Diabetologia. 2017; 60 (8): 1502 – 1511.
Opublikowano online 2017 May 20. doi: 10.1007/s00125-017-4305-4
PMCID: PMC5491592
1Abstrakcyjny
Cele/hipoteza
Przejadanie się tłuszczów w diecie powoduje otyłość u ludzi i gryzoni. Ostatnie badania na ludziach i gryzoniach wykazały, że uzależnienie od tłuszczów ma wspólny mechanizm z uzależnieniem od alkoholu, nikotyny i narkotyków pod względem dysfunkcji mózgowych systemów nagrody. Podkreślono, że dieta wysokotłuszczowa (HFD) osłabia sygnalizację receptora dopaminy D2 (D2R) w prążkowiu, kluczowym regulatorze mózgowego układu nagrody, co powoduje hedoniczne przejadanie się. Wcześniej informowaliśmy, że specyficzny dla brązowego ryżu składnik bioaktywny γ-oryzanol osłabiał preferencje dla HFD poprzez kontrolę podwzgórza. Dlatego zbadaliśmy możliwość, że γ-oryzanol modulowałby funkcjonowanie mózgowego układu nagrody u myszy.
Metody
Samce myszy C57BL/6J karmione HFD traktowano doustnie γ-oryzanolem i oceniano poziomy cząsteczek zaangażowanych w sygnalizację D2R w prążkowiu. Zbadano wpływ γ-oryzanolu na metylację DNA promotora D2R i późniejsze zmiany preferencji co do tłuszczu w diecie. Ponadto zbadano wpływ 5-aza-2′-dezoksycytydyny, silnego inhibitora metylotransferaz DNA (DNMT), na preferencje żywieniowe, sygnalizację D2R i poziomy DNMT w prążkowiu. Hamujący wpływ γ-oryzanolu na aktywność DNMT oceniano enzymatycznie in vitro.
Efekt
W prążkowiu myszy karmionych HFD produkcja D2R została zmniejszona poprzez wzrost metylacji DNA regionu promotora D2R. Doustne podawanie γ-oryzanolu zmniejszyło ekspresję i aktywność DNMT, przywracając w ten sposób poziom D2R w prążkowiu. Farmakologiczne hamowanie DNMT przez 5-aza-2′-deoksycytydynę również poprawiło preferencje dotyczące tłuszczu w diecie. Zgodnie z tymi ustaleniami, testy enzymatyczne in vitro wykazały, że γ-oryzanol hamuje aktywność DNMT.
Wnioski/interpretacja
Wykazaliśmy, że γ-oryzanol łagodzi indukowaną przez HFD hipermetylację DNA regionu promotora D2R w prążkowiu myszy. Nasz eksperymentalny paradygmat podkreśla γ-oryzanol jako obiecującą substancję przeciw otyłości z wyraźną właściwością bycia nowym modulatorem epigenetycznym.
Elektroniczny materiał uzupełniający
Wersja online tego artykułu (doi:10.1007/s00125-017-4305-4) zawiera recenzowane, ale nieedytowane materiały dodatkowe, które są dostępne dla autoryzowanych użytkowników.
Wprowadzenie
Przejadanie się u osób otyłych ma przynajmniej częściowo wspólne mechanizmy z uzależnieniem od alkoholu, nikotyny i narkotyków.1]. Oprócz podwzgórzowej i hormonalnej regulacji apetytu, mózgowy układ nagrody, w szczególności sygnalizacja receptora dopaminy, jest ściśle powiązany z uzależniającymi lub hedonicznymi zachowaniami żywieniowymi.2]. Poprzednie badanie na szczurach wykazało, że knockdown prążkowia receptora dopaminy D2 (D2R) przez interferujący RNA o krótkiej szpilce do włosów, w którym pośredniczy lentiwirus, szybko wywołał podobne do uzależnienia deficyty nagrody i kompulsywne poszukiwanie jedzenia [3]. Ze względu na zmniejszoną gęstość D2R prążkowie grzbietowe jest mniej wrażliwe na nagrodę pokarmową w porównaniu z szczupłymi grupami kontrolnymi u otyłych ludzi i gryzoni.3-5]. Zgodnie z tym założeniem, Taqallel IA gen ANKK1 locus genu (kodujący powtórzenie DRD2/ankyrynę i domenę kinazy zawierającą 1), który zmniejsza wytwarzanie D2R w prążkowiu, jest związany z fenotypem otyłości u ludzi [6], podczas gdy skutki utraty wagi po operacji bariatrycznej są związane z podwyższoną gęstością prążkowia D2R [7]. Dane te silnie sugerują znaczenie prążkowia D2R jako nowego celu terapeutycznego w leczeniu otyłości. Jednak niektóre opracowane leki, które działały na układ nagrody w mózgu, powodowały znaczne skutki uboczne, w tym poważne problemy psychiatryczne, w wyniku których ostatecznie wycofano je z klinik [8].
