Źródło
Katedra Biologii Komórkowej, Uniwersytet Cincinnati, Cincinnati, Ohio, USA.
Abstrakcyjny
Wstęp:
Niezdolność do zahamowania zachowań, gdy staną się one nieprzystosowalne, jest składnikiem kilku chorób psychicznych, a przyśrodkowa kora przedczołowa (mPFC) została zidentyfikowana jako potencjalny mediator hamowania behawioralnego. Obecne badanie przetestowano, czy mPFC jest zaangażowany w hamowanie zachowań seksualnych, gdy wiąże się z niepożądanymi wynikami.
METODY:
Wykorzystując samce szczurów, zbadano wpływ uszkodzeń obszarów infralimbic i prelimbicznych mPFC na ekspresję zachowań seksualnych i zdolność do hamowania krycia przy użyciu paradygmatu niechęci do warunkowania kopulacji.
WYNIKI:
Zmiany w środkowej korze przedczołowej nie zmieniały ekspresji zachowań seksualnych. W przeciwieństwie do tego, zmiany mPFC całkowicie zablokowały nabywanie warunkującego niechęć do seksu, a uszkodzone zwierzęta nadal kojarzyły się, w przeciwieństwie do silnego hamowania behawioralnego w kierunku kopulacji u nienaruszonych samców zwierząt mPFC, w wyniku czego tylko 22% nienaruszonych samców zwierząt nadal kojarzyło się. Jednakże szczury z uszkodzeniami mPFC były zdolne do tworzenia warunkowej preferencji miejsca dla nagrody seksualnej i warunkowanej niechęci do miejsca dla chlorku litu, co sugeruje, że te zmiany nie zmieniły asocjacyjnego uczenia się ani wrażliwości na chlorek litu.
WNIOSKI:
Obecne badanie wskazuje, że zwierzęta ze zmianami mPFC są prawdopodobnie zdolne do tworzenia skojarzeń z nieprzyjemnymi skutkami ich zachowania, ale nie są w stanie powstrzymać poszukiwania nagrody seksualnej w obliczu nieprzyjemnych konsekwencji. Dane te mogą przyczynić się do lepszego zrozumienia powszechnej patologii leżącej u podstaw zaburzeń kontroli impulsów, ponieważ kompulsywne zachowania seksualne są często współwystępujące z zaburzeniami psychicznymi i chorobą Parkinsona.
WPROWADZENIE
Przyśrodkowa kora przedczołowa (mPFC) bierze udział w wielu wyższych funkcjach układu nerwowego ssaków, w tym w regulacji pobudzenia emocjonalnego, zachowaniach lękowych, a także elastyczności behawioralnej i podejmowaniu decyzji (1-5). Uważa się, że podejmowanie decyzji w oparciu o nagrody jest kontrolowane przez obwód neuronowy składający się z mPFC, ciała migdałowatego i prążkowia (6) w którym mPFC działa jako „odgórny” kontroler tego procesu (7,8). Główną cechą podejmowania decyzji w oparciu o nagrodę jest możliwość śledzenia relacji „wynik-odpowiedź” w czasie (9). W ten sposób, gdy konsekwencje związane z działaniem behawioralnym stają się niekorzystne, częstotliwość tych działań maleje. Powoduje to pozytywną adaptację behawioralną, a ta odpowiedź zależy od nienaruszonej funkcji mPFC (8, 10). Niezdolność do zmiany działań behawioralnych, gdy prowadzą one do niekorzystnych konsekwencji, jest objawem wspólnym dla różnych zaburzeń uzależniających (11-15).
