Inwazja sacharozy indukuje szybki handel receptorami AMPA (2013)

J Neurosci. Rękopis autora; dostępny w PMC Oct 3, 2013.
Opublikowany w końcowym edytowanym formularzu jako:
Ostateczna, zredagowana wersja tego artykułu jest dostępna bezpłatnie pod adresem J Neurosci
Zobacz inne artykuły w PMC, że cytować opublikowany artykuł.

Abstrakcyjny

Mechanizmy, dzięki którym nagrody naturalne, takie jak cukier, wpływają na transmisję synaptyczną i zachowanie, są w dużej mierze niezbadane. Tutaj badamy regulację synaps jądra półleżącego przez spożycie sacharozy. Wcześniejsze badania wykazały, że przemyt receptora AMPA jest głównym mechanizmem regulacji siły synaptycznej in vitro, przemieszczanie receptorów AMPA zawierających podjednostkę GluA1 odbywa się poprzez dwuetapowy mechanizm obejmujący transport receptorów pozasynaptycznych, a następnie transport synaptyczny. Zgłaszamy, że u szczurów powtarzane codzienne przyjmowanie roztworu sacharozy 25% przejściowo podwyższonego spontanicznego poruszania się i nasilonych synaps rdzeniowych półleżących poprzez włączenie Ca2+-przepuszczalne receptory AMPA (CPAR), które zawierają receptory AMPA zawierające GluA1 i pozbawione GluA2. Badania elektrofizjologiczne, biochemiczne i ilościowe mikroskopii elektronowej wykazały, że trening sacharozy (7 dni) indukował stabilną (> 24 godz.) Wewnątrzrdzeniową populację GluA1, oraz że u tych szczurów pojedynczy bodziec sacharozy szybko (5 min), ale przejściowo (<24 godz.) Był podwyższony GluA1 w miejscach pozasynaptycznych. Wymagane były CPAR i receptory dopaminy D1 in vivo dla zwiększonej lokomocji po spożyciu sacharozy. Co istotne, protokół 7-day codziennego spożywania 3% roztworu sacharyny, niekalorycznego środka słodzącego, indukował synaptyczny GluA1 podobnie do 25% sacharozy. TWyniki hese wskazują na wieloetapowy handel GluA1, opisany wcześniej in vitro, jako mechanizm ostrej regulacji transmisji synaptycznej in vivo przez naturalną nagrodę orosensoryczną. Handel jest stymulowany drogą chemosensoryczną, która nie zależy od wartości kalorycznej sacharozy.

Wprowadzenie

Nadmierna konsumpcja sacharozy stanowi istotny problem zdrowia publicznego (Hu i Malik, 2010), ale mechanizmy, za pomocą których naturalne nagrody orosensoryczne, takie jak sacharoza, regulują transmisję synaptyczną, wpływając na zachowanie, nie są znane. Plastyczność synaptyczna w jądrze półleżącym, integralny składnik obwodów nagrody mózgowej (Sesack and Grace, 2010), przyczynia się do wielu form zmotywowanych zachowań, w tym do nagradzania (Day and Carelli, 2007), odpowiedzi na stres społeczny (LaPlant i in., 2010) oraz patologie uzależnień (Luscher i Malenka, 2011). Powtarzająca się ekspozycja na kokainę powoduje plastyczność synaptyczną w neuronach półleżących i brzusznych obszarów nakrywkowych (VTA) (Brebner i in., 2005; Grueter i in., 2010; Mameli i in., 2009; Pascoli i in., 2012; Thomas i wsp., 2001; Ungless i in., 2001). Po przedłużonym dostępie do kokainy, a następnie przedłużającym się wycofaniu, synapsy są wzmacniane poprzez włączenie Ca2+-przepuszczalne, pozbawione GluA2 receptory glutaminianowe typu AMPA (CPAR), których sygnalizacja pośredniczy w inkubacji głodu kokainowego (Conrad i in., 2008; McCutcheon i in., 2011a). Podobnie jak kokaina, nagrody orosensoryczne, takie jak sacharoza, silnie podnoszą poziom półleżącej dopaminy (Smith, 2004), ale nie zbadano indukcji nagromadzenia nagromadzonej półleżącej krwi.

Receptory AMPA (AMPAR) są głównymi mediatorami transmisji pobudzenia ośrodkowego układu nerwowego, a ich handel przyczynia się do różnych procesów nerwowych, w tym uczenia się i pamięci (Nedelescu i in., 2010; Rumpel i in., 2005; Whitlock i in., 2006). AMPARs składają się z czterech różnych podjednostek, GluA1-4. AMPARs zawierające GluA2 to Ca2+- przepuszczalny i ruch konstytutywny dla synaps, podczas gdy receptory pozbawione GluA2 (CPAR), które są głównie homomerami GluA1, przewodzą Ca2+ i wykazują wewnętrzną rektyfikację. GluA1 przechodzi zależny od aktywności ruch synaptyczny przez dwuetapową ścieżkę, w której fosforylacja Ser 845 przez kinazę białkową zależną od cAMP (PKA) i zależną od cGMP kinazę białkową II (cGKII) sprzyja akumulacji receptora w miejscach pozasynaptycznych w błonie plazmatycznej (Esteban i in., 2003; Serulle i in., 2007; Sun i wsp., 2008; Sun i wsp., 2005). Po bocznej dyfuzji do synapsy fosforylacja Ser 818 przez PKC stabilizuje AMPAR w synapsie (Boehm i in., 2006), zakotwiczone do gęstości postsynaptycznej (Ehlers i in., 2007; Oh et al., 2006; Serulle i in., 2007). Jak2+fosforylacja kinazy II zależnej od kalmoduliny II (CaMKII) Ser 567 i Ser 831 również przyczynia się do włączenia synaptycznego i kierowania pozasynaptycznego (Lu i wsp., 2010; Roche i in., 1996), odpowiednio. Nie wiadomo jednak, czy in vivo włączenie CPAR wykorzystuje te szybkie, wieloetapowe mechanizmy opisane in vitro.

Aby zbadać mechanizmy, za pomocą których nagrody orosensoryczne, takie jak sacharoza, regulują synapsy pobudzające półleżące, zastosowaliśmy paradygmat krótkiego przyjmowania sacharozy i zmierzyliśmy zmiany w transmisji synaptycznej w neuronach półleżących. Obserwujemy, że powtarzające się spożywanie sacharozy nasila bodźce półleżące poprzez włączenie CPAR i że u zwierzęcia wyszkolonego w sacharozie pojedynczy bodziec sacharozy jest wystarczający, aby wywołać szybki ruch GluA1 do miejsc pozasynaptycznych. Ponieważ sacharyna, niekaloryczna substancja słodząca, wywołuje ruch synaptyczny podobnie jak sacharoza, handel jest reakcją na szlaki orosensoryczne, a nie kaloryczne. Ponadto blokada CPAR zapobiegała indukowanym przez sacharozę wzrostom spontanicznej aktywności lokomotorycznej in vivo, dalsze identyfikowanie jednostek centralnych rozliczeniowych typu accumbens jako ważnych regulatorów reakcji na nagrody naturalne.

Materiały i Metody

Przedmioty i procedury chirurgiczne

Osobnikami były samce szczurów Sprague-Dawley (Taconic; eksperymenty behawioralne) ważące 150-300 gramy po przybyciu i samice szczurów E18 ciężarnych Sprague-Dawley (eksperymenty Taconic; hodowla komórek). Szczury trzymano 2 na klatkę do eksperymentów behawioralnych w cyklu 12h / 12h światło-ciemność (światła na 18: 00) i miały dostęp do żywności i wody ad libitum w każdym momencie. Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Instytucję ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt w New York University School of Medicine i zostały przeprowadzone zgodnie z „Zasadami opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi” (numer publikacji NIH 85 – 23).

Trening sacharozy i pomiary lokomotoryczne

Szczury transportowano do pokoju testowego 3 przez kolejne dni dla 2 h / dzień w ich klatkach domowych. Czwartego dnia butelki zawierające wodę lub 25% sacharozy wprowadzono przez pokrywę klatki dla 5 min. Następnie zważono butelki. We wszystkich doświadczeniach szczury musiały wypić co najmniej 1 g sacharozy podczas dostępu 5 min w ciągu 3 dni rozpoczęcia szkolenia, aby włączyć je do badania; w rzeczywistości wszystkie szczury spełniły to kryterium. Po usunięciu butelki szczury pozostały w pomieszczeniu testowym przez 30 min przed transportem z powrotem do obiektu dla zwierząt. W dniu poświęcenia szczury stały się nieprzytomne przez CO2, dekapitowano gilotyną, a próbki tkanek zbierano na lodzie. W przypadku eksperymentów lokomotorycznych szczury umieszczono w komorach pomiarowych lokomotorycznych (Accuscan, Columbus, OH) w sumie 35-min. Po 15-min w komorze, butelka z korkiem została wprowadzona przez górną część komory i ustabilizowana. Butelkę usunięto z górnej części komory po 5-min, a szczury pozostały w komorze przez dodatkowe 15-min po usunięciu butelki. Tę procedurę powtórzono identycznie dla 7 kolejnych dni. Przebyty dystans zmierzono za pomocą systemu VersaMax (Accuscan, Columbus, OH), który monitorował aktywność zwierząt za pomocą siatki wiązek światła podczerwonego 16 × 16, które przechodzą przez klatkę dla zwierząt (42 × 42 × 30 cm) od przodu do tyłu i od lewej do prawej . Informacje o stanie wiązki, skanowane z szybkością 100 razy na sekundę, były przechowywane na dysku. Aktywność wyrażono jako odległość ambulatoryjną mierzoną w cm podczas 12 różnych 3-min pojemników w sesji 35 min (końcowy pojemnik był 2-min).

