Insulina aktywuje receptory insuliny (InsRs) w podwzgórzu, aby zasygnalizować uczucie sytości po posiłku. Jednak rosnąca częstość występowania otyłości, która skutkuje chronicznie podwyższonym poziomem insuliny, oznacza, że ​​insulina może również działać w ośrodkach mózgowych, które regulują motywację i nagrodę. Opisujemy tutaj, że insulina może wzmacniać działanie zależnego od potencjału uwalniania dopaminy (DA) w jądrze półleżącym (NAc) i ogoniasto-skorupie poprzez mechanizm pośredni, który obejmuje cholinergiczne interneurony prążkowia, które wyrażają InsR. Co więcej, dwie różne manipulacje przewlekłą dietą u szczurów, restrykcja pokarmowa (FR) i dieta obesogenna (OB), przeciwnie zmieniają wrażliwość prążkowia na uwalnianie DA do insuliny, ze zwiększoną reaktywnością we FR, ale utratą reaktywności w OB. Badania behawioralne pokazują, że nienaruszone poziomy insuliny w powłoce NAc są niezbędne do uzyskania preferencji smaku sparowanego roztworu glukozy. Łącznie dane te sugerują, że sygnalizacja insulinowa prążkowia zwiększa uwalnianie DA, wpływając na wybory żywieniowe.

Powszechnie wiadomo, że trwały wzrost insuliny w osoczu podczas posiłku i po posiłku aktywuje receptory insuliny (InsRs) w podwzgórzu, co zapewnia negatywne sprzężenie zwrotne z obwodami apetycznymi, które zmniejszają dalsze spożywanie posiłków^{1, 2, 3}. Insulina mózgowa pochodzi głównie z komórek β trzustki, z aktywnym transportem z osocza do mózgu przy barierze krew-mózg^{4, 5, 6, 7, 8}, chociaż istnieje coraz więcej dowodów na neuronalną syntezę i uwalnianie insuliny^{1, 9}. Warto zauważyć, że ekspresja InsRs nie ogranicza się do podwzgórza, chociaż funkcja InsRs pod podwzgórzem pozostaje nierozwiązana^{1, 2, 3}. Biorąc pod uwagę coraz częstsze występowanie otyłości i cukrzycy typu II, w których poziomy krążącej insuliny są stale podwyższone, a transport insuliny przez mózg i wrażliwość receptorów są zmniejszone^{3, 8, 10, 11}, kluczowe jest zrozumienie funkcji insuliny w regionach mózgu, które regulują motywację i nagrodę. Szczególnie interesujące regiony mózgu to jądro półleżące (NAc), które pośredniczy w nagradzających efektach zarówno jedzenia, jak i leków.^{12, 13}, i caudate-putamen (CPu), który odgrywa rolę w zachowaniach opartych na nawykach i pragnieniu¹³. InsR są wyrażane w tych regionach, przy czym najwyższa gęstość występuje w NAc^{3, 14}; InsRs są także wyrażane przez neurony dopaminowe (DA) w śródmózgowiu, w tym neurony w obszarze brzusznej nakrywki (VTA) i istocie czarnej pars compacta (SNc)¹⁵. Poziom insuliny w mózgu jest proporcjonalny do stężenia insuliny w osoczu i otłuszczenia ciała^{6, 7, 8}, prowadząc do hipotezy, że insulina może działać w InsRs w tych regionach mózgu, aby wpływać na nagrody żywnościowe^{3, 16, 17}.

Wcześniejsze badania synaptosomów prążkowia, komórek heterologicznych, wycinków mózgu i in vivo wykazali, że aktywacja InsR przez insulinę prowadzi do zwiększenia wychwytu DA przez transporter DA (DAT)^{18, 19, 20, 21, 22, 23}. Proces ten obejmuje szlak sygnalizacji kinazy PI3^{19, 20}i powoduje wstawienie DAT do błony plazmatycznej¹⁹. Poziom krążącej insuliny dynamicznie moduluje aktywność DAT prążkowia, ze zmniejszonym wychwytem DA i ekspresją powierzchniową DAT obserwowanymi w modelach zwierzęcych cukrzycy i po restrykcjach pokarmowych (FR)^{20, 21}. Wykazano, że zależne od insuliny zwiększenie aktywności DAT zmniejsza wywołane stężenie pozakomórkowej DA ([DA]_o) w VTA²³, odzwierciedlając przesunięcie równowagi między uwalnianiem DA a jego wychwytem. Zgodnie z ustaloną rolą insuliny w sytości, ostre mikroiniekcja insuliny w VTA może zmniejszyć nagrodę pokarmową^{23, 24}, podczas gdy myszy pozbawione InsRs w neuronach VTA i SNc DA wykazują zwiększone spożycie pokarmu i stają się otyłe²⁵. Chociaż insulina może wywoływać długotrwałe obniżenie pobudzenia pobudzającego do neuronów VTA DA²⁴, ponownie zgodna z rolą w sytości, ekspozycja na insulinę może również zwiększyć szybkość wypalania neuronów DA, prawdopodobnie przez zmniejszenie hamowania DA i hamowania za pośrednictwem autoreceptora²⁵. Trudno przewidzieć efekt netto insuliny na uwalnianie DA prążkowia. Rzeczywiście, wyniki badań nad wpływem insuliny na uwalnianie DA w prążkowiu ex vivo plasterki¹⁹ oraz wpływ lokalnego mikrowstrzykiwania insuliny w NAc na nagrodę pokarmową²⁶ wydają się być sprzeczne. Aby rozwiązać ten problem, oceniliśmy aksonalne uwalnianie i wychwyt DA w nienaruszonym mikrośrodowisku NAc i CPu ex vivo skrawki prążkowia za pomocą szybkiej woltamperometrii cyklicznej (FCV) i określono wpływ sygnalizacji insuliny w NAc na zachowanie nagrody in vivo.

Nasze badania pokazują, że głównym efektem insuliny w NAc i CPu jest zwiększenie uwalniania DA, pomimo jednoczesnego wzrostu wychwytu DA. Ta dynamiczna regulacja uwalniania DA obejmuje zależny od insuliny wzrost pobudliwości cholinergicznych interneuronów prążkowia (ChIs), co prowadzi do zwiększonego uwalniania DA poprzez aktywację nikotynowych receptorów acetylocholiny (ACh) (nAChR). Wpływ insuliny na ChI i uwalnianie DA jest pośredniczony przez InsRs. W szczególności, wpływ insuliny na uwalnianie DA jest amplifikowany w plastrach ze szczurów FR, ale stępiony u szczurów na diecie obesogenic (OB). Te dane pokazujące wzmocnienie uwalniania DA w ex vivo plasterki insuliny prowadzą do przewidywania, że ​​insulina może działać jako sygnał nagrody in vivo. Rzeczywiście, równoległe badania behawioralne wykazują rolę insuliny w powłoce NAc w warunkowaniu preferencji smakowych. Odkrycia te wskazują na nową rolę insuliny jako sygnału nagrody, która może wpływać na wybór żywności

Insulina działająca przy InsRs zwiększa uwalnianie DA z prążkowia

Wstępne badanie lokalnie wywołanego [DA]_o monitorowane przez FCV w ex vivo plasterki prążkowia od szczurów ad libitum (AL) dostęp do żywności i wody ujawnił nieoczekiwane odkrycie, że ostre stosowanie insuliny w szeregu fizjologicznie istotnych stężeń^{1, 4} zwiększone wywołanie pojedynczego impulsu [DA]_o (Rys. 1a – c), z insuliną EC₅₀ wartości (stężenie, przy którym efekt był w połowie maksymalny) 2 – 12 nM (Rys. 1b). Zwiększono wywołane [DA]_o było szczególnie zaskakujące, biorąc pod uwagę, że towarzyszył temu znaczny wzrost maksymalnej stawki (V_max) za pośrednictwem DAT w każdym subregionie (Tabela 1), co doprowadziłoby do konkurencyjnego spadku wywołanego [DA]_o, jak podano wcześniej^{22, 23}. Zamiast tego stwierdziliśmy, że to wywołało [DA]_o został maksymalnie wzmocniony 20 – 55% przez 30 nM insulinę; regionem o największym proporcjonalnym efekcie była powłoka NAc, która jest podregionem prążkowia o najwyższej ekspresji InsR^{1, 14}. Plastry wystawione na działanie insuliny 30 nM w identycznych warunkach nie wykazały zmian w zawartości prążkowia DA (Uzupełnienie Rys. 1a), co sugeruje, że insulina zmienia dynamiczną regulację uwalniania, a nie tylko zwiększa syntezę DA. Warto zauważyć, że wpływ insuliny na wywołany [DA]_o został utracony przy stężeniach ponadnarodowych ≥100 nM (Rys. 1b). Nie wynikało to ze zwiększonego uwalniania aktywności DAT, ponieważ wpływ insuliny był na nią V_max również został utracony w tych stężeniach (Tabela 1). Ogólnie dane te pokazują, że w nienaruszonym mikrośrodowisku prążkowia dominujący wpływ insuliny na wywołane [DA]_o ma zwiększyć uwalnianie, pomimo jednoczesnego wzrostu wychwytu DA.

  

  

(a) Średnia wywołana pojedynczym impulsem [DA]_o w powłoce NAc, rdzeniu NAc i CPu przed i po insulinie (Ins) zilustrowanym dla 30 nM; słupki błędów pominięte, ale patrz (b); strzałki wskazują czas bodźca. Zwiększona insulina wywołana [DA]_o w powłoce (przez 55 ± 10%), rdzeń (przez 37 ± 5%) i CPu (przez 20 ± 4%) (***P<0.001). (b) Wpływ insuliny był zależny od stężenia w zakresie fizjologicznym (1 – 30 nM) w powłoce (n= 22 – 24, F_5,133= 14.471, P<0.001), rdzeń (n= 36 – 76, F_5,308= 16.318, P<0.001) i CPu (n= 30 – 62, F_5,253= 13.763, P<0.001), ale utracone przy ≥100 nM. (c) Reprezentatywne zapisy wywołanego pikiem [DA]_o w czasie w pojedynczym miejscu w rdzeniu NAc przy braku podawania leku (Con), podczas stosowania insuliny (30 nM) lub gdy insulinę zastosowano w obecności inhibitora InsR HNMPA (5 μM). (d) Średnia wywołana szczytem [DA]_o dane pokazujące zapobieganie wpływowi insuliny (30 nM) przez HNMPA, antagonistę InsR S961 (1 μM) i inhibitor PI3K LY294002 (1 μM), ale nie przez inhibitor IGF-1R PPP (1 μM) (n= 29 – 76; P> 0.9 w porównaniu z samą insuliną). Dla Rys. 1a – d, n= liczba miejsc na podregion ze szczurów 3 – 6 dla każdego stężenia leku lub insuliny; jednokierunkowa ANOVA, uczciwy test istotności Tukeya (HSD). Widzieć Uzupełnienie Rys. 1b, c dla danych NAc i CPu.

• Obraz w pełnym rozmiarze (98 KB)

 

 

Ponieważ insulina może także działać na receptory insulinopodobnego czynnika wzrostu 1 (IGF-1R), chociaż w stężeniach przekraczających 100 nM (ref. 1), staraliśmy się potwierdzić, że zwiększający się wpływ insuliny na wywołany [DA]_o był zależny od InsR. Okazało się, że tak było, ponieważ efektowi zapobiegał wewnątrzkomórkowy inhibitor InsR, kwas hydroksy-2-naftalenylometylofosfonowy (HNMPA) i antagonista InsR, S961, ale nie selektywny inhibitor IGF-1R, pikropodofilina²⁴ (PPP; Rys. 1c, d i Uzupełnienie Rys. 1b, c). Następnie zbadaliśmy zaangażowanie kinazy PI3, która inicjuje szlak sygnałowy odpowiedzialny za zależną od insuliny regulację DAT¹⁹. Przy stężeniu 1 μM, sam inhibitor P13K LY249002 nie miał wpływu na wywołane pikiem [DA]_o or V_max (n= Strony 29 – 76 (rdzeń NAc) na lek, P> 0.05, jednokierunkowa analiza wariancji (ANOVA); dane nieprzedstawione), ale zapobiegały wpływowi insuliny na wywołane [DA]_o we wszystkich podregionach prążkowia (Rys. 1d i Uzupełnienie Rys. 1b, c).

