Wpływ brunatnego γ-oryzanolu na epigenetyczną modulację receptorów D2 dopaminy w prążkowiu mózgu w otyłości wywołanej dietą wysokotłuszczową u myszy (2017)

. 2017; 60 (8): 1502 – 1511.

Opublikowano online 2017 May 20. doi:  10.1007/s00125-017-4305-4

PMCID: PMC5491592

Abstrakcyjny

Cele / hipoteza

Przejadanie się tłuszczów dietetycznych powoduje otyłość u ludzi i gryzoni. Ostatnie badania na ludziach i gryzoniach wykazały, że uzależnienie od tłuszczów ma wspólny mechanizm uzależnienia od alkoholu, nikotyny i narkotyków pod względem dysfunkcji mózgowych systemów nagradzania. Podkreślono, że dieta wysokotłuszczowa (HFD) osłabia sygnalizację receptora dopaminowego D2 (D2R) w prążkowiu, kluczowym regulatorze systemu nagradzania mózgu, co prowadzi do przejadania się hedonicznego. Wcześniej informowaliśmy, że bioaktywny składnik γ-oryzanol specyficzny dla brązowego ryżu łagodzi preferencję dla HFD poprzez kontrolę podwzgórza. W związku z tym zbadaliśmy możliwość, że γ-oryzanol moduluje funkcjonowanie mózgowego systemu nagrody u myszy.

Metody

Samce myszy C57BL / 6J karmionych HFD doustnie traktowano γ-oryzanolem i oceniano poziomy prążkowia cząsteczek zaangażowanych w sygnalizację D2R. Zbadano wpływ γ-oryzanolu na metylację DNA promotora D2R i późniejsze zmiany preferencji tłuszczu pokarmowego. Ponadto zbadano wpływ 5-aza-2′-deoksycytydyny, silnego inhibitora metylotransferaz DNA (DNMT), na preferencje pokarmowe, sygnalizację D2R i poziomy DNMT w prążkowiu. Hamujące działanie γ-oryzanolu na aktywność DNMT oceniano enzymatycznie in vitro.

wyniki

W prążkowiu od myszy karmionych HFD wytwarzanie D2R było zmniejszone przez wzrost metylacji DNA regionu promotora D2R. Doustne podawanie γ-oryzanolu zmniejszało ekspresję i aktywność DNMT, przywracając w ten sposób poziom D2R w prążkowiu. Farmakologiczne hamowanie DNMT przez 5-aza-2′-deoksycytydynę również poprawiło preferencje dla tłuszczu pokarmowego. Zgodnie z tymi odkryciami enzymatyczne testy in vitro wykazały, że γ-oryzanol hamował aktywność DNMT.

Wnioski / interpretacja

Wykazaliśmy, że γ-oryzanol łagodzi indukowaną przez HFD hipermetylację DNA regionu promotorowego D2R w prążkowiu myszy. Nasz eksperymentalny paradygmat podkreśla γ-oryzanol jako obiecującą substancję przeciw otyłości o wyraźnej właściwości bycia nowym modulatorem epigenetycznym.

Elektroniczny materiał uzupełniający

Wersja online tego artykułu (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) zawiera recenzowany, ale nieedytowany materiał uzupełniający, który jest dostępny dla autoryzowanych użytkowników.

Słowa kluczowe: Metylacja DNA, dopamina, epigenetyka, zachowanie żywieniowe, odżywianie, otyłość, nagroda, prążkowie, cukrzyca typu 2

Wprowadzenie

Przejadanie się u osób otyłych ma przynajmniej częściowo wspólne mechanizmy uzależnienia od alkoholu, nikotyny i narkotyków []. Oprócz podwzgórzowej i hormonalnej regulacji apetytu, system nagradzania mózgu, w szczególności sygnalizacja receptora dopaminy, jest ściśle związany z uzależniającym lub hedonicznym zachowaniem żywieniowym []. Poprzednie badanie na szczurach wykazało, że knockdown receptora dopaminy D2 w prążkowiu (D2R) przez pośredniczące w lentiwirusie krótkie interferujące RNA o szybkim spinie szybko wywołało podobne do uzależnienia niedobory nagrody i przymusowe poszukiwanie pożywienia []. Ze względu na zmniejszoną gęstość D2R, prążkowie grzbietowe jest mniej wrażliwe na nagrodę pokarmową w porównaniu z chudymi grupami kontrolnymi u otyłych ludzi i gryzoni [-]. Zgodnie z tym pojęciem TaqAllele IA ANKK1 locus genu (kodujący DRD2 / powtórzenie ankyryny i domena kinazy zawierająca 1), który zmniejsza wytwarzanie prążkowia D2R, jest związany z fenotypem otyłości u ludzi [], podczas gdy skutki utraty wagi po zabiegu bariatrycznym są związane ze zwiększoną gęstością prążkowia D2R []. Dane te silnie sugerują znaczenie prążkowia D2R jako nowego celu terapeutycznego w leczeniu otyłości. Jednak niektóre opracowane leki, które działały na system nagradzania mózgu, spowodowały znaczące działania niepożądane, w tym poważne problemy psychiczne, co doprowadziło do ich wycofania z klinik [].

Modyfikacje epigenetyczne mają kluczowe znaczenie nie tylko dla rozwoju i różnicowania, ale także dlatego, że powstają w wyniku zmian środowiskowych, w tym w diecie i stylu życia []. Metylacja DNA jest głównym epigenetycznym zdarzeniem dla stabilności ekspresji genów []. U szczurów narażenie matki na dietę wysokotłuszczową (HFD) międzypokoleniowo zmienia metylację DNA w centralnym systemie nagrody u potomstwa, prowadząc do nadmiernego zużycia HFD przez młode []. W szczególności metylotransferazy DNA (DNMT) odgrywają kluczową rolę w regulacji zachowania żywieniowego i aktywności fizycznej [, ], sugerując, że DNMT mogą stanowić obiecujące cele terapeutyczne w leczeniu zespołu otyłości i cukrzycy. Co ważne, niektóre naturalne substancje pochodzące z żywności, w tym kwas kawowy i epigalokatechina, działają jako inhibitory DNMT [, ].