Trening sacharyny

Aby porównać indukowany sacharozą ruch GluA1 z efektami spożycia sacharyny, dorosłe samce szczurów 12 (250 g) umieszczono w obiekcie dla zwierząt w cyklu 12 godzin światło / ciemność. Następnie wszystkie szczury przyzwyczajały się do pomieszczenia testowego, przenosząc je do pomieszczenia testowego, pozostawiano na godziny 2 i transportowano z powrotem do zakładu dla zwierząt. Jeden w XNXX dniu (po dniach przyzwyczajenia 4) szczurom podano butelki z dostępem zawierające wodę, sacharozę lub sacharynę. Szczury 3 miały dostęp do butelki zawierającej wodę spoczywającej na górze klatki z dziobkiem wystającym do klatki przez pokrywkę. Czas dostępu wynosił 4 minut, następnie butelkę usunięto, a po 5 min dodatkowe minuty szczurów przeniesiono z powrotem do obiektu dla zwierząt. Szczury 15 miały dostęp do roztworu 4% sacharozy, a szczury 25 miały dostęp do roztworu 4% sacharyny (Sweet'n Low). Zmierzono objętość zużytego płynu. Procedurę tę powtórzono w dniach 3. W X-XI dniu picia, bezpośrednio po usunięciu butelki, szczury uśmiercono i zebrano rdzeń półleżący, a poziomy GluA7 zbadano metodą Western blot.

Elektrofizjologia

Szczury wytresowano w sacharozie, jak opisano powyżej, w przezroczystych klatkach z tworzywa sztucznego i po usunięciu butelki w dniu 7 znieczulono ketaminą (100 mg / kg ip) i ksylazyną (10 mg / kg ip) i perfundowano przezsercowo zimną solą fizjologiczną (eksperymenty mEPSC) lub natychmiast dekapitowano (eksperymenty rektyfikacji). Mózgi szybko usuwano do sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF) składającego się z następujących (w mM): dla eksperymentów mEPSC: NaCl (118), KCl (2.5), CaCl2 (3), MgCl2 (1), NaHCO3 (26), NaH2PO4 (1), D-glukoza (10), osmolarność dostosowana do 325 mOsm i napowietrzana przez 95% O2/ 5% CO2 (pH 7.4); do eksperymentów rektyfikacyjnych: sacharoza 75, 87 NaCl, 2.5 KCl, 1.25 NaH2PO4, 0.5 CaCl2, 7 MgCl2 6 H2O, 25 NaHCO3, Dekstroza 10, barbotowana 95% O2 / 5% CO2 (pH 7.4). Plastry koronalne (grubość 300μm) zawierające jądro półleżące wycięto w lodowatym ACSF przy użyciu wibrotomu (Leica, VT1200S) i utrzymywano zanurzone w ACSF (ACSF, w mM: 124 NaCl, 2.5 KCl, 1.25 NaH2PO4, 2.5 CaCl2, 1.5 MgSO4 7H2O, 26 NaHCO3i 10 dekstrozy) przez <30 min; następnie trzymano w preinkubatorze na plastry w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę, aby umożliwić regenerację. W przypadku eksperymentów mEPSC: pojedynczy wycinek przeniesiono następnie do komory rejestrującej, w której był zanurzony w nylonowej siatce w temperaturze 32 ° C z wbudowanym podgrzewaczem roztworu i kontrolerem TC324B (Warner Instruments, CT). Komorę poddawano ciągłej perfuzji ACSF ze stałą szybkością 2 ml / min. Średnie neurony kolczaste z obszaru rdzenia jądra półleżącego zidentyfikowano pod kontrolą wzrokową za pomocą interferencyjnego mikroskopu wideo z kontrastem w podczerwieni (Hamamatsu C5405) z pionowym mikroskopem Olympus BX50WI wyposażonym w obiektyw zanurzeniowy o dużej odległości roboczej 40x. Elektrody łatkowe (4–6 MΩ) wypełnione roztworem pipety wewnątrzkomórkowej zawierającej (w mM): CsCl (145), HEPES (10), EGTA (0.5) i MgATP (5). Osmolarność doprowadzono do 290 mOsm za pomocą sacharozy, a pH doprowadzono do 7.4 za pomocą CsOH. Miniaturowe pobudzające prądy postsynaptyczne (mEPSC) rejestrowano w obecności bicukuliny (10 μM) i tetrodotoksyny (1 μM) przy użyciu wzmacniacza Axopatch 200B (Molecular Devices, CA) i zdigitalizowano przez Digidata 1322A (Molecular Devices, CA). Do eksperymentów rektyfikacyjnych: skrawki przenoszono do komory rejestrującej i perfundowano (2.0–2.5 ml min-1) z natlenionym ACSF w 33 – 35 ° C zawierającym pikrotoksynę 50 μm w celu wyizolowania EPSC. Zapis somatycznych całych komórek wykonano z rdzeniowych rdzeniowych średnich neuronów w napięciu-zacisku ze wzmacniaczem Multiclamp 700B (Molecular Devices) przy użyciu mikroskopii wideo IR-DIC. Pipety krosowe (4 – 6 MΩ) wypełniono roztworem wewnątrzkomórkowym (w mM: 125 Cs-glukonian, 2 CsCl, 5 TEA-Cl, 4 Mg-ATP, 0.3 GTP, fosfokreatyna 10, 10 HEPES, 0.5 EGTA i 3.5 QX -314). Dane filtrowano przy 2 kHz, digitalizowano przy 10 kHz i analizowano przy użyciu Clampfit 10 (Molecular Devices). Stymulację pozakomórkową (0.01 – 1 ms, 5 – 150 μA, 0.2 Hz) zastosowano za pomocą małej szklanej elektrody bipolarnej 0.05 – 0.5 mm od elektrody rejestrującej. Po ~ XUMX min rejestracji linii podstawowej, roztwór zawierający Naspm (10 μM) perfundowano do kąpieli przez 200 min. Zmiany amplitudy EPSC mierzono przed i po podaniu leku w potencjałach utrzymywania −10, −70, −50, 30, + 0, + 20 i + 40 mV. Indeks rektyfikacji (ir) został obliczony poprzez skorygowanie ewentualnych przesunięć potencjału odwracania i obliczony z następującego równania: ir = (I-70 / 70) / (I+ 40 / 40), gdzie I-70 i I+ 40 są amplitudy EPSC zarejestrowane odpowiednio w -70 mV i + 40 mV.

Frakcjonowanie subkomórkowe i Western blotting

Odczyny zbierano na lodzie, jak opisano powyżej. Gdy rdzeń i skorupa zostały oddzielnie rozdzielone, separacja została potwierdzona przez sondowanie frakcji synaptosomu pod kątem β-hydroksylazy dopaminowej, enzymu znajdującego się w końcówkach aksonów w powłoce, ale nie w rdzeniu (Sesack and Grace, 2010). Frakcje zawierające całą komórkę, synaptosom i PSD przygotowano jak opisano wcześniej (Jordan i in., 2004). Osady synaptosomalne ponownie zawieszono w 200 μl 25 mM Tris z 1% Triton X-100, kołysano w 4 ° C dla 30-min, i wirowano przy 13,800 x g dla 15-min w mikrowirówce do granulowania PSD. Osad zawierający surowe PSD ponownie zawieszono w 25 mM Tris z 2% SDS. Frakcje analizowano metodą Western blot na żelach SDS-PAGE, jak opisano wcześniej (Jordan i in., 2004). Zastosowano następujące przeciwciała: β-hydroksylazę dopaminową (1: 1,000, Abcam), GluA1 (1: 1,000, Millipore), fosfor-Ser 845 GluA1 (1: 1,000, Millipore), GluA2 (1: 1,000, Millipore) i tubulinę (1: 10,000, Sigma).