Zachowanie seksualne samców gryzoni jest naturalnym zachowaniem opartym na nagrodzie, w którym relacje wynik-odpowiedź są monitorowane w celu osiągnięcia celu kopulacji (16). Jednak samce szczurów powstrzymują się od kopulacji, gdy zachowania seksualne są połączone z awersyjnym chlorkiem litu stymulującego (LiCl; 17, 18). Aktywność mPFC była skorelowana z męskim zachowaniem seksualnym u gryzoni (19-25) i ludzi (26). Jednak dokładna rola mPFC w zachowaniach seksualnych pozostaje niejasna. Celem niniejszego badania było scharakteryzowanie wpływu zmian mPFC na ekspresję zachowań seksualnych oraz nabycie zahamowania behawioralnego w kierunku zachowań seksualnych u szczurów przy użyciu modelu niechęci do warunkowania kopulacji. Zmiany obejmowały jądra infralimbic (IL) i prelimbiczne (PL) mPFC, ponieważ wykazano, że te podregiony przenikają do obszarów mózgu zaangażowanych w regulację zachowań seksualnych (20). Wyniki tego badania pokazują, że nienaruszona funkcja mPFC nie jest wymagana do normalnego wyrażania zachowań seksualnych. Wyniki potwierdzają hipotezę, że mPFC reguluje hamowanie behawioralne w stosunku do zachowań seksualnych, gdy takie zachowanie wiąże się z niepożądanymi wynikami.
MATERIAŁY I METODY
Zwierzęta
Dorosłe samce (250 – 260 gramy) Szczury Sprague Dawley uzyskane z laboratoriów Harlan (Indianapolis) były trzymane pojedynczo w sztucznie oświetlonym pokoju w odwróconym cyklu światło / ciemność (12: 12 h, wyłączone przy 10 AM) w temperaturze 72 ° F. Żywność i woda były dostępne przez cały czas. Ovariektomizowane, estrogen (kapsułka z silastikiem sc z 5% 17-beta-estradiol benzoesanem) i progesteron (wstrzyknięcie sc 500 μg w 0.1 ml oleju sezamowego) zagruntowane samice szczurów Sprague Dawley (210 – 225 gramów) zastosowano we wszystkich testach kojarzenia rozpoczęto cztery godziny po rozpoczęciu ciemnego okresu, a zachowanie przeprowadzono w prostokątnej klatce testowej z pleksiglasu (60 × 45 × 50 cm) przy słabym czerwonym oświetleniu. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Cincinnati, University of Western Ontario Animal Care Committee i zgodne z wytycznymi NIH i CCAC dotyczącymi badań na kręgowcach.
Operacja zmiany chorobowej
Zwierzęta znieczulono dawką 1-ml / kg (87 mg / kg ketaminy i 13 mg / kg ksylazyny). Zwierzęta umieszczono w aparacie stereotaktycznym (instrumenty Kopf, Tujunga, CA USA), wykonano nacięcie w celu odsłonięcia czaszki i wywiercono otwory nad miejscami wstrzyknięcia za pomocą wiertła dremmel (Dremmel, USA). Kwas ibotenowy (0.25μl, 2% w PBS) podawano obustronnie, stosując dwa wstrzyknięcia przy różnych współrzędnych grzbietowo-brzusznych, każdy w okresie 1.5 minut, stosując strzykawkę Hamiltona 5μl o następujących współrzędnych względem Bregmy (z czaszką wyrównaną poziomo): Dla PL i IL zmiany: AP = 2.9, ML = 0.6, DV = −5.0 i −2.5. Zmiany pozorowane wykonywano tymi samymi metodami, ale stosując zastrzyki z nośnika (PBS). Wszystkim zwierzętom pozwolono na powrót do zdrowia po dniach 7-10 przed testami behawioralnymi.
Wnętrze
Wyrażanie zachowań seksualnych
Uszkodzenia PL i IL przeprowadzono u zwierząt, które nie były wcześniej seksualnie leczone przed operacją. Po wyzdrowieniu zwierzętom pozwolono na kojarzenie raz w tygodniu, aż do wykazania jednego wytrysku, w sumie przez cztery kolejne tygodnie po zabiegu. Różnice w parametrach seksualnych (tj. Opóźnienia w montażu, wszczepienie, wytrysk i liczba wierzchowców i wszczepień) w ramach każdego eksperymentu analizowano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji z chirurgią uszkodzenia jako czynnikiem. Porównania post hoc przeprowadzono za pomocą testów PLSD Fishera, wszystkie z poziomami istotności 5%.