Modyfikacje epigenetyczne mają kluczowe znaczenie nie tylko dla rozwoju i różnicowania, ale także dlatego, że powstają w wyniku zmian środowiskowych, w tym w diecie i stylu życia [9]. Metylacja DNA jest głównym wydarzeniem epigenetycznym warunkującym stabilność ekspresji genów [9]. U szczurów ekspozycja matki na dietę wysokotłuszczową (HFD) międzypokoleniowo zmienia metylację DNA w centralnym systemie nagrody u potomstwa, prowadząc do nadmiernego spożycia HFD przez młode [XNUMX].10]. W szczególności metylotransferazy DNA (DNMT) odgrywają kluczową rolę w regulacji zachowań żywieniowych i aktywności fizycznej [10, 11], co sugeruje, że DNMT mogą być obiecującymi celami terapeutycznymi w terapii zespołu otyłości i cukrzycy. Co ważne, wiadomo, że niektóre naturalne substancje pochodzące z żywności, w tym kwas kawowy i epigallokatechina, działają jako inhibitory DNMT [12, 13].
Niedawno wykazaliśmy, że bioaktywny, specyficzny dla brązowego ryżu składnik γ-oryzanol, mieszanina estru kwasu ferulowego i kilku fitosteroli, osłabia preferencje dla tłuszczu w diecie poprzez zmniejszenie stresu retikulum endoplazmatycznego (ER) podwzgórza.14]. U myszy i królików podawany doustnie γ-oryzanol był szybko wchłaniany z jelita i rozprowadzany głównie do mózgu.15, 16]. Podsumowując te odkrycia, naturalne produkty pochodzące z żywności działające na ośrodkowy układ nerwowy mogą stanowić alternatywę dla bezpiecznego łagodzenia zaburzeń zachowania żywieniowego u osób z otyłością. W tym kontekście przetestowaliśmy hipotezę, że γ-oryzanol zmieniłby status metylacji DNA w systemie nagrody mózgu, powodując osłabienie preferencji dla HFD u myszy.
Metody
Zwierzęta
Siedmiotygodniowe samce myszy C57BL / 6J otrzymane z Charles River Laboratories Japan (Kanagawa, Japonia) trzymano (3–4 na klatkę) w warunkach wolnych od specyficznych patogenów w 24 ° C w świetle 12 h / 12 h / ciemny cykl. Po tygodniu aklimatyzacji 8-tygodniowe myszy dobrano pod względem masy i podzielono na dwie lub trzy grupy, które miały przejść każdy eksperyment. Myszom zapewniono swobodny dostęp do pożywienia i wody. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu Ryukyus (nr 5352, 5718 i 5943).
Podanie γ-oryzanolu i 5-aza-2′-deoksycytydyny
Aby ocenić preferencje dla HFD, γ-oryzanol (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japonia) podawano 8-tygodniowym myszom przez zgłębnik podczas testu wyboru pokarmu, jak opisano wcześniej [14, 17]. Do innych eksperymentów wytworzono HFD (D12079B; Research Diets, New Brunswick, NJ, USA) zawierające 0.4% γ-oryzanolu w postaci peletek. Składniki diety przedstawiono w tabeli z elektronicznymi materiałami uzupełniającymi (ESM). 1. Po 12 tygodniach karmienia pobrano tkankę z prążkowia i podwzgórza. Dzienne spożycie γ-oryzanolu, oszacowane na podstawie średniego spożycia pokarmu przez myszy, wynosiło około 320 μg/g masy ciała. Dawki γ-oryzanolu określono w sposób opisany wcześniej [14]. 5-aza-2′-deoksycytydynę (5-aza-dC; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) wstrzykiwano dootrzewnowo (0.25 μg/g masy ciała) trzy razy w tygodniu przez 12 tygodni [18].
Oszacowanie preferencji dla tłuszczu w diecie
Aby ocenić preferencje dotyczące tłuszczu w diecie, testy żywności dały wybór między karmą a HFD (D12450B i D12451; diety badawcze), jak opisano wcześniej [14]. Składniki diety przedstawiono w tabeli ESM 1. W skrócie, myszom pozwolono na swobodny dostęp do karmy i HFD. Spożycie karmy i HFD mierzono co tydzień i analizowano pod kątem zmian preferencji dotyczących tłuszczu w diecie. Preferencję HFD obliczono według wzoru: preferencja HFD = [(spożycie HFD/całkowite spożycie pokarmu) × 100].