Niedawno wykazaliśmy, że bioaktywny, specyficzny dla brązowego ryżu składnik γ-oryzanol, mieszanina estru kwasu ferulowego i kilku fitosteroli, łagodzi preferencje dla tłuszczu pokarmowego poprzez zmniejszenie stresu retikulum endoplazmatycznego (ER) w podwzgórzu []. U myszy i królików doustnie podawany γ-oryzanol był szybko wchłaniany z jelita i rozprowadzany głównie do mózgu [, ]. Biorąc te ustalenia razem, naturalne produkty żywnościowe działające na centralny układ nerwowy mogą być alternatywą dla bezpiecznego łagodzenia zaburzeń zachowania żywieniowego w otyłości. W tym kontekście przetestowaliśmy hipotezę, że γ-oryzanol zmieniłby stan metylacji DNA w systemie nagradzania mózgu, powodując osłabienie preferencji dla HFD u myszy.

Metody

Zwierzęta

Siedmiotygodniowe samce myszy C57BL / 6J uzyskane z Charles River Laboratories Japan (Kanagawa, Japonia) trzymano (3-4 na klatkę) w warunkach wolnych od specyficznych patogenów w 24 ° C w świetle 12 h / 12 h / ciemny cykl. Po tygodniu aklimatyzacji, myszy w wieku 8 tygodni dopasowano pod względem wagi i podzielono na dwie lub trzy grupy, aby poddać je każdemu doświadczeniu. Myszy miały swobodny dostęp do pożywienia i wody. Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komisję Etyczną ds. Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu Ryukyus (nr 5352, 5718 i 5943).

Podawanie γ-oryzanolu i 5-aza-2′-deoksycytydyny

Aby ocenić preferencje dla HFD, γ-oryzanol (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japonia) podawano myszom 8-tygodniowym przez zgłębnik podczas testu wyboru żywności, jak opisano wcześniej [, ]. Do innych eksperymentów wytworzono granulki HFD (D12079B; Research Diets, New Brunswick, NJ, USA) zawierające 0.4% γ-oryzanolu. Składniki diety przedstawiono w tabeli elektronicznego materiału uzupełniającego (ESM) 1. Po 12 tygodniach karmienia pobrano tkankę z prążkowia i podwzgórza. Dzienne spożycie γ-oryzanolu, oszacowane na podstawie średniego spożycia pokarmu przez myszy, wynosiło około 320 μg / g masy ciała. Dawki γ-oryzanolu określono zgodnie z wcześniejszym opisem []. 5-aza-2′-deoksycytydynę (5-aza-dC; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) wstrzykiwano dootrzewnowo (0.25 μg / g masy ciała) trzy razy w tygodniu przez 12 tygodni [].

Ocena preferencji dla tłuszczu dietetycznego

Aby ocenić preferencje dotyczące tłuszczu dietetycznego, testy żywności zapewniły wybór między chow a HFD (D12450B i D12451; Diety badawcze), jak opisano wcześniej []. Składniki diety pokazano w tabeli ESM 1. W skrócie, myszy miały swobodny dostęp do karmy i HFD. Spożycie karmy i HFD mierzono co tydzień i analizowano pod kątem zmian preferencji dla tłuszczu w diecie. Preferencję HFD obliczono według wzoru: Preferencja HFD = [(spożycie HFD / całkowite spożycie pokarmu) × 100].

Sekwencjonowanie wodorosiarczynem w celu metylacji DNA

DNA oczyszczono przy użyciu zestawu DNeasy Blood & Tissue (QIAGEN, Tokio, Japonia). Roztwór DNA zmieszano ze świeżo przygotowanym 3 mol / l NaOH, inkubowano w 37 ° C przez 15 min i dodano do 5.3 mol / l mocznika, 1.7 mol / l wodorosiarczynu sodu i 4.9 mmol / l hydrochinonu. Roztwór poddano 15 cyklom denaturacji w 95 ° C przez 30 si inkubacji w 50 ° C przez 15 min []. DNA potraktowany wodorosiarczynem oczyszczono za pomocą zestawu do oczyszczania MinElute PCR (QIAGEN) i amplifikowano za pomocą PCR przy użyciu zestawu KAPA HiFi HotStart Uracil + ReadyMix PCR (KAPA Biosystems, Woburn, MA, USA) i starterów wokół miejsca CpG regionu promotora D2R . Sekwencje starterów były następujące: starter do przodu, 5′-GTAAGAATTGGTTGGTTGGAGTTAAAA-3 ′; primer odwrotny, 5′-ACCCTACCCTCTAAAACCACAACTAC-3 ′. Następnie sekwencje adaptorów dodano i oczyszczono przy użyciu Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, Kalifornia, USA). Próbki następnie połączono i załadowano do GS Junior (Roche Diagnostics, Tokio, Japonia) w celu sekwencjonowania zgodnie z protokołem producenta. Poziom metylacji wyrażono jako procent metylowanych cytozyn we wszystkich resztach cytozyn.

Test aktywności DNMT

Test aktywności enzymatycznej DNMT przeprowadzono przy użyciu zestawu EpiQuik DNA Methyltransferase Assay Kit Test (Epigentek Group, Brooklyn, NY, USA) i EPIgeneous Methyltransferase Assay Kit (Cisbio Japan, Chiba, Japan) zgodnie z protokołami producenta.

Aby ocenić działanie hamujące każdego związku na metylację DNA, powstanie S-adenozylo-l-homocysteinę (SAH) mierzono w obecności każdego związku (20 μmol / l do testów przesiewowych), S-adenozylometionina (SAM; 10 μmol / l) i substrat DNMT (4 ng / μl) w 37 ° C przez 90 min. Aby ocenić kinetykę Michaelisa – Mentena, DNMT1 (20 µmol / l) inkubowano z γ-oryzanolem, SAM (5 µmol / l) i wskazanym stężeniem poli dI-dC w 37 ° C przez 90 min. DNMT3a (100 μmol / l) i DNMT3b (100 μmol / l) inkubowano z γ-oryzanolem, SAM (5 μmol / l) i wskazanym stężeniem poli dG · dC w 37 ° C przez 120 min. Testy przeprowadzono czterokrotnie. Wyekstrahowane białko (0.75 mg / ml) inkubowano z SAM (5 μmol / l), poli dI-dC (5 μg / ml) i poli dG · dC (5 μg / ml) w 40 ° C przez 120 min, oraz Zmierzono tworzenie SAH.