Eksperymenty z podniesionym labiryntem plus
Zwierzęta ze zmianami lub pozorowanym leczeniem badano na podwyższonym labiryncie plus (EPM). Test ten przeprowadzono pięć tygodni po zabiegu i tydzień po ostatniej sesji krycia. EPM został wykonany z przezroczystej pleksiglasu i składał się z czterech ramion o równej długości, rozciągających się od środkowej areny, która tworzyła kształt znaku plus. Dwa ramiona labiryntu były otwarte na otoczenie zewnętrzne, a pozostałe dwa ramiona labiryntu były otoczone ciemnymi bocznicami (wysokość 40cm), które rozciągały się na całej długości ramienia. Granice między środkowym obszarem a ramionami zostały określone przez białe pasy na ramionach umieszczone 12cm od środka labiryntu. Testy EPM przeprowadzono przy słabym oświetleniu, 1 – 4 godziny po rozpoczęciu ciemnego okresu. Różnice między pozorowanymi i uszkodzonymi zwierzętami określono za pomocą testów t-Studenta z poziomem istotności 5%.
Uwarunkowana awersja seksualna
Samce szczurów poddano trzem sesjom krycia w celu uzyskania doświadczenia seksualnego przed zmianą lub pozorowaną operacją. Zwierzęta, które wykazywały wytrysk podczas co najmniej dwóch z trzech testów kojarzenia przedoperacyjnego, zostały włączone do tego badania i podzielone losowo na cztery grupy eksperymentalne: Sham-LiCl, Lesion-LiCl, Sham-Saline i Lesion-Saline. Zmiany chorobowe lub operacje pozorowane wykonywano 3 dni po ostatniej sesji treningowej. Zwierzęta pozostawiono do regeneracji przez tydzień po operacjach przed rozpoczęciem sesji kondycjonowania. Podczas sesji kondycjonowania połowa oszustów i uszkodzonych samców otrzymywała LiCl natychmiast po parzeniu (Sham-LiCl i Lesion-LiCl), podczas gdy druga połowa pozorowanego i uszkodzonych samców służyła jako kontrola i otrzymywała sól fizjologiczną bezpośrednio po kryciu (Sham-Saline i Lesion-Saline). W dniu kondycjonowania 1 zwierzętom pozwolono połączyć się z jedną ejakulacją i wstrzyknięto im w ciągu jednej minuty po wytrysku dawką 20ml / kg albo 0.15M LiCl albo solą fizjologiczną, a następnie umieszczono z powrotem w ich klatkach domowych. Rano w dniu kondycjonowania 2, wszystkie samce zważono i zwierzętom kondycjonowanym solą fizjologiczną podano dawkę 20ml / kg 0.15M LiCl, podczas gdy zwierzętom kondycjonowanym LiCl wstrzyknięto równoważną dawkę soli fizjologicznej. Ten paradygmat powtórzono w ciągu dwudziestu kolejnych dni, w sumie dziesięć pełnych sesji kondycjonujących. Parametry zachowań seksualnych rejestrowano podczas każdej próby. Różnice w procentach zwierząt, które wykazywały wierzchowce i intromisje lub ejakulacje były analizowane dla każdej próby przy użyciu analizy chi-kwadrat z poziomem istotności 5%. Ponieważ nie stwierdzono różnic między grupami Sham-Saline i Lesion-Saline w żadnym parametrze, te dwie grupy połączono do analizy statystycznej (n = 9) i porównano z grupą Lesion-LiCl lub Sham-LiCl.
Warunkowa preferencja miejsca
Zwierzęta, które nie były wcześniej seksualnie, przeszