tym standardową karmę laboratoryjną, ważono ponownie po zakończeniu sesji karmienia. Spożycie kalorii z różnych makroskładników odżywczych obliczono na podstawie informacji żywieniowych dostarczonych przez producenta.

Wywołane przez cue tłumienie zachowań żywieniowych.

Procedury karmienia odbywały się w wyciszonych komorach instrumentalnych o wymiarach identycznych jak te używane w eksperymentach BSR. Szczury umieszczono w komorze operanta i miały dostęp do diety kafeteryjnej lub karmy na 30 minut. Artykuły spożywcze były dostarczane w małych metalowych pojemnikach. Wszystkie pokarmy zważono przed i po sesjach karmienia, które wykonywano podczas normalnego okresu karmienia szczurów. Spożycie karmy oceniano na podstawie spożycia 45-mg pastylek karmy identycznych pod względem składu jak karma dostarczana w klatkach domowych szczurów. Następnie szczurom pozwolono na 30-minutowy dostęp do diety w kafeterii, aż do osiągnięcia stabilnego spożycia (zdefiniowanego jako <10% zmiany dziennego spożycia), co wymagało 5-7 dni. Po ustabilizowaniu spożycia smacznego pokarmu w tym okresie odniesienia, szczury w każdych warunkach dostępu przydzielono do dwóch grup: karanych (otrzymujących wstrząs łapą) i bezkarnych (nieotrzymujących wstrząsu łapą). Następnie szczury poddano czterem sesjom warunkującym w kolejnych dniach w tej samej komorze operacyjnej, w której poprzednio miały dostęp do smacznego pożywienia. Podczas 30-minutowych sesji kondycjonujących światło sygnalizacyjne (bodziec warunkowy) było aktywowane na 10 minut, wyłączane na 10 minut, a następnie włączane ponownie na 10 minut. Ukarane szczury otrzymywały wstrząs łapy tylko podczas prezentacji światła sygnalizacyjnego (0.5 mA przez 1.0 s; 10 stymulacji z ~ 1-minutowymi przerwami). Bezkarne szczury otrzymały światło sygnalizacyjne w ten sam sposób, ale bez wywołania szoku stopy. W dniu testu, dzień po ostatniej sesji kondycjonującej, szczury w grupach ukaranych otrzymywały przerywany wstrząs stopy (w sumie pięć stymulacji) połączony z aktywacją światła sygnalizacyjnego przez 5 minut. Bezkarne szczury ponownie wystawiono na światło sygnalizacyjne przy braku wstrząsu stopy. Po 5-minutowym okresie karania, wszystkim szczurom umożliwiono dostęp do smacznego pożywienia na 30-minutową sesję z warunkowym bodźcem aktywowanym w sposób przerywany (10 min włączone światło sygnalizacyjne, 10 min wyłączone, 10 min włączone).

Analizy statystyczne.

Wyjściowe progi nagród zostały zdefiniowane jako średnia wartość progowa dla 5 d przed dostępem do diety w stołówce dla każdego pacjenta. Progi nagród zostały wyrażone jako procentowa zmiana od wartości progowej linii bazowej. Dane dotyczące procentowej wartości progowej wartości progowej nagrody, przyrostu masy ciała, zużycia kalorii i zużycia kalorii z tłuszczu analizowano za pomocą analizy wariancji z zastosowaniem dwóch czynników, powtarzanych pomiarów, z dostępem (tylko karma, ograniczony dostęp lub rozszerzony dostęp), źródło kalorii ( standardowa dieta chow lub kafeteria), wirus (kontrola Lenti lub Lenti-D2Rsh) i wskazówka (sparowana lub niesparowana z karą) jako czynniki międzyosobnicze i czas jako czynnik wewnątrzobiektowy. W stosownych przypadkach główne efekty w analizach wariancji były dalej analizowane za pomocą testów post hoc Bonferroniego. Wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono za pomocą oprogramowania GraphPad Prism.

