Diabetologia. 2017; 60 (8): 1502 – 1511.
Opublikowano online 2017 May 20. doi: 10.1007/s00125-017-4305-4
PMCID: PMC5491592
1Abstrakcyjny
Cele / hipoteza
Przejadanie się tłuszczów dietetycznych powoduje otyłość u ludzi i gryzoni. Ostatnie badania na ludziach i gryzoniach wykazały, że uzależnienie od tłuszczów ma wspólny mechanizm uzależnienia od alkoholu, nikotyny i narkotyków pod względem dysfunkcji mózgowych systemów nagradzania. Podkreślono, że dieta wysokotłuszczowa (HFD) osłabia sygnalizację receptora dopaminowego D2 (D2R) w prążkowiu, kluczowym regulatorze systemu nagradzania mózgu, co prowadzi do przejadania się hedonicznego. Wcześniej informowaliśmy, że bioaktywny składnik γ-oryzanol specyficzny dla brązowego ryżu łagodzi preferencję dla HFD poprzez kontrolę podwzgórza. W związku z tym zbadaliśmy możliwość, że γ-oryzanol moduluje funkcjonowanie mózgowego systemu nagrody u myszy.
Metody
Samce myszy C57BL / 6J karmionych HFD doustnie traktowano γ-oryzanolem i oceniano poziomy prążkowia cząsteczek zaangażowanych w sygnalizację D2R. Zbadano wpływ γ-oryzanolu na metylację DNA promotora D2R i późniejsze zmiany preferencji tłuszczu pokarmowego. Ponadto zbadano wpływ 5-aza-2′-deoksycytydyny, silnego inhibitora metylotransferaz DNA (DNMT), na preferencje pokarmowe, sygnalizację D2R i poziomy DNMT w prążkowiu. Hamujące działanie γ-oryzanolu na aktywność DNMT oceniano enzymatycznie in vitro.
wyniki
W prążkowiu od myszy karmionych HFD wytwarzanie D2R było zmniejszone przez wzrost metylacji DNA regionu promotora D2R. Doustne podawanie γ-oryzanolu zmniejszało ekspresję i aktywność DNMT, przywracając w ten sposób poziom D2R w prążkowiu. Farmakologiczne hamowanie DNMT przez 5-aza-2′-deoksycytydynę również poprawiło preferencje dla tłuszczu pokarmowego. Zgodnie z tymi odkryciami enzymatyczne testy in vitro wykazały, że γ-oryzanol hamował aktywność DNMT.
Wnioski / interpretacja
Wykazaliśmy, że γ-oryzanol łagodzi indukowaną przez HFD hipermetylację DNA regionu promotorowego D2R w prążkowiu myszy. Nasz eksperymentalny paradygmat podkreśla γ-oryzanol jako obiecującą substancję przeciw otyłości o wyraźnej właściwości bycia nowym modulatorem epigenetycznym.
Elektroniczny materiał uzupełniający
Wersja online tego artykułu (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) zawiera recenzowany, ale nieedytowany materiał uzupełniający, który jest dostępny dla autoryzowanych użytkowników.
Wprowadzenie
Przejadanie się u osób otyłych ma przynajmniej częściowo wspólne mechanizmy uzależnienia od alkoholu, nikotyny i narkotyków [1]. Oprócz podwzgórzowej i hormonalnej regulacji apetytu, system nagradzania mózgu, w szczególności sygnalizacja receptora dopaminy, jest ściśle związany z uzależniającym lub hedonicznym zachowaniem żywieniowym [2]. Poprzednie badanie na szczurach wykazało, że knockdown receptora dopaminy D2 w prążkowiu (D2R) przez pośredniczące w lentiwirusie krótkie interferujące RNA o szybkim spinie szybko wywołało podobne do uzależnienia niedobory nagrody i przymusowe poszukiwanie pożywienia [3]. Ze względu na zmniejszoną gęstość D2R, prążkowie grzbietowe jest mniej wrażliwe na nagrodę pokarmową w porównaniu z chudymi grupami kontrolnymi u otyłych ludzi i gryzoni [3-5]. Zgodnie z tym pojęciem TaqAllele IA ANKK1 locus genu (kodujący DRD2 / powtórzenie ankyryny i domena kinazy zawierająca 1), który zmniejsza wytwarzanie prążkowia D2R, jest związany z fenotypem otyłości u ludzi [6], podczas gdy skutki utraty wagi po zabiegu bariatrycznym są związane ze zwiększoną gęstością prążkowia D2R [7]. Dane te silnie sugerują znaczenie prążkowia D2R jako nowego celu terapeutycznego w leczeniu otyłości. Jednak niektóre opracowane leki, które działały na system nagradzania mózgu, spowodowały znaczące działania niepożądane, w tym poważne problemy psychiczne, co doprowadziło do ich wycofania z klinik [8].