Lokalizacja InsRs na aksonach DA i ChI

Obserwowany wzrost w V_max dla wychwytu DA z fizjologicznymi poziomami insuliny implikuje obecność InsRs na aksonach DA, podobnie jak poprzednie wyniki w różnych preparatach prążkowia^{18, 19, 20, 21, 22}. Chociaż wykazano funkcjonalną ekspresję InsR na neuronach DA śródmózgowia^{15, 23, 24, 25}, Nie zgłoszono ekspresji InsR na aksonach prążkowia DA. Zajęliśmy się tym za pomocą immunohistochemii. Gęsta immunoreaktywność InsR w całym prążkowiu ograniczyła ilościową ocenę lokalizacji InsR na aksonach DA, które zidentyfikowano za pomocą immunoreaktywności dla enzymu syntetyzującego DA, hydroksylazy tyrozynowej (TH). Dlatego przyjęliśmy wcześniej zgłoszony protokół²⁷, który obejmował zliczanie punkcji InsR, która pokrywała się z profilami TH + w normalnym widoku obrazu i ponowne liczenie po obróceniu tylko obrazu InsR przez 90 °. Jeśli pozorne nakładanie się profili InsR i TH + było niespecyficzne, procedura ta powinna dać statystycznie podobne zliczenia, czy normalny, czy 90 ° jest poza fazą. Analiza ta wykazała jednak zmniejszenie nakładania się InsR puncta z profilami TH + 14 ± 9% (n= Pola 42, P<0.01, sparowany dwustronny t-test; dane nie pokazane), potwierdzające obecność InsR na aksonach DA. Co jednak bardziej intrygujące, immunologiczne znakowanie prążkowia InsR ujawniło wyraźną ekspresję InsR na ciałach dużych komórek, które zidentyfikowano jako prążkowate ChI poprzez koimmunologiczne znakowanie acetylotransferazy choliny (ChAT), głównego enzymu wymaganego do syntezy ACh. Stosując kryteria elektrofizjologiczne²⁸ aby zidentyfikować ChI we wstępnych badaniach rejestrowania całych komórek, kilka neuronów wypełniono biocytyną, a następnie przetworzono w celu przeprowadzenia immunohistochemii; wszystkie z nich (4 / 4) były immunopozytywne zarówno dla InsR, jak i ChAT (Rys. 2a). Późniejsza ocena kolokalizacji InsR i ChAT w NAc potwierdziła, że ​​praktycznie wszystkie neurony ChAT + wyrażały InsR (96%; n= Neurony 27 / 28 w czterech sekcjach od dwóch szczurów).

  

  

(a) ChI wypełniony biocytyną, następnie znakowany immunologicznie dla ChAT i InsR (reprezentujący ChI wypełnione biocytyną 4 / 4); scalony obraz pokazuje kolokalizację; pasek skali, 10 μm. (b-e) Odpowiedź ChI prążkowia na serię impulsów depolaryzujących (czas trwania 3; odstępy 200, 300 i 400 pA; 120-s) przed i po insulinie (30 nM). (b) Adaptacja częstotliwości skokowej w ChI (górnej) jest widoczna w rozładowaniu potencjału czynnościowego (AP) podczas wstrzykiwania prądu, podczas gdy impulsowanie utrzymuje się przez cały impuls prądu w insulinie (niższy); kompletny zestaw danych pokazany w d, (c) Reprezentatywny przebieg czasu wywołanego przez insulinę wzrostu liczby AP z każdym bieżącym krokiem dla ChI b, (d) Podsumowanie numeru AP podczas impulsów prądowych dostarczanych przed i przy szczytowym efekcie ekspozycji na insulinę (n= 21 sparowane stymulacje, neurony 7, szczury 5) (e) Średnie odpowiedzi pokazujące wpływ insuliny (+ Ins) w warunkach kontrolnych (Con; n= 21 sparowane stymulacje, neurony 7, ***P<0.001, sparowany dwustronny t-test), w obecności HNMPA (5 μM) (n= 12 sparowane stymulacje, neurony 4, szczury 4, P>0.05, sparowany dwustronny t-test) iw obecności PPP (1 μM) (n= 18 sparowane stymulacje, neurony 6, szczury 6, **P<0.01, test rangowania z dopasowaną parą Wilcoxona). (f) Średnia wywołana pojedynczym impulsem [DA]_o w rdzeniu NAc przed i po insulinie (30 nM) w mekamylaminie (Mec; 5 μM) lub DHβE (1 μM) normalizowanej do kontroli szczytowej 100% (n= Strony 20 – 40 na podregion na warunek ze szczurów 3 – 4, P> 0.05 w porównaniu z grupą kontrolną, bez pary t-test). (g) Średnia wywołana pojedynczym impulsem [DA]_o w wycinkach przodomózgowia z kontroli heterozygotycznej (Het) i Czat Myszy KO przed i po insulinie (30 nM), znormalizowane do kontroli szczytowej 100%. Zwiększona insulina wywołana [DA]_o u myszy heterozygotycznych przez 190 ± 23% w powłoce NAc, 140 ± 8% w rdzeniu NAc i 137 ± 12% w CPu (n= Miejsca 15 – 25 na podregion z myszy 3 – 4 na genotyp, **P<0.01, ***P<0.001 w porównaniu z kontrolą niesparowaną t-test), ale nie miał wpływu na wywołane [DA]_o w dowolnym subregionie prążkowia Czat Myszy KO (P> 0.1).

• Obraz w pełnym rozmiarze (167 KB)

 

 

Insulina zwiększa pobudliwość ChI

Aby przetestować funkcjonalność InsRs na prążkowiu ChI, zbadaliśmy wpływ insuliny na pobudliwość ChI przy użyciu zapisu całych komórek z prądem. Pobudliwość ChI oceniano za pomocą serii depolaryzujących impulsów prądowych 3, aby wywołać ciąg potencjałów czynnościowych, które niezawodnie wykazywały adaptację częstotliwości szczytowej (Rys. 2b), często z utratą impulsu do końca aktualnego impulsu. Uderzające jest to, że insulina (30 nM) tłumiła adaptację częstotliwości skoków, co skutkowało stopniowym wzrostem liczby potencjału czynnościowego w czasie (Rys. 2c), z maksymalnym wzrostem (Rys. 2d, e) zwykle obserwowane pomiędzy 20 i 50 min ekspozycji na insulinę. W przypadku braku insuliny kontrolne ChI nie wykazywały zmian w liczbie wywołanych potencjałów czynnościowych (P> 0.05, sparowany dwustronny t-test; dane nie pokazane); w porównaniu z neuronami kontrolnymi monitorowanymi w tym samym przedziale czasu, neurony eksponowane na insulinę wykazały znacznie większą zmianę w liczbie wywołanych potencjałów czynnościowych (kontrola n= Pary bodźców 12 z czterech neuronów, insulina n= Pary bodźców 21 z siedmiu neuronów, F_1,25= 5.63, P<0.05, dwuczynnikowa ANOVA pomiarów mieszanych; dane niepokazane). Wpływowi insuliny na wzrost liczby potencjałów czynnościowych zapobiegał HNMPA, ale nie selektywny inhibitor IGF-1R PPP (Rys. 2e), wykazując, że zwiększona pobudliwość ChI przez insulinę była zależna od InsR.

Wzmocnienie insuliny wywołanego [DA]_o wymaga nAChR i ACh

Poprzednie badania wykazały, że ChI i ACh silnie regulują uwalnianie DA prążkowia poprzez nAChRs na aksonach DA^{29, 30, 31, 32, 33, 34}. Duża ekspresja InsR na ChI i zwiększenie pobudliwości ChI obserwowane w ostrej ekspozycji na insulinę sugerują, że te neurony mogą być nowymi celami dla insuliny, które mogą prowadzić do ulepszonego uwalniania DA. Aby to sprawdzić, zbadaliśmy wpływ insuliny w obecności mekamylaminy, nieselektywnego antagonisty nAChR lub dihydro-β-erytroidy (DHβE), selektywnego antagonisty dla nAChR zawierających β2 (β2 *), które są wzbogacone w Aksony DA³⁵. Wywołany [DA]_o był łatwo wykrywany w obecności tych antagonistów, chociaż oba leki zmniejszały amplitudę wywołanego pojedynczym impulsem [DA]_o (na przykład przez 13 – 26% w rdzeniu NAc), jak opisano wcześniej^{29, 30, 31, 32}. Na poparcie roli ACh i nAChR, wpływ insuliny na wywołany [DA]_o zapobiegano przez mekamylaminę lub DHβE (Rys. 2f). Aby potwierdzić udział sygnalizacji ACh w prążkowiu w uwalnianiu DA we wzmocnionej insulinie, zbadaliśmy wpływ insuliny na ex vivo skrawki prążkowia myszy, u których ekspresja ChAT została genetycznie usunięta w strukturach przodomózgowia (przodomózgowia Czat Myszy KO), w tym prążkowie³². Chociaż ChI są nienaruszone u tych myszy, synteza ACh jest zniesiona, co prowadzi do zmniejszenia, ale wciąż łatwo wykrywalnego wywołanego pojedynczym impulsem [DA]_o, jak opisano wcześniej³². W kontrolnych heterozygotycznych osobnikach z miotu, insulina (30 nM) wzrosła wywołana [DA]_o w powłoce NAc i rdzeniu oraz w CPu przez 37 – 90% (Rys. 2g), przekraczając amplifikację obserwowaną w prążkowiu szczura (na przykład, Rys. 1). Jednak wpływ insuliny na wywołany [DA]_o był nieobecny w całym kompleksie prążkowia w przodomózgowiu Czat Myszy KO, wykazujące, że pośredniczone przez insulinę zwiększenie uwalniania DA wymaga ACh prążkowia, ale nie współ-uwalnianych przekaźników z ChI, takich jak glutaminian³⁶.

Wpływ insuliny na wywołany [DA]_o jest zależna od diety

Stężenia insuliny w osoczu i mózgu są proporcjonalne do otyłości ciała^{6, 7, 8}i może prowadzić do kompensacyjnych zmian w wrażliwości mózgu na insulinę. Dlatego przetestowaliśmy hipotezę, że dieta wpływa na zdolność insuliny do promowania uwalniania DA, stosując skrawki prążkowia od szczurów utrzymywanych albo w przewlekłej diecie FR lub OB w porównaniu z kontrolami AL. Zgodnie z oczekiwaniami poziom insuliny w osoczu był skorelowany z masą ciała, przy niższej insulinie we FR niż u szczurów AL lub OB (Rys. 3a i Tabela 2). Pomimo tych różnic w krążącej insulinie, wywołane pikiem [DA]_o w powłoce NAc i rdzeniu, a CPu był znacznie niższy ex vivo plasterki prążkowia z obu grup diety w porównaniu z AL (Rys. 3b i Uzupełniające Rys. 2 a, b), co oznacza, że ​​oprócz insuliny czynniki bezwzględnie wywołują [DA]_o. Zawartość prążkowia DA nie różniła się między grupami diet, co wskazuje na zmianę regulacji uwalniania, a nie na syntezę DA (Uzupełnienie Rys. 2c). Zgodnie ze zmianą regulacji dynamicznej, czułość uwalniania DA prążkowia do insuliny była wyraźnie zależna od diety. U szczurów FR stężenia insuliny ≤1 nM, które nie miały wpływu na AL (Rys. 1b), zwiększono wywołane [DA]_o (Rys. 3c), odzwierciedlając zwiększoną wrażliwość na insulinę, z EC₅₀ wartości w prążkowiu FR (0.4 – 0.6 nM), które były o około rząd wielkości niższe niż w AL (porównaj Figs 1b i 3c). W uderzającym kontraście, wpływ insuliny został utracony w prążkowiu OB; nawet insulina 30 nM, która miała maksymalny efekt w prążkowiu AL (Rys. 1b), nie miało wpływu na OB (Rys. 3c).