Referencje

Referencje

1. Saper CB, Chou TC, Elmquist JK. Potrzeba karmienia: homeostatyczna i hedoniczna kontrola jedzenia. Neuron. 2002;36: 199-211. [PubMed]
2. Zheng H, Berthoud HR. Jedzenie dla przyjemności lub kalorii. Curr Opin Pharmacol. 2007;7: 607-612. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
3. Farooqi IS, i in. Leptyna reguluje regiony prążkowia i zachowania żywieniowe człowieka. Science. 2007;317: 1355. [PubMed]
4. Ścieg
E, Spoor S, Bohon C, Mały DM. Związek między otyłością a stępieniem
odpowiedź prążkowia na pokarm jest moderowana przez allel TaqIA A1. Science. 2008;322: 449-452. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
5. Noble EP. Uzależnienie i proces nagradzania poprzez polimorfizmy genu receptora dopaminy D2: przegląd. Eur Psychiatrii. 2000;15: 79-89. [PubMed]
6. Wang GJ, Volkow ND, Fowler JS. Rola dopaminy w motywacji do jedzenia u ludzi: konsekwencje otyłości. Expert Opin Ther Cele. 2002;6: 601-609. [PubMed]
7. Stoisko
ML, Wilkenfeld RL, Pagnini DL, Booth SL, King LA. Postrzeganie
młodzież z nadwagą i otyłością: waga badania opinii. J Paediatr Child Health. 2008;44: 248-252. [PubMed]
8. Puhla
RM, Moss-Racusin CA, Schwartz MB, Brownell KD. Stygmatyzacja wagi
i redukcja uprzedzeń: perspektywy dorosłych z nadwagą i otyłych. Zdrowie Educ Res. 2008;23: 347-358. [PubMed]
9. Amerykańskie Stowarzyszenie Lekarzy. Podręcznik diagnostyczny i statystyczny zaburzeń psychicznych. Czwarta edycja (DSM-IV) 1994.
10. Markou
A, Koob GF. Skonstruuj ważność progu samostymulacji
paradygmat: efekty manipulacji nagrodą i wydajnością. Physiol Behav. 1992;51: 111-119. [PubMed]
11. Rolls BJ, Rowe EA, Turner RC. Utrzymująca się otyłość u szczurów po okresie spożywania mieszanej, wysokoenergetycznej diety. J Physiol. 1980;298: 415-427. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
12. Ahmed SH, Kenny PJ, Koob GF, Markou A. Dowody neurobiologiczne allostazy hedonicznej związanej z eskalacją używania kokainy. Nat Neurosci. 2002;5: 625-626. [PubMed]
13. Markou A, Koob GF. Anhedonia pokokainowa. Model zwierzęcy wycofania kokainy. Neuropsychopharmacology. 1991;4: 17-26. [PubMed]
14. Kenny
PJ, Chen SA, Kitamura O, Markou A, Koob GF. Warunkowe wycofanie
napędza konsumpcję heroiny i zmniejsza wrażliwość na nagrody. J Neurosci. 2006;26: 5894-5900. [PubMed]
15. Bawełna
P, Sabino V, Steardo L, Zorrilla EP. Przewidywanie zależne od opioidów
negatywny kontrast i objadanie się u szczurów z ograniczonym dostępem do
bardzo preferowane jedzenie. Neuropsychopharmacology. 2008;33: 524-535. [PubMed]
16. Llado
I, et al. Wpływ karmienia dietą stołową na adrenoceptor beta3
ekspresja i aktywność lipolityczna w białej tkance tłuszczowej mężczyzny i
samice szczurów. Int J Obes Relat Metab Disord. 2000;24: 1396-1404. [PubMed]
17. Przypalenie ryb
CS, Elazar Z, Fuchs S. Różnicowa glikozylacja i wewnątrzkomórkowa
handel długimi i krótkimi izoformami receptora dopaminy D2.
J Biol Chem. 1995;270: 29819-29824. [PubMed]
18. Vanderschuren LJ, Everitt BJ. Poszukiwanie długotrwałych narkotyków staje się kompulsywne. Science. 2004;305: 1017-1019. [PubMed]
19. Volkow ND, Wise RA. Jak uzależnienie od narkotyków może pomóc nam zrozumieć otyłość? Nat Neurosci. 2005;8: 555-560. [PubMed]
20. Blundella
JE, Herberg LJ. Względne skutki deficytu żywieniowego i niedostatku
okres na szybkość elektrycznej samo-stymulacji bocznego podwzgórza. Natura. 1968;219: 627-628. [PubMed]
21. Hoebel BG, Teitelbaum P. Hypothalamic kontrola żywienia i samostymulacji. Science. 1962;135: 375-377. [PubMed]
22. Góra G, Hoebel BG. Boczna autostymulacja podwzgórza: Samostanowienie progu zwiększone przez spożycie pokarmu. Psychon Science. 1967;9: 265-266.
23. Hoebel BG. Karmienie i autostymulacja. Ann NY Acad Sci. 1969;157: 758-778. [PubMed]
24. Hoebel BG, Balagura S. Samostymulacja bocznego podwzgórza zmodyfikowanego insuliną i glukagonem. Physiol Behav. 1967;2: 337-340.
25. Hoebel BG, Thompson RD. Niechęć do bocznej stymulacji podwzgórza spowodowanej karmieniem żołądkowym lub otyłością. J Comp Physiol Psychol. 1969;68: 536-543. [PubMed]