Mikroskopia elektronowa

W dniu pobierania tkanki (dzień 7 treningu sacharozy), szczury z grup testowych 3 (woda, sacharoza / woda, sacharoza; szczury 3 / grupa testowa) umieszczono w komorach pomiaru ruchu na 15-min; w 15-min butelkę wprowadzono przez szczyt komory. Szczury w grupie wodnej otrzymywały wodę, szczury w grupie ustrozowej otrzymywały 25% sacharozy, szczury w grupie Sacharoza / Woda, które spożywały 25% sacharozy na dni 6, otrzymywały wodę. Szczury głęboko znieczulono Nembutalem (50 mg / kg ip) i perfundowano przezsercowo buforem fosforanowym 0.1 M (pH 7.4) zawierającym 4% paraformaldehyd i 0.1% glutaraldehyd z szybkością 50 ml / min podczas pierwszego 3-min, następnie w szybkość 20 ml / min dla następnej 7-min. Tkankę przygotowano do znakowania immunologicznego po nałożeniu (PEG), a obrazy przechwytywano jak opisano wcześniej (Nedelescu i in., 2010). Etykiety immunologiczne zostały skategoryzowane według ich pozycji względem PSD w asymetrycznych złączach synaptycznych jako „rozszczep”, „w pobliżu PSD” (w obrębie szerokości PSD 1 z PSD), „w PSD”, „wewnątrzrdzeniowy” lub „błona pozasynaptyczna”. każde zwierzę, synapsy 93 były próbkami z jądra półleżącego. Losowe pobieranie próbek zostało zapewnione poprzez analizę wszystkich pierwszych losowo napotkanych synaps 93, gdy systematycznie przesuwałyśmy się po siatce, a następnie łączono tę samą liczbę synaps z każdego z trzech zwierząt, które otrzymały identyczne zabiegi przedubojowe. Przeprowadzono dwa rodzaje kwantyfikacji. Jednym z nich była ocena poziomu immunoreaktywności GluR1, poprzez ustalenie liczby cząstek PEG, które wystąpiły w odrębnych domenach funkcjonalnych kręgosłupa. Drugim było oszacowanie proporcji synaps oznaczonych na PSD przez dowolną liczbę cząstek PEG. Nawet synapsy znakowane tylko cząstką PEG 1 uznano za oznakowane, na podstawie wcześniejszych prac wykazujących specyficzność procedury GluR1-PEG (Nedelescu i in., 2010). Wpływ leczenia na proporcję i poziom znakowania immunologicznego GluR1 analizowano jednokierunkową ANOVA z planowanymi porównaniami post hoc (LSD Fishera). Aby wyeliminować błąd eksperymentalny, dane zostały potrójnie zaślepione: jeden eksperymentator przeprowadził trening sacharozy i prowadził zapisy zwierząt w trzech grupach testowych, drugi eksperymentator stworzył mikrografy elektronowe i przypisał nowy kod alfanumeryczny do każdej mikrografii i zachował kod zapieczętowany , a trzej dodatkowi eksperymentatorzy zeskanowali mikrografie i ilościowe cząstki PEG. Po zakończeniu kwantyfikacji PEG eksperymentatorzy zebrali się, aby ujawnić tożsamości każdej mikrografii.

Implantacja kaniuli i zastrzyki wewnątrzczaszkowe

Wstrzyknięcie wewnątrzczaszkowe zastosowano do dostarczania Naspm i APV do rdzenia półleżącego. Do implantacji kaniuli, jak opisano wcześniej (Carr i in., 2010), szczury głęboko znieczulono ketaminą (100 mg / kg ip) i ksylazyną (10 mg / kg ip) i wstrzyknięto pooperacyjnie benaminę przeciwbólową (1 mg / kg podskórnie). Szczury wszczepiono stereotaktycznie dwiema kaniulami prowadzącymi 26 (PlasticsOne, Roanoke, VA) obustronnie w rdzeniu półleżącym o współrzędnych: 1.6 mm przed bregma; 2.9 mm poprzecznie do szwu strzałkowego, końcówki pochylone 8 ° w kierunku linii środkowej, 5.6 mm brzuszne do powierzchni czaszki. Kaniule utrzymywano na miejscu przez akryl dentystyczny i utrzymywano drożność za pomocą mandrynu okluzyjnego. Do iniekcji wewnątrzczaszkowych, roztwory Naspm i APV wprowadzono do dwóch długości 30 cm rurki PE-50 przymocowanej na jednym końcu do strzykawek Hamiltona 25-μl wypełnionych wodą destylowaną, a na drugim końcu do kaniuli iniekcyjnej 31, która wydłużyła 2.0 mm poza wszczepionymi przewodnikami. Strzykawki zostały zamontowane na podwójnych uchwytach pompy strzykawkowej Harvard 2272 microliter, która dostarczyła objętość wstrzyknięcia 0.5 μl przez okres 100 sek. W minutę po zakończeniu wstrzyknięć usunięto kaniule iniekcyjne z prowadnic, wymieniano mandryn i zwierzęta umieszczono w komorach do testów lokomotorycznych do treningu sacharozy. Po uśmierceniu zwierząt analizowano kriogeniczne skrawki mózgu pod kątem lokalizacji kaniuli; 2 ze zwierząt 15 wykluczono z badania z powodu niewłaściwego umieszczenia kaniuli.

Analiza statystyczna

Jednokierunkową ANOVA, a następnie testy post hoc Fishera zastosowano do mikroskopii elektronowej, immunocytochemii i eksperymentów biotynylacji. W elektrofizjologii zastosowano dwustronne testy t-Studenta. W przypadku eksperymentów z nadaktywnością sacharozy zastosowano dwukierunkową ANOVA, a następnie testy post hoc Fishera.

WYNIKI

Charakterystyka paradygmatu przyjmowania sacharozy

Zastosowaliśmy paradygmat przyjmowania sacharozy, aby zbadać wpływ naturalnej nagrody orosensorycznej na transmisję synaptyczną (Rysunek 1A). Dorosłe samce szczurów transportowano do pokoju testowego przez trzy kolejne dni. Czwartego dnia (pierwszy dzień treningu) szczury umieszczono w komorze pomiarowej lokomotorycznej. Po 15 minutach pomiaru aktywności lokomotorycznej w komorze, butelki zawierające albo wodę (dla zwierząt wodnych) albo roztwór sacharozy 25% (dla zwierząt z sacharozą) wprowadzono do komór pomiarowych przez otwory w pokrywie komory. Butelki usunięto po minutach 5 i zmierzono aktywność lokomotoryczną dla dodatkowych 15 minut przed zwróceniem zwierząt do domowych klatek. Powtórzyliśmy tę procedurę dla kolejnych dni 7. W niektórych eksperymentach trening sacharozy został rozszerzony na 8th dzień. Ten krótki, bezwarunkowy dostęp do bardzo smacznego rozwiązania pozwolił nam zbadać zarówno ostre, jak i skumulowane skutki spożycia sacharozy, ponieważ zwierzęta niezawodnie wchłaniały sacharozę energicznie podczas okna dostępu w ciągu trzech dni treningu (Rysunek 1B). Te warunki eksperymentalne umożliwiły porównanie grup testowych bezpośrednio po zaprzestaniu przyjmowania. Naszym kryterium włączenia do badania było to, że szczury zaczynają spożywać co najmniej jeden gram sacharozy podczas okresu dostępu w ciągu trzech dni od rozpoczęcia szkolenia; żadne zwierzęta nie zostały wykluczone z badania na podstawie tego kryterium.

Rysunek 1  

Powtarzające się przyjmowanie sacharozy powoduje przejściowe podwyższenie samoistnego poruszania się.

Zaobserwowaliśmy, że w ciągu trzech dni treningu zwierzęta z sacharozy spożywały znacznie więcej roztworu sacharozy niż zwierzęta wodne spożywały wodę (Rysunek 1B). Ponadto, podczas gdy w dniach treningowych 1 – 6 nie zaobserwowano żadnych istotnych różnic w spontanicznym poruszaniu się (dane nie pokazane), zaobserwowaliśmy znaczny wzrost całkowitej przebytej odległości u zwierząt z sacharozą w porównaniu ze zwierzętami wodnymi w ciągu trzech minut po usunięciu butelki w dniu 7 (Rysunek 1D), a ta różnica była również obecna w dniu 8 (Rysunek 1E). W ciągu trzech minut przed wprowadzeniem butelki w żadnym z dni testowych nie zaobserwowano różnic w całkowitej przebytej odległości pomiędzy zwierzętami wodnymi i sacharozowymi (Rysunek 1C), sugerując, że podwyższona lokomocja była ostrą reakcją na spożycie sacharozy specyficznie dla szczura trenowanego przez sacharozę, a nie warunkową odpowiedzią na komorę lokomocyjną. Zgodnie z tą możliwością wystąpiła istotna dodatnia korelacja między ilością spożywanej sacharozy a całkowitą przebytą odległością (Rysunek 1F). Nie było różnicy w masie zwierząt między grupami sacharozy i wody przed lub po dniach treningu 7 (danych nie pokazano).

Spożycie sacharozy indukuje inkorporację CPAR

Trening z sacharozą doprowadził do przejściowego podniesienia lokomocji w ostatnim dniu treningowym. Aby ustalić, czy temu następstwu spożycia sacharozy towarzyszyły zmiany elektrofizjologiczne jądra półleżącego, regionu regulującego zachowanie nagrody, przygotowaliśmy plasterki jądra półleżącego natychmiast po usunięciu butelki w dniu 7 i zarejestrowano z neuronów rdzenia półleżącego (Rysunek 2A). Podstawowy podregion ma związek z reakcjami lokomotorycznymi na bodźce nagradzające (Sesack and Grace, 2010). Odkryliśmy, że zarówno amplituda, jak i częstotliwość spontanicznych miniaturowych pobudzających prądów postsynaptycznych (mEPSC) były znacznie większe w rdzeniu półleżącym zwierząt Sacharozy w porównaniu ze zwierzętami wodnymi (Rysunek 2B). Wykazało to, że wielokrotne zużycie sacharozy może pozytywnie regulować transmisję synaptyczną w jądrze półleżącym. Aby ustalić, czy włączenie CPAR odegrało rolę w nasileniu po sacharozie, określiliśmy wskaźniki rektyfikacji neuronów rdzeniowych półleżących poprzez pomiar EPSC przy różnych potencjałach błonowych (Rysunki 2C, 2D i 2E). CPAR rektyfikują wewnętrznie przy depolaryzowanym potencjale z powodu endogennej blokady poliamin. Zaobserwowaliśmy znaczącą korektę w zapisach z neuronów zwierząt z sacharozy, na co wskazuje nieliniowość w związku I / V, w porównaniu ze zwierzętami wodnymi (Rysunek 2E), oprócz znacznego wzrostu wskaźnika rektyfikacji (Rysunek 2F).

Rysunek 2  

Synapsy rdzeniowe Accumbens są wzmacniane po wielokrotnym spożyciu sacharozy.

Aby potwierdzić podwyższenie poziomów CPAR inną metodą, zarejestrowaliśmy z neuronów rdzeniowych półleżących po włączeniu do kąpieli specyficznego blokera CPAR, 1-Naphthylacetyl spermine (Naspm). Odkryliśmy, że Naspm znacząco zmniejsza amplitudę EPSC w zapisach z neuronów z sacharozy, ale nie ze zwierząt wodnych (Rysunki 3A – C). Dodatkowo, po leczeniu Naspm, zależność I / V w neuronach od zwierząt ze sacharozy stała się liniowa, odzwierciedlając hamowanie CPAR w synapsach zwierzęcych sacharozy, podczas gdy nie obserwowano znaczącego wpływu na zależność I / V po leczeniu Naspm w neuronach ze zwierząt wodnych (Rysunki 3D). Wyniki te pokazują, że powtarzające się spożywanie sacharozy indukuje włączenie CPAR do synaps w rdzeniu półleżącym.

Rysunek 3  

Spożycie sacharozy powoduje włączenie przepuszczalnych dla Ca2 + receptorów AMPA.

Spożycie sacharozy indukuje handel GluA1

CPAR są receptorami AMPA, które nie mają podjednostki receptora AMPA GluA2. Zatem synaptyczne włączanie CPAR najczęściej obejmuje zależny od aktywności synaptycznej ruch podjednostki GluA1 (He i in., 2009; Isaac i in., 2007; Liu i Zukin, 2007; Plant i in., 2006). Aby potwierdzić włączenie synaptyczne CPAR po treningu sacharozy, zbadaliśmy, czy spożycie sacharozy zwiększa ekspresję synaptyczną GluA1. Szczury miały dostęp do sacharozy jak opisano powyżej dla 7 kolejnych dni. W dniach 1, 3, 5 i 7 wyizolowaliśmy frakcje całej komórki, synaptosomu i gęstości postsynaptycznej (PSD) z trzech regionów mózgu: rdzeń półleżący (rdzeń), skorupa półleżąca (skorupa) i kora somatosensoryczna (kora). Przeanalizowaliśmy całe komórki i frakcje PSD metodą Western blot pod kątem ekspresji GluA1 i GluA2.

Nie stwierdziliśmy żadnych zmian w GluA1 lub GluA2 we frakcjach całych komórek lizatów półleżących w badanych dniach testowych, co sugeruje, że powtarzane zużycie sacharozy nie reguluje ogólnych poziomów tych białek (Rysunki 4A – C). Jednak w frakcjach półleżących PSD GluA1 znacząco zwiększył się w dniu 7 w rdzeniu, ale nie w powłoce, podczas gdy GluA2 nie zmienił się znacząco w żadnej frakcji (Rysunki 4D – 4F i dane nie pokazane). Nie zaobserwowaliśmy znaczącego wzrostu GluA1 we frakcjach PSD półleżących w poprzednich dniach testowych (Rysunki 4D – F) i GluA1 lub GluA2 nie zmieniły się w frakcjach PSD kory w żadnym z dni testowych (dane nie pokazane). Zwiększona GluA1, zwłaszcza w stosunku do GluA2, w rdzeniowych PSD półleżących po wielokrotnym spożyciu sacharozy jest zgodna ze zwiększoną rektyfikacją obserwowaną w neuronach rdzeniowych półleżących, jak opisano powyżej.

Rysunek 4  

Gęstość postsynaptyczna GluA1, ale nie GluA2, zwiększa się w jądrze półleżącym po spożyciu sacharozy.

Wykazano, że zależny od aktywności ruch GluA1 przyczynia się do plastyczności synaptycznej in vitro i również in vivo (Lu i Roche, 2011). Wykazano szybki, wieloetapowy mechanizm handlu GluA1 in vitro (Serulle i in., 2007; Sun i wsp., 2008; Sun i wsp., 2005). Jak dotąd jednak wkład tego wieloetapowego mechanizmu w akumulację synaptyczną GluA1 in vivo nie został przetestowany. Aby ustalić, czy trening sacharozy indukuje gwałtowny ruch GluA1 przez wieloetapowy mechanizm, zlokalizowaliśmy GluA1 w jądrze półleżącym synapsy zwierząt wyszkolonych w sacharozie i wodzie za pomocą ilościowej mikroskopii elektronowej. Tkankę rdzeniową Accumbens zbierano siódmego dnia treningu sacharozy z grup szczurów testowych 3. Były to szczury, które: 1) spożywały wodę na dni 7 (woda), 2) zużywały sacharozę na dni 7 (sacharoza) i 3) spożywały sacharozę na dni 6 i wodę na dzień 7 (sacharoza / woda). Szczury uśmiercano na 7th dzień, 5 minut po spożyciu sacharozy lub wody. Zatem porównanie dwóch grup testowych, zwierząt z sacharozy / wody i sacharozy, ze sobą nawzajem i ze zwierzętami wodnymi, ujawniło skalę czasową zmian postsynaptycznych indukowanych przez konsumpcję sacharozy u szczurów wyszkolonych w sacharozie. Zmierzono GluA1 znakowany immunologicznie (PEG) w 5 w różnych przedziałach postsynaptycznych: cytozol dendrytyczny kręgosłupa (wewnątrzpęcherzowy), pozasynaptyczną błonę plazmatyczną (błonę), PSD, w pobliżu PSD i szczelinę synaptyczną, z trzema ostatnimi przedziałami zgrupowanymi razem jako PSD „(Rys. 5A). Aby wyeliminować błąd eksperymentatora, tożsamości grup testowych mikrografii elektronowej zostały potrójnie zaślepione.

Rysunek 5  

Mikroskopia elektronowa ujawnia indukcję wielostopniowego transportu GluA1 przez spożycie sacharozy.

Zarówno sacharoza, jak i zwierzęta z sacharozą / wodą wykazywały znacząco podwyższone wewnątrzpęcherzowe GluA1 w stosunku do zwierząt wodnych (Rys. 5B i 5C). Sugeruje to, że chroniczne spożycie sacharozy zwiększa wewnątrzkomórkową pulę receptorów AMPA zawierających GluA1 sąsiadujących z miejscami synaptycznymi, receptorów, które mogą być łatwo dostępne dla transportu synaptycznego, i, co ważne, że ta wewnątrzkomórkowa pula może utrzymywać się przez godziny 24 po ostatecznym spożyciu sacharozy . Następnie zbadaliśmy istotne pytanie, czy ostry bodziec sacharozy może wywołać szybki handel GluA1. Zaobserwowaliśmy, że pozasynaptyczna błona plazmatyczna GluA1 była znacząco zwiększona u zwierząt z sacharozą w porównaniu ze zwierzętami zarówno z sacharozą / wodą i wodą (Rysunki 5B i 5D). Ta obserwacja wskazuje, że naturalna nagroda orosensoryczna dostarczana przez pojedynczy bodziec sacharozy może szybko (<5 min), ale przejściowo (czas rozpadu <24 h) podnieść pozasynaptyczną populację receptorów AMPA zawierających GluA1, tworząc niestabilną pulę, z której receptory może kierować ruch do synapsy.

Znacząco in vitro badania sugerują, że synaptyczne włączanie receptorów AMPA odbywa się w krokach 2. W pierwszej, fosforylacja Ser 845 zależna od glutaminianu lub dopaminy podnosi poziomy receptorów w miejscach pozasynaptycznych w błonie plazmatycznej (Esteban i in., 2003; Serulle i in., 2007; Sun i wsp., 2008; Sun i wsp., 2005), podczas gdy w drugiej fosforylacja Ser 818 sprzyja wbudowaniu synaptycznemu (Boehm i in., 2006). Nasze porównanie z mikroskopem elektronowym zwierząt sacharozowych ze zwierzętami ze sacharozy / wody i wody pokazuje, że zaobserwowano pierwszy etap handlu GluA1 in vitro (Makino i Malinow, 2009), następuje również szybki ruch do błony pozasynaptycznej in vivo po dostarczeniu nagrody orosensorycznej.

Zgodnie z opisanymi powyżej elektrofizjologią i wynikami biochemicznymi, PEG EM wykazał, że spożycie sacharozy indukowało również drugi etap wprowadzania receptora GluA1 do synapsy przez GluA1, ponieważ poziom immunoreaktywności GluA1 w PSD był znacznie większy dla sacharozy w porównaniu ze szczurami wodnymi, i wystąpił trend w kierunku zwiększenia GluA1 w sacharozie / wodzie w porównaniu ze szczurami wodnymi (Rysunki 5B i 5E). Wzrost zwierząt ze sacharozy / wody jest zgodny z szybkim włączeniem GluA1, które rozpada się z synaptycznym okresem półtrwania ~ 24 hr, lub szybkim włączeniem GluA1 i zastąpieniem przez synaptyczny GluA1 / 2 w podobnym okresie czasu. Odsetek synaps wyrażających GluA1 w PSD był również znacząco większy u szczurów sacharozy w porównaniu ze szczurami wodnymi (Rysunek 5F), co sugeruje, że GluA1 trafiał do synaps, którym wcześniej brakowało GluA1. Sugeruje to również, że wzrost amplitudy mEPSC obserwowany u szczurów z sacharozą wynika ze wzrostu synaptycznego GluA1 i że wzrost częstości mEPSC może wynikać z rekrutacji GluA1 do wcześniej niemych synaps półleżących, chociaż nie można odrzucić nasilenia uwalniania glutaminianu. Zmierzyliśmy również liczbę synaps w każdej z trzech badanych grup, aby określić, czy spożycie sacharozy wywołało synaptogenezę; nie było różnic między trzema grupami testowymi (dane nieprzedstawione). Dochodzimy do wniosku, że wielokrotne spożycie sacharozy podnosi stabilną (> 24 godziny) wewnątrzrdzeniową pulę GluA1, a pojedynczy bodziec sacharozy dla wytresowanego sacharozy (6 dni) szczura jest wystarczający do szybkiego (5 minut) podwyższenia poziomu GluA1 w pozasynaptycznej błonie plazmatycznej, potencjalnie pobieranie receptorów z puli wewnątrzrdzeniowej. Sugerujemy, że część tych pozasynaptycznych receptorów jest stabilnie włączana do PSD, prowadząc do obserwowanego wskaźnika rektyfikacji i zmian PSD GluA1, zanim pula pozasynaptyczna powróci do poziomu podstawowego w 24 godziny po stymulacji. Wyniki te pokazują, że naturalna nagroda może ostro wywołać szybki przemyt GluA1 u wytresowanego zwierzęcia.

Aktywność CPAR jest wymagana dla zwiększonej lokomocji po spożyciu sacharozy

Średnie neurony kolczaste otrzymują zarówno dopaminergiczne, jak i glutaminergiczne dane wejściowe (Calabresi, i in., 1992). W celu oceny zaangażowania sygnalizacji glutaminianowej w podwyższone spontaniczne poruszanie się, które zaobserwowaliśmy po spożyciu sacharozy u szczurów wyszkolonych w sacharozie, wszczepiliśmy kaniule do rdzenia półleżącego szczurów i wyszkoliliśmy zwierzęta w komorach pomiaru ruchu, jak opisano powyżej. W dniu 8 treningu sacharozowego wstrzykiwaliśmy Naspm do rdzenia przed umieszczeniem w komorze testowej lokomotorycznej. Wstrzyknięcie zmniejszyło całkowitą przebytą odległość zwierząt ze sacharozy i wyeliminowało różnicę między zwierzętami ze sacharozy i wodą obserwowanymi bezpośrednio po usunięciu butelki (Rysunek 6A). Aby sprawdzić, czy stres spowodowany manipulowaniem zwierzętami nie wpłynął na odpowiedź sacharozy, wstrzyknęliśmy solankę do rdzenia następnego dnia (dzień 9 treningu sacharozy); ponownie zaobserwowano znaczną nadpobudliwość zwierząt ze sacharozą bezpośrednio po usunięciu butelki (Rysunek 6B). To pokazuje, że Naspm specyficznie hamował indukowane sacharozą podniesienie lokomocji. Wstrzyknięcie antagonisty NMDAR, APV, do rdzenia w kolejnych dniach również wyeliminowało różnicę między zwierzętami ze sacharozy i wodą (Rysunek 6C), wykazując, że NMDAR są również wymagane do podniesienia spontanicznego poruszania się po spożyciu sacharozy. W celu ustalenia, czy warunkowa odpowiedź na komorę testową odgrywała rolę w indukcji hiperaktywności, zwierzęta umieszczano w komorze na 35 min bez wprowadzania butelki; nie zaobserwowano różnic w przebytej odległości między zwierzętami ze sacharozy i wodą (Rysunek 6D). Naspm i APV nie wpływały na zużycie sacharozy (Rysunek 6E), wykazując, że podstawowe CPAR i NMDAR nie są wymagane do energicznego spożycia sacharozy. Zwierzęta, w których kaniule nie zostały umieszczone w rdzeniu półleżącym (2 ze zwierząt 15), jak oceniono po uśmierceniu (Rysunek 6F), nie zostały uwzględnione w badaniu. Podsumowując, dane te razem pokazują, że spożycie sacharozy przez szczura wyszkolonego w sacharozie indukuje ruch synaptyczny GluA1 w minutach 5, i że blokada mechanizmów sygnalizacyjnych kontrolujących ten ruch zapobiega wzrostowi spontanicznej aktywności lokomotorycznej po sacharozie.

Rysunek 6  

Podwyższone spontaniczne poruszanie się po spożyciu sacharozy wymaga CPAR i NMDAR.

Można przewidzieć dwie ścieżki sygnalizacji sacharozy. Jeden, ściśle chemosensoryczny lub orosensoryczny szlak, jest inicjowany wiązaniem sacharozy do receptora słodkiego smaku, co odpowiada heteromerycznemu kompleksowi receptora sprzężonego z białkiem G, T1R2 / T2R3 (Kitagawa i in., 2001; Max i in., 2001; Nelson i in., 2001; Sainz i in., 2001). Bogate w kalorie składniki odżywcze mogą również regulować funkcje mózgu poprzez szlaki metaboliczne niezależnie od smaku, chociaż mechanizmy nie są dobrze poznane (de Araujo i wsp., 2008). Aby rozróżnić te dwie alternatywy dla szlaku przemytu GluA1 indukowanego przez sacharozę, powtórzyliśmy protokół treningowy z trzema grupami szczurów (szczury 4 / grupę), którym podano 5 minut do butelek zawierających wodę, 25% roztwór sacharozy lub 3% sacharyny (słodka i niska). Butelki usunięto i szczury pozostały na 15 dłużej w klatce treningowej. Trening powtarzano w dniach 7. Objętości cieczy zużytej przez grupy testowe sacharozy i sacharyny nie różniły się znacząco od siebie i obie były większe niż spożycie przez grupę wodną, ​​zgodne z nagrodą obu słodkich substancji (Rysunek 7A). W X-XI dniu picia, bezpośrednio po usunięciu butelki, szczury uśmiercono, zebrano tkankę rdzenia półleżącego i połączono dla każdej grupy testowej, wyizolowaną frakcję PSD i poziomy GluA7 sondowano metodą Western blot (Rysunek 7B). Tak jak poprzednio, zwierzęta, które spożywały sacharozę, wykazywały podwyższoną GluA1 we frakcji PSD w stosunku do grupy wodnej (Rysunek 7C). Co istotne, GluA1 był również podwyższony we frakcji PSD zwierząt, które spożywały sacharynę. Nie było znaczącej różnicy w poziomach GluA1 we frakcjach całych komórek z rdzenia półleżącego wody, sacharozy i zwierząt sacharynowych, co sugeruje, że wzrost GluA1 był specyficzny dla frakcji synaptycznej (Rysunek 7D). Ponieważ sacharyna stymuluje ten sam heteromeryczny kompleks receptora smaku sprzężonego z białkiem G jako sacharoza (Masuda i in., 2012; Nelson i in., 2001), ale brakuje mu wartości kalorycznej, dochodzimy do wniosku, że stymulacja receptora słodkiego smaku jest wystarczająca do zainicjowania sygnalizacji, która podnosi poziom GluA1 w jądrze półleżącym synapsy rdzeniowej.

Rysunek 7  

Trening sacharyny wywołuje wzrost Synaptic GluA1 podobny do treningu sacharozy.

Dyskusja

Pokazaliśmy, że nagroda orosensoryczna, powtarzające się spożycie sacharozy, może ostro indukować włączenie synaptyczne GluA1 poprzez opisany wcześniej wieloetapowy mechanizm transportu in vitro. Powtarzane spożycie sacharozy w dniach 6 – 7 potęgowało elektrofizjologiczne synapsy rdzeniowe półleżące poprzez wprowadzenie CPAR. Efektowi temu towarzyszyła akumulacja GluA1, ale nie GluA2 w PSD rdzenia, i była specyficzna regionalnie i czasowo, ponieważ nie zaobserwowano żadnych zmian przed dniem treningu 7 w rdzeniu i nie zaobserwowano żadnych zmian w muszli półleżącej lub w Kora somatosensoryczna. Analiza za pomocą mikroskopu elektronowego wykazała, że ​​powtarzające się spożywanie sacharozy podnosiło względnie stabilne (t1/2 > 24 godz.) Populacja wewnątrzrdzeniowych receptorów zawierających GluA1. Sacharoza również szybko (5 min) i przejściowo (t1/2 <24 godz.) Podwyższone poziomy receptorów zawierających GluA1 w miejscach pozasynaptycznych u zwierząt trenowanych sacharozą, zwiększając populację AMPAR zdolnych do bocznej dyfuzji do synapsy. Synaptyczny GluA1, zarówno reprezentowany przez frakcję PSD, jak i wykrywany przez PEG-EM, był znacząco zwiększony w sacharozie w porównaniu ze zwierzętami wodnymi. Na podstawie tych wyników proponujemy, aby dwuetapowy mechanizm egzocytozy pozasynaptycznej, po której następował ruch synaptyczny w celu wstawienia synaptycznego AMPAR, opisany wcześniej in vitro (Boehm i in., 2006; Makino i Malinow, 2009; Oh et al., 2006; Serulle i in., 2007; Sun i wsp., 2005) można szybko zainicjować in vivo naturalną nagrodą orosensoryczną.

Zmiany w poziomach synaptycznych GluA1 obserwowano dopiero po sesjach treningowych 7, co sugeruje, że do wzmocnienia konieczne jest kilkudniowe działanie. W eksperymentach biochemicznych in vivo, nie zaobserwowaliśmy znaczącego wzrostu poziomów PSD GluA1 w rdzeniu półleżącym w dniach treningu 1, 3 i 5 sacharozy; dopiero po dniach 7 treningu sacharozowego GluA1 w PSD był znacząco podwyższony. W eksperymentach z mikroskopią elektronową zaobserwowaliśmy, że zwierzęta z sacharozą / wodą, które były sacharozą wytrenowane w dniach 6, ale nie otrzymały bodźca sacharozowego w godzinach 24, wykazywały tendencję do zwiększonego PSD GluA1. Zwierzęta te wykazywały również podwyższony wewnątrzpęcherzowy GluA1 w porównaniu ze zwierzętami wodnymi, ale nie obserwowano zmian w błonie pozasynaptycznej GluA1. Z tych wyników wyciągamy trzy wnioski. Po pierwsze, receptory AMPA zawierające GluA1 gromadzą się śródskórnie z kolejnymi stymulacjami sacharozy. Biorąc pod uwagę, że poprzednie badania wykazały, że spożycie sacharozy indukuje uwalnianie dopaminy w półleżących (Cacciapaglia i in., 2012; McCutcheon i in., 2012; Rada i in., 2005), i że D1R mogą napędzać lokalne tłumaczenie GluA1 w dendrytach (Smith i wsp., 2005), uwalnianie dopaminy po spożyciu sacharozy może wywołać miejscową syntezę GluA1, która prowadzi do wewnątrzkomórkowej akumulacji GluA1. Alternatywnie, wzrost wewnątrzrdzeniowy może odzwierciedlać handel GluA1 z odległych miejsc. Jest prawdopodobne, że ruch egzocytotyczny z tej podwyższonej puli wewnątrzpochodnej przyczynia się do puli pozasynaptycznej w błonie plazmatycznej. Po drugie, obserwacja wzrostu błony pozasynaptycznej GluA1 w sacharozie, ale nie w zwierzętach ze sacharozą / wodą lub wodą sugeruje, że receptory pozasynaptyczne albo przechodzą przez drugi etap do synapsy, albo są endocytozowane w obrębie 24 hr po spożyciu sacharozy, co powoduje, że przejściowy basen pozasynaptyczny. Po trzecie, podwyższenie poziomu PSD GluA1 zwierzęcia sacharozowego w porównaniu ze zwierzętami wodnymi, ale nie zwierząt ze sacharozy / wody sugeruje również, że po każdym bodźcu sacharozowym receptory przemieszczają się poprzecznie do synapsy z puli receptorów przemieszczanych szybko do pozasynaptycznej błony komórkowej. Nie możemy wykluczyć, że GluA1 przemieści się bezpośrednio z puli wewnątrzrdzeniowej do synapsy. Taka ścieżka wydaje się jednak mało prawdopodobna, biorąc pod uwagę badania, które pokazują, że GluA1 jest wstawiany pozasynaptycznie (Boehm i in., 2006; Makino i Malinow, 2009; Oh et al., 2006; Serulle i in., 2007; Sun i wsp., 2005). Odkrycia te stanowią pierwszy dowód, że przebieg w czasie przemytu GluA1 (<5 min) i zaobserwowana ścieżka in vitro są również obserwowane in vivo. Ponadto nasze wyniki sugerują, że powtarzające się bodźce nagradzające modyfikują zdolność do wzmocnienia synapsy poprzez podniesienie puli receptorów wewnątrzpochodnych, które mogą być przedmiotem handlu.

Ponieważ sacharyna indukowała ruch GluA1 podobnie jak sacharoza, kaloryczna zawartość sacharozy nie jest wymagana. Sacharyna stymuluje ten sam receptor słodkiego smaku, T1R2 / T2R3, co sacharoza (Masuda i in., 2012; Nelson i in., 2001), snieprzyjemna aktywacja tego receptora prawdopodobnie inicjuje włączenie GluA1 do synaps MSN. Sacharoza zwiększa uwalnianie dopaminy w półleżących neuronach VTA (Cacciapaglia i in., 2012; McCutcheon i in., 2012; Rada i in., 2005) lprzejście do handlu powierzchniowego GluA1. Zatem szlak łączący receptor słodkiego smaku z VTA prawdopodobnie będzie miał kluczowe znaczenie dla badanej tutaj plastyczności.

Prawdopodobne jest, że szybki handel GluA1 po spożyciu sacharozy odgrywa rolę w regulacji spontanicznej lokomocji. Rzeczywiście, u zwierząt wyszkolonych w sacharozie, hamowanie CPAR zapobiegało zwiększeniu spontanicznej aktywności lokomotorycznej natychmiast po spożyciu sacharozy. Całkowita odległość przebyta przez szczury po zużyciu sacharozy zmierzona w kolejnych dniach była znacząco podwyższona tylko w okresie 3 min bezpośrednio po spożyciu sacharozy w siódmym dniu treningu. Zwiększona aktywność natychmiast po zaobserwowaniu sacharozy począwszy od dnia 3 treningu, ale nie zmieniła się znacząco aż do dnia 7. Tym razem przebieg aktywności koreluje z przebiegiem czasowym akumulacji GluA1 w dendrytach rdzeniowych półleżących. Zwiększona lokomocja była funkcjonalną konsekwencją przemieszczania się CPAR do synaps MSN w rdzeniu półleżącym, ponieważ wstrzyknięcie Naspm do rdzenia hamowało wzrost aktywności. Zapobieganie podwyższonej lokomocji przez inhibitor receptora NMDA wykazało, że sygnalizacja glutaminianu za pośrednictwem receptorów NMDA, jak również CPAR była konieczna do podniesienia aktywności lokomotorycznej. Blokada sygnalizacji glutaminianowej nie miała wpływu na spożycie sacharozy, zgodnie z wcześniejszymi badaniami wykazującymi, że rdzeń półleżący bierze udział w orkiestracji reakcji motorycznych związanych z nagrodą orosensoryczną, ale nie samym spożyciem (Smith, 2004). Podobny przebieg czasowy dla rozwoju hiperlokomocji odnotowano dla rozwoju warunkowej nadpobudliwości u zwierząt karmionych codziennym posiłkiem w charakterystycznym środowisku (Matthews i in., 1996). Gdyby obecną odpowiedzią była uwarunkowana nadaktywność wynikająca z powiązania kontekstu i sacharozy, to poprzedziłaby ona dostarczanie sacharozy, czego nie zaobserwowano. Możliwe, że badani wykazują podniecenie eksploracyjne. Konieczne byłyby dalsze eksperymenty w celu rozróżnienia, czy podwyższona lokomocja po spożyciu sacharozy była pobudzeniem eksploracji, w przeciwieństwie do formy uczulenia motorycznego lub innego zachowania. W każdym przypadku podniesienie spontanicznej lokomocji wymagało sygnalizacji glutaminianu i wynikało, przynajmniej częściowo, z włączenia CPAR do rdzenia półleżącego.

Zwiększona aktywność lokomotoryczna po spożyciu sacharozy może wynikać bezpośrednio z obserwowanego nasilenia synaps rdzeniowych półleżących, ponieważ zwiększona wydajność z bezpośredniej ścieżki zwojów podstawy mózgu sprzyja poruszaniu się poprzez hamowanie wzgórza motorycznego (Sesack and Grace, 2010). Twzmocnione synapsy najprawdopodobniej znajdują się na bezpośredniej ścieżce neuronów rdzeniowych półleżących, które wyrażają D1R. Wzmocnienie synaps bezpośrednich neuronów szlaku spowodowałoby, gdyby aktywność D1R indukowała przemieszczanie AMPAR zawierających GluA1 do synaps w tych neuronach po silnym uwalnianiu dopaminy. Wynikające z tego nasilenie zwiększyłoby aktywność w projekcjach hamujących neuronów szlaku bezpośredniego do jąder wyjściowych jąder podstawnych, tym samym odhamowując wzgórze motoryczne i promując aktywność kory ruchowej (Gerfen i Surmeier, 2011; Kravitz i in., 2010; Sesack and Grace, 2010). Potencjał synaptyczny obserwowany po wielokrotnym spożyciu sacharozy prawdopodobnie ma miejsce w neuronach bezpośredniego szlaku, ponieważ dopamina działająca przez receptor D1 może indukować fosforylację GluA1 S845, prowadząc do transportu powierzchniowego.