  

  

(a) Stężenie insuliny w osoczu jest dodatnio skorelowane z masą ciała w różnych grupach żywieniowych (R= 0.76). (b) Średnia wywołana pojedynczym impulsem [DA]_o w rdzeniu NAc (patrz Uzupełniające Rys. 2a, b dla powłoki NAc i CPu) był niższy we FR (38 ± 4%) i OB (25 ± 4%) w stosunku do AL (n= Strony 50 – 60 od szczurów 5 – 6 na grupę dietetyczną, F_2,156= 23.337, jednokierunkowa ANOVA, Tukey HSD; ***P<0.001); OB kontra FR (P<0.08). (c) Wrażliwość wywołanego [DA]_o do insuliny zwiększono we FR, ale stracono w OB (n= Miejsca 21 – 49 na podregion na stężenie ze szczurów 2 – 4 na grupę diet, jednokierunkowa ANOVA, Tukey HSD), z większą czułością u szczurów FR i AL we wszystkich podregionach (P<0.001 dla każdego regionu; dwukierunkowa ANOVA; Procesor: F_{(conc × diet; 3,286)}= 10.253; rdzeń: F_{(conc × diet; 3,353)}= 6.166; muszla: F_{(conc × diet; 3,195)}= 10.735).

• Obraz w pełnym rozmiarze (124 KB)

 

 

Dane te sugerują odwrotną zależność między czułością prążkowia InsR a otyłością ciała. Alternatywnie jednak te zależne od diety różnice mogą odzwierciedlać zmienioną czułość nAChR. Dlatego określiliśmy odpowiedź na stężenie nikotyny w rdzeniu NAc z każdej grupy dietetycznej. Nikotyna powoduje odczulanie nAChR, które można określić ilościowo przez porównanie stosunku [DA]_o wywołane krótkim pociągiem pięciu impulsów w 100 Hz do pojedynczego impulsu wywołanego [DA]_o (5 p: 1 p ratio) jako wskaźnik aktywacji / desensytyzacji nAChR^{30, 31}. Korzystając z tego podejścia, nie stwierdziliśmy różnic między grupami diet w czułości nAChR w rdzeniu NAc (Uzupełnienie Rys. 3a – c). Ponadto, stosunek kontroli 5 p: 1 p nie różnił się między grupami diet w rdzeniu NAc (Uzupełnienie Rys. 3d) lub CPu (nie zilustrowano), sugerując, że dieta nie zmienia zależnej od nAChR regulacji uwalniania DA. Zatem wydaje się, że czułość prążkowia InsR jest wzmocniona w FR w porównaniu ze szczurami AL, ale nie występuje u szczurów OB, z utratą regulacji uwalniania DA prążkowia przy fizjologicznych stężeniach insuliny.

Insulina w powłoce NAc moduluje preferencję warunkowanego smaku

Preferencje żywieniowe są generowane zarówno przez czynniki przed, jak i po spożyciu; mechanizmy dla każdego z nich nie są całkowicie rozwiązane, ale obecne dowody wskazują na sygnalizację DA NAc w obu^{37, 38}. Biorąc pod uwagę, że poziom insuliny w osoczu i płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF) gwałtownie wzrasta po obwodowym podwyższeniu glukozy⁶i że wzrost insuliny w prążkowiu można wykryć w ciągu 5 min podwyższenia insuliny w osoczu⁷logiczne jest postawienie hipotezy, że obwodowe uwalnianie insuliny podczas posiłku może zwiększyć uwalnianie DA z NAc i przyczynić się do pozabiegowych mechanizmów nagrody. Dostosowaliśmy wcześniej opisany protokół preferencji smaku³⁷ z roztworami glukozy słodzonymi sacharyną u szczurów w celu przetestowania hipotezy, że blokowanie działania endogennej insuliny przez miejscowe stosowanie przeciwciała insuliny (InsAb) w NAc zmniejszyłoby preferencję dla sparowanego smaku. Skuteczność InsAb w blokowaniu działania insuliny badano w in vitro test wychwytu DA w synaptosomach prążkowia. Insulina (30 nM) spowodowała znaczący wzrost V_max w synaptosomach z NAc lub CPu (Uzupełnienie Rys. 4), zgodne z naszym V_max dane z plastrów prążkowia (Tabela 1) oraz z wcześniejszymi badaniami^{18, 19, 20, 21, 22, 23}. W przypadku braku insuliny ani InsAb, ani przeciwciało kontrolne immunoglobulina G (IgG) nie zmieniły V_max dla wychwytu DA względem kontroli. W obecności IgG insulina nadal powodowała znaczący wzrost V_max; jednak wpływ insuliny na V_max zaginął w obecności InsAb (Uzupełnienie Rys. 4).

Aby zminimalizować uszkodzenie tkanki i zachować czułość tkanki docelowej, przetestowano dwie grupy osobników, w których zmieniliśmy mikroiniekcję wewnątrz NAc za pomocą procedury mikrowstrzyknięcia próbnego, zamiast stosowania pojedynczej grupy osobników i łączenia jednego aromatyzowanego roztworu z InsAb, a innego z pojazd. W konsekwencji, podczas sesji kondycjonowania z jedną butelką, grupa eksperymentalna otrzymała mikrowstrzyknięcia InsAb w połączeniu z jednym z dwóch smaków, aw sesjach naprzemiennych próbne mikrowstrzyknięcia w połączeniu z innym smakiem (Rys. 4a, lewo). Grupa kontrolna otrzymała pozorne mikroiniekcje na przemian z mikroiniekcjami soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) lub IgG. Oba aromatyzowane roztwory zawierały glukozę podczas kondycjonowania. Nie oczekiwano różnic w preferencjach między smakami w grupie kontrolnej z mikroiniekcją, podczas gdy oczekiwano, że preferencja przesunie się w kierunku pozornego smaku z mikrowstrzykiwaniem w grupie z wstrzyknięciem mikro-InsAb.

  

  

(a) Schemat ilustrujący kondycjonowanie z jedną butelką (z lewej) i test z dwoma butelkami (z prawej). (b) Zużycie objętości (ml) podczas sesji kondycjonowania jednej butelki. Wystąpiła znacząca interakcja między sesją infuzji i zabiegiem mikroiniekcji (n= Szczury 19 – 20 na grupę, F_(3,111)= 3.088, P<0.05, mieszana ANOVA 2 × 4 z powtarzanymi pomiarami podczas sesji kondycjonującej wlewem). Mikrowstrzyknięcie InsAb znacznie zmniejszyło zużycie w porównaniu z kontrolą podczas trzeciego (t(40) = 3.026, **P<0.01) i czwarty (t(40) = 3.052, **P<0.01, chroniony jednostronny t-testy) napary. Próbne zastrzyki nie miały wpływu na spożycie w żadnej z grup (F_3,111= 1.110, 2 × 4 wymieszał ANOVA z powtarzanymi pomiarami na próbnej sesji kondycjonowania). (c) Objętość zużyta podczas testu preferencji smaku dwóch butelek. Wystąpiła znacząca interakcja między leczeniem smaku i mikroiniekcji podczas kondycjonowania (F_1,37= 5.36, P<0.05, dwukierunkowa mieszana ANOVA z powtarzanymi pomiarami smaku). Grupa InsAb spożyła znacznie mniej smaku sparowanego z InsAb w porównaniu ze smakiem sparowanym pozornie (t(18) = 2.82, ** P<0.01, chroniony jednostronny t-test); grupa kontrolna nie wykazywała preferencji smakowych (t(19) = 0.803, P> 0.05, chronione t-test). Porównując grupy, szczury InsAb wypiły znacznie mniej smaku sparowanego (t(40) = 1.96, *P<0.05) i znacznie więcej pozorowanego smaku (t(40) = 1.77, *P<0.05, chroniony jednostronny t-test) niż kontrole.

• Obraz w pełnym rozmiarze (161 KB)

 

 

Podczas sesji kondycjonowania z jedną butelką mikroiniekcja InsAb znacząco zmniejszyła zużycie w porównaniu z pojazdem podczas trzeciego i czwartego wlewu (Rys. 4b). Natomiast obie grupy zużywały tę samą objętość roztworu podczas wszystkich czterech próbnych sesji wstrzyknięć (F_3,111= 0.127, P>0.05, mieszana dwukierunkowa ANOVA) (Rys. 4b). Po łącznie ośmiu sesjach kondycjonowania, preferencje smakowe oceniano w teście z dwiema butelkami, w którym szczury miały jednocześnie dostęp do obu rozwiązań smakowych (Rys. 4a). Analiza statystyczna ujawniła znaczącą interakcję między smakiem a zabiegiem mikroiniekcji otrzymanym podczas kondycjonowania (Rys. 4c). Grupa InsAb zużywała znacznie mniej smaku sparowanego InsAb w porównaniu z pozornie sparowanym smakiem (Rys. 4c), podczas gdy grupa pojazdów nie wykazywała preferencji smakowych (Rys. 4c), sugerując, że nienaruszona sygnalizacja insulinowa przyczyniła się do wyboru słodkiego roztworu kalorycznego. W porównaniu z podłożem, szczury z mikroiniekcją InsAb piły znacznie mniej smaku sparowanego w parze i znacznie więcej smaku sparowanego z zastrzykiem (Rys. 4c). Mikroiniekcja IgG (t(9) = 0.792. P>0.05, chroniony t-testy) lub PBS (t(9) = 0.442. P>0.05, chroniony t-testy) nie miały wpływu na preferencje smakowe (dane nie pokazane), argumentując przeciwko możliwości, że niespecyficzny efekt mikroiniekcji InsAb zmniejszył preferencje konsumpcyjne lub smakowe. Należy również zauważyć, że preferencja grupy InsAb podczas testu nie jest preferencją dla mniej nowatorskiego smaku, ponieważ nie było interakcji między sesją a typem sesji (rzeczywista infuzja w porównaniu z próbną infuzją) dla grupy InsAb (F_3,54= 1.584, P> 0.05, dwukierunkowa ANOVA). Oznacza to, że grupa InsAb nie konsumowała więcej smaku sparowanego z wlewem pozorowanym w porównaniu z aromatem sparowanym z infuzją InsAb; raczej różnice między leczonymi grupami pojawiały się tylko podczas sesji warunkujących infuzją. Podsumowując, dane te wskazują, że insulina zawarta w NAc odgrywa rolę we wzmacnianiu preferencji dla smaku, który sygnalizuje ładunek glikemiczny.

Opisujemy tutaj, że insulina wzmacnia uwalnianie DA prążkowia w sposób zależny od nAChR poprzez modulowanie pobudliwości ChI poprzez InsRs. Nasze wyniki sugerują, że insulina może służyć jako sygnał nagrody, oprócz jej ustalonej roli w sygnalizowaniu sytości. W szczególności, wpływ insuliny na uwalnianie DA jest modulowany przez dietę, ze znacznie zwiększoną wrażliwością na insulinę po FR, ale całkowitą utratą regulacji zwiększonej insuliną w diecie OB. Zmiany te wydają się odzwierciedlać zmiany w czułości InsR, które są odwrotnie proporcjonalne do poziomów insuliny w krążeniu, biorąc pod uwagę, że poziom insuliny w osoczu okazał się zależny od diety, ale czułość nAChR nie była. Wreszcie, nasze badania preferencji smakowych u zwierząt zachowujących się sugerują, że sygnalizacja insuliny w powłoce NAc wpływa na preferencje żywieniowe, co nie tylko implikuje insulinę w uczeniu się związanym z żywnością, ale także potwierdza jej rolę jako sygnału nagrody.

Net [DA]_o odzwierciedla równowagę między uwalnianiem DA a wychwytem DA przez DAT. Poprzednie dowody wskazujące, że insulina może regulować aktywność DAT^{18, 19, 20, 21, 22, 23} doprowadziły do ​​przewidywania, że ​​wzrost insuliny powinien spowodować spadek netto wywołanego [DA]_o poprzez zwiększony wychwyt DA. Jednak odkryliśmy, że w prążkowiu działanie insuliny jest bardziej złożone. Chociaż ekspozycja na insulinę wzrosła V_max w przypadku DAT główny wpływ insuliny na uwalnianie DA, a nie na wychwyt DA, przy stałym wzroście wywołanego [DA]_o w fizjologicznym zakresie stężeń insuliny w powłoce NAc i jądrze oraz w CPu. Chociaż wzrost wywołał [DA]_o powrócił do poziomów kontrolnych w supraphysiological stężeniu 100 nM, V_max był również niezmieniony od kontroli, eliminując dominujący wpływ na DAT jako wyjaśnienie. Zamiast tego, utrata wpływu na wychwyt, jak również uwalnianie, pociąga za sobą odczulanie InsRs lub obniżenie poziomu szlaków sygnałowych w dół przy wysokich stężeniach insuliny. Rzeczywiście, InsR ulegają szybkiej endocytozie i degradacji po związaniu insuliny w tkankach obwodowych¹, z pojawiającymi się dowodami na utratę wrażliwości neuronalnej InsR po krótkotrwałej ekspozycji na wysokie poziomy insuliny lub diety wysokokaloryczne^{10, 11, 39}.