Test aktywności receptora γ związany z estrogenem

Potencjalną aktywność antagonistyczną γ-oryzanolu wobec receptora związanego z estrogenem-γ (ERRγ) oceniano przy użyciu systemu oznaczania ludzkiego receptora estrogenowego receptora gamma (INDIGO Bioscience, State College, PA, USA) zgodnie z protokołem producenta. W skrócie, ssacze komórki reporterowe inne niż człowiek, wykazujące konstytutywną ekspresję aktywnego ERRγ, eksponowano na wskazane stężenia każdego związku przez 24 godziny w trzech powtórzeniach.

Western blotting

Zostało to wykonane zgodnie z wcześniejszym opisem [] z przeciwciałami przeciwko D2R (1: 500, królik), transporterowi dopaminy (DAT; 1: 500, królik), hydroksylazie tyrozynowej (TH; 1: 1000, królik) (AB5084P, AB1591P i AB152, Merck Millipore, Billerica, MA, USA), przetwornik sygnału i aktywator transkrypcji 3α (STAT3α; 1: 1000, królik), DNMT1 (1: 1000, królik), DNMT3a (1: 1000, królik) (nr 8768, 5032 i 3598; Cell Signaling Technology, Tokio, Japonia), DNMT3b (1 μg / ml, królik), ERRγ (1: 1000, królik) i β-aktyna (1: 10,000 16049, mysz) (ab128930, ab6276 i abXNUMX; Abcam, Cambridge, MA, USA).

Ilościowa PCR w czasie rzeczywistym

Ekspresję genów zbadano jak opisano wcześniej []. Poziomy mRNA zostały znormalizowane do Rn18s (18S rRNA). Zestawy starterów stosowane do ilościowych analiz PCR w czasie rzeczywistym podsumowano w tabeli ESM 2.

Analiza statystyczna

Dane wyrażono jako średnią ± SEM. W stosownych przypadkach zastosowano jednokierunkową ANOVA i ANOVA z powtarzanymi pomiarami, a następnie wielokrotne testy porównawcze (metoda Bonferroniego – Dunna). Studenta t test wykorzystano do analizy różnic między dwiema grupami. Różnice uznano za znaczące w p <0.05.

wyniki

Farmakologiczne hamowanie DNMT przez 5-aza-dC osłabiło preferencję dietetycznego tłuszczu u myszy

U myszy karmionych HFD metylacja DNA w regionie promotora D2R w prążkowiu była znacznie zwiększona w porównaniu z myszami karmionymi karmą dla chowów (ryc. (Ryc. 1a) .1za). Z drugiej strony, podwzgórze metylacja DNA w regionie promotora D2R była najwyraźniej wyższa niż w prążkowiu w diecie chow (p <0.01) (ryc. (Ryc. 1a, 1a, f) i nie został zmieniony przez HFD (ryc. (Rys. 1f) .1fa). U myszy karmionych HFD zwiększoną metylację DNA w regionie promotora D2R w prążkowiu normalizowano przez traktowanie 5-aza-dC, silnym inhibitorem DNMT (ryc. (Ryc. 1a) .1za). Natomiast metylacja DNA w regionie promotora D2R w podwzgórzu nie uległa istotnej zmianie w wyniku leczenia 5-aza-dC (ryc. (Rys. 1f) .1fa). W prążkowiu 20-tygodniowych samców myszy karmionych HFD przez 12 tygodni, poziomy mRNA i białka D2R były znacząco obniżone (ryc. (Ryc. 1b, 1b, k, l). Natomiast poziomy receptorów dopaminowych D1 (D1R, kodowane przez Drd1), które działają w sposób odwrotny do D2R na cyklazy adenylowej i wewnątrzkomórkowej sygnalizacji za pośrednictwem cAMP, pozostały niezmienione (ryc. (Ryc. 1c) .1do). Ponadto nie było zmian w poziomach innych cząsteczek związanych z sygnalizacją D2R, takich jak TH i DAT na poziomie mRNA i / lub białka (ryc. (Ryc. 1d, 1d, e, k, m). Z drugiej strony nie zaobserwowano widocznych zmian w podwzgórzu, w tym w D2R (ryc. (Ryc. 1g – m) .1g – m). Warto zauważyć, że poziomy białka D2R i TH w podwzgórzu były znacznie niższe niż w prążkowiu (ryc. (Ryc. 11, 1l, m), prawdopodobnie odzwierciedlając względne znaczenie sygnalizacji receptora dopaminy w układzie nagrody mózgu w porównaniu z podwzgórzem.

Rys. 1 

Hamowanie DNMT przez 5-aza-dC osłabia preferencję dla HFD poprzez zwiększenie D2R w prążkowiu myszy karmionych HFD. Poziom metylacji DNA w regionie promotora D2R w prążkowiu (n = 3) (a) i podwzgórze (n = 3) ...

Aby zbadać, czy metylacja DNA w regionie promotora D2R zmieni preferencję dla tłuszczu dietetycznego, przeanalizowano zachowanie żywieniowe myszy leczonych 5-aza-dC. Jak oczekiwano, 5-aza-dC znacząco zwiększył poziomy mRNA i białka dla D2R w prążkowiu myszy karmionych HFD (ryc. (Ryc. 1b, 1b, k, l). Z drugiej strony, nie było wpływu na poziomy Drd1, Th i Slc6a3 (kodujący DAT) w prążkowiu lub na poziomach Drd2, Drd1, Th i Slc6a3 w podwzgórzu (ryc. (Rys. 1c – e, 1c – e, g – m). Podczas gdy myszy traktowane nośnikiem preferowały HFD, preferencja dla HFD była znacznie zmniejszona u myszy leczonych 5-aza-dC (88% wartości dla myszy traktowanych nośnikiem) (Fig. (Rys. 1n) .1n). W konsekwencji leczenie 5-aza-dC zmniejszyło przyrost masy ciała (ryc. (Rys. 11o).