W szeregu badań zbadano wpływ powtarzanej stymulacji kokainą, po której nastąpiło wycofanie, leczenie, które wywiera głęboki wpływ na funkcjonowanie systemu nagrody i ostatecznie prowadzi do uczulenia na kokainę, które charakteryzuje się zwiększoną reakcją motoryczną na kokainę, głód narkotykowy i nawroty (Kalivas i wsp., 1998). Powtarzane wstrzyknięcie IP kokainą w dniach 5 – 10, a następnie wycofanie spowodowało stopniowy wzrost w ciągu 14 dni w powierzchniowych receptorach AMPA zawierających GluA2 (Boudreau i in., 2007; Kourrich i in., 2007). Jednakże, w dniach 45 odstawienia po 10 d samodzielnego podawania, zaobserwowano duży wzrost wskaźnika rektyfikacji w MSN szczurów (McCutcheon i in., 2011b) wskazujące na wzrost CPAR. W ten sposób obserwowano handel CPAR zarówno po spożyciu sacharozy, jak i w bieżącej pracy, a także samokopiując kokainę, aczkolwiek w bardzo różnych warunkach leczenia. Ponieważ bezpośrednie konsekwencje samodzielnego podawania kokainy lub zastrzyku (np. W 5 po minutach) nie są znane, działania kokainy nie można porównywać bezpośrednio z aktualną pracą z sacharozą. Podobnie nie wiadomo, czy CPAR utrzymują się w synapsach MSN zwierząt wyszkolonych w sacharozie po zaprzestaniu treningu z sacharozą lub jeśli takie zwierzęta wykazują uczulenie na sacharozę po długotrwałym odstawieniu.

Zrozumienie, w jaki sposób nagradzające bodźce regulują plastyczność i zachowanie półleżących przedmiotów, ma kluczowe znaczenie dla rozwiązania problemu uzależnienia, hiperfagii, patologicznego hazardu i innych zaburzeń zachowania (Basar i in., 2010; Berridge, 2009; Luscher i Malenka, 2011). Nadmierna konsumpcja cukru przyczynia się do epidemii otyłości (Hu i Malik, 2010) i chociaż potencjalnie podobne do narkomanii (Avena i wsp., 2008), jego mechanizm nie został dokładnie zbadany. Obecne odkrycia ustalają podstawowe elementy plastyczności indukowanej nagrodą, z których przyszłe badania mogą dotyczyć regulacji złożonych zachowań, potencjalnie dostarczając nowych sposobów konfrontacji z patologiami związanymi z nagrodami.

Podziękowanie

Dziękujemy członkom Laboratorium Ziff, byłym i obecnym, za pomoc techniczną i pomocne dyskusje, w tym H. Girma, L. Lee i dr. B. Fernholz, B. Jordan, W. Lu, G. Rameau, S. Restituito i Y. Serulle. Praca ta była wspierana przez National Institute of Mental Health Predoctoral Fellowship F31MH76617-01 i NIH Training Grant 5T32DC000063 dla New York University Training Program in the Neurosciences (DST), R01NS061920 z National Institute of Neurological Disorders and Stroke (EBZ), 1R21MH091445- 01 z National Institute of Mental Health and Office of Research on Women's Health, Klarman Family Foundation Grants Program in Eating Disorders Research, NYU's Research Challenge Fund i P30EY13079 (CA), National Institute on Drug Abuse grant DA003956 oraz Independent Investigator Award od NARSAD (KDC), National Institute on Deafness and Other Communications Disorders przyznaje DC009635 RCF oraz poprzez grant początkowy w Centre of Excellence on Addiction z New York University Langone Medical Center.

Przypisy

Konflikt interesów: Autorzy nie deklarują konkurencyjnych interesów finansowych.