Modyfikacje epigenetyczne mają kluczowe znaczenie nie tylko dla rozwoju i różnicowania, ale także dlatego, że powstają w wyniku zmian środowiskowych, w tym w diecie i stylu życia [9]. Metylacja DNA jest głównym epigenetycznym zdarzeniem dla stabilności ekspresji genów [9]. U szczurów narażenie matki na dietę wysokotłuszczową (HFD) międzypokoleniowo zmienia metylację DNA w centralnym systemie nagrody u potomstwa, prowadząc do nadmiernego zużycia HFD przez młode [10]. W szczególności metylotransferazy DNA (DNMT) odgrywają kluczową rolę w regulacji zachowania żywieniowego i aktywności fizycznej [10, 11], sugerując, że DNMT mogą stanowić obiecujące cele terapeutyczne w leczeniu zespołu otyłości i cukrzycy. Co ważne, niektóre naturalne substancje pochodzące z żywności, w tym kwas kawowy i epigalokatechina, działają jako inhibitory DNMT [12, 13].
Niedawno wykazaliśmy, że bioaktywny, specyficzny dla brązowego ryżu składnik γ-oryzanol, mieszanina estru kwasu ferulowego i kilku fitosteroli, łagodzi preferencje dla tłuszczu pokarmowego poprzez zmniejszenie stresu retikulum endoplazmatycznego (ER) w podwzgórzu [14]. U myszy i królików doustnie podawany γ-oryzanol był szybko wchłaniany z jelita i rozprowadzany głównie do mózgu [15, 16]. Biorąc te ustalenia razem, naturalne produkty żywnościowe działające na centralny układ nerwowy mogą być alternatywą dla bezpiecznego łagodzenia zaburzeń zachowania żywieniowego w otyłości. W tym kontekście przetestowaliśmy hipotezę, że γ-oryzanol zmieniłby stan metylacji DNA w systemie nagradzania mózgu, powodując osłabienie preferencji dla HFD u myszy.
Metody
Zwierzęta
Siedmiotygodniowe samce myszy C57BL / 6J uzyskane z Charles River Laboratories Japan (Kanagawa, Japonia) trzymano (3-4 na klatkę) w warunkach wolnych od specyficznych patogenów w 24 ° C w świetle 12 h / 12 h / ciemny cykl. Po tygodniu aklimatyzacji, myszy w wieku 8 tygodni dopasowano pod względem wagi i podzielono na dwie lub trzy grupy, aby poddać je każdemu doświadczeniu. Myszy miały swobodny dostęp do pożywienia i wody. Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komisję Etyczną ds. Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu Ryukyus (nr 5352, 5718 i 5943).
Podawanie γ-oryzanolu i 5-aza-2′-deoksycytydyny
Aby ocenić preferencje dla HFD, γ-oryzanol (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japonia) podawano myszom 8-tygodniowym przez zgłębnik podczas testu wyboru żywności, jak opisano wcześniej [14, 17]. Do innych eksperymentów wytworzono granulki HFD (D12079B; Research Diets, New Brunswick, NJ, USA) zawierające 0.4% γ-oryzanolu. Składniki diety przedstawiono w tabeli elektronicznego materiału uzupełniającego (ESM) 1. Po 12 tygodniach karmienia pobrano tkankę z prążkowia i podwzgórza. Dzienne spożycie γ-oryzanolu, oszacowane na podstawie średniego spożycia pokarmu przez myszy, wynosiło około 320 μg / g masy ciała. Dawki γ-oryzanolu określono zgodnie z wcześniejszym opisem [14]. 5-aza-2′-deoksycytydynę (5-aza-dC; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) wstrzykiwano dootrzewnowo (0.25 μg / g masy ciała) trzy razy w tygodniu przez 12 tygodni [18].
Ocena preferencji dla tłuszczu dietetycznego
Aby ocenić preferencje dotyczące tłuszczu dietetycznego, testy żywności zapewniły wybór między chow a HFD (D12450B i D12451; Diety badawcze), jak opisano wcześniej [14]. Składniki diety pokazano w tabeli ESM 1. W skrócie, myszy miały swobodny dostęp do karmy i HFD. Spożycie karmy i HFD mierzono co tydzień i analizowano pod kątem zmian preferencji dla tłuszczu w diecie. Preferencję HFD obliczono według wzoru: Preferencja HFD = [(spożycie HFD / całkowite spożycie pokarmu) × 100].
Sekwencjonowanie wodorosiarczynem w celu metylacji DNA
DNA oczyszczono przy użyciu zestawu DNeasy Blood & Tissue (QIAGEN, Tokio, Japonia). Roztwór DNA zmieszano ze świeżo przygotowanym 3 mol / l NaOH, inkubowano w 37 ° C przez 15 min i dodano do 5.3 mol / l mocznika, 1.7 mol / l wodorosiarczynu sodu i 4.9 mmol / l hydrochinonu. Roztwór poddano 15 cyklom denaturacji w 95 ° C przez 30 si inkubacji w 50 ° C przez 15 min [19]. DNA potraktowany wodorosiarczynem oczyszczono za pomocą zestawu do oczyszczania MinElute PCR (QIAGEN) i amplifikowano za pomocą PCR przy użyciu zestawu KAPA HiFi HotStart Uracil + ReadyMix PCR (KAPA Biosystems, Woburn, MA, USA) i starterów wokół miejsca CpG regionu promotora D2R . Sekwencje starterów były następujące: starter do przodu, 5′-GTAAGAATTGGTTGGTTGGAGTTAAAA-3 ′; primer odwrotny, 5′-ACCCTACCCTCTAAAACCACAACTAC-3 ′. Następnie sekwencje adaptorów dodano i oczyszczono przy użyciu Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, Kalifornia, USA). Próbki następnie połączono i załadowano do GS Junior (Roche Diagnostics, Tokio, Japonia) w celu sekwencjonowania zgodnie z protokołem producenta. Poziom metylacji wyrażono jako procent metylowanych cytozyn we wszystkich resztach cytozyn.
Test aktywności DNMT
Test aktywności enzymatycznej DNMT przeprowadzono przy użyciu zestawu EpiQuik DNA Methyltransferase Assay Kit Test (Epigentek Group, Brooklyn, NY, USA) i EPIgeneous Methyltransferase Assay Kit (Cisbio Japan, Chiba, Japan) zgodnie z protokołami producenta.
Aby ocenić działanie hamujące każdego związku na metylację DNA, powstanie S-adenozylo-l-homocysteinę (SAH) mierzono w obecności każdego związku (20 μmol / l do testów przesiewowych), S-adenozylometionina (SAM; 10 μmol / l) i substrat DNMT (4 ng / μl) w 37 ° C przez 90 min. Aby ocenić kinetykę Michaelisa – Mentena, DNMT1 (20 µmol / l) inkubowano z γ-oryzanolem, SAM (5 µmol / l) i wskazanym stężeniem poli dI-dC w 37 ° C przez 90 min. DNMT3a (100 μmol / l) i DNMT3b (100 μmol / l) inkubowano z γ-oryzanolem, SAM (5 μmol / l) i wskazanym stężeniem poli dG · dC w 37 ° C przez 120 min. Testy przeprowadzono czterokrotnie. Wyekstrahowane białko (0.75 mg / ml) inkubowano z SAM (5 μmol / l), poli dI-dC (5 μg / ml) i poli dG · dC (5 μg / ml) w 40 ° C przez 120 min, oraz Zmierzono tworzenie SAH.
Test aktywności receptora γ związany z estrogenem
Potencjalną aktywność antagonistyczną γ-oryzanolu wobec receptora związanego z estrogenem-γ (ERRγ) oceniano przy użyciu systemu oznaczania ludzkiego receptora estrogenowego receptora gamma (INDIGO Bioscience, State College, PA, USA) zgodnie z protokołem producenta. W skrócie, ssacze komórki reporterowe inne niż człowiek, wykazujące konstytutywną ekspresję aktywnego ERRγ, eksponowano na wskazane stężenia każdego związku przez 24 godziny w trzech powtórzeniach.
Western blotting
Zostało to wykonane zgodnie z wcześniejszym opisem [20] z przeciwciałami przeciwko D2R (1: 500, królik), transporterowi dopaminy (DAT; 1: 500, królik), hydroksylazie tyrozynowej (TH; 1: 1000, królik) (AB5084P, AB1591P i AB152, Merck Millipore, Billerica, MA, USA), przetwornik sygnału i aktywator transkrypcji 3α (STAT3α; 1: 1000, królik), DNMT1 (1: 1000, królik), DNMT3a (1: 1000, królik) (nr 8768, 5032 i 3598; Cell Signaling Technology, Tokio, Japonia), DNMT3b (1 μg / ml, królik), ERRγ (1: 1000, królik) i β-aktyna (1: 10,000 16049, mysz) (ab128930, ab6276 i abXNUMX; Abcam, Cambridge, MA, USA).
Ilościowa PCR w czasie rzeczywistym
Ekspresję genów zbadano jak opisano wcześniej [14]. Poziomy mRNA zostały znormalizowane do Rn18s (18S rRNA). Zestawy starterów stosowane do ilościowych analiz PCR w czasie rzeczywistym podsumowano w tabeli ESM 2.