Sekwencjonowanie wodorosiarczynowe pod kątem metylacji DNA
DNA oczyszczono przy użyciu zestawu DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, Tokio, Japonia). Roztwór DNA zmieszano ze świeżo przygotowanym 3 mol/l NaOH, inkubowano w 37°C przez 15 min i dodano do 5.3 mol/l mocznika, 1.7 mol/l wodorosiarczynu sodu i 4.9 mmol/l hydrochinonu. Roztwór poddano 15 cyklom denaturacji w 95°C przez 30 s i inkubacji w 50°C przez 15 min [19]. DNA potraktowane wodorosiarczynem oczyszczono przy użyciu zestawu MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN) i zamplifikowano metodą PCR przy użyciu zestawu KAPA HiFi HotStart Uracil + ReadyMix PCR Kit (KAPA Biosystems, Woburn, MA, USA) i starterów wokół miejsca CpG regionu promotora D2R . Sekwencje starterów były następujące: starter lewy, 5'-GTAAGAATTGGTTGGTTGGAGTTAAAA-3'; starter odwrotny, 5′-ACCCTACCCTCTTAAAACCACAACTAC-3′. Następnie sekwencje adapterów zostały dodane i oczyszczone przy użyciu Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, CA, USA). Następnie próbki zebrano i załadowano do GS Junior (Roche Diagnostics, Tokio, Japonia) w celu sekwencjonowania zgodnie z protokołem producenta. Poziom metylacji wyrażono jako procent zmetylowanych cytozyn we wszystkich resztach cytozyn.
Test aktywności DNMT
Test aktywności enzymatycznej DNMT przeprowadzono przy użyciu zestawu EpiQuik DNA Methyltransferase Activity/Inhibition Assay Kit (Epigentek Group, Brooklyn, NY, USA) i zestawu EPIgeneous Methyltransferase Assay (Cisbio Japan, Chiba, Japonia) zgodnie z protokołami producenta.
Aby ocenić działanie hamujące każdego związku na metylację DNA, tworzenie S-adenozylo-20-homocysteinę (SAH) mierzono w obecności każdego związku (XNUMX μmol/l do testów przesiewowych), S-adenozylometionina (SAM; 10 μmol/l) i substrat DNMT (4 ng/μl) w 37°C przez 90 min. Aby ocenić kinetykę Michaelisa-Mentena, DNMT1 (20 μmol / l) inkubowano z γ-oryzanolem, SAM (5 μmol / l) i wskazanym stężeniem poli dI-dC w 37 ° C przez 90 min. DNMT3a (100 μmol/l) i DNMT3b (100 μmol/l) inkubowano z γ-oryzanolem, SAM (5 μmol/l) i wskazanym stężeniem poli dG·dC w 37°C przez 120 min. Testy przeprowadzono czterokrotnie. Wyekstrahowane białko (0.75 mg/ml) inkubowano z SAM (5 μmol/l), poli dI-dC (5 μg/ml) i poli dG·dC (5 μg/ml) w 40°C przez 120 min i Mierzono tworzenie SAH.
Test aktywności receptora γ związanego z estrogenem
Potencjalne działanie antagonistyczne γ-oryzanolu na estrogenopodobny receptor γ (ERRγ) oceniano przy użyciu Human Estrogen-Related Receptor Gamma Reporter Assay System (INDIGO Bioscience, State College, PA, USA) zgodnie z protokołem producenta. W skrócie, komórki reporterowe ssaków innych niż człowiek konstytutywnie eksprymujące aktywny ERRγ były eksponowane na wskazane stężenia każdego związku przez 24 godziny w trzech powtórzeniach.
Western blotting
Zostało to wykonane zgodnie z wcześniejszym opisem [20] z przeciwciałami przeciwko D2R (1:500, królik), transporter dopaminy (DAT; 1:500, królik), hydroksylaza tyrozynowa (TH; 1:1000, królik) (AB5084P, AB1591P i AB152, Merck Millipore, Billerica, MA, USA), przetwornik sygnału i aktywator transkrypcji 3α (STAT3α; 1:1000, królik), DNMT1 (1:1000, królik), DNMT3a (1:1000, królik) (nr 8768, 5032 i 3598; Cell Signaling Technology, Tokio, Japonia), DNMT3b (1 μg/ml, królik), ERRγ (1:1000, królik) i β-aktyna (1:10,000 16049, mysz) (ab128930, ab6276 i abXNUMX; Abcam, Cambridge, MA, USA).
Ilościowa PCR w czasie rzeczywistym
Ekspresję genów zbadano w sposób opisany wcześniej [14]. Poziomy mRNA znormalizowano do Rn18 (18S rRNA). Zestawy starterów stosowane do ilościowych analiz PCR w czasie rzeczywistym podsumowano w tabeli ESM 2.