γ-oryzanol zmniejsza poziomy DNMT w prążkowiu myszy karmionych HFD

Jak wcześniej informowaliśmy [], doustne podawanie γ-oryzanolu samcom myszy przez zgłębnik znacznie osłabiło preferencję dla HFD (93% wartości dla myszy traktowanych podłożem) (Fig. (Rys. 2a), 2a), co powoduje widoczne osłabienie przyrostu masy ciała (ryc. (Rys. 2b) .2b). Dlatego zbadaliśmy potencjalny wpływ γ-oryzanolu na epigenetyczną modulację D2R w prążkowiu.

Rys. 2 

Hamujący wpływ γ-oryzanolu na DNMT u myszy karmionych HFD. Preferencje HFD (a) i masa ciała (b) u myszy leczonych oryzanolem γ podczas testów wyboru pokarmu chow vs HFD (n = 4 klatki; trzy myszy na klatkę). Poziomy mRNA dla ...

U ssaków istnieją trzy główne DNMT - DNMT1, 3a i 3b. Funkcje DNMT1 w celu utrzymania metylacji DNA, podczas gdy DNMT3a i 3b odgrywają rolę w ułatwianiu metylacji de novo DNA []. Aby zbadać potencjalny wpływ γ-oryzanolu na DNMT in vivo, oceniliśmy poziomy DNMT w mózgach myszy karmionych HFD. Chociaż HFD per se nie miało wpływu na poziomy mRNA i białka DNMT w prążkowiu lub podwzgórzu, suplementacja γ-oryzanolem znacząco zmniejszyła poziomy DNMT w prążkowiu, ale nie w podwzgórzu (ryc. (Rys. 2c – e, 2c – e, g – i, k – n). Dane te podnoszą możliwość, że γ-oryzanol może regulować poziomy DNMT w sposób specyficzny dla prążkowia. W podobny sposób 5-aza-dC znacząco zmniejszył poziomy mRNA DNMT3a i 3b preferencyjnie w prążkowiu (ESM Ryc. 1ogłoszenie).

Na podstawie poprzedniego badania wykazującego, że poziom mRNA DNMT1 był pozytywnie regulowany, przynajmniej częściowo, przez receptor jądrowy ERRγ [], zbadaliśmy potencjalny wpływ γ-oryzanolu na aktywność ERRγ. W komórkach ssaków innych niż człowiek konstytutywnie wyrażających aktywny ERRγ, 4-hydroksytamoksyfen, silny odwrotny agonista ERRγ, znacznie zmniejszał aktywność ERRγ. Warto zauważyć, że γ-oryzanol częściowo zmniejszył aktywność ERRγ (zmniejszenie wartości wrodzonej o około 40%) (ryc. (Ryc. 3a) .3za). Co ważne, ERRγ był silnie wyrażany w prążkowiu, ale nie w podwzgórzu (ryc. (Rys. 3b – d) .3b – d). W przeciwieństwie do sytuacji w prążkowiu, γ-oryzanol znacząco zwiększał poziomy DNMT1 białka tylko w podwzgórzu (ryc. (Rys. 2k, 2k, l). Wyniki te można wyjaśnić, przynajmniej częściowo, naszym odkryciem, że STAT3α, pozytywny regulator poziomu DNMT1 [], był obficie wyrażany w podwzgórzu, ale nie w prążkowiu (ryc. (Rys. 33na przykład).

Rys. 3 

Wpływ γ-oryzanolu na aktywność ERRγ i STAT3α. (a) Hamujący wpływ γ-oryzanolu na ERRγ in vitro. Krzywe dawka-odpowiedź aktywności ERRγ z γ-oryzanolem (czarne kółka), kwas ferulowy ...

W celu dalszej oceny wpływu γ-oryzanolu na aktywność DNMT in vivo, tworzenie SAH, produktu ubocznego metylacji DNA, a także silnego inhibitora DNMT, oceniano u myszy leczonych oryzanolem γ karmionych HFD. Nie stwierdzono istotnych zmian w tworzeniu SAH ani w prążkowiu, ani w podwzgórzu między myszami karmionymi HFD a karmionymi karmą dla kotów (ryc. (Rys. 2f, 2f, j). Zauważalnie, γ-oryzanol znacząco zmniejszał tworzenie SAH w prążkowiu (ryc. (Rys. 2f) 2f) ale nie w podwzgórzu (ryc. (Rys. 2j), 2j), sugerując, że γ-oryzanol może tłumić aktywność DNMT w sposób specyficzny dla prążkowia u myszy karmionych HFD.

Analizy enzymatyczne właściwości hamujących γ-oryzanolu dla DNMT in vitro

Następnie oceniliśmy wpływ γ-oryzanolu na aktywność DNMT in vitro. Oceniano siły hamowania γ-oryzanolu, kwasu ferulowego, 5-aza-dC, haloperidolu (reprezentatywny antagonista D2R), chinpirolu (reprezentatywny agonista D2R) i SAH przeciwko DNMT. Jako kontrola pozytywna SAH silnie osłabił aktywność DNMT w sposób zależny od dawki (ryc. (Rys. 4a – f) .4a – f). Zgodnie z oczekiwaniami haloperidol i chinpirol nie wykazały żadnego wpływu na aktywność DNMT (ESM Rys. 2). Zauważalnie γ-oryzanol znacząco hamował aktywność DNMT1 (IC50 = 3.2 μmol / l), 3a (IC50 = 22.3 μmol / l) i 3b (maksymalne hamowanie 57%) (ryc. (Ryc. 4d – f) .4d – f). Natomiast aktywność hamująca kwasu ferulowego, metabolitu γ-oryzanolu, była znacznie niższa niż aktywność γ-oryzanolu (ryc. (Rys. 44d – f).