Opisany tutaj dominujący wpływ insuliny na zwiększenie uwalniania DA prążkowia kontrastuje z wynikami dwóch innych ostatnich ex vivo studia przekrojowe. W pierwszej insulina spowodowała zmniejszenie elektrycznie wywołanego przelewu [³H] DA z plastrów prążkowia, chociaż zwiększone [³H] Przepełnienie DA wykryto, gdy DAT został zahamowany²². Biorąc pod uwagę, że wydany [³H] DA musi uniknąć wychwytu za pośrednictwem DAT w całej tkance, która ma być wykryta w roztworze superfuzyjnym, protokół ten jest szczególnie wrażliwy na regulację DAT. Nasze wyniki pokazujące, że insulina zwiększa uwalnianie DA poprzez ChI i aktywacja nAChR, oprócz zwiększenia wychwytu za pośrednictwem DAT, wyjaśniałyby pozornie paradoksalny wzrost insuliny zwiększonej [³H] Przepełnienie DA widoczne przy blokowaniu konkurencyjnych efektów na DAT²². Drugie badanie wykorzystało FCV do bezpośredniego wykrywania uwalniania DA w somatodendrytyce w VTA, ale także odkryło dominujący wpływ insuliny na wychwyt DA, odzwierciedlony w zmniejszeniu wywołanym [DA]_o (ref. 23). Różnice w wielu czynnikach, od lokalnego mikroukładu do somatodendrytycznych w porównaniu z aksonalnymi mechanizmami uwalniania DA⁴⁰, może przyczynić się do tej regionalnej różnicy. Jak jednak omówiono poniżej, zależne od regionu role insuliny będą raczej komplementarne niż sprzeczne.

Wcześniej zakładano, że w każdej roli zależnej od insuliny regulacji sygnalizacji DA pośredniczy bezpośrednia aktywacja InsR na neuronach DA. Pokazujemy tutaj, że InsRs są także wyrażane na prążkowiu ChIs i że insulina moduluje pobudliwość ChI w celu wzmocnienia uwalniania DA prążkowia, co może odgrywać kluczową rolę w wpływie insuliny na dietę. Striatal ChIs otrzymują projekcje z neuronów jądra wewnątrzgałkowego wzgórza, które wykazują eksplozję impulsową w odpowiedzi na najistotniejsze bodźce sensoryczne i pomagają napędzać gwałtowne przerwy w ChI, które są ważne w kierowaniu uwagi, wzmacnianiu i uczeniu asocjacyjnym⁴¹. Dlatego działanie insuliny na InsRs na prążkowate ChI może nasilać wpływ sensorycznych sygnałów pokarmowych na reakcję prążkowia na wypalanie wzgórzowe, przyczyniając się do zwiększenia postrzegania wartości nagrody spożywanego posiłku. Bezpośrednia promocja uwalniania DA prążkowia przez aktywację ChI doprowadziła do sugestii, że czynniki stymulujące ChI będą miały uprzywilejowaną rolę jako wyzwalacze uwalniania DA³³. Nasze dane dostarczają pierwszych potwierdzających dowodów na to, że zwiększona pobudliwość insuliny ChI i sygnalizacja ACh dynamicznie zwiększają uwalnianie DA.

Podwyższone uwalnianie DA w obecności insuliny również przemawia przeciwko zwiększeniu sygnalizacji ACh w stopniu, który powoduje desensytyzację nAChR lub aktywację receptora muskarynowego ACh (mAChR), z których każda może tłumić wywołane pojedynczym pulsem [DA]_o (refs 29, 30, 31, 42). Tak więc opisane tutaj mechanizmy różnią się od aktywacji mAChR przez ACh, co wiąże się z niechęcią i sytością⁴³.

Wywołany pojedynczym impulsem [DA]_o był niższy zarówno u szczurów FR, jak i OB niż u szczurów AL; chociaż wyniki te są zgodne z wcześniejszymi raportami^{44, 45, 46}nasze badania stanowią pierwsze systematyczne porównanie trzech podregionów prążkowia w dwóch grupach dietetycznych w stałych ramach czasowych. Mechanizmy leżące u podstaw zależnych od diety zmian w uwalnianiu DA nie zostały wyjaśnione i wykraczają poza zakres niniejszych badań. Jednakże, biorąc pod uwagę, że poziom insuliny w osoczu jest przeciwnie zmieniony przez diety FR i OB, jest mało prawdopodobne, że zmniejszy się to wywołane [DA]_o w obu grupach jest konsekwencją zależnego od diety poziomu insuliny.

Z drugiej strony, zmiany w czułości InsR z dietą i wynikającym z tego zależnym od diety poziomem insuliny w osoczu dostarczają najbardziej prawdopodobnego wyjaśnienia zwiększonej wrażliwości na insulinę we FR i utraty odpowiedzi na insulinę w OB. Nie było dowodów na alternatywne wyjaśnienie zmienionej czułości nAChR u szczurów FR lub OB w porównaniu z AL. Chociaż nasze odkrycia są jednymi z pierwszych, które wskazują na zwiększoną wrażliwość prążkowia InsR na FR¹⁸, utracie wagi może towarzyszyć obniżony poziom insuliny w CSF⁷, co przyczyniłoby się do zwiększenia wrażliwości uwalniania DA na insulinę we FR. Odwrotnie, utrata wrażliwości na insulinę u szczurów OB jest zgodna z wcześniejszymi dowodami na obniżoną czułość InsR mózgu indukowaną przez przyrost masy ciała lub diety OB^{3, 10, 11}.

Autonomiczne ex vivo dane plasterka potwierdzają hipotezę, że insulina może sygnalizować zarówno nagrodę, jak i sytość. Testowaliśmy tę hipotezę, blokując wpływ endogennej insuliny z dwustronną mikroiniekcją InsAb w powłoce NAc podczas warunkowania preferencji smakowych. Spójne z rolą w nagradzaniu, blokowanie efektu insuliny zmniejszało preferencje dla smaku sparowanego roztworu zawierającego glukozę w porównaniu do smaku związanego z nienaruszoną sygnalizacją insuliny. Blokowanie insuliny w powłoce NAc również zmniejszało zużycie sparowanego roztworu podczas kondycjonowania w jednej butelce, podczas gdy pozorowane lub kontrolne mikroiniekcje nie miały wpływu na konsumpcję. Dane te sugerują, że insulina w powłoce NAc odgrywa rolę w preferencjach żywieniowych. Wcześniejsze badania wykazały, że nienaruszona sygnalizacja DA w NAc jest niezbędna do uzyskania kondycjonowania smaku^{37, 38}, potwierdzając rolę DA NAC w pośredniczeniu w wzmacnianiu efektów roztworów odżywczych. W tym świetle preferencja dla roztworu glukozy sparowanego z nienaruszoną dostępnością insuliny przemawia przeciwko pierwszoplanowemu wpływowi insuliny na wychwyt DA w mediowanej DAT w powłoce NAc, ponieważ oczekuje się, że zmniejszy się [DA]_o a zatem zmniejszają zużycie smaku kontrolowanego. Nasze wyniki są również zgodne z wynikami z poprzedniego badania, w którym mikroiniekcja insuliny do powłoki NAc zwiększyła czas, w którym zwierzęta były zaangażowane w doustne podawanie sacharozy, z granicznym wzrostem spożycia sacharozy²⁶, co było przeciwieństwem oczekiwanej konsekwencji zwiększonego wychwytu DA. Ogólnie rzecz biorąc, te dane behawioralne są zgodne z przewidywanym wpływem insuliny na prążkowia ChIs i zwiększonym uwalnianiem DA. Jednak wyniki te nie wykluczają udziału innych elementów mikroukładu prążkowia w monitorowanych zachowaniach, biorąc pod uwagę powszechną ekspresję InsR w prążkowiu^{1, 14}.

Przedstawione tu badania stanowią pierwszy dowód na to, że insulina odgrywa rolę w przekazywaniu wartości kalorycznej, a zatem i satysfakcjonujących efektów posiłku, co ma istotne znaczenie dla wpływu insuliny zarówno u osób z niedowagą, jak i otyłością. Kilka badań wskazuje, że po spożyciu skutki pokarmu, niezależnie od tego, czy szlaki transdukcji smaku są nienaruszone⁴⁷, zwiększ uwalnianie NAc DA i pozytywne wzmocnienie zachowania^{37, 47}. Zatem postabsorpcyjna odpowiedź insuliny może kodować wydajność glikemiczną posiłku i przyczyniać się do wzmocnienia preferencji żywieniowych i zachowań, które umożliwiają konsumpcję. Jednak skrajne zmiany w poziomie insuliny w krążeniu i centralna czułość InsR mogą odgrywać rolę w nieprawidłowych, jak również zachowaniach adaptacyjnych. Na przykład, hipoinsulinemia i kompensacyjna regulacja w górę czułości InsR u pacjentów z FR mogą być czynnikiem w ich skłonności do upijania się⁴⁸. Odwrotnie, centralna niewrażliwość na insulinę w cukrzycy typu II lub otyłości, odzwierciedlona tutaj u szczurów OB, może przyczynić się do zmniejszenia poczucia nagrody po spożyciu, zwiększając spożycie pokarmów o wysokim indeksie glikemicznym jako kompensacji^{49, 50}. Dlatego też zwiększenie lub zmniejszenie wrażliwości na insulinę prążkowia może przyczynić się do patologicznego odżywiania, powodując objadanie się i / lub otyłość.

Ogólnie rzecz biorąc, nasze odkrycia ujawniają nową rolę insuliny jako sygnału nagrody. Taka rola kontrastuje z jej znaną funkcją jako sygnałem sytości, w tym z niedawnymi odkryciami, że insulina mikrowstrzykiwana do VTA może zmniejszać żywienie hedoniczne i preferować sygnały związane z nagrodą za żywność^{23, 24}. Rodzi to pytanie, jak pozornie przeciwstawne role insuliny w tych funkcjach zależnych od DA można pogodzić. Odpowiedź może być taka, że ​​te efekty są komplementarne, a nie sprzeczne. Obecne wyniki wskazują, że insulina w prążkowiu przekazuje wartość nagrody spożywanego posiłku. Podwójna rola w sygnalizowaniu sytości może po prostu pozwolić insulinie służyć ważnemu celowi zakończenia posiłku, jednocześnie ustanawiając pamięć o jej wartościach odżywczych, a tym samym nagradzających, wzmacniając w ten sposób powtarzanie zachowań związanych z przyjmowaniem pokarmu.

Obsługa zwierząt

Procedury na zwierzętach były zgodne z wytycznymi NIH i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt NYU School of Medicine. Wszystkie zwierzęta były w cyklu 12 h light: dark, z włączonymi światłami od 06: 00 do 18: 00; ex vivo plasterki zostały przygotowane między 08: 00 i 12: 00. Przeprowadzono badania mechanistyczne u szczurów i myszy AL ex vivo plasterki od zwierząt trzymanych w parach, podczas gdy szczury trzymano pojedynczo dla wszystkich porównań grup dietetycznych i dla badań behawioralnych.

Szczury dietetyczne

Dorosłe samce szczurów Sprague-Dawley (Taconic) miały 8-10 w wieku od rozpoczęcia leczenia dietami trwającymi 21 – 30 dni. Szczury przypisywano półlosowo do grup dietetycznych: osobników uszeregowano według masy początkowej, a następnie każde kolejne trio szczurów było losowo rozmieszczane wśród grup dietetycznych. Szczury AL miały swobodny dostęp do karmy dla szczurów przez ten sam okres, co szczury sparowane na diecie FR lub OB. Wszystkie szczury miały swobodny dostęp do wody. Ograniczenie żywności zostało wdrożone jak poprzednio⁵¹; pokrótce, szczury otrzymywały 40-50% spożycia AL standardowej karmy dla szczurów codziennie, aż masa ciała zmniejszyła się o 20%, po czym pokarm był miareczkowany w celu utrzymania tej wagi. Szczury OB miały swobodny dostęp do karmy dla szczurów i czekolady. Upewnij się, że jest to bardzo smaczny płyn o umiarkowanie wysokiej zawartości tłuszczu i cukru⁵².