Analiza statystyczna
Dane wyrażono jako średnią ± SEM. W stosownych przypadkach zastosowano jednoczynnikową ANOVA i ANOVA z powtarzanymi pomiarami, a następnie wielokrotne testy porównawcze (metoda Bonferroniego-Dunna). studenckie t Test posłużył do analizy różnic między dwiema grupami. Różnice uznano za znaczące w p <0.05.
Efekt
Farmakologiczne hamowanie DNMT przez 5-aza-dC osłabiło preferencję dla tłuszczu w diecie u myszy
U myszy karmionych HFD metylacja DNA w regionie promotora D2R w prążkowiu była znacznie zwiększona w porównaniu z myszami karmionymi karmą (ryc. (Rys.1a).1A). Z drugiej strony metylacja DNA podwzgórza w regionie promotora D2R była najwyraźniej wyższa niż w prążkowiu pod dietą karmy (p < 0.01) (ryc. (Rys.1a,1a, f) i nie został zmieniony przez HFD (ryc. (Rys.1f).1F). U myszy karmionych HFD zwiększona metylacja DNA w regionie promotora D2R w prążkowiu została znormalizowana przez traktowanie 5-aza-dC, silnym inhibitorem DNMT (ryc. (Rys.1a).1A). W przeciwieństwie do tego, metylacja DNA w regionie promotora D2R w podwzgórzu nie została znacząco zmieniona przez traktowanie 5-aza-dC (ryc. (Rys.1f).1F). W prążkowiu 20-tygodniowych samców myszy karmionych HFD przez 12 tygodni poziomy mRNA i białka D2R były znacznie zmniejszone (ryc. (Rys. 1b, 1b, k, l). Natomiast poziomy receptorów dopaminy D1 (D1R, kodowane przez Drd1), które działają w sposób przeciwny do D2R na cyklazę adenylową i sygnalizację wewnątrzkomórkową za pośrednictwem cAMP, pozostały niezmienione (ryc. (Rys.1c).1C). Ponadto nie było zmian w poziomach innych cząsteczek związanych z sygnalizacją D2R, takich jak TH i DAT na poziomie mRNA i / lub białka (ryc. (Rys. 1d, 1d, e, k, m). Z drugiej strony nie zaobserwowano widocznych zmian w podwzgórzu, w tym dla D2R (ryc. (Rys. 1g – m).1g-m). Warto zauważyć, że poziomy białka D2R i TH w podwzgórzu były znacznie niższe niż w prążkowiu (ryc. (Rys. 1l, 1l, m), prawdopodobnie odzwierciedlając względne znaczenie sygnalizacji receptora dopaminy w systemie nagrody mózgu w porównaniu z podwzgórzem.
Aby zbadać, czy metylacja DNA w regionie promotora D2R zmieni preferencje dotyczące tłuszczu w diecie, przeanalizowano zachowania żywieniowe myszy traktowanych 5-aza-dC. Zgodnie z oczekiwaniami, 5-aza-dC znacznie zwiększyło poziomy mRNA i białka dla D2R w prążkowiu myszy karmionych HFD (ryc. (Rys. 1b, 1b, k, l). Z drugiej strony nie było wpływu na poziomy Drd1, Th i Slc6a3 (kodowanie DAT) w prążkowiu lub na poziomach Drd2, Drd1, Cz i Slc6a3 w podwzgórzu (ryc. (Ryc. 1c – e, 1c – e, g – m). Podczas gdy myszy traktowane nośnikiem preferowały HFD, preferencje dla HFD były znacznie zmniejszone u myszy traktowanych 5-aza-dC (88% wartości dla myszy traktowanych nośnikiem) (ryc. (Rys.1n).1N). W konsekwencji leczenie 5-aza-dC zmniejszyło przyrost masy ciała (ryc. (Rys.11o).
γ-oryzanol zmniejsza poziomy DNMT w prążkowiu myszy karmionych HFD
Jak już informowaliśmy [14], doustne podawanie γ-oryzanolu samcom myszy przez zgłębnik znacznie osłabiło preferencję dla HFD (93% wartości dla myszy traktowanych nośnikiem) (ryc. (Rys.2a),2a), powodując widoczne osłabienie przyrostu masy ciała (ryc. (Rys.2b).2B). Dlatego zbadaliśmy potencjalny wpływ γ-oryzanolu na modulację epigenetyczną D2R w prążkowiu.
U ssaków istnieją trzy główne DNMT — DNMT1, 3a i 3b. Funkcje DNMT1 utrzymują metylację DNA, podczas gdy DNMT3a i 3b odgrywają rolę w ułatwianiu metylacji DNA de novo [21]. Aby zbadać potencjalny wpływ γ-oryzanolu na DNMT in vivo, oceniliśmy poziomy DNMT w mózgach myszy karmionych HFD. Chociaż HFD per se nie miał wpływu na poziomy mRNA i białka DNMT ani w prążkowiu, ani w podwzgórzu, suplementacja γ-oryzanolem znacznie zmniejszyła poziomy DNMT w prążkowiu, ale nie w podwzgórzu (ryc. (Ryc. 2c – e, 2c-e, g-i, k-n). Dane te wskazują na możliwość, że γ-oryzanol może regulować poziomy DNMT w sposób specyficzny dla prążkowia. W podobny sposób 5-aza-dC znacznie obniżył poziomy mRNA DNMT3a i 3b preferencyjnie w prążkowiu (ESM Ryc. 1ogłoszenie).
Na podstawie wcześniejszych badań wykazujących, że poziom mRNA DNMT1 był pozytywnie regulowany, przynajmniej częściowo, przez jądrowy receptor ERRγ [22] zbadaliśmy potencjalny wpływ γ-oryzanolu na aktywność ERRγ. W komórkach ssaków innych niż człowiek konstytutywnie wykazujących ekspresję aktywnego ERRγ, 4-hydroksytamoksyfen, silny odwrotny agonista ERRγ, znacznie zmniejszał aktywność ERRγ. Warto zauważyć, że γ-oryzanol częściowo zmniejszył aktywność ERRγ (około 40% redukcja wartości wrodzonej) (ryc. (Rys.3a).3A). Co ważne, ERRγ był silnie wyrażany w prążkowiu, ale nie w podwzgórzu (ryc. (Rys. 3b – d).3b-d). W przeciwieństwie do sytuacji w prążkowiu, γ-oryzanol znacząco zwiększał poziomy białka DNMT1 tylko w podwzgórzu (ryc. (Rys. 2k, 2k, l). Wyniki te można przynajmniej częściowo wyjaśnić naszym odkryciem, że STAT3α, pozytywny regulator poziomu DNMT1 [23], był obficie wyrażany w podwzgórzu, ale nie w prążkowiu (ryc. (Rys.33np).
Aby dokładniej ocenić wpływ γ-oryzanolu na aktywność DNMT in vivo, oceniano powstawanie SAH, produktu ubocznego metylacji DNA, a także silnego inhibitora DNMT, u myszy leczonych γ-oryzanolem karmionych HFD. Nie było znaczących zmian w tworzeniu SAH ani w prążkowiu, ani w podwzgórzu między myszami karmionymi HFD i karmionymi karmą (ryc. (Rys. 2f, 2f, j). Zauważalnie, γ-oryzanol znacznie zmniejszył tworzenie SAH w prążkowiu (ryc. (Rys. 2f) 2f), ale nie w podwzgórzu (ryc. (Rys.2j), 2j), co sugeruje, że γ-oryzanol może tłumić aktywność DNMT w sposób specyficzny dla prążkowia u myszy karmionych HFD.
Analizy enzymatyczne właściwości hamujących γ-oryzanolu dla DNMT in vitro
Następnie oceniliśmy wpływ γ-oryzanolu na aktywność DNMT in vitro. Oceniono siłę hamowania γ-oryzanolu, kwasu ferulowego, 5-aza-dC, haloperidolu (reprezentatywnego antagonisty D2R), chinpirolu (reprezentatywnego agonisty D2R) i SAH wobec DNMT. Jako kontrola pozytywna, SAH silnie osłabiał aktywność DNMT w sposób zależny od dawki (ryc. (Rys. 4a – f).4a–f). Zgodnie z oczekiwaniami haloperidol i chinpirol nie wykazywały wpływu na aktywność DNMT (ESM Ryc. 2). Zauważalnie, γ-oryzanol istotnie hamował aktywność DNMT1 (IC50 = 3.2 μmol/l), 3a (IC50 = 22.3 μmol/l) i 3b (maksymalne hamowanie 57%) (ryc. (Rys. 4d – f).4d-f). Natomiast działanie hamujące kwasu ferulowego, metabolitu γ-oryzanolu, było znacznie niższe niż γ-oryzanolu (ryc. (Rys.44d-f).