26. Wilkinson HA, Peele TL. Modyfikacja wewnątrzczaszkowej samostymulacji przez uczucie głodu. Am J Physiol. 1962;203: 537-540. [PubMed]
27. Fulton S, Woodside B, Shizgal P. Modulacja obwodów nagrody mózgu przez leptynę. Science. 2000;287: 125-128. [PubMed]
28. Wang GJ i in. Zaburzenia żołądka aktywują obwody sytości w ludzkim mózgu. Neuroimage. 2008;39: 1824-1831. [PubMed]
29. Batterham RL i in. Modulacja PYY korowych i podwzgórzowych obszarów mózgu przewiduje zachowania żywieniowe u ludzi. Natura. 2007;450: 106-109. [PubMed]
30. Hommel JD i in. Sygnalizacja receptora leptyny w śródmózgowych neuronach dopaminowych reguluje żywienie. Neuron. 2006;51: 801-810. [PubMed]
31. Fulton S i in. Regulacja leptyny w szlaku dopaminy mezoaccumbens. Neuron. 2006;51: 811-822. [PubMed]
32. Kenny PJ. Systemy wynagrodzeń dla mózgu i kompulsywne używanie narkotyków. Trends Pharmacol Sci. 2007;28: 135-141. [PubMed]
33. Wang GJ i in. Dopamina w mózgu i otyłość. Lancet. 2001;357: 354-357. [PubMed]
34. Huang
XF, i in. Gęstość transportera dopaminy i gęstości wiązania receptora D2 w
myszy podatne lub odporne na przewlekłą otyłość wywołaną dietą wysokotłuszczową. Behav Brain Res. 2006;175: 415-419. [PubMed]
35. Thanosa
PK, Michaelides M, Piyis YK, Wang GJ, Volkow ND. Ograniczenie żywności
znacznie zwiększa receptor dopaminy D2 (D2R) w szczurzym modelu otyłości
jak oceniono za pomocą obrazowania muPET in vivo ([11C] raclopopride) i in vitro
([3H] spiperone) autoradiografia. Synapse. 2008;62: 50-61. [PubMed]
36.Frank
GK, i in. Zwiększone wiązanie receptora dopaminy D2 / D3 po wyzdrowieniu
z jadłowstrętem psychicznym mierzonym za pomocą pozytronowej tomografii emisyjnej i
[11c] raclopopride. Biol Psychiatry. 2005;58: 908-912. [PubMed]
37. Neville
MJ, Johnstone EC, Walton RT. Identyfikacja i charakterystyka
ANKK1: nowy gen kinazy ściśle związany z DRD2 w paśmie chromosomów
11q23.1. Hum Mutat. 2004;23: 540-545. [PubMed]
38. Mastronardi CA, Yu WH, Srivastava VK, Dees WL, McCann SM. Wydzielanie leptyny indukowane lipopolisacharydem jest kontrolowane nerwowo. Proc Natl Acad Sci US A. 2001;98: 14720-14725. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
39. Yin
HH, Knowlton BJ, Balleine BW. Dezaktywacja prążkowia grzbietowo-bocznego
zwiększa wrażliwość na zmiany w ewentualności wyników
uwarunkowania instrumentalne. Behav Brain Res. 2006;166: 189-196. [PubMed]
40. Klein TA i in. Genetycznie określone różnice w uczeniu się na błędach. Science. 2007;318: 1642-1645. [PubMed]
41. Teegarden SL, Bale TL. Zmniejszenie preferencji żywieniowych powoduje wzrost emocjonalności i ryzyko nawrotu diety. Biol Psychiatry. 2007;61: 1021-1029. [PubMed]
42. Wołków
ND, et al. Związane są z tym receptory D2 o niskiej prążkowiu dopaminy
metabolizm przedczołowy u osób otyłych: możliwe czynniki. Neuroimage. 2008;42: 1537-1543. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
43. Clarke HF, Dalley JW, Crofts HS, Robbins TW, Roberts AC. Elastyczność poznawcza po wyczerpaniu serotoniny przedczołowej. Science. 2004;304: 878-880. [PubMed]
44. Owies
NM, Rada P, Hoebel BG. Dowody na uzależnienie od cukru: behawioralne i
neurochemiczne skutki przerywanego, nadmiernego spożycia cukru. Neurosci Biobehav Rev. 2008;32: 20-39. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
45. Volkow ND, O'Brien CP. Kwestie związane z DSM-V: czy otyłość należy uwzględnić jako zaburzenie mózgu? Am J Psychiatry. 2007;164: 708-710. [PubMed]
46. ​​Cottone P, i in. Rekrutacja do systemu CRF pośredniczy w ciemnej stronie kompulsywnego jedzenia. Proc Natl Acad Sci US A. 2009;106: 20016-20020. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
47. Pellegrino LJ, Pellegrino AS, Cushman AJ. Atlas stereoskopowy mózgu szczura. New York: Plenum Press; 1979.
48. David C, Fishburn CS, Monsma FJ, Jr, Sibley DR, Fuchs S. Synteza i przetwarzanie receptorów dopaminergicznych D2. Biochemia. 1993;32: 8179-8183. [PubMed]

Korespondencja do:

· Paul J Kenny ([email chroniony])