Przodomózgowie Czat myszy z nokautem

Myszy z warunkowym allelem pływającym Czat (Czat^flox) zostały skrzyżowane z Nkx2.1^Cre linia transgeniczna do produkcji myszy, w której ablacja syntezy ACh jest ograniczona do przodomózgowia³². Nie zmutowane transgeniczne zwierzęta z miotu były kontrolami; ich genotypy Cre⁺;Czat^{flox / +} i Cre^-;Czat^{flox / flox} są określane jako „heterozygoty”. Dorosłe samce myszy używane do badań na przekrojach miały ad libitum dostęp do chow i wody.

Ex vivo przygotowanie plasterków i roztwory fizjologiczne

Szczury lub myszy głęboko znieczulono za pomocą 50 mg kg^-1 pentobarbital (dootrzewnowy (ip)) i dekapitowany. W przypadku woltamperometrii wycinki koronalnych przodomózgowia (grubość 300 – 400-μm) wycięto na mikrotomie wibracyjnego ostrza Leica VT1200S (Leica Microsystems; Bannockburn, IL) w lodowatym sztucznym CSF buforowanym HEPES (aCSF) zawierającym (w mM): NaCl (120); NaHCO₃ (20); glukoza (10); Kwas HEPES (6.7); KCl (5); Sól sodowa HEPES (3.3); CaCl₂ (2); i MgSO₄ (2), zrównoważony 95% O₂/ 5% CO₂. Następnie plasterki utrzymywano w tym roztworze w temperaturze pokojowej przez 1 h przed eksperymentowaniem^{30, 32, 53}. W przypadku elektrofizjologii, po znieczuleniu, szczury perfundowano przezsercowo za pomocą lodowatego roztworu zawierającego (w mM): sacharozę (225); KCl (2.5); CaCl₂ (0.5); MgCl₂ (7); NaHCO₃ (28); NaH₂PO₄ (1.25); glukoza (7); askorbinian (1); i pirogronian (3) i zrównoważony 95% O₂/ 5% CO₂. Plastry pocięto w tym roztworze, a następnie przeniesiono do komory odzyskiwania w zmodyfikowanym aCSF zawierającym (w mM): NaCl (125); KCl (2.5); NaH₂PO₄ (1.25); NaHCO₃ (25); MgCl₂(1); CaCl₂ (2); glukoza (25); askorbinian (1); pirogronian (3); i mio-inozytol (4), zrównoważony 95% O₂/ 5% CO₂; ten roztwór był początkowo w 34 ° C, a następnie pozostawiono do ostygnięcia stopniowo do temperatury pokojowej⁵⁴. Wszystkie eksperymenty woltamperometryczne i fizjologiczne przeprowadzono w zanurzonej komorze rejestrującej w 32 ° C, która była przepełniona w 1.5 ml min^-1 z aCSF zawierającym (w mM): NaCl (124); KCl (3.7); NaHCO₃ (26); CaCl₂ (2.4); MgSO₄ (1.3); KH₂PO₄ (1.3); i glukoza (10) i albumina surowicy bydlęcej (BSA, 0.05 – 0.1 mg ml^-1) zrównoważone 95% O₂/ 5% CO₂; plasterki pozostawiono do zrównoważenia w tym środowisku przez 30 min przed doświadczeniem.

Cykliczna woltamperometria z szybkim skanowaniem

Wywołane badania uwalniania DA przeprowadzono stosując FCV w wycinkach mózgu^{32, 53} przygotowane z samców szczurów lub Czat myszy z nokautem przodomózgowia i kontrole heterozygotyczne (tygodnie 5-8). Studia w Czat myszy z nokautem były zaślepione, ale grupy dietetyczne szczurów miały oczywiste fenotypy, które uniemożliwiały oślepienie. Pomiary woltamperometryczne wykonano za pomocą woltamperomierza Millar (dostępnego na specjalne życzenie dr Juliana Millera z St. Bartholomew's i Royal London School of Medicine and Dentistry, University of London). W przypadku FCV zastosowano konwencjonalny kształt trójkąta z zakresem skanowania −0.7 do + 1.3 V (w porównaniu z Ag / AgCl), szybkość skanowania 800 V s^-1oraz interwał próbkowania 100 ms^{30, 32, 53}. Dane uzyskano przy użyciu płyty DigiData 1200B A / D kontrolowanej przez oprogramowanie Clampex 7.0 (Molecular Devices). Uwalnianie DA wywoływano za pomocą koncentrycznej elektrody stymulującej; amplituda impulsu stymulującego wynosiła 0.4 – 0.6 mA, a czas trwania wynosił 100 μs^{30, 32, 53}. Lokalną stymulację pojedynczym impulsem zastosowano w rdzeniu NAc i CPu; jednakże, krótki impuls wysokiej częstotliwości (pięć impulsów przy 100 Hz) został użyty do wzmocnienia wywołanego [DA]_o w powłoce NAc. Oba paradygmaty bodźców wywołują uwalnianie DA, który jest potencjałem działania i Ca²⁺ zależne, nie dotknięte jednocześnie uwalnianym glutaminianem i GABA^{42, 55}i ułatwione przez jednoczesne wydanie ACh^{29, 30, 31, 32, 33, 34}. Aby określić ilościowo wywołane [DA]_o, elektrody kalibrowano znanymi stężeniami DA w 32 ° C po każdym eksperymencie w aCSF iw obecności każdego leku stosowanego podczas danego eksperymentu⁵³.

Eksperymenty woltamperometryczne do oceny wpływu insuliny na wywołaną [DA]_o uzyskano za pomocą jednego z dwóch protokołów. Wstępne doświadczenia w celu określenia przebiegu czasowego wpływu insuliny (Sigma, I5523) przeprowadzono przez monitorowanie wywołanego [DA]_o co 5 min w jednej witrynie. Insulinę zastosowano po konsekwentnym wywołaniu [DA]_o uzyskano (zwykle pomiary 4 – 5); wpływ insuliny był maksymalny po 50 – 60 min, a następnie wywołany [DA]_o pozostawał na tym poziomie przez czas trwania eksperymentu (zazwyczaj 90 min całkowita ekspozycja na insulinę; Rys. 1c). Następnie oceniano wpływ insuliny przez wywołanie zapisu [DA]_o w 4 – 5 osobnych miejscach w plasterkach (+ 1.5 mm od bregma) w każdym z trzech podregionów prążkowia w warunkach kontrolnych (aCSF lub aCSF plus lek) i ponownie w czasie maksymalnego działania insuliny (pobieranie próbek w 60 – 80 min), a następnie próbki te uśredniono dla każdego podregionu. Wpływ insuliny zmniejszył się z czasem po przygotowaniu plasterka; zminimalizować czas ex vivo i aby zoptymalizować wykorzystanie zwierząt, zazwyczaj dwie komory od danego zwierzęcia badano w komorze rejestrującej w tym samym czasie. Leki stosowane w celu zakwestionowania działania insuliny stosowano 15 min przed insuliną przez superfuzję aCSF, w tym ester trisacetoksymetylowy HNMPA (HNMPA-AM_3; Enzo Life Sciences), S961 (Novo Nordisk), LY294002 (Sigma), picropodophyllotoxin (PPP; Tocris), mekamylamina (Tocris) i DHβE (Tocris). Jak opisano w wynikach, możliwą zmianę wrażliwości nikotynowych receptorów ACh wśród grup dietetycznych badano przez porównanie stosunku piku [DA]_o wywołany przez 5 p (100 Hz) z wywołanym przez 1 p wywołany (stosunek 5 p: 1 p)^{30, 31} w rdzeniu NAc w obecności nikotyny 0 – 500 nM (Sigma).

Określenie V _max z wywołanego [DA]_o transjenty w skrawkach prążkowia

Aby ocenić indukowane insuliną zmiany w wychwycie DA za pośrednictwem DAT, początkowa część fazy opadania wywołanego [DA]_o krzywe dopasowano do równania Michaelisa-Mentena w celu wyodrębnienia V_max (maksymalna stała szybkość pobierania)⁵⁶. K_m (który jest odwrotnie powiązany z powinowactwem DAT do DA) ustalono na 0.2 μM i wiadomo, że jest podobny we wszystkich podregionach prążkowia⁵⁷ i nienaruszona przez insulinę (patrz Uzupełnienie Rys. 4 podpis).

Rejestracja całych komórek

Plasterki mózgu przygotowano od samców szczurów 29- do 35-dniowych; warunki zapisu były identyczne z tymi stosowanymi w badaniach uwalniania DA. Nagrania z prądem stałym w całych komórkach wykorzystywały konwencjonalne metody⁵⁴. Chri prążkowia wizualizowano za pomocą mikroskopu Olympus BX51WI (Olympus America, Center Valley, PA) z optyką z kontrastem podczerwonym o interferencji różnicowej i celem zanurzenia w wodzie × 40. Roztwór pipety zawierał (w mM): K-glukonian (129); KCl (11); HEPES (10); MgCl₂ (2); EGTA (1); Na₂-ATP (2); Na₃-GTP (0.3); i dostosowano do pH 7.2 – 7.3 za pomocą KOH. Dla zarejestrowanych neuronów, które mają być ocenione pod kątem immunoreaktywności ChAT, 0.3% biocytin włączono do roztworu pipety, a neurony rejestrowano krótko (~ 5 min), aby zminimalizować rozcieńczenie zawartości wewnątrzkomórkowej. Opór pipet wynosił ~ 3 – 5 MΩ. Nagrania uzyskano przy użyciu wzmacniacza Axopatch 200B (Molecular Devices, Sunnyvale CA) i filtra dolnoprzepustowego przy 2 kHz. ChI zidentyfikowano według ustalonych kryteriów elektrofizjologicznych²⁸; początkowo większość była aktywna tonicznie, ale aktywność ulegała zmniejszeniu zmiennie po łataniu. Jednak reakcja na obecne wstrzyknięcie była na ogół solidna i stała w czasie, dlatego została wykorzystana do zbadania wpływu insuliny na pobudliwość ChI (patrz Wyniki). W eksperymentach mających na celu zbadanie roli InsR i IGF-1R w tej odpowiedzi zastosowano HNMPA lub PPP przez co najmniej 20 min, zanim ChI została załatana. Maksymalne efekty samej insuliny były zazwyczaj obserwowane po ~ 16 min ekspozycji, chociaż w niektórych komórkach wzrost nie był maksymalny aż do 50 min lub dłużej. Ponadto, w czterech z sześciu neuronów zarejestrowanych w PPP, insulina spowodowała początkowy spadek liczby skoków przed odzyskaniem i przekroczeniem początkowej liczby skokowej. W konsekwencji, we wszystkich doświadczeniach, wpływ insuliny określano ilościowo przez porównanie maksymalnego wpływu na liczbę kolców z liczbą skoków wywołanych bezpośrednio przed zastosowaniem insuliny. Widoczna różnica w czasie osiągnięcia efektu szczytowego może odzwierciedlać wiele czynników, w tym głębokość zarejestrowanej komórki w plasterku. Wywołane potencjały działania rejestrowano również w ChI przy braku insuliny w porównywalnych punktach czasowych.

Wysokosprawna chromatografia cieczowa

Zawartość DA w skrawkach prążkowia szczura (grubość 400-μm) określono za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detekcją elektrochemiczną⁵⁸. Pary plasterków równoważono dla 30 min w 32 ° C w aCSF, a następnie jeden plaster na parę inkubowano przez dodatkowe 60 min w 32 ° C w aCSF, podczas gdy drugi inkubowano w aCSF z 10 lub 30 nM insuliny. Dla porównań grup dietetycznych pobrano tkankę prążkowia między 30 – 60 min po odzyskaniu. Po inkubacji nadmiar aCSF ostrożnie usunięto z plastrów, próbkę tkanki prążkowia (7-10 mg) zważono, zamrożono na suchym lodzie, a następnie przechowywano, a następnie przechowywano w -80 ° C. W dniu analizy próbki sonikowano w lodowatym eluencie, odtlenionym argonem⁵⁸, odwirować w mikrowirówce przez 2 min, a supernatant wstrzyknięto bezpośrednio na kolumnę HPLC (BAS, West Lafayette, IN); detektorem była szklista elektroda węglowa ustawiona w 0.7 V w stosunku do Ag / AgCl.