Dalej badaliśmy właściwości hamujące γ-oryzanolu na DNMT. Tworzenie SAH mierzono w celu oceny działania hamującego γ-oryzanolu na DNMT in vitro. Dane dotyczące tworzenia SAH podczas metylacji DNA za pośrednictwem DNMT wskazują na nasycający się wzór kinetyki Michaelisa-Mentena zarówno dla obecności, jak i nieobecności γ-oryzanolu (ryc. (Rys. 4g–i).4żołnierz amerykański). W metylacji DNA za pośrednictwem DNMT1 analiza Eadie-Hofstee wykazała, że γ-oryzanol nie wykazywał wpływu na V max tworzenia SAH (nośnik, 597 pmol/min; γ-oryzanol 2 μmol/l, 619 pmol/min; γ-oryzanol 20 μmol/l, 608 pmol/min), podczas gdy γ-oryzanol najwyraźniej zwiększał K m (nośnik, 0.47 μg/ml; γ-oryzanol 2 μmol/l, 0.67 μg/ml; γ-oryzanol 20 μmol/l, 0.89 μg/ml) (ryc. (Rys.4j).4J). Wyniki te sugerują, że γ-oryzanol hamuje DNMT1 przynajmniej częściowo w sposób konkurencyjny. Z drugiej strony, dla metylacji DNA za pośrednictwem DNMT3a i 3b, γ-oryzanol zmniejszał V max powstawania SAH (DNMT3a: nośnik, 85.3 pmol/min; γ-oryzanol 2 μmol/l, 63.1 pmol/min; γ-oryzanol 20 μmol/l, 42.5 pmol/min; DNMT3b: nośnik, 42.3 pmol/min; γ -oryzanol 2 μmol/l; 28.0 pmol/min, γ-oryzanol 20 μmol/l, 15.0 pmol/min) i podobnie K m dla tej reakcji (DNMT3a: nośnik, 0.0086 μg/ml; γ-oryzanol 2 μmol/l, 0.0080 μg/ml; γ-oryzanol 20 μmol/l, 0.0058 μg/ml; DNMT3b: nośnik, 0.0122 μg/ml; γ- oryzanol 2 μmol/l, 0.0097 μg/ml; γ-oryzanol 20 μmol/l, 0.0060 μg/ml) (ryc. (Rys. 4k, 4k, l). Wyniki te sugerują, że γ-oryzanol hamuje DNMT3a i 3b przynajmniej częściowo w sposób niekonkurencyjny.
γ-oryzanol zwiększa poziomy D2R w prążkowiu myszy karmionych HFD
Następnie przetestowaliśmy możliwość, że γ-oryzanol zwiększy zawartość prążkowia D2R poprzez hamowanie DNMT. U myszy karmionych HFD doustne podawanie γ-oryzanolu znacznie zmniejszyło metylację DNA prążkowia w regionie promotora D2R (ryc. (Rys.5a),5a), podczas gdy nie zrobił tego w podwzgórzu (ryc. (Rys.5f).5F). Zgodnie z tymi ustaleniami poziomy mRNA i białka D2R były wzajemnie zwiększone (ryc. (Rys. 5b, 5b, g, k, l). Podobnie jak dane dotyczące leczenia 5-aza-dC (ryc. (Rys.1),1), nie było widocznego wpływu na poziomy RNA i białek Drd1, Th i Slc6a3 (DAT) w prążkowiu i brak wpływu na poziomy Drd1, Th i Slc6a3 w podwzgórzu (ryc. (Ryc. 5c – e, 5c – e, h – k, m).
Wcześniejsze badania wykazały, że poziomy D2R i DNMT1 są regulowane przez stres ER i zapalenie przynajmniej częściowo przez NF-κB [17, 24, 25]. Dlatego zbadaliśmy poziomy genów związanych ze stresem ER i genami związanymi ze stanem zapalnym. Jak wykazano wcześniej [26], HFD zwiększa ekspresję genów kodujących TNF-α (Tnfa), białko chemotaktyczne monocytów – 1 (MCP-1) (Ccl2), białko homologiczne C/EBP (Posiekać), DnaJ 4 zlokalizowany w ER (ERdj4) (Dnajb9) i splicingowa forma białka wiążącego X-box 1 (Xbp1s) w podwzgórzu, ale nie w prążkowiu (ryc. (Rys.6).6). Warto zauważyć, że suplementacja HFD γ-oryzanolem znacznie zmniejszyła zwiększoną ekspresję Ccl2, Posiekać, Dnajb9 i Xbp1s wyłącznie w podwzgórzu, ale nie w prążkowiu (ryc. (Rys.66).
Dyskusja
Głównym odkryciem w niniejszym badaniu jest to, że γ-oryzanol działa jako silny inhibitor DNMT w prążkowiu myszy, osłabiając w ten sposób, przynajmniej częściowo, preferencję dla HFD poprzez epigenetyczną modulację prążkowia D2R. W prążkowiu myszy karmionych HFD poziomy D2R były znacznie obniżone, podczas gdy poziomy D1R, TH i DAT nie uległy zmianie (ryc. (Rys. 1b – e, 1b – e, k – m). Dane te są zgodne z poglądem, że rozregulowanie prążkowia D2R odgrywa kluczową rolę w postrzeganiu nagrody pokarmowej na HFD, prowadząc do hedonicznej nadmiernej konsumpcji HFD u otyłych zwierząt [3]. W niniejszym badaniu leczenie myszy karmionych HFD 5-aza-dC znacznie zwiększyło poziomy prążkowia D2R (ryc. (Rys. 1b, 1b, k, l) prawdopodobnie poprzez zmniejszenie poziomu metylacji DNA w regionie promotora D2R (ryc. (Rys.1a),1a), aw konsekwencji osłabił preferencję dla tłuszczu w diecie (ryc. (Rys.1n).1N). To odkrycie potwierdza również krytyczną rolę prążkowia D2R w postrzeganiu nagrody za jedzenie na HFD.