Rys. 4 

Hamujący wpływ γ-oryzanolu na DNMT in vitro. Wysokoprzepustowe testy przesiewowe pod kątem potencjalnych inhibitorów DNMT1 (a), DNMT3a (b) i DNMT3b (c). Potencjały hamujące przeciwko DNMT dla γ-oryzanolu, kwasu ferulowego (metabolitu γ-oryzanolu), ...

Następnie zbadaliśmy właściwości hamujące γ-oryzanolu na DNMT. Powstawanie SAH zmierzono w celu oceny aktywności hamującej γ-oryzanolu na DNMT in vitro. Dane dotyczące tworzenia SAH podczas metylacji DNA za pośrednictwem DNMT wskazują na nasycalny wzór kinetyki Michaelisa – Mentena zarówno dla obecności, jak i braku γ-oryzanolu (ryc. (Ryc. 4g – i) .4żołnierz amerykański). W metylacji DNA za pośrednictwem DNMT1 analiza Eadie – Hofstee wykazała, że ​​γ-oryzanol nie wykazał wpływu na V max tworzenia SAH (nośnik, 597 pmol / min; γ-oryzanol 2 μmol / l, 619 pmol / min; γ-oryzanol 20 μmol / l, 608 pmol / min), podczas gdy γ-oryzanol wyraźnie zwiększał K m (nośnik, 0.47 μg / ml; γ-oryzanol 2 μmol / l, 0.67 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.89 μg / ml) (ryc. (Ryc. 4j) .4jot). Wyniki te sugerują, że γ-oryzanol hamuje DNMT1 przynajmniej częściowo w sposób konkurencyjny. Z drugiej strony, dla metylacji DNA za pośrednictwem DNMT3a- i 3b, γ-oryzanol zmniejszał V max tworzenie SAH (DNMT3a: nośnik, 85.3 pmol / min; γ-oryzanol 2 μmol / l, 63.1 pmol / min; γ-oryzanol 20 μmol / l, 42.5 pmol / min; DNMT3b: nośnik, 42.3 pmol / min; γ -oryzanol 2 μmol / l; 28.0 pmol / min, γ-oryzanol 20 μmol / l, 15.0 pmol / min) i analogicznie K m dla tej reakcji (DNMT3a: nośnik, 0.0086 μg / ml; γ-oryzanol 2 μmol / l, 0.0080 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.0058 μg / ml; DNMT3b: nośnik, 0.0122 μg / ml; γ- oryzanol 2 μmol / l, 0.0097 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.0060 μg / ml) (ryc. (Rys. 4k, 4k, l). Wyniki te sugerują, że γ-oryzanol hamuje DNMT3a i 3b co najmniej częściowo w sposób niekonkurencyjny.

γ-oryzanol zwiększa poziomy D2R w prążkowiu myszy karmionych HFD

Następnie przetestowaliśmy możliwość, że γ-oryzanol zwiększy zawartość prążkowia D2R poprzez hamowanie DNMT. U myszy karmionych HFD doustne podawanie γ-oryzanolu znacznie zmniejszyło metylację prążkowia DNA w regionie promotora D2R (ryc. (Rys. 5a), 5a), podczas gdy nie zrobił tego w podwzgórzu (ryc. (Rys. 5f) .5fa). Zgodnie z tymi odkryciami poziomy mRNA i białka D2R wzrosły wzajemnie (ryc. (Ryc. 5b, 5b, g, k, l). Podobne do danych dotyczących leczenia 5-aza-dC (ryc. (Ryc. 1), 1), nie stwierdzono widocznego wpływu na poziom RNA i białka w Drd1, Th i Slc6a3 (DAT) w prążkowiu i bez wpływu na poziomy Drd1, Th i Slc6a3 w podwzgórzu (ryc. (Rys. 5c – e, 5c – e, h – k, m).

Rys. 5 

Hamowanie DNMT przez γ-oryzanol osłabia preferencję dla HFD poprzez zwiększenie D2R w prążkowiu myszy karmionych HFD. Poziom metylacji DNA regionu promotora D2R w prążkowiu (n = 3) (a) i podwzgórze ...

Poprzednie badania wykazały, że poziomy D2R i DNMT1 są regulowane przez stres ER i stan zapalny przynajmniej częściowo poprzez NF-κB [, , ]. Dlatego zbadaliśmy poziomy genów związanych ze stresem ER i stanów zapalnych. Jak wcześniej wykazano [], HFD zwiększyła ekspresję genów kodujących TNF-α (Tnfa), białko chemoatraktantu monocytów - 1 (MCP-1) (Ccl2), Białko homologiczne C / EBP (Posiekać), Zlokalizowane w ER DnaJ 4 (ERdj4) (Dnajb9) i splicowanej postaci białka wiążącego X-box 1 (Xbp1s) w podwzgórzu, ale nie w prążkowiu (ryc. (Ryc. 6) .6). W szczególności suplementacja HFD γ-oryzanolem znacznie zmniejszyła zwiększoną ekspresję Ccl2, Posiekać, Dnajb9 i Xbp1s wyłącznie w podwzgórzu, ale nie w prążkowiu (ryc. (Rys. 66).

Rys. 6 

Ekspresja genów prozapalnych i związanych ze stresem ER w prążkowiu i podwzgórzu. Poziomy mRNA dla Tnfa (a, f), Ccl2 (b, g), Posiekać (c, h), Dnajb9 (d, i) oraz aktywną splicowaną formę Xbp1 (Xbp1s) (e, j) w prążkowiu (n = 8) ...

Dyskusja

Głównym odkryciem w niniejszym badaniu jest to, że γ-oryzanol działa jako silny inhibitor DNMT w prążkowiu myszy, tym samym osłabiając, przynajmniej częściowo, preferencję dla HFD poprzez modulację epigenetyczną prążkowia D2R. W prążkowiu myszy karmionych HFD poziomy D2R były znacznie zmniejszone, podczas gdy poziomy D1R, TH i DAT nie uległy zmianie (ryc. (Ryc. 1b – e, 1b – e, k – m). Dane te są zgodne z poglądem, że rozregulowanie prążkowia D2R odgrywa kluczową rolę w postrzeganiu nagrody za jedzenie na HFD, co prowadzi do nadmiernej konsumpcji hedonicznej HFD u otyłych zwierząt []. W niniejszym badaniu leczenie myszy karmionych HFD 5-aza-dC znacznie zwiększyło poziom D2R w prążkowiu (ryc. (Ryc. 1b, 1b, k, l) ewentualnie przez obniżenie poziomu metylacji DNA w regionie promotora D2R (ryc. (Rys. 1a), 1a) iw konsekwencji osłabił preferencję dla tłuszczu dietetycznego (ryc. (Rys. 1n) .1n). To odkrycie potwierdza również kluczową rolę prążkowia D2R w postrzeganiu nagrody za jedzenie na HFD.