Immunohistochemia

Do znakowania immunohistochemicznego szczury znieczulono pentobarbitalem sodu (50 mg kg^-1, ip), następnie perfundowano przezsercowo PBS (154 mM NaCl w buforze fosforanowym 10 mM, pH 7.2), a następnie 4% paraformaldehyd w tym PBS; mózgi usunięto, a przekroje koronalne (20 μm) wycięto i poddano konwencjonalnej obróbce^{27, 59}. Obrazy immunofluorescencyjne uzyskano za pomocą mikroskopu konfokalnego Nikon PM 800 wyposażonego w kamerę cyfrową sterowaną przez oprogramowanie Spot (Diagnostic Instruments Inc.) i stosując cel X XUMUMX (apertura numeryczna = 100) lub mikroskop konfokalny Zeiss LSM 1.4 przy użyciu × 510 cel (apertura numeryczna = 63). Laserami były Argon (1.2 nm), He / Ne (488 nm) i He / Ne (543 nm). Odpowiednie filtry dla każdego lasera zostały wybrane przez oprogramowanie mikroskopu konfokalnego. Rozmiar otworu różnił się w zależności od zastosowanego celu i grubości przekroju wybranej w zgenerowanie pakietów; wybraliśmy optymalną wartość otworu wskazaną przez oprogramowanie (zwykle 30 μm). Pliki cyfrowe analizowano za pomocą oprogramowania do dekonwolucji (AutoQuant Imaging), z końcowymi obrazami przetwarzanymi za pomocą programu Adobe Photoshop 7.0. Wszystkie obrazy zostały dostosowane do jasności i kontrastu; takie regulacje zostały wykonane jednakowo dla wszystkich części obrazu. Aksony prążkowia DA zidentyfikowano za pomocą dwóch przeciwciał TH: poliklonalnego królika AB152 anty-TH (1: 800) i myszy monoklonalnej MAB318 anty-TH (1: 500) (oba z Chemicon). Zastosowano trzy przeciwciała InsR: sc-57342 i sc-09 (1: 100; Santa Cruz) i PP5 (prezent od Pfizera). Specyfika każdego z nich została wcześniej wykazana^{60, 61}i potwierdzono w niniejszych badaniach przez brak znakowania immunologicznego przeciwciałami sc-57342 lub PP5 w obecności odpowiedniego peptydu blokującego. Przeciwciało ChAT było AB144 (1: 200; Millipore), a biotyna pochodziła z Vector (1: 200). Jako przeciwciała drugorzędowe zastosowano osiołek przeciwkróliczy Alexa 488 (Invitrogen) lub osioł przeciwkrólicze Cy2 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME), osioł przeciw kozie Cy3 (Jackson) i osioł anty-mysi Cy5 (Jackson).

Aby ocenić kolokalizację InsR w aksonach TH +, zastosowaliśmy metody opisane wcześniej w celu zidentyfikowania obecności Kir6.2, podjednostki tworzącej pory K wrażliwej na ATP⁺ kanały w aksonach DA²⁷. Puncta reprezentujące InsRs były rozłożone w skorygowanych obrazach, co wskazuje, że nałożenie z immunoreaktywnością TH może do pewnego stopnia wystąpić przez przypadek. Aby przetestować to założenie, policzyliśmy superimpozycje InsR / TH w niezależnych polach 42 w trzech odcinkach znakowanych immunologicznie NAc od dwóch szczurów. Pliki cyfrowe InsR zostały następnie obrócone 90 ° zgodnie z ruchem wskazówek zegara, a liczby powtórzono; rotacja zmniejszyła liczbę punków InsR, które współlokowały z TH w większości pól (patrz Wyniki). Zmniejszenie liczby superpozycji z rotacją²⁷ wskazał udział InsR puncta w każdym polu prążkowia związanym z aksonami DA.

Glukoza we krwi i insulina ELISA

Krew pnia zbierano w czasie dekapitacji do badań przekrojowych. Stężenie glukozy we krwi oznaczano natychmiast za pomocą standardowego monitora stężenia glukozy we krwi. W przypadku insuliny pobrano dodatkową krew do probówek zawierających EDTA i odwirowano przy 1,500g dla 15 min; supernatant (osocze) zebrano i przechowywano w -80 ° C aż do przetworzenia za pomocą zestawu ALPCO Rat Insulin ELISA.

Umieszczenie kaniuli i weryfikacja histologiczna

Czterdzieści jeden dorosłych samców szczurów Sprague-Dawley (Taconic i Charles River) początkowo ważących 350 – 425 g znieczulono ketaminą (100 mg kg^-1, ip) i ksylazyna (10 mg kg^-1, ip) i wszczepiono stereotaktycznie dwie przewlekle założone kaniule prowadzące (miernik 26) umieszczone obustronnie 2.0 mm grzbietowo do miejsc infuzji w osłonie przyśrodkowej NAc⁶² (1.6 mm przed bregma; 2.1 mm poprzecznie do szwu strzałkowego, końcówki nachylone pod kątem 8 ° w kierunku linii środkowej, 5.8 mm brzusznie do powierzchni czaszki). Szczurom podawano banaminę (2.0 mg kg^-1, podskórnie) jako pooperacyjny środek przeciwbólowy po wyzdrowieniu ze znieczulenia i rano po nim. Tydzień po zabiegu szczury umieszczono na FR (opisanym powyżej) i utrzymywano na 80% ich pooperacyjnej wadze regeneracyjnej przez pozostałą część badania. Umieszczenie kaniuli określono histologicznie po zakończeniu testów behawioralnych. Każdy szczur zabito CO₂, dekapitowany, mózg usuwany i utrwalany w 10% buforowanej formalinie przez> 48 godzin. Zamrożone skrawki koronalne (grubość 40 µm) pocięto na kriostacie Reichert-Jung, rozmrożono na szkiełkach pokrytych żelatyną i wybarwiono fioletem krezylowym. Dane od danego szczura wykorzystano tylko wtedy, gdy obie kaniule znajdowały się w środkowej powłoce NAc⁶² (w tym granica skorupa / rdzeń lub skorupa / guz węchowy) (Uzupełnienie Rys. 5); w oparciu o te kryteria dwa szczury zostały wykluczone z ostatecznej analizy.

Wstępna ekspozycja warunkująca preferencje smakowe

Szczury otrzymywały jedną przez noc (w klatce domowej) i sześć sesji 30-min-dziennie przed ekspozycją (w komorach testowych) na 0.2% sacharyny sodowej (Sigma) w wodzie z odstępem 48-h pomiędzy sesjami. Szczury otrzymały następnie dwie sesje 5-min-dziennie na ekspozycję na 0.2% sacharyny sodowej w niesłodzonym 0.05% winogronowym lub wiśniowym Kool-Aid (Kraft Foods) w wodzie. W pierwszej sesji przedekspozycyjnej Kool-Aid połowa szczurów otrzymała roztwór o smaku wiśniowym, a druga połowa otrzymała roztwór o smaku winogron. Smaki zostały odwrócone w drugiej sesji Kool-Aid przed ekspozycją, aby upewnić się, że wszystkie szczury pobrały próbki każdego smaku. Spożycie zmierzono dla wszystkich sesji przedekspozycyjnych. Komory testowe były przezroczystymi klatkami z tworzywa sztucznego ze świeżą pościelą. Dla wszystkich sesji przed ekspozycją szczury miały dostęp do tego samego roztworu po obu stronach komory. Z wyjątkiem sesji przedekspozycyjnej przez całą noc, wszystkie sesje były przeprowadzane w pokoju procedury behawioralnej, z okresem przyzwyczajenia 30-min przed jakimkolwiek treningiem lub testowaniem.

Klimatyzacja z jedną butelką

Wcześniejsze badania wykazały, że mikroiniekcja InsAb do podwzgórza brzuszno-przyśrodkowego może blokować działanie insuliny na zachowanie żywieniowe i wydzielanie glukagonu^{63, 64}. Tutaj zastosowaliśmy to podejście do oceny możliwej roli insuliny we wzmacnianiu wyboru żywności. Szczury przydzielono półlosowo na podstawie średniej objętości przyjmowanej przed ekspozycją na dwie grupy, kontrolną lub eksperymentalną (InsAb). W grupie kontrolnej szczury otrzymały nośnik (mikroiniekcja PBS; 137 mM NaCl i 2.7 mM KCl w buforze fosforanowym 10 mM) lub IgG (Abcam ab81032; 0.5 μg μl^-1 w PBS, jak otrzymano) mikroiniekcja w skorupie NAc przed spożyciem jednego z dwóch aromatyzowanych roztworów i pozorna mikroiniekcja przed spożyciem innego aromatyzowanego roztworu. W grupie doświadczalnej szczury otrzymały mikroiniekcję powłoki InsAb NAc (Abcam ab46707; 0.5 μl 1 μg μl^-1 w PBS, jak otrzymano) przed ekspozycją na jeden roztwór aromatyzowany i udawaną mikroiniekcję przed ekspozycją na inny. Zastosowano dwa zestawy osobników z naprzemiennym mikrowstrzykiwaniem płynnym i próbnym mikroiniekcją, tak że całkowita liczba mikroiniekcji była ograniczona do czterech, tym samym minimalizując możliwe uszkodzenie tkanki i utratę czułości w miejscu mikroiniekcji⁶⁵. W przypadku mikroiniekcji płynu roztwór kontrolny lub InsAb załadowano na dwie długości rurki 30-cm PE-50 przymocowanej na jednym końcu do strzykawek Hamiltona 5 μl wypełnionych wodą destylowaną, a na drugim końcu do kaniuli iniekcyjnej 31, która wydłużyła 2.0 mm poza wszczepionymi przewodnikami. Objętości infuzji 0.5 μl były dostarczane przez 90 s z szybkością 0.005 μl s^-1; wtryskiwacz pozostawiono na miejscu dla ~ 60 s, aby umożliwić czas na dyfuzję, a następnie wtryskiwacz zastąpiono mandrynem.

Szczury przeniesiono bezpośrednio do komór behawioralnych w ciągu 2 min zakończenia mikrowstrzykiwania lub pozornej mikroiniekcji. Roztwory kondycjonujące zawierały 0.2% sacharyny sodowej, niesłodzonego 0.05% winogronowego lub wiśniowego Kool-Aid i 0.8% glukozy. Dostęp do rozwiązania był ograniczony do 30 min na sesję. Sparowany smak i strona komory z dostępem do picia zostały częściowo losowo przydzielone i zrównoważone w każdej grupie. Odstęp między mikroiniekcjami wynosił co najmniej 72 h, na przemian z infuzją i próbnymi sesjami w sumie ośmiu sesjach kondycjonowania.

Test preferencji dwóch butelek

Czterdzieści osiem godzin po ostatniej sesji kondycjonowania szczury umieszczono w komorach testowych z jednoczesnym dostępem do obu smaków warunkujących; roztworami były 0.2% sacharyna sodowa w 0.05% winogronowym lub wiśniowym Kool-Aid, bez glukozy. Testy przeprowadzono w dniach 2 (min 60 dziennie). Pozycję probówki do picia zawierającej pozornie sparowany lub sparowany roztwór zmieniono, aby zapewnić, że każdy szczur był testowany pod kątem zużycia każdego roztworu po obu stronach klatki. Spożycie każdego aromatyzowanego roztworu uśredniono dla dwóch dni testowych w celu określenia preferencji.

[³H] wychwyt DA w synaptosomach prążkowia w celu oceny skuteczności InsAb

Synaptosomy prążkowia^{21, 66} przygotowano ze szczurów AL (samce, 350-400 g), z NAc (otoczka i rdzeń) i CPu rozcięto i przygotowano oddzielnie. Tkankę z każdego regionu homogenizowano w objętościach 15 lodowatego roztworu sacharozy 0.32 M w szklanym homogenizatorze z napędzanym silnikiem tłuczkiem teflonowym; po płukaniu i odwirowaniu końcowy osad ponownie zawieszono w lodowatej sacharozie 0.32 M^{21, 66}. Przed rozpoczęciem [³H] Test wychwytu DA⁶⁶, próbki synaptosomalne w całkowitej objętości 180 μl buforu do wychwytu inkubowano w wytrząsarce dla 15 min w 30 ° C w obecności lub nieobecności insuliny 30 nM, w nośniku (PBS) lub w InsAb (końcowe rozcieńczenie 1: 500) , w IgG (końcowe rozcieńczenie 1: 500) lub w nośniku. Bufor wychwytu zawierał (w mM): NaCl (122); Na₂HPO₄ (3); NaH₂PO₄ (15); KCl (5); MgSO₄ (1.2); glukoza (10), CaCl₂ (1); nialamid (0.01); tropolone (0.1); i kwas askorbinowy (0.001), pH 7.4. Wykorzystanie [³H] DA zainicjowano przez szybkie dozowanie 20 μl każdej zawiesiny synaptosomów do płytek studzienkowych 96 z różnymi stężeniami DA (0.003-1.0 μM) i [³H] DA (5 nM); po 5 min w wytrząsarce do płytek w 25 ° C, wychwyt zakończono przez zimną, szybką filtrację próżniową⁶⁶. Zliczenia na studzienkę przekształcono w pmole, a następnie skorygowano do mg całkowitego białka na minutę. Wszystkie testy przeprowadzono w trzech powtórzeniach i powtórzono co najmniej cztery razy; V_max i K_m obliczono za pomocą oprogramowania Biosoft Kell Radlig (Cambridge, Wielka Brytania).