Analiza statystyczna
Dane wyrażono jako średnią ± SEM. W stosownych przypadkach zastosowano jednokierunkową ANOVA i ANOVA z powtarzanymi pomiarami, a następnie wielokrotne testy porównawcze (metoda Bonferroniego – Dunna). Studenta t test wykorzystano do analizy różnic między dwiema grupami. Różnice uznano za znaczące w p <0.05.
wyniki
Farmakologiczne hamowanie DNMT przez 5-aza-dC osłabiło preferencję dietetycznego tłuszczu u myszy
U myszy karmionych HFD metylacja DNA w regionie promotora D2R w prążkowiu była znacznie zwiększona w porównaniu z myszami karmionymi karmą dla chowów (ryc. (Ryc. 1a) .1za). Z drugiej strony, podwzgórze metylacja DNA w regionie promotora D2R była najwyraźniej wyższa niż w prążkowiu w diecie chow (p <0.01) (ryc. (Ryc. 1a, 1a, f) i nie został zmieniony przez HFD (ryc. (Rys. 1f) .1fa). U myszy karmionych HFD zwiększoną metylację DNA w regionie promotora D2R w prążkowiu normalizowano przez traktowanie 5-aza-dC, silnym inhibitorem DNMT (ryc. (Ryc. 1a) .1za). Natomiast metylacja DNA w regionie promotora D2R w podwzgórzu nie uległa istotnej zmianie w wyniku leczenia 5-aza-dC (ryc. (Rys. 1f) .1fa). W prążkowiu 20-tygodniowych samców myszy karmionych HFD przez 12 tygodni, poziomy mRNA i białka D2R były znacząco obniżone (ryc. (Ryc. 1b, 1b, k, l). Natomiast poziomy receptorów dopaminowych D1 (D1R, kodowane przez Drd1), które działają w sposób odwrotny do D2R na cyklazy adenylowej i wewnątrzkomórkowej sygnalizacji za pośrednictwem cAMP, pozostały niezmienione (ryc. (Ryc. 1c) .1do). Ponadto nie było zmian w poziomach innych cząsteczek związanych z sygnalizacją D2R, takich jak TH i DAT na poziomie mRNA i / lub białka (ryc. (Ryc. 1d, 1d, e, k, m). Z drugiej strony nie zaobserwowano widocznych zmian w podwzgórzu, w tym w D2R (ryc. (Ryc. 1g – m) .1g – m). Warto zauważyć, że poziomy białka D2R i TH w podwzgórzu były znacznie niższe niż w prążkowiu (ryc. (Ryc. 11, 1l, m), prawdopodobnie odzwierciedlając względne znaczenie sygnalizacji receptora dopaminy w układzie nagrody mózgu w porównaniu z podwzgórzem.
Aby zbadać, czy metylacja DNA w regionie promotora D2R zmieni preferencję dla tłuszczu dietetycznego, przeanalizowano zachowanie żywieniowe myszy leczonych 5-aza-dC. Jak oczekiwano, 5-aza-dC znacząco zwiększył poziomy mRNA i białka dla D2R w prążkowiu myszy karmionych HFD (ryc. (Ryc. 1b, 1b, k, l). Z drugiej strony, nie było wpływu na poziomy Drd1, Th i Slc6a3 (kodujący DAT) w prążkowiu lub na poziomach Drd2, Drd1, Th i Slc6a3 w podwzgórzu (ryc. (Rys. 1c – e, 1c – e, g – m). Podczas gdy myszy traktowane nośnikiem preferowały HFD, preferencja dla HFD była znacznie zmniejszona u myszy leczonych 5-aza-dC (88% wartości dla myszy traktowanych nośnikiem) (Fig. (Rys. 1n) .1n). W konsekwencji leczenie 5-aza-dC zmniejszyło przyrost masy ciała (ryc. (Rys. 11o).
γ-oryzanol zmniejsza poziomy DNMT w prążkowiu myszy karmionych HFD
Jak wcześniej informowaliśmy [14], doustne podawanie γ-oryzanolu samcom myszy przez zgłębnik znacznie osłabiło preferencję dla HFD (93% wartości dla myszy traktowanych podłożem) (Fig. (Rys. 2a), 2a), co powoduje widoczne osłabienie przyrostu masy ciała (ryc. (Rys. 2b) .2b). Dlatego zbadaliśmy potencjalny wpływ γ-oryzanolu na epigenetyczną modulację D2R w prążkowiu.
U ssaków istnieją trzy główne DNMT - DNMT1, 3a i 3b. Funkcje DNMT1 w celu utrzymania metylacji DNA, podczas gdy DNMT3a i 3b odgrywają rolę w ułatwianiu metylacji de novo DNA [21]. Aby zbadać potencjalny wpływ γ-oryzanolu na DNMT in vivo, oceniliśmy poziomy DNMT w mózgach myszy karmionych HFD. Chociaż HFD per se nie miało wpływu na poziomy mRNA i białka DNMT w prążkowiu lub podwzgórzu, suplementacja γ-oryzanolem znacząco zmniejszyła poziomy DNMT w prążkowiu, ale nie w podwzgórzu (ryc. (Rys. 2c – e, 2c – e, g – i, k – n). Dane te podnoszą możliwość, że γ-oryzanol może regulować poziomy DNMT w sposób specyficzny dla prążkowia. W podobny sposób 5-aza-dC znacząco zmniejszył poziomy mRNA DNMT3a i 3b preferencyjnie w prążkowiu (ESM Ryc. 1ogłoszenie).