Nasz test in vitro wykazał, że hamująca aktywność γ-oryzanolu przeciwko DNMT była najwyraźniej silniejsza niż jego metabolitu kwas ferulowy (ryc. (Ryc. 4d – f), 4d – f), co sugeruje znaczenie pełnej struktury γ-oryzanolu dla jego hamowania działania na DNMT. U myszy karmionych HFD nasze badania sugerują, że po podaniu doustnym γ-oryzanol dociera do mózgu jako kompletna struktura i preferencyjnie zmniejsza poziomy i aktywność DNMT w prążkowiu, co w konsekwencji zmniejsza metylację DNA w regionie promotora D2R w prążkowiu. Ponadto nasze badania in vitro wykazały, że γ-oryzanol działa jako częściowy antagonista przeciw ERRγ, który przede wszystkim służy jako pozytywny regulator produkcji DNMT1 [], aw konsekwencji zmniejszyło aktywność DNMT1 (ryc. (Ryc. 3a) .3za). Warto zauważyć, że ERRγ był silnie wyrażany w prążkowiu, ale nie w podwzgórzu u myszy (ryc. (Rys. 3b) .3b). Dane te sugerują, że γ-oryzanol może potencjalnie obniżyć poziom mRNA DNMT1, przynajmniej częściowo, poprzez hamowanie ERRγ. W przeciwieństwie do prążkowia γ-oryzanol nie wykazywał wpływu na poziom D2R w podwzgórzu myszy karmionych HFD (ryc. (Ryc. 5g, 5g, k, l).

Z drugiej strony wykazaliśmy, że γ-oryzanol znacznie zwiększa poziomy DNMT1 w podwzgórzu, ale nie w prążkowiu (ryc. (Rys. 2k, 2k, l). Wykazano, że STAT3 zwiększa zawartość DNMT1 w złośliwych komórkach chłoniaka T []. W szczególności wcześniej wykazaliśmy, że γ-oryzanol znacznie zwiększa indukowaną leptyną fosforylację STAT3 w podwzgórzu myszy karmionych HFD []. Należy również zauważyć, że STAT3α był zasadniczo wyrażany w podwzgórzu, ale nie w prążkowiu u myszy (ryc. (Ryc. 3e – g) .3na przykład). Dane te kuszą nas do spekulacji, że pozorną różnicę w działaniu γ-oryzanolu na poziomy DNMT1 między podwzgórzem a prążkowiem można przynajmniej częściowo przypisać specyficznej dla regionu zawartości STAT3α i ERRγ w mózgu myszy ( Figa. (Ryc. 3b – g) .3b – g). Łącznie wydaje się, że u myszy występuje wzajemny wzór ekspresji ERRγ i STAT3α między prążkowiem a podwzgórzem. Na podstawie naszych wyników uzasadnione jest zatem spekulowanie, że w prążkowiu, gdzie produkcja ERRγ jest obfita, γ-oryzanol może preferencyjnie obniżać poziom mRNA i aktywność enzymatyczną DNMT1 jako negatywnego regulatora ERRγ. Natomiast w podwzgórzu, gdzie dominuje wytwarzanie STAT3α, γ-oryzanol może preferencyjnie zwiększać poziomy DNMT1.

Niedawne badanie wykazało, że tłumienie prążkowatej sygnalizacji D2R wywołane przez HFD zaburza zachowanie żywieniowe [], co sugeruje potencjalne znaczenie hamowania DNMT w prążkowiu w leczeniu otyłości. Z drugiej strony poprzednie badanie wykazało możliwość, że status metylacji DNA genu 4 receptora melanokortyny wyrażanego w specyficznych jądrach podwzgórza może modulować transgeneracyjne formy otyłości u zdolnych do życia żółtych myszy []. Chociaż uzasadnione są dalsze badania w celu wyjaśnienia podstawowych mechanizmów, badania te sugerują znaczenie metylacji DNA specyficznej dla tkanki, genu i sekwencji w patofizjologii otyłości wywołanej HFD.

Niedawno informowaliśmy, że HFD podniosło poziom D2R w wyspach trzustkowych myszy [, ]. Jest prawdopodobne, że w takim wzmocnieniu pośredniczy, przynajmniej częściowo, stres ER i zapalenie poprzez NF-κB, ponieważ w regionie promotora D2R znajduje się kilka elementów odpowiadających na NF-κB [, ]. Ponadto ostatnie badania wykazały, że TNF-α i IL-1β zwiększają poziom i aktywność DNMT1 w tkance tłuszczowej myszy karmionych HFD []. Co ważne, obecne badanie wykazało, że HFD preferencyjnie indukował stres ER i stan zapalny w podwzgórzu, ale nie w prążkowiu (ryc. (Ryc. 6) .6). Dogłębne mechanizmy specyficznej dla tkanki, regionu i miejsca metylacji i demetylacji DNA w naszym paradygmacie eksperymentalnym muszą czekać na dalsze badania.

Wraz z naszym poprzednim raportem wykazującym, że γ-oryzanol osłabia preferencję dla HFD poprzez podwzgórze regulującą stres ER u myszy [], γ-oryzanol reprezentuje również unikalną właściwość poprawy zarówno regulacji hedonicznej, jak i metabolicznej dysregulacji zachowań żywieniowych. Ponieważ wiadomo, że niektóre opracowane leki przeciw otyłości powodują krytyczne działania niepożądane [], naturalne podejście do systemu nagradzania mózgu oparte na jedzeniu powinno bezpiecznie leczyć zespół otyłości i cukrzycy []. W tym paradygmacie γ-oryzanol jest obiecującym kandydatem na otyłość z wyraźną właściwością bycia modulatorem epigenetycznym.