Analiza statystyczna

Dane podano jako średnie ± sem; istotność oceniano za pomocą sparowanych lub niesparowanych uczniów t-testy lub ANOVA, chyba że wskazano inaczej. Dla danych woltamperometrycznych n jest liczbą miejsc rejestracji, biorąc pod uwagę, że zmienność między ośrodkami w obrębie subregionu prążkowia jest większa niż zmienność między zwierzętami lub między przekrojami^{30, 32, 55, 56}; numer zwierzęcia jest odnotowywany dla każdego zestawu danych. WE₅₀ wpływ insuliny i nikotyny na wywołane pikiem [DA]_o obliczono stosując Prism 6.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). W przypadku danych elektrofizjologicznych istotność statystyczną oceniano za pomocą parowania t-testy lub test Wilcoxona w Prism 6.0 lub mieszana dwukierunkowa ANOVA w SAS 9.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC). Aby ocenić udział insuliny w warunkowaniu preferencji smakowych, zakończono dwa pełne badania z użyciem protokołów, które były identyczne z wyjątkiem zastosowanego leczenia nośnikiem. W pierwszym badaniu szczury 10 otrzymały infuzje nośników PBS i 9 otrzymały infuzje InsAB. W drugim badaniu szczury 10 otrzymywały infuzje nośników IgG i 10 otrzymywały infuzje InsAb. Nie było znaczącej różnicy między dwiema grupami nośników (PBS lub IgG) podczas sesji kondycjonowania wlewu (F₁₉= 0.619, mieszana dwukierunkowa ANOVA) z powtarzanymi pomiarami na sesji kondycjonowania wlewu) lub w teście (F₁₉= 0.012, dwukierunkowa mieszana ANOVA z powtarzanymi pomiarami smaku). W konsekwencji dwa eksperymenty połączono do analizy. Do tej analizy zastosowano mieszaną ANOVA 2 × 4 (z powtarzanymi pomiarami w dniu kondycjonowania wlewu) w celu określenia wpływu leczenia mikrowstrzykiwaniem podczas kondycjonowania, a następnie chronionego t-testy (jeden ogon, aby określić, w jakich sesjach kondycjonowania leczenie mikroiniekcyjne zmniejszyło objętość przyjmowania). Ta sama analiza została zakończona dla próbnych sesji kondycjonowania. Aby określić wpływ obróbki kondycjonującej podczas testu preferencji smaku dwóch butelek, dane analizowano stosując mieszaną dwukierunkową ANOVA (z powtarzanymi pomiarami smaku), a następnie zabezpieczono t-testy (jeden testowany w celu przetestowania hipotezy, że InsAb zmniejszy preferencje).

Jak zacytować ten artykuł: Stouffer, MA i wsp. Insulina zwiększa uwalnianie dopaminy z prążkowia poprzez aktywację interneuronów cholinergicznych, a tym samym sygnalizuje nagrodę. Nat. Commun. 6: 8543 doi: 10.1038 / ncomms9543 (2015).