Na podstawie poprzedniego badania wykazującego, że poziom mRNA DNMT1 był pozytywnie regulowany, przynajmniej częściowo, przez receptor jądrowy ERRγ [22], zbadaliśmy potencjalny wpływ γ-oryzanolu na aktywność ERRγ. W komórkach ssaków innych niż człowiek konstytutywnie wyrażających aktywny ERRγ, 4-hydroksytamoksyfen, silny odwrotny agonista ERRγ, znacznie zmniejszał aktywność ERRγ. Warto zauważyć, że γ-oryzanol częściowo zmniejszył aktywność ERRγ (zmniejszenie wartości wrodzonej o około 40%) (ryc. (Ryc. 3a) .3za). Co ważne, ERRγ był silnie wyrażany w prążkowiu, ale nie w podwzgórzu (ryc. (Rys. 3b – d) .3b – d). W przeciwieństwie do sytuacji w prążkowiu, γ-oryzanol znacząco zwiększał poziomy DNMT1 białka tylko w podwzgórzu (ryc. (Rys. 2k, 2k, l). Wyniki te można wyjaśnić, przynajmniej częściowo, naszym odkryciem, że STAT3α, pozytywny regulator poziomu DNMT1 [23], był obficie wyrażany w podwzgórzu, ale nie w prążkowiu (ryc. (Rys. 33na przykład).
W celu dalszej oceny wpływu γ-oryzanolu na aktywność DNMT in vivo, tworzenie SAH, produktu ubocznego metylacji DNA, a także silnego inhibitora DNMT, oceniano u myszy leczonych oryzanolem γ karmionych HFD. Nie stwierdzono istotnych zmian w tworzeniu SAH ani w prążkowiu, ani w podwzgórzu między myszami karmionymi HFD a karmionymi karmą dla kotów (ryc. (Rys. 2f, 2f, j). Zauważalnie, γ-oryzanol znacząco zmniejszał tworzenie SAH w prążkowiu (ryc. (Rys. 2f) 2f) ale nie w podwzgórzu (ryc. (Rys. 2j), 2j), sugerując, że γ-oryzanol może tłumić aktywność DNMT w sposób specyficzny dla prążkowia u myszy karmionych HFD.
Analizy enzymatyczne właściwości hamujących γ-oryzanolu dla DNMT in vitro
Następnie oceniliśmy wpływ γ-oryzanolu na aktywność DNMT in vitro. Oceniano siły hamowania γ-oryzanolu, kwasu ferulowego, 5-aza-dC, haloperidolu (reprezentatywny antagonista D2R), chinpirolu (reprezentatywny agonista D2R) i SAH przeciwko DNMT. Jako kontrola pozytywna SAH silnie osłabił aktywność DNMT w sposób zależny od dawki (ryc. (Rys. 4a – f) .4a – f). Zgodnie z oczekiwaniami haloperidol i chinpirol nie wykazały żadnego wpływu na aktywność DNMT (ESM Rys. 2). Zauważalnie γ-oryzanol znacząco hamował aktywność DNMT1 (IC50 = 3.2 μmol / l), 3a (IC50 = 22.3 μmol / l) i 3b (maksymalne hamowanie 57%) (ryc. (Ryc. 4d – f) .4d – f). Natomiast aktywność hamująca kwasu ferulowego, metabolitu γ-oryzanolu, była znacznie niższa niż aktywność γ-oryzanolu (ryc. (Rys. 44d – f).
Następnie zbadaliśmy właściwości hamujące γ-oryzanolu na DNMT. Powstawanie SAH zmierzono w celu oceny aktywności hamującej γ-oryzanolu na DNMT in vitro. Dane dotyczące tworzenia SAH podczas metylacji DNA za pośrednictwem DNMT wskazują na nasycalny wzór kinetyki Michaelisa – Mentena zarówno dla obecności, jak i braku γ-oryzanolu (ryc. (Ryc. 4g – i) .4żołnierz amerykański). W metylacji DNA za pośrednictwem DNMT1 analiza Eadie – Hofstee wykazała, że γ-oryzanol nie wykazał wpływu na V max tworzenia SAH (nośnik, 597 pmol / min; γ-oryzanol 2 μmol / l, 619 pmol / min; γ-oryzanol 20 μmol / l, 608 pmol / min), podczas gdy γ-oryzanol wyraźnie zwiększał K m (nośnik, 0.47 μg / ml; γ-oryzanol 2 μmol / l, 0.67 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.89 μg / ml) (ryc. (Ryc. 4j) .4jot). Wyniki te sugerują, że γ-oryzanol hamuje DNMT1 przynajmniej częściowo w sposób konkurencyjny. Z drugiej strony, dla metylacji DNA za pośrednictwem DNMT3a- i 3b, γ-oryzanol zmniejszał V max tworzenie SAH (DNMT3a: nośnik, 85.3 pmol / min; γ-oryzanol 2 μmol / l, 63.1 pmol / min; γ-oryzanol 20 μmol / l, 42.5 pmol / min; DNMT3b: nośnik, 42.3 pmol / min; γ -oryzanol 2 μmol / l; 28.0 pmol / min, γ-oryzanol 20 μmol / l, 15.0 pmol / min) i analogicznie K m dla tej reakcji (DNMT3a: nośnik, 0.0086 μg / ml; γ-oryzanol 2 μmol / l, 0.0080 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.0058 μg / ml; DNMT3b: nośnik, 0.0122 μg / ml; γ- oryzanol 2 μmol / l, 0.0097 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.0060 μg / ml) (ryc. (Rys. 4k, 4k, l). Wyniki te sugerują, że γ-oryzanol hamuje DNMT3a i 3b co najmniej częściowo w sposób niekonkurencyjny.