 

Elektroniczny materiał uzupełniający

 

ESM(256K, pdf) 

(PDF 256 kb)

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni S. Okamoto (University of the Ryukyus, Japonia) za przejrzenie manuskryptu. Dziękujemy M. Hiracie, H. Kaneshiro, I. Asato i C. Noguchi (University of the Ryukyus, Japonia) za pomoc sekretariatu.

Skróty

5-aza-dC5-aza-2′-deoksycytydyna
D1RReceptor dopaminy D1
D2RReceptor dopaminy D2
DATTransporter dopaminy
DNMTMetylotransferaza DNA
ERRetikulum endoplazmatyczne
ERRReceptor związany z estrogenem
HFDWysoko-tłuszczowa dieta
SAHS-Adenozylo-l-homocysteina
SAMS-Adenozylometionina
STAT3αPrzetwornik sygnału i aktywator transkrypcji 3α
THHydroksylaza tyrozynowa
 

Uwagi

Dostępność danych

Zestawy danych generowane i / lub analizowane podczas bieżącego badania są dostępne od odpowiedniego autora na uzasadnione prośby.

Finansowanie

Prace te były częściowo wspierane przez Grants-in-Aid z Japan Society for the Science of Promotion (JSPS; KAKENHI Grant Numbers 15K19520 and 24591338), Council for Science, Technology and Innovation (CSTI), Międzyresortowy Program Promocji Strategicznej Innowacji (SIP) „Technologie tworzenia rolnictwa nowej generacji, leśnictwa i rybołówstwa”, Lotte Foundation, Japan Foundation for Applied Enzymology, New Energy and Industrial Technology Development Organisation (NEDO), Project for Formation of Life Science Network (Pharmaceutical Field ) (Prefektura Okinawa, Japonia) oraz Projekt promocji klastrów medycznych w Prefekturze Okinawa, Japonia, wraz z grantem z Prefektury Okinawa na promocję medycyny zaawansowanej (Prefektura Okinawa, Japonia).

Dwoistość zainteresowania

Autorzy deklarują, że z tym manuskryptem nie ma dwoistości interesów.

Oświadczenie o wkładzie

CK i HM zaprojektowali badania. CK i TK przeprowadzili eksperymenty i przeanalizowali dane. TK, CS-O, CT, MT, MM i KA przyczyniły się do interpretacji danych. CK i HM napisali manuskrypt. Wszyscy autorzy przyczynili się do interpretacji danych. Wszyscy autorzy przyłączyli się do przeglądu manuskryptu i zatwierdzili jego ostateczną wersję. HM jest gwarantem tej pracy, miał pełny dostęp do wszystkich danych i bierze pełną odpowiedzialność za integralność danych i dokładność analizy danych.

Przypisy

 

Elektroniczny materiał uzupełniający

Wersja online tego artykułu (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) zawiera recenzowany, ale nieedytowany materiał uzupełniający, który jest dostępny dla autoryzowanych użytkowników.

 