Nasz test in vitro wykazał, że aktywność hamująca γ-oryzanolu przeciwko DNMT była najwyraźniej silniejsza niż aktywność jego metabolitu, kwasu ferulowego (ryc. (Rys. 4d – f), 4d – f), co sugeruje znaczenie pełnej struktury γ-oryzanolu dla jego działania hamującego na DNMT. U myszy karmionych HFD nasze badania sugerują, że po podaniu doustnym γ-oryzanol dociera do mózgu jako kompletna struktura i zmniejsza poziomy i aktywność DNMT preferencyjnie w prążkowiu, co w konsekwencji zmniejsza metylację DNA w regionie promotora D2R w prążkowiu. Ponadto nasze badania in vitro wykazały, że γ-oryzanol działa jako częściowy antagonista wobec ERRγ, który przede wszystkim służy jako pozytywny regulator produkcji DNMT1 [22], aw konsekwencji zmniejszył aktywność DNMT1 (ryc. (Rys.3a).3A). Warto zauważyć, że ERRγ był silnie wyrażany w prążkowiu, ale nie w podwzgórzu u myszy (ryc. (Rys.3b).3B). Dane te sugerują, że γ-oryzanol może potencjalnie obniżać poziom mRNA DNMT1, przynajmniej częściowo, poprzez hamowanie ERRγ. W przeciwieństwie do prążkowia, γ-oryzanol nie wykazywał wpływu na poziom D2R w podwzgórzu myszy karmionych HFD (ryc. (Rys. 5g, 5g, k, l).
Z drugiej strony wykazaliśmy, że γ-oryzanol znacząco zwiększał poziomy DNMT1 w podwzgórzu, ale nie w prążkowiu (ryc. (Rys. 2k, 2k, l). Wykazano, że STAT3 zwiększa zawartość DNMT1 w złośliwych komórkach chłoniaka T [23]. Warto zauważyć, że wcześniej wykazaliśmy, że γ-oryzanol znacząco zwiększa indukowaną leptyną fosforylację STAT3 w podwzgórzu myszy karmionych HFD [14]. Należy również zauważyć, że STAT3α był zasadniczo wyrażany w podwzgórzu, ale nie w prążkowiu u myszy (ryc. (Rys. 3e – g).3np). Dane te kuszą nas do spekulacji, że widoczną różnicę w działaniu γ-oryzanolu na poziomy DNMT1 między podwzgórzem a prążkowiem można przynajmniej częściowo przypisać specyficznej dla regionu zawartości STAT3α i ERRγ w mózgu myszy ( Figa. (Rys. 3b – g).3b–g). Łącznie wydaje się, że istnieje wzajemny wzór ekspresji ERRγ i STAT3α między prążkowiem a podwzgórzem u myszy. Na podstawie naszych wyników uzasadnione jest zatem spekulowanie, że w prążkowiu, gdzie produkcja ERRγ jest obfita, γ-oryzanol może preferencyjnie obniżać poziom mRNA i aktywność enzymatyczną DNMT1 jako negatywnego regulatora ERRγ. Natomiast w podwzgórzu, gdzie dominuje produkcja STAT3α, γ-oryzanol może preferencyjnie zwiększać poziom DNMT1.
Niedawne badanie wykazało, że osłabienie sygnalizacji D2R prążkowia wywołane przez HFD rozregulowuje zachowanie żywieniowe [3], co sugeruje potencjalne znaczenie hamowania DNMT prążkowia w leczeniu otyłości. Z drugiej strony, poprzednie badanie wykazało możliwość, że stan metylacji DNA genu receptora melanokortyny 4, wyrażanego w określonych jądrach podwzgórza, może modulować międzypokoleniowe formy otyłości u żółtych myszy zdolnych do agouti.27]. Chociaż dalsze badania są uzasadnione w celu wyjaśnienia podstawowych mechanizmów, badania te sugerują znaczenie metylacji DNA specyficznej dla tkanki, genu i sekwencji w patofizjologii otyłości wywołanej HFD.