γ-oryzanol zwiększa poziomy D2R w prążkowiu myszy karmionych HFD
Następnie przetestowaliśmy możliwość, że γ-oryzanol zwiększy zawartość prążkowia D2R poprzez hamowanie DNMT. U myszy karmionych HFD doustne podawanie γ-oryzanolu znacznie zmniejszyło metylację prążkowia DNA w regionie promotora D2R (ryc. (Rys. 5a), 5a), podczas gdy nie zrobił tego w podwzgórzu (ryc. (Rys. 5f) .5fa). Zgodnie z tymi odkryciami poziomy mRNA i białka D2R wzrosły wzajemnie (ryc. (Ryc. 5b, 5b, g, k, l). Podobne do danych dotyczących leczenia 5-aza-dC (ryc. (Ryc. 1), 1), nie stwierdzono widocznego wpływu na poziom RNA i białka w Drd1, Th i Slc6a3 (DAT) w prążkowiu i bez wpływu na poziomy Drd1, Th i Slc6a3 w podwzgórzu (ryc. (Rys. 5c – e, 5c – e, h – k, m).
Poprzednie badania wykazały, że poziomy D2R i DNMT1 są regulowane przez stres ER i stan zapalny przynajmniej częściowo poprzez NF-κB [17, 24, 25]. Dlatego zbadaliśmy poziomy genów związanych ze stresem ER i stanów zapalnych. Jak wcześniej wykazano [26], HFD zwiększyła ekspresję genów kodujących TNF-α (Tnfa), białko chemoatraktantu monocytów - 1 (MCP-1) (Ccl2), Białko homologiczne C / EBP (Posiekać), Zlokalizowane w ER DnaJ 4 (ERdj4) (Dnajb9) i splicowanej postaci białka wiążącego X-box 1 (Xbp1s) w podwzgórzu, ale nie w prążkowiu (ryc. (Ryc. 6) .6). W szczególności suplementacja HFD γ-oryzanolem znacznie zmniejszyła zwiększoną ekspresję Ccl2, Posiekać, Dnajb9 i Xbp1s wyłącznie w podwzgórzu, ale nie w prążkowiu (ryc. (Rys. 66).
Dyskusja
Głównym odkryciem w niniejszym badaniu jest to, że γ-oryzanol działa jako silny inhibitor DNMT w prążkowiu myszy, tym samym osłabiając, przynajmniej częściowo, preferencję dla HFD poprzez modulację epigenetyczną prążkowia D2R. W prążkowiu myszy karmionych HFD poziomy D2R były znacznie zmniejszone, podczas gdy poziomy D1R, TH i DAT nie uległy zmianie (ryc. (Ryc. 1b – e, 1b – e, k – m). Dane te są zgodne z poglądem, że rozregulowanie prążkowia D2R odgrywa kluczową rolę w postrzeganiu nagrody za jedzenie na HFD, co prowadzi do nadmiernej konsumpcji hedonicznej HFD u otyłych zwierząt [3]. W niniejszym badaniu leczenie myszy karmionych HFD 5-aza-dC znacznie zwiększyło poziom D2R w prążkowiu (ryc. (Ryc. 1b, 1b, k, l) ewentualnie przez obniżenie poziomu metylacji DNA w regionie promotora D2R (ryc. (Rys. 1a), 1a) iw konsekwencji osłabił preferencję dla tłuszczu dietetycznego (ryc. (Rys. 1n) .1n). To odkrycie potwierdza również kluczową rolę prążkowia D2R w postrzeganiu nagrody za jedzenie na HFD.