1. Schulingkamp, ​​RJ, Pagano, TC, Hung, D. & Raffa, RB Receptory insuliny i działanie insuliny w mózgu: przegląd i implikacje kliniczne. Neurosci. Biobehav. Rev. 24, 855–872 (2000).
   • CAS
   • ISI
   • PubMed
   • Artykuł
   • Pokaż kontekst
2. Gerozissis, K. Insulina mózgowa, homeostaza energii i glukozy; geny, środowisko i patologie metaboliczne. Eur. J. Pharmacol. 585, 38 – 49 (2008).
3. CAS
4. PubMed
5. Artykuł
6. Pokaż kontekst
7. CAS
8. PubMed
9. Artykuł
10. Pokaż kontekst
11. CAS
12. PubMed
13. Artykuł
14. Pokaż kontekst
15. CAS
16. PubMed
17. Artykuł
18. Pokaż kontekst
19. CAS
20. ISI
21. PubMed
22. Artykuł
23. Pokaż kontekst
24. ISI
25. PubMed
26. Artykuł
27. Pokaż kontekst
28. CAS
29. PubMed
30. Artykuł
31. Pokaż kontekst
32. Pokaż kontekst
33. CAS
34. ISI
35. PubMed
36. Artykuł
37. Pokaż kontekst
38. CAS
39. ISI
40. PubMed
41. Artykuł
42. Pokaż kontekst
43. CAS
44. ISI
45. PubMed
46. Pokaż kontekst
47. ISI
48. PubMed
49. Artykuł
50. Pokaż kontekst
51. CAS
52. ISI
53. PubMed
54. Artykuł
55. Pokaż kontekst
56. CAS
57. ISI
58. PubMed
59. Artykuł
60. Pokaż kontekst
61. Pokaż kontekst
62. CAS
63. ISI
64. PubMed
65. Artykuł
66. Pokaż kontekst
67. CAS
68. ISI
69. PubMed
70. Artykuł
71. Pokaż kontekst
72. CAS
73. ISI
74. PubMed
75. Artykuł
76. Pokaż kontekst
77. PubMed
78. Artykuł
79. Pokaż kontekst
80. Pokaż kontekst
81. CAS
82. PubMed
83. Artykuł
84. Pokaż kontekst
85. ISI
86. PubMed
87. Artykuł
88. Pokaż kontekst
89. CAS
90. ISI
91. PubMed
92. Artykuł
93. Pokaż kontekst
94. CAS
95. ISI
96. PubMed
97. Artykuł
98. Pokaż kontekst
99. CAS
100. PubMed
101. Artykuł
102. Pokaż kontekst
103. Pokaż kontekst
104. CAS
105. ISI
106. PubMed
107. Artykuł
108. Pokaż kontekst
109. CAS
110. ISI
111. PubMed
112. Artykuł
113. Pokaż kontekst
114. CAS
115. ISI
116. PubMed
117. Artykuł
118. Pokaż kontekst
119. CAS
120. ISI
121. PubMed
122. Artykuł
123. Pokaż kontekst
124. PubMed
125. Artykuł
126. Pokaż kontekst
127. CAS
128. ISI
129. PubMed
130. Artykuł
131. Pokaż kontekst
132. CAS
133. PubMed
134. Artykuł
135. Pokaż kontekst
136. CAS
137. ISI
138. PubMed
139. Artykuł
140. Pokaż kontekst
141. CAS
142. PubMed
143. Artykuł
144. Pokaż kontekst
145. ISI
146. PubMed
147. Artykuł
148. Pokaż kontekst
149. Pokaż kontekst
150. Pokaż kontekst
151. CAS
152. ISI
153. PubMed
154. Artykuł
155. Pokaż kontekst
156. CAS
157. ISI
158. PubMed
159. Artykuł
160. Pokaż kontekst
161. CAS
162. ISI
163. PubMed
164. Artykuł
165. Pokaż kontekst
166. CAS
167. ISI
168. PubMed
169. Artykuł
170. Pokaż kontekst
171. CAS
172. ISI
173. PubMed
174. Pokaż kontekst
175. CAS
176. ISI
177. PubMed
178. Artykuł
179. Pokaż kontekst
180. PubMed
181. Artykuł
182. Pokaż kontekst
183. CAS
184. ISI
185. PubMed
186. Artykuł
187. Pokaż kontekst
188. CAS
189. ISI
190. PubMed
191. Artykuł
192. Pokaż kontekst
193. CAS
194. ISI
195. PubMed
196. Artykuł
197. Pokaż kontekst
198. CAS
199. ISI
200. PubMed
201. Artykuł
202. Pokaż kontekst
203. Pokaż kontekst
204. CAS
205. ISI
206. PubMed
207. Pokaż kontekst
208. Pokaż kontekst
209. Pokaż kontekst
210. Pokaż kontekst
211. CAS
212. ISI
213. PubMed
214. Artykuł
215. Pokaż kontekst
216. CAS
217. PubMed
218. Artykuł
219. Pokaż kontekst
220. CAS
221. ISI
222. PubMed
223. Pokaż kontekst
224. Pokaż kontekst
225. CAS
226. PubMed
227. Artykuł
228. Pokaż kontekst
229. ISI
230. PubMed
231. Artykuł
232. Pokaż kontekst
233. Pokaż kontekst
234. ISI
235. PubMed
236. Artykuł
237. Pokaż kontekst
238. Pokaż kontekst
239. CAS
240. ISI
241. PubMed
242. Artykuł
243. Pokaż kontekst
244. Pokaż kontekst
245. Vogt, MC & Bruning, JC Sygnalizacja insuliny w OUN w kontroli homeostazy energetycznej i metabolizmu glukozy - od embrionu do starości. Trends Endocrinol. Metab. 24, 76–84 (2013).
246. Havrankova, J., Schmechel, D., Roth, J. & Brownstein, M. Identyfikacja insuliny w mózgu szczura. Proc. Natl Acad. Sci. USA 75-5737 (5741).
247. King, GL & Johnson, S. Transport insuliny za pośrednictwem receptora przez komórki śródbłonka. Science 227, 1583-1586 (1985).
248. Strubbe, JH, Porte, D. Jr & Woods, SC Odpowiedzi na insulinę i poziomy glukozy w osoczu i płynie mózgowo-rdzeniowym podczas postu i ponownego karmienia szczurów. Physiol. Behav. 44, 205-208 (1988).
249. Banks, WA & Kastin, AJ Zróżnicowana przepuszczalność bariery krew-mózg na dwa peptydy trzustkowe: insulinę i amylinę. Peptides 19, 883-889 (1998).
250. Banki, WA Źródło insuliny mózgowej. Eur. J. Pharmacol. 490, 5 – 12 (2004).
251. Nemoto, T. i wsp. Nowe spostrzeżenia dotyczące syntezy insuliny i jej wydzielania w hipokampie szczura i korze mózgowej: indukowane amyloidem β1-42 obniżenie poziomu proinsuliny poprzez kinazę syntazy glikogenu-3β. Sygnał komórki. 26, 253 – 259 (2014).
252. De Souza, CT i wsp. Spożywanie bogatej w tłuszcze diety aktywuje odpowiedź prozapalną i indukuje oporność na insulinę w podwzgórzu. Endokrynologia 146, 4192 – 4199 (2005).
253. Anthony, K. i wsp. Tłumienie reakcji wywołanych insuliną w sieciach mózgowych kontrolujących apetyt i nagrodę w insulinooporności: podstawa mózgowa dla upośledzonej kontroli przyjmowania pokarmu w zespole metabolicznym? Cukrzyca 55, 2986 – 2992 (2006).
254. Kelley, AE & Berridge, KC Neuronauka naturalnych nagród: związek z uzależniającymi narkotykami. J. Neurosci. 22, 3306-3311 (2002).
255. Koob, GF i Volkow, ND Neurocircuitry of addiction. Neuropsychopharmacology 35, 217–238 (2010).
256. Werther, GA i wsp. Lokalizacja i charakterystyka receptorów insuliny w mózgu szczura i przysadce mózgowej in vitro autoradiografia i skompensowana densytometria. Endokrynologia 121, 1562 – 1570 (1987).
257. Figlewicz, DP, Evans, SB, Murphy, J., Hoen, M. & Baskin, DG Expression of receptors for insulin and leptin in ventral tegmental area / substance nigra (VTA / SN) of the rat. Brain Res. 964, 107-115 (2003).
258. Daws, LC i wsp. Sygnalizacja insulinowa i uzależnienie. Neuropharmacology 61, 1123 – 1128 (2011).
259. Figlewicz, DP & Sipols, AJ Sygnały regulacyjne dotyczące energii i nagrody żywnościowe. Pharmacol. Biochem. Behav. 97, 15–24 (2010).
260. Patterson, TA i wsp. Niedobór pokarmu zmniejsza mRNA i aktywność transportera dopaminy szczura. Neuroendokrynologia 68, 11 – 20 (1998).
261. Carvelli, L. i wsp. Regulacja kinazy PI 3 wychwytu dopaminy. J. Neurochem. 81, 859 – 869 (2002).
262. Williams, JM i wsp. Hipoinsulinemia reguluje indukowany amfetaminą odwrotny transport dopaminy. PLoS Biol. 5, e274 (2007).
263. Zhen, J., Reith, MEA & Carr, KD Przewlekłe ograniczenie żywności i funkcja transportera dopaminy w prążkowiu szczura. Brain Res. 1082, 98–101 (2006).
264. Schoffelmeer, AN i wsp. Insulina moduluje wrażliwą na kokainę funkcję transportera monoamin i zachowanie impulsywne. J. Neurosci. 31, 1284 – 1291 (2011).
265. Mebel, DM, Wong, JC, Dong, YJ & Borgland, SL Insulina w okolicy nakrywkowej brzusznej zmniejsza odżywianie hedoniczne i hamuje stężenie dopaminy poprzez zwiększony wychwyt zwrotny. Eur. J. Neurosci. 36, 2336-2346 (2012).
266. Labouebe, G. i wsp. Insulina indukuje długotrwałą depresję neuronów dopaminowych brzusznej okolicy nakrywkowej przez endokannabinoidy. Nat. Neurosci. 16, 300 – 308 (2013).
267. Konner, AC i wsp. Rola sygnalizacji insuliny w neuronach katecholaminergicznych w kontrolowaniu homeostazy energii. Cell Metab. 13, 720 – 728 (2011).
268. Figlewicz, DP, Bennett, JL, Aliakbari, S., Zavosh, A. & Sipols, AJ Insulina działa w różnych miejscach OUN, zmniejszając ostre spożycie sacharozy i samodzielne podawanie sacharozy u szczurów. Jestem. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 295, R388 – R394 (2008).
269. Patel, JC, Witkovsky, P., Coetzee, WA & Rice, ME Druga regulacja uwalniania dopaminy w prążkowiu przez pre-synaptic K_ATP kanały. J. Neurochem. 118, 721 – 736 (2011).
270. Tepper, JM & Bolam, JP Różnorodność funkcjonalna i specyfika neostriatal interneurons. Curr. Opin. Neurobiol. 14, 685-692 (2004).
271. Zhou, FM, Liang, Y. & Dani, JA Endogenna nikotynowa aktywność cholinergiczna reguluje uwalnianie dopaminy w prążkowiu. Nat. Neurosci. 4, 1224-1229 (2001).
272. Rice, ME i Cragg, SJ Nikotyna wzmacnia sygnały dopaminy związane z nagrodą w prążkowiu. Nat. Neurosci. 7, 583–584 (2004).
273. Zhang, H. & Sulzer, D. Zależna od częstotliwości modulacja uwalniania dopaminy przez nikotynę. Nat. Neurosci. 7, 581–582 (2004).
274. Patel, JC, Rossignol, E., Rice, ME i Machold, RP Przeciwstawne regulacje uwalniania dopaminy w prążkowiu i eksploracyjnych zachowań motorycznych przez cholinergiczne bodźce przodomózgowia i pnia mózgu. Nat. Commun. 3, 1172 (2012).
275. Threlfell, S. i wsp. Uwalnianie dopaminy prążkowia jest wyzwalane przez synchroniczną aktywność w neuronach cholinergicznych. Neuron 75, 58 – 64 (2012).
276. Cachope, R. i wsp. Selektywna aktywacja interneuronów cholinergicznych zwiększa uwalnianie fazowe dopaminy dopełniającej: ustawia ton dla przetwarzania nagrody. Rep. Komórkowa 2, 1 – 9 (2012).
277. Jones, IW, Bolam, JP i Wonnacott, S. Presynaptic localization of the nikotynic acetylcholine receptor beta2 subunit immunoreactivity in rat nigrostriatal dopaminergic neurones. J. Comp. Neurol. 439, 235-247 (2001).
278. Higley, MJ i wsp. Cholinergiczne interneurony pośredniczą w szybkiej zależnej od VGluT3 transmisji glutaminergicznej w prążkowiu. PLoS ONE 6, e19155 (2011).
279. Touzani, K., Bodnar, R. & Sclafani, A. Aktywacja receptorów dopaminowych D1-podobnych w jądrze półleżącym ma kluczowe znaczenie dla nabycia, ale nie ekspresji, preferencji smakowych uwarunkowanych przez składniki odżywcze u szczurów. Eur. J. Neurosci. 27, 1525-1533 (2008).
280. Sclafani, A., Touzani, K. & Bodnar, RJ Dopamine i wyuczone preferencje żywieniowe. Physiol. Behav. 104, 64–68 (2011).
281. Mayer, CM i Belsham, DD Centralna sygnalizacja insuliny jest osłabiona przez długotrwałą ekspozycję na insulinę poprzez fosforylację seryny substratu 1 receptora insuliny, degradację proteasomalną i lizosomalną degradację receptora insuliny. Endocrinology 151, 75–84 (2010).
282. Rice, ME, Patel, JC & Cragg, SJ Uwalnianie dopaminy w zwojach podstawy mózgu. Neuroscience 198, 112–137 (2011).
283. Smith, Y., Surmeier, DJ, Redgrave, P. i Kimura, M. Wkład wzgórza w zmiany behawioralne związane z zwojami podstawnymi i wzmocnienie. J. Neurosci. 31, 16102-16106 (2011).
284. Threlfell, S. i wsp. Striatalne receptory muskarynowe promują zależność aktywności przenoszenia dopaminy przez różne podtypy receptorów na neuronach cholinergicznych w prążkowiu brzusznym i grzbietowym. J. Neurosci. 30, 3398 – 3408 (2010).
285. Hoebel, BG, Avena, NM & Rada, P. Accumbens równowaga dopaminy-acetylocholiny w podejściu i unikaniu. Curr. Opin. Pharmacol. 7, 617–627 (2007).
286. Pothos, EN, Creese, I. & Hoebel, BG Ograniczone odżywianie z utratą wagi wybiórczo zmniejsza pozakomórkową dopaminę w jądrze półleżącym i zmienia odpowiedź dopaminy na amfetaminę, morfinę i przyjmowane pokarmy. J. Neurosci. 15, 6640-6650 (1995).
287. Geiger, BM i wsp. Deficyty mezolimbicznej neurotransmisji dopaminy w otyłości dietetycznej u szczurów. Neuroscience 159, 1193 – 1199 (2009).
288. Morris, JK i wsp. Oporność na insulinę upośledza nigrostriatalną funkcję dopaminy. Exp. Neurol. 231, 171 – 180 (2011).
289. De Araujo, IE i wsp. Nagroda pokarmowa przy braku sygnalizacji receptora smaku. Neuron 57, 930 – 941 (2008).
290. Stice, E., Spoor, S., Bohon, C. & Small, DM Związek między otyłością a stępioną odpowiedzią prążkowia na pokarm jest moderowany przez allel TaqIA A1. Science 322, 449–452 (2008).
291. Wang, GJ i wsp. Dopamina mózgowa i otyłość. Lancet 357, 354 – 357 (2001).
292. Johnson, PM i Kenny, PJ Dopaminowe receptory D2 w dysfunkcji nagrody podobnej do uzależnienia i kompulsywnym jedzeniu u otyłych szczurów. Nat. Neurosci. 13, 635–641 (2010).
293. Carr, KD, Kim, G.-Y. & Cabeza de Vaca, S. Nagradzające i pobudzające ruchy działanie bezpośrednich agonistów receptora dopaminy jest spotęgowane przez przewlekłe ograniczenie pokarmu u szczurów. Psychopharmacology (Berl.) 154, 420–428 (2001).
294. Levin, BE i Keesey, RE Obrona różnych punktów masy ciała u otyłych i opornych szczurów wywołanych dietą. Jestem. J. Physiol. 274, R412 – R419 (1998).
295. Patel, JC & Rice, ME Monitorowanie aksonalnego i somatodendrytycznego uwalniania dopaminy przy użyciu szybkiej cyklicznej woltamperometrii w skrawkach mózgu. Methods Mol. Biol. 96, 243–273 (2013).
296. Lee, CR, Witkovsky, P. & Rice, ME Regulacja istoty czarnej pars reticulata GABAergic neuron activity by H₂O₂ przez kanały wrażliwe na kwas flufenamowy i K_ATP kanały. Z przodu. Syst. Neurosci. 5, 14 (2011).
297. Chen, BT, Moran, KA, Avshalumov, MV & Rice, ME Ograniczona regulacja uwalniania dopaminy somatodendrytycznej przez wrażliwy na napięcie Ca²⁺ kanały kontrastowały z silną regulacją aksonalnego uwalniania dopaminy. J. Neurochem. 96, 645 – 655 (2006).
298. Li, X. i wsp. Zwiększona transmisja dopaminy w prążkowiu i sprawność motoryczna nadekspresji LRRK2 u myszy jest eliminowana przez rodzinną mutację choroby Parkinsona G2019S. J. Neurosci. 30, 1788 – 1797 (2010).
299. Wu, Q., Reith, MEA, Wightman, RM, Kawagoe, KT & Garris, PA Wyznaczanie parametrów uwalniania i wychwytu na podstawie dynamiki dopaminy wywołanej elektrycznie mierzonej woltamperometrią w czasie rzeczywistym. J. Neurosci. Methods 112, 119–133 (2001).
300. Chen, BT, Avshalumov, MV & Rice, ME H.₂O₂ to nowy, endogenny modulator uwalniania synaptycznej dopaminy. J. Neurophysiol. 85, 2468 – 2476 (2001).
301. Witkovsky, P., Patel, JC, Lee, CR & Rice, ME Immunocytochemiczna identyfikacja białek zaangażowanych w uwalnianie dopaminy z przedziału somatodendrytycznego nigralnych neuronów dopaminergicznych. Neuroscience 164, 488–496 (2009).
302. Sugimoto, K. i wsp. Receptor insuliny w nerwach obwodowych szczura: jego lokalizacja i alternatywnie składane izoformy. Cukrzyca Metab. Res. Rev. 16, 354 – 363 (2000).
303. M. Sanchez-Alavez i wsp. Insulina powoduje hipertermię poprzez bezpośrednie hamowanie wrażliwych na ciepło neuronów. Cukrzyca 59, 43 – 50 (2010).
304. Paxinos, G. & Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates 6th edn Academic (2007).
305. Strubbe, JH & Mein, CG Zwiększone karmienie w odpowiedzi na obustronne wstrzyknięcie przeciwciał insulinowych w VMH. Physiol Behav. 19, 309-313 (1977).
306. Paranjape, SA i wsp. Wpływ insuliny w brzuszno-przyśrodkowym podwzgórzu na wydzielanie glukagonu trzustki in vivo. Cukrzyca 59, 1521 – 1527 (2010).
307. Wise, RA & Hoffman, DC Lokalizacja mechanizmów nagrody leków przez wstrzyknięcia wewnątrzczaszkowe. Synapsa 10, 247–263 (1992).
308. Zhen, J., Maiti, S., Chen, N., Dutta, AK i Reith, MEA Interakcja między hydroksypiperydynowym analogiem 4- (2-benzhydryloksy-etylo) -1- (4-fluorobenzylo) piperydyny i asparaginianu 68 w ludzki transporter dopaminy. Eur. J. Pharmacol. 506, 17–26 (2004).

Pobierz odniesienia

Badania te były wspierane przez grant NIH DA033811 (MER, KDC i MEAR), NS036362 (MER), DA03956 (KDC) i nagrodę NARSAD Independent Investigator Award (KDC). S961 był hojnym prezentem od Dr Lauge Schaffer, Novo Nordisk. Przeciwciało PP5 było hojnym prezentem od firmy Pfizer. Dziękujemy dr Charlesowi Nicholsonowi z NYU School of Medicine za oprogramowanie do ekstrakcji V_max wartości z danych FCV.