Niedawno donieśliśmy, że HFD zwiększa poziom D2R w wysepkach trzustkowych myszy [17, 24]. Jest prawdopodobne, że w takiej augmentacji przynajmniej częściowo pośredniczy stres ER i stan zapalny za pośrednictwem NF-κB, ponieważ w regionie promotorowym D2R znajduje się kilka elementów reagujących na NF-κB.17, 24]. Ponadto ostatnie badanie wykazało, że TNF-α i IL-1β zwiększają poziom i aktywność DNMT1 w tkance tłuszczowej myszy karmionych HFD.25]. Co ważne, niniejsze badanie wykazało, że HFD indukował stres i zapalenie ER preferencyjnie w podwzgórzu, ale nie w prążkowiu (ryc. (Rys.6).6). Dogłębne mechanizmy metylacji i demetylacji DNA specyficznej dla tkanki, regionu i miejsca w naszym paradygmacie eksperymentalnym muszą poczekać na dalsze badania.
Wraz z naszym poprzednim raportem pokazującym, że γ-oryzanol osłabia preferencję dla HFD poprzez podwzgórzową regulację stresu ER u myszy [14], γ-oryzanol ma również wyjątkową właściwość łagodzenia zarówno hedonicznej, jak i metabolicznej dysregulacji zachowań żywieniowych. Ponieważ wiadomo, że niektóre opracowane leki przeciw otyłości powodują krytyczne skutki uboczne [8] oczekuje się, że naturalne podejście do systemu nagradzania mózgu oparte na żywności będzie bezpiecznie leczyć zespół otyłości i cukrzycy [16]. W tym paradygmacie γ-oryzanol jest obiecującym kandydatem do walki z otyłością z wyraźną właściwością bycia modulatorem epigenetycznym.
Podziękowania
Jesteśmy wdzięczni S. Okamoto (University of the Ryukyus, Japonia) za przejrzenie manuskryptu. Dziękujemy M. Hirata, H. Kaneshiro, I. Asato i C. Noguchi (University of the Ryukyus, Japonia) za pomoc sekretarską.
Skróty
| 5-aza-dC | 5-aza-2′-deoksycytydyna |
| D1R | Receptor dopaminy D1 |
| D2R | Receptor dopaminy D2 |
| DAT | Transporter dopaminy |
| DNMT | Metylotransferaza DNA |
| ER | Retikulum endoplazmatyczne |
| ERR | Receptor związany z estrogenem |
| HFD | Wysoko-tłuszczowa dieta |
| SAH | S-Adenozylo-XNUMX-homocysteina |
| SAM | S-Adenozylometionina |
| STAT3α | Przetwornik sygnału i aktywator transkrypcji 3α |
| TH | Hydroksylaza tyrozynowa |
Uwagi
Dostępność danych
Zbiory danych wygenerowane i/lub przeanalizowane podczas bieżącego badania są dostępne u odpowiedniego autora na uzasadnione żądanie.
Finansowanie
Ta praca była częściowo wspierana przez Grants-in-Aid od Japan Society for the Promotion of Science (JSPS; KAKENHI Grant Numbers 15K19520 and 24591338), the Council for Science, Technology and Innovation (CSTI), Międzyresortowy Strategiczny Program Promocji Innowacji (SIP) „Technologie tworzenia nowej generacji rolnictwa, leśnictwa i rybołówstwa”, Fundacja Lotte, Japońska Fundacja Enzymologii Stosowanej, Organizacja Rozwoju Nowej Energii i Technologii Przemysłowych (NEDO), Projekt Tworzenia Sieci Nauk Przyrodniczych (Dziedzina Farmaceutyczna ) (Prefektura Okinawa, Japonia) oraz Projekt Promocji Klastra Medycznego Prefektury Okinawa, Japonia, wraz z grantem Prefektury Okinawa na promocję zaawansowanej medycyny (Prefektura Okinawa, Japonia).
Dwoistość zainteresowania
Autorzy oświadczają, że z tym manuskryptem nie wiąże się dwoistość interesów.
Deklaracja wkładu
CK i HM zaprojektowali badania. CK i TK przeprowadzili eksperymenty i przeanalizowali dane. TK, CS-O, CT, MT, MM i KA przyczynili się do interpretacji danych. CK i HM napisali rękopis. Wszyscy autorzy przyczynili się do interpretacji danych. Wszyscy autorzy włączyli się w rewizję manuskryptu i zatwierdzili jego ostateczną wersję. HM jest gwarantem tej pracy, miał pełny dostęp do wszystkich danych i bierze pełną odpowiedzialność za integralność danych i dokładność analizy danych.
Przypisy
Elektroniczny materiał uzupełniający
Wersja online tego artykułu (doi:10.1007/s00125-017-4305-4) zawiera recenzowane, ale nieedytowane materiały dodatkowe, które są dostępne dla autoryzowanych użytkowników.
Referencje
;