Referencje

1. DiLeone RJ, Taylor JR, Picciotto MR. Dążenie do jedzenia: porównania i rozróżnienia między mechanizmami nagradzania żywności i uzależnienia od narkotyków. Nat Neurosci. 2012; 15: 1330 – 1335. doi: 10.1038 / nn.3202. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed] [Cross Ref]
2. Kenny PJ. Wspólne mechanizmy komórkowe i molekularne w otyłości i uzależnieniu od narkotyków. Nat Rev Neurosci. 2011; 12: 638 – 651. doi: 10.1038 / nrn3105. [PubMed] [Cross Ref]
3. Johnson PM, Kenny PJ. Receptory dopaminy D2 w uzależniającej dysfunkcji nagrody i kompulsywnym jedzeniu u otyłych szczurów. Nat Neurosci. 2010; 13: 635 – 641. doi: 10.1038 / nn.2519. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed] [Cross Ref]
4. Stice E, Spoor S, Bohon C, Small DM. Związek między otyłością a tępą odpowiedzią prążkowia na pokarm jest moderowany przez allel TaqIA A1. Nauka. 2008; 322: 449 – 452. doi: 10.1126 / science.1161550. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed] [Cross Ref]
5. Geiger BM, Haburcak M, Avena NM, Moyer MC, Hoebel BG, Pothos EN. Niedobory neurotransmisji mezolimbicznej dopaminy w otyłości pokarmowej u szczurów. Neuronauka. 2009; 159: 1193 – 1199. doi: 10.1016 / j.neuroscience.2009.02.007. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed] [Cross Ref]
6. Noble EP. Uzależnienie i proces nagradzania poprzez polimorfizmy genu receptora dopaminowego D2: przegląd. Eur Psychiatry. 2000; 15: 79 – 89. doi: 10.1016 / S0924-9338 (00) 00208-X. [PubMed] [Cross Ref]
7. Wang GJ, Tomasi D, Backus W, i in. Zaburzenia żołądka aktywują obwody sytości w ludzkim mózgu. NeuroImage. 2008; 39: 1824 – 1831. doi: 10.1016 / j.neuroimage.2007.11.008. [PubMed] [Cross Ref]
8. Janero DR, Makriyannis A. Antagoniści receptora kannabinoidowego: możliwości farmakologiczne, doświadczenie kliniczne i rokowanie translacyjne. Expert Opin Emerg Narkotyki. 2009; 14: 43 – 65. doi: 10.1517 / 14728210902736568. [PubMed] [Cross Ref]
9. Jaenisch R, Bird A. Epigenetyczna regulacja ekspresji genów: w jaki sposób genom integruje sygnały wewnętrzne i środowiskowe. Nat Genet. 2003; 33 (Suppl): 245 – 254. doi: 10.1038 / ng1089. [PubMed] [Cross Ref]
10. Ong ZY, Muhlhausler BS. Karmienie matek „śmieciowym pokarmem” matek szczurów zmienia wybory żywieniowe i rozwój mezolimbicznej ścieżki nagrody u potomstwa. FASEB J. 2011; 25: 2167 – 2179. doi: 10.1096 / fj.10-178392. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed] [Cross Ref]
11. Barres R, Osler ME, Yan J i in. Metylacja non-CpG promotora PGC-1alfa przez DNMT3B kontroluje gęstość mitochondriów. Cell Metab. 2009; 10: 189 – 198. doi: 10.1016 / j.cmet.2009.07.011. [PubMed] [Cross Ref]
12. Lee WJ, Zhu BT. Hamowanie metylacji DNA przez kwas kawowy i kwas chlorogenowy, dwa powszechne polifenole kawowe zawierające katechol. Rakotwórczość. 2006; 27: 269 – 277. doi: 10.1093 / carcin / bgi206. [PubMed] [Cross Ref]
13. Fang MZ, Wang Y, Ai N i in. Herbaciany polifenol (-) - epigallokatechina-galusan 3 hamuje metylotransferazę DNA i reaktywuje geny wyciszone metylacją w liniach komórek rakowych. Cancer Res. 2003; 63: 7563 – 7570. [PubMed]
14. Kozuka C, Yabiku K, Sunagawa S, i in. Ryż brązowy i jego składnik, gamma-oryzanol, osłabiają preferencję diety wysokotłuszczowej poprzez zmniejszenie stresu retikulum podwzgórzowego u myszy. Cukrzyca. 2012; 61: 3084 – 3093. doi: 10.2337 / db11-1767. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed] [Cross Ref]
15. Kozuka C, Sunagawa S, Ueda R, i in. Gamma-Oryzanol chroni komórki beta trzustki przed stresem retikulum endoplazmatycznego u samców myszy. Endokrynologia. 2015; 156: 1242 – 1250. doi: 10.1210 / en.2014-1748. [PubMed] [Cross Ref]
16. Kozuka C, Yabiku K, Takayama C, Matsushita M, Shimabukuro M, Masuzaki H. Nowe podejście oparte na naukach żywności do zapobiegania i leczenia otyłości i cukrzycy typu 2: najnowsze badania brązowego ryżu i γ-oryzanolu. Obes Res Clin Pract. 2013; 7: e165 – e172. doi: 10.1016 / j.orcp.2013.02.003. [PubMed] [Cross Ref]
17. Kozuka C, Sunagawa S, Ueda R, i in. Nowy mechanizm insulinotropowy gamma-oryzanolu pochodzącego z pełnego ziarna poprzez tłumienie lokalnej sygnalizacji receptora dopaminy D w mysiej wysepce. Br J Pharmacol. 2015; 172: 4519 – 4534. doi: 10.1111 / bph.13236. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed] [Cross Ref]
18. Karahoca M, Momparler RL. Analiza farmakokinetyczna i farmakodynamiczna 5-aza-2′-deoksycytydyny (decytabiny) w opracowaniu harmonogramu dawkowania w leczeniu raka. Epigenetyka kliniczna. 2013; 5: 3. doi: 10.1186 / 1868-7083-5-3. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed] [Cross Ref]
19. Rein T, Zorbas H, DePamphilis ML. Aktywne miejsca inicjacji replikacji ssaków są związane z klastrem o dużej gęstości dinukleotydów mCpG. Mol Cell Biol. 1997; 17: 416 – 426. doi: 10.1128 / MCB.17.1.416. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed] [Cross Ref]
20. Tanaka T, Masuzaki H, Yasue S, i in. Centralna sygnalizacja melanokortyny przywraca mięśni szkieletowych fosforylację kinazy białkowej aktywowanej AMP u myszy karmionych dietą wysokotłuszczową. Cell Metab. 2007; 5: 395 – 402. doi: 10.1016 / j.cmet.2007.04.004. [PubMed] [Cross Ref]
21. Okano M, Bell DW, Haber DA, Li E. Metylotransferazy DNA Dnmt3a i Dnmt3b są niezbędne do metylacji de novo i rozwoju ssaków. Komórka. 1999; 99: 247 – 257. doi: 10.1016 / S0092-8674 (00) 81656-6. [PubMed] [Cross Ref]
22. Zhang Y, Wang L. Hamowanie receptora jądrowego SHP przez ekspresję Dnmt1 przez ERRγ FEBS Lett. 2011; 585: 1269 – 1275. doi: 10.1016 / j.febslet.2011.03.059. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed] [Cross Ref]
23. Zhang Q, Wang HY, Woetmann A, Raghunath PN, Odum N, Wasik MA. STAT3 indukuje transkrypcję genu metylotransferazy DNA 1 (DNMT1) w złośliwych limfocytach T. Krew. 2006; 108: 1058 – 1064. doi: 10.1182 / blood-2005-08-007377. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed] [Cross Ref]
24. Bontempi S, Fiorentini C, Busi C, Guerra N, Spano P, Missale C. Identyfikacja i charakterystyka dwóch miejsc jądrowego czynnika-kappaB w regionie regulacyjnym receptora dopaminowego D2. Endokrynologia. 2007; 148: 2563 – 2570. doi: 10.1210 / en.2006-1618. [PubMed] [Cross Ref]
25. Kim AY, Park YJ, Pan X i in. Indukowana otyłością hipermetylacja genu adiponektyny pośredniczy w insulinooporności. Nat Commun. 2015; 6: 7585. doi: 10.1038 / ncomms8585. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed] [Cross Ref]
26. Ozcan L, Ergin AS, Lu A i in. Stres retikulum endoplazmatycznego odgrywa kluczową rolę w rozwoju oporności na leptynę. Cell Metab. 2009; 9: 35 – 51. doi: 10.1016 / j.cmet.2008.12.004. [PubMed] [Cross Ref]
27. Waterland RA, Travisano M, Tahiliani KG, Rached MT, Mirza S. Suplementacja donorem metylu zapobiega transgeneracyjnemu wzmocnieniu otyłości. Int J Obes. 2008; 32: 1373 – 1379. doi: 10.1038 / ijo.2008.100. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed] [Cross Ref]