Nasz test in vitro wykazał, że hamująca aktywność γ-oryzanolu przeciwko DNMT była najwyraźniej silniejsza niż jego metabolitu kwas ferulowy (ryc. (Ryc. 4d – f), 4d – f), co sugeruje znaczenie pełnej struktury γ-oryzanolu dla jego hamowania działania na DNMT. U myszy karmionych HFD nasze badania sugerują, że po podaniu doustnym γ-oryzanol dociera do mózgu jako kompletna struktura i preferencyjnie zmniejsza poziomy i aktywność DNMT w prążkowiu, co w konsekwencji zmniejsza metylację DNA w regionie promotora D2R w prążkowiu. Ponadto nasze badania in vitro wykazały, że γ-oryzanol działa jako częściowy antagonista przeciw ERRγ, który przede wszystkim służy jako pozytywny regulator produkcji DNMT1 [22], aw konsekwencji zmniejszyło aktywność DNMT1 (ryc. (Ryc. 3a) .3za). Warto zauważyć, że ERRγ był silnie wyrażany w prążkowiu, ale nie w podwzgórzu u myszy (ryc. (Rys. 3b) .3b). Dane te sugerują, że γ-oryzanol może potencjalnie obniżyć poziom mRNA DNMT1, przynajmniej częściowo, poprzez hamowanie ERRγ. W przeciwieństwie do prążkowia γ-oryzanol nie wykazywał wpływu na poziom D2R w podwzgórzu myszy karmionych HFD (ryc. (Ryc. 5g, 5g, k, l).
Z drugiej strony wykazaliśmy, że γ-oryzanol znacznie zwiększa poziomy DNMT1 w podwzgórzu, ale nie w prążkowiu (ryc. (Rys. 2k, 2k, l). Wykazano, że STAT3 zwiększa zawartość DNMT1 w złośliwych komórkach chłoniaka T [23]. W szczególności wcześniej wykazaliśmy, że γ-oryzanol znacznie zwiększa indukowaną leptyną fosforylację STAT3 w podwzgórzu myszy karmionych HFD [14]. Należy również zauważyć, że STAT3α był zasadniczo wyrażany w podwzgórzu, ale nie w prążkowiu u myszy (ryc. (Ryc. 3e – g) .3na przykład). Dane te kuszą nas do spekulacji, że pozorną różnicę w działaniu γ-oryzanolu na poziomy DNMT1 między podwzgórzem a prążkowiem można przynajmniej częściowo przypisać specyficznej dla regionu zawartości STAT3α i ERRγ w mózgu myszy ( Figa. (Ryc. 3b – g) .3b – g). Łącznie wydaje się, że u myszy występuje wzajemny wzór ekspresji ERRγ i STAT3α między prążkowiem a podwzgórzem. Na podstawie naszych wyników uzasadnione jest zatem spekulowanie, że w prążkowiu, gdzie produkcja ERRγ jest obfita, γ-oryzanol może preferencyjnie obniżać poziom mRNA i aktywność enzymatyczną DNMT1 jako negatywnego regulatora ERRγ. Natomiast w podwzgórzu, gdzie dominuje wytwarzanie STAT3α, γ-oryzanol może preferencyjnie zwiększać poziomy DNMT1.
Niedawne badanie wykazało, że tłumienie prążkowatej sygnalizacji D2R wywołane przez HFD zaburza zachowanie żywieniowe [3], co sugeruje potencjalne znaczenie hamowania DNMT w prążkowiu w leczeniu otyłości. Z drugiej strony poprzednie badanie wykazało możliwość, że status metylacji DNA genu 4 receptora melanokortyny wyrażanego w specyficznych jądrach podwzgórza może modulować transgeneracyjne formy otyłości u zdolnych do życia żółtych myszy [27]. Chociaż uzasadnione są dalsze badania w celu wyjaśnienia podstawowych mechanizmów, badania te sugerują znaczenie metylacji DNA specyficznej dla tkanki, genu i sekwencji w patofizjologii otyłości wywołanej HFD.
Niedawno informowaliśmy, że HFD podniosło poziom D2R w wyspach trzustkowych myszy [17, 24]. Jest prawdopodobne, że w takim wzmocnieniu pośredniczy, przynajmniej częściowo, stres ER i zapalenie poprzez NF-κB, ponieważ w regionie promotora D2R znajduje się kilka elementów odpowiadających na NF-κB [17, 24]. Ponadto ostatnie badania wykazały, że TNF-α i IL-1β zwiększają poziom i aktywność DNMT1 w tkance tłuszczowej myszy karmionych HFD [25]. Co ważne, obecne badanie wykazało, że HFD preferencyjnie indukował stres ER i stan zapalny w podwzgórzu, ale nie w prążkowiu (ryc. (Ryc. 6) .6). Dogłębne mechanizmy specyficznej dla tkanki, regionu i miejsca metylacji i demetylacji DNA w naszym paradygmacie eksperymentalnym muszą czekać na dalsze badania.
Wraz z naszym poprzednim raportem wykazującym, że γ-oryzanol osłabia preferencję dla HFD poprzez podwzgórze regulującą stres ER u myszy [14], γ-oryzanol reprezentuje również unikalną właściwość poprawy zarówno regulacji hedonicznej, jak i metabolicznej dysregulacji zachowań żywieniowych. Ponieważ wiadomo, że niektóre opracowane leki przeciw otyłości powodują krytyczne działania niepożądane [8], naturalne podejście do systemu nagradzania mózgu oparte na jedzeniu powinno bezpiecznie leczyć zespół otyłości i cukrzycy [16]. W tym paradygmacie γ-oryzanol jest obiecującym kandydatem na otyłość z wyraźną właściwością bycia modulatorem epigenetycznym.