Referencje

  1. Avena NM, Rada P, Hoebel BG. Dowody na uzależnienie od cukru: behawioralne i neurochemiczne skutki przerywanego, nadmiernego spożycia cukru. Neurosci Biobehav Rev. 2008; 32: 20-39. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
  2. Basar K, Sesia T, Groenewegen H, Steinbusch HW, Visser-Vandewalle V, Temel Y. Nucleus accumbens i impulsywność. Prog Neurobiol. 2010; 92: 533 – 557. [PubMed]
  3. Berridge KC. Nagrody za „lubienie” i „chęć” jedzenia: substraty mózgu i role w zaburzeniach odżywiania. Fizjologia i zachowanie. 2009; 97: 537–550. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
  4. Boehm J, Kang MG, Johnson RC, Esteban J, Huganir RL, Malinow R. Synaptyczna inkorporacja receptorów AMPA podczas LTP jest kontrolowana przez miejsce fosforylacji PKC na GluR1. Neuron. 2006; 51: 213 – 225. [PubMed]
  5. Boudreau AC, Reimers JM, Milovanovic M, Wolf ME. Receptory AMPA na powierzchni komórki w jądrze szczura zwiększają się podczas odstawienia kokainy, ale internalizują po prowokacji kokainą w połączeniu ze zmienioną aktywacją kinaz białkowych aktywowanych mitogenami. J Neurosci. 2007; 27: 10621 – 10635. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
  6. Brebner K, Wong TP, Liu L, Liu Y, Campsall P, Szary S, Phelps L, Phillips AG, Wang YT. Nucleus accumbens długotrwała depresja i ekspresja uczulenia behawioralnego. Nauka. 2005; 310: 1340 – 1343. [PubMed]
  7. Cacciapaglia F, Saddoris MP, Wightman RM, Carelli RM. Różnicowa dynamika uwalniania dopaminy w jądrze półleżącym rdzenia i powłoki śledzi różne aspekty ukierunkowanego zachowania dla sacharozy. Neuropharmacology 2012 [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
  8. Calabresi P, Maj R, Pisani A, Mercuri NB, Bernardi G. Długotrwała depresja synaptyczna w prążkowiu: charakterystyka fizjologiczna i farmakologiczna. J Neurosci. 1992; 12: 4224 – 4233. [PubMed]
  9. Carr KD, Chau LS, Cabeza de Vaca S, Gustafson K, Stouffer M, Tukey DS, Restituito S, Ziff EB. Podjednostka receptora AMPA GluR1 w dół od stymulacji receptora dopaminowego D-1 w jądrze półleżącym jądra pośredniczy w zwiększaniu wielkości nagrody lekarskiej u szczurów z ograniczeniem pokarmowym. Neuroscience. 2010; 165: 1074 – 1086. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
  10. Conrad KL, Tseng KY, Uejima JL, Reimers JM, Heng LJ, Shaham Y, Marinelli M, Wolf ME. Tworzenie się receptorów AMPA pozbawionych półleżących GluR2 pośredniczy w inkubacji głodu kokainowego. Natura. 2008; 454: 118 – 121. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
  11. Day JJ, Carelli RM. Jądro półleżące i nauka Pawłowa. Neurobiolog. 2007; 13: 148 – 159. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
  12. de Araujo IE, Oliveira-Maia AJ, Sotnikova TD, Gainetdinov RR, Caron MG, Nicolelis MA, Simon SA. Nagroda pokarmowa przy braku sygnalizacji receptora smaku. Neuron. 2008; 57: 930 – 941. [PubMed]
  13. Ehlers MD, Heine M, Groc L, Lee MC, Choquet D. Dyfuzyjne pułapkowanie receptorów GluR1 AMPA przez specyficzną dla wkładu aktywność synaptyczną. Neuron. 2007; 54: 447 – 460. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
  14. Esteban JA, Shi SH, Wilson C, Nuriya M, Huganir RL, fosforylacja podjednostek receptora AMPA w Malinow R. PKA kontroluje ruch synaptyczny leżący u podstaw plastyczności. Nat Neurosci. 2003; 6: 136 – 143. [PubMed]
  15. Gerfen CR, Surmeier DJ. Modulacja systemów projekcji prążkowia przez dopaminę. Coroczny przegląd neurobiologii. 2011; 34: 441 – 466. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
  16. Grueter BA, Brasnjo G, Malenka RC. Postsynaptyczny TRPV1 wyzwala specyficzną dla typu komórki długoterminową depresję w jądrze półleżącym. Neurobiologia przyrody. 2010; 13: 1519 – 1525. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
  17. He K, Song L, Cummings LW, Goldman J, Huganir RL, Lee HK. Stabilizacja receptorów AMPA przepuszczalnych dla Ca2 + w miejscach perisynaptycznych przez fosforylację GluR1-S845. Proc Natl Acad Sci US A. 2009; 106: 20033 – 20038. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
  18. Hu FB, Malik VS. Napoje słodzone cukrem a ryzyko otyłości i cukrzycy typu 2: dowody epidemiologiczne. Fizjologia i zachowanie. 2010; 100: 47–54. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
  19. Isaac JT, Ashby MC, McBain CJ. Rola podjednostki GluR2 w funkcji receptora AMPA i plastyczności synaptycznej. Neuron. 2007; 54: 859 – 871. [PubMed]
  20. Jordan BA, Fernholz BD, Boussac M, Xu C, Grigorean G, Ziff EB, Neubert TA. Identyfikacja i weryfikacja nowych białek gęstości postsynaptycznej gryzoni. Mol Cell Proteomics. 2004; 3: 857 – 871. [PubMed]
  21. Kalivas PW, Pierce RC, Cornish J, Sorg BA. Rola uwrażliwienia na głód i nawrót w uzależnieniu od kokainy. J Pharmacol. 1998; 12: 49 – 53. [PubMed]
  22. Kitagawa M, Kusakabe Y, Miura H, Ninomiya Y, Hino A. Molekularna identyfikacja genetyczna genu receptora dla słodkiego smaku. Biochemiczna i biofizyczna komunikacja naukowa. 2001; 283: 236 – 242. [PubMed]
  23. Kourrich S, Rothwell PE, Klug JR, Thomas MJ. Doświadczenie z kokainą kontroluje dwukierunkową plastyczność synaptyczną jądra półleżącego. J Neurosci. 2007; 27: 7921 – 7928. [PubMed]
  24. Kravitz AV, Freeze BS, Parker PR, Kay K, Thwin MT, Deisseroth K, Kreitzer AC. Regulacja zachowań motorycznych w chorobie Parkinsona poprzez kontrolę optogenetyczną obwodów jąder podstawy. Natura. 2010; 466: 622 – 626. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
  25. LaPlant Q, Vialou V, Covington HE, 3rd, Dumitriu D, Feng J, Warren BL, Maze I, Dietz DM, Watts EL, Iniguez SD i in. Dnmt3a reguluje zachowanie emocjonalne i plastyczność kręgosłupa w jądrze półleżącym. Nat Neurosci. 2010; 13: 1137 – 1143. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
  26. Liu SJ, Zukin RS. Przepuszczalne receptory AMPA Ca2 + w plastyczności synaptycznej i śmierci neuronów. Trendy w neuronaukach. 2007; 30: 126 – 134. [PubMed]
  27. Lu W, Isozaki K, Roche KW, Nicoll RA. Synaptyczne celowanie receptorów AMPA jest regulowane przez miejsce CaMKII w pierwszej pętli wewnątrzkomórkowej GluA1. Proc Natl Acad Sci US A. 2010; 107: 22266 – 22271. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
  28. Lu W, Roche KW. Posttranslacyjna regulacja handlu i funkcjonowania receptora AMPA. Aktualna opinia w neurobiologii 2011 [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
  29. Luscher C, Malenka RC. Sztuczna synaptyczna plastyczność w uzależnieniu: od zmian molekularnych do przebudowy obwodu. Neuron. 2011; 69: 650 – 663. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
  30. Makino H, Malinow R. Włączenie receptora AMPA do synaps podczas LTP: rola ruchu bocznego i egzocytozy. Neuron. 2009; 64: 381 – 390. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
  31. Mameli M, Halbout B, Creton C, Engblom D, Parkitna JR, Spanagel R, Luscher C. Plastyczność synaptyczna wywołana kokainą: trwałość w VTA wyzwala adaptacje w NAc. Nat Neurosci. 2009; 12: 1036 – 1041. [PubMed]
  32. Masuda K, Koizumi A, Nakajima K, Tanaka T, Abe K, Misaka T, Ishiguro M. Charakterystyka sposobów wiązania między receptorem słodkiego smaku człowieka a słodkimi związkami o niskiej masie cząsteczkowej. PloS jeden. 2012; 7: e35380. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
  33. Matthews K, Wilkinson LS, Robbins TW. Powtarzające się rozłąki matek u przedwcześnie urodzonych szczurów osłabiają reakcje behawioralne na pierwotne i uwarunkowane zachęty w wieku dorosłym. Physiol Behav. 1996; 59: 99 – 107. [PubMed]
  34. Max M, Shanker YG, Huang L, Rong M, Liu Z, Campagne F, Weinstein H, Damak S, Margolskee RF. Tas1r3, kodujący nowego kandydującego receptora smaku, jest alleliczny w stosunku do locus Sac słodkiej odpowiedzi. Genetyka przyrody. 2001; 28: 58 – 63. [PubMed]
  35. McCutcheon JE, Beeler JA, Roitman MF. Sygnały predykcyjne sacharozy wywołują większe fazowe uwalnianie dopaminy niż sygnały przewidujące sacharynę. Synapsa. 2012; 66: 346 – 351. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
  36. McCutcheon JE, Wang X, Tseng KY, Wolf ME, Marinelli M. Przepuszczalne dla wapnia receptory AMPA są obecne w synapsach jądra półleżącego po przedłużonym odstawieniu kokainy z samopodawania, ale nie kokainy podawanej eksperymentalnie. The Journal of neuroscience: oficjalne czasopismo Society for Neuroscience. 2011a; 31: 5737 – 5743. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
  37. McCutcheon JE, Loweth JA, Ford KA, Marinelli M, Wolf ME, Tseng KY. Aktywacja mGluR w Grupie I odwraca indukowaną kokainą akumulację przepuszczalnych dla wapnia receptorów AMPA w półleżeniach jądra półleżącego poprzez mechanizm zależny od kinazy białkowej C. J Neurosci. 2011b; 31: 14536 – 14541. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
  38. Nedelescu H, Kelso CM, Lazaro-Munoz G, Purpura M, Cain CK, Ledoux JE, Aoki C. Endogenne receptory AMPA zawierające GluR1 przemieszczają się do asymetrycznych synaps w bocznym ciele migdałowatym we wczesnej fazie powstawania pamięci strachu: mikroskopia elektronowa immunocytochemiczna badanie. Dziennik neurologii porównawczej. 2010; 518: 4723 – 4739. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
  39. Nelson G, Hoon MA, Chandrashekar J, Zhang Y, Ryba NJ, Zuker CS. Ssacze receptory słodkiego smaku. Komórka. 2001; 106: 381 – 390. [PubMed]
  40. Oh MC, Derkach VA, Guire ES, Soderling TR. Ruch błony pozasynaptycznej regulowany przez fosforylację seryny 1 GluR845 poprzedza receptory AMPA dla długotrwałego wzmocnienia. J Biol Chem. 2006; 281: 752 – 758. [PubMed]
  41. Pascoli V, Turiault M, Luscher C. Odwrócenie wywoływanego przez kokainę wzmocnienia synaptycznego resetuje wywoływane przez narkotyki zachowanie adaptacyjne. Natura. 2012; 481: 71 – 75. [PubMed]
  42. Plant K, Pelkey ​​KA, Bortolotto ZA, Morita D, Terashima A, McBain CJ, Collingridge GL, Isaac JT. Przejściowe włączanie natywnych receptorów AMPA pozbawionych GluR2 podczas długotrwałego wzmocnienia hipokampa. Nat Neurosci. 2006; 9: 602 – 604. [PubMed]
  43. Rada P, Avena NM, Hoebel BG. Codzienne objadanie się cukrem wielokrotnie uwalnia dopaminę w skorupie półleżącej. Neuroscience. 2005; 134: 737 – 744. [PubMed]
  44. Roche KW, O'Brien RJ, Mammen AL, Bernhardt J, Huganir RL. Charakterystyka wielu miejsc fosforylacji na podjednostce GluR1 receptora AMPA. Neuron. 1996; 16: 1179 – 1188. [PubMed]
  45. Rumpel S, LeDoux J, Zador A, Malinow R. Postsynaptyczny handel receptorem leżący u podstaw formy uczenia się asocjacyjnego. Nauka. 2005; 308: 83 – 88. [PubMed]
  46. Sainz E, Korley JN, Battey JF, Sullivan SL. Identyfikacja nowego członka rodziny T1R przypuszczalnych receptorów smaku. Journal of neurochemistry. 2001; 77: 896 – 903. [PubMed]
  47. Serulle Y, Zhang S, Ninan I, Puzzo D, McCarthy M, Khatri L, Arancio O, Ziff EB. Interakcja GluR1-cGKII reguluje ruch receptora AMPA. Neuron. 2007; 56: 670 – 688. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
  48. Sesack SR, Grace AA. Sieć wynagrodzeń Cortico-Basal Ganglia: mikroukład. Neuropsychofarmakologia: oficjalna publikacja American College of Neuropsychopharmacology. 2010; 35: 27 – 47. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
  49. Smith GP. Akumulacja dopaminy pośredniczy w nagradzającym efekcie stymulacji orosensorycznej przez sacharozę. Apetyt. 2004; 43: 11 – 13. [PubMed]
  50. Smith WB, Starck SR, Roberts RW, Schuman EM. Dopaminergiczna stymulacja lokalnej syntezy białek wzmacnia ekspresję powierzchniową GluR1 i transmisję synaptyczną w neuronach hipokampa. Neuron. 2005; 45: 765 – 779. [PubMed]
  51. Sun X, Milovanovic M, Zhao Y, Wolf ME. Ostra i przewlekła stymulacja receptora dopaminy moduluje ruch receptora AMPA w neuronach jądra półleżącego współhodowanych z neuronami kory przedczołowej. The Journal of neuroscience: oficjalne czasopismo Society for Neuroscience. 2008; 28: 4216 – 4230. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
  52. Słońce X, Zhao Y, Wolf ME. Stymulacja receptora dopaminy moduluje insercję synaptyczną receptora AMPA w neuronach kory przedczołowej. J Neurosci. 2005; 25: 7342 – 7351. [PubMed]
  53. Thomas MJ, Beurrier C, Bonci A, Malenka RC. Długotrwała depresja jądra półleżącego: neuronalny korelator uczulenia behawioralnego na kokainę. Nat Neurosci. 2001; 4: 1217 – 1223. [PubMed]
  54. Ungless MA, Whistler JL, Malenka RC, Bonci A. Ekspozycja na pojedynczą kokainę in vivo indukuje długotrwałe wzmocnienie neuronów dopaminowych. Natura. 2001; 411: 583 – 587. [PubMed]
  55. Whitlock JR, Heynen AJ, Shuler MG, Bear MF. Uczenie się wywołuje długotrwałe wzmocnienie w hipokampie. Nauka. 2006; 313: 1093 – 1097. [PubMed]