Podziękowania
Jesteśmy wdzięczni S. Okamoto (University of the Ryukyus, Japonia) za przejrzenie manuskryptu. Dziękujemy M. Hiracie, H. Kaneshiro, I. Asato i C. Noguchi (University of the Ryukyus, Japonia) za pomoc sekretariatu.
Skróty
| 5-aza-dC | 5-aza-2′-deoksycytydyna |
| D1R | Receptor dopaminy D1 |
| D2R | Receptor dopaminy D2 |
| DAT | Transporter dopaminy |
| DNMT | Metylotransferaza DNA |
| ER | Retikulum endoplazmatyczne |
| ERR | Receptor związany z estrogenem |
| HFD | Wysoko-tłuszczowa dieta |
| SAH | S-Adenozylo-l-homocysteina |
| SAM | S-Adenozylometionina |
| STAT3α | Przetwornik sygnału i aktywator transkrypcji 3α |
| TH | Hydroksylaza tyrozynowa |
Uwagi
Dostępność danych
Zestawy danych generowane i / lub analizowane podczas bieżącego badania są dostępne od odpowiedniego autora na uzasadnione prośby.
Finansowanie
Prace te były częściowo wspierane przez Grants-in-Aid z Japan Society for the Science of Promotion (JSPS; KAKENHI Grant Numbers 15K19520 and 24591338), Council for Science, Technology and Innovation (CSTI), Międzyresortowy Program Promocji Strategicznej Innowacji (SIP) „Technologie tworzenia rolnictwa nowej generacji, leśnictwa i rybołówstwa”, Lotte Foundation, Japan Foundation for Applied Enzymology, New Energy and Industrial Technology Development Organisation (NEDO), Project for Formation of Life Science Network (Pharmaceutical Field ) (Prefektura Okinawa, Japonia) oraz Projekt promocji klastrów medycznych w Prefekturze Okinawa, Japonia, wraz z grantem z Prefektury Okinawa na promocję medycyny zaawansowanej (Prefektura Okinawa, Japonia).
Dwoistość zainteresowania
Autorzy deklarują, że z tym manuskryptem nie ma dwoistości interesów.
Oświadczenie o wkładzie
CK i HM zaprojektowali badania. CK i TK przeprowadzili eksperymenty i przeanalizowali dane. TK, CS-O, CT, MT, MM i KA przyczyniły się do interpretacji danych. CK i HM napisali manuskrypt. Wszyscy autorzy przyczynili się do interpretacji danych. Wszyscy autorzy przyłączyli się do przeglądu manuskryptu i zatwierdzili jego ostateczną wersję. HM jest gwarantem tej pracy, miał pełny dostęp do wszystkich danych i bierze pełną odpowiedzialność za integralność danych i dokładność analizy danych.
Przypisy
Elektroniczny materiał uzupełniający
Wersja online tego artykułu (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) zawiera recenzowany, ale nieedytowany materiał uzupełniający, który jest dostępny dla autoryzowanych użytkowników.
Referencje
English
Afrikaans
Shqip
አማርኛ
العربية
Հայերեն
Azərbaycan dili
Euskara
Беларуская мова
বাংলা
Bosanski
Български
Català
Cebuano
Chichewa
简体中文
繁體中文
Corsu
Hrvatski
Čeština
Dansk
Nederlands
Esperanto
Eesti
Filipino
Suomi
Français
Frysk
Galego
ქართული
Deutsch
Ελληνικά
ગુજરાતી
Kreyol ayisyen
Harshen Hausa
Ōlelo Hawaiʻi
עִבְרִית
हिन्दी
Hmong
Magyar
Íslenska
Igbo
Bahasa Indonesia
Gaelige
Italiano
日本語
Basa Jawa
ಕನ್ನಡ
Қазақ тілі
ភាសាខ្មែរ
한국어
كوردی
Кыргызча
ພາສາລາວ
Latin
Latviešu valoda
Lietuvių kalba
Lëtzebuergesch
Македонски јазик
Malagasy
Bahasa Melayu
മലയാളം
Maltese
Te Reo Māori
मराठी
Монгол
ဗမာစာ
नेपाली
Norsk bokmål
پښتو
فارسی
Polski
Português
ਪੰਜਾਬੀ
Română
Русский
Samoan
Gàidhlig
Српски језик
Sesotho
Shona
سنڌي
සිංහල
Slovenčina
Slovenščina
Afsoomaali
Español
Basa Sunda
Kiswahili
Svenska
Тоҷикӣ
தமிழ்
తెలుగు
ไทย
Türkçe
Українська
اردو
O‘zbekcha
Tiếng Việt
Cymraeg
isiXhosa
יידיש
Yorùbá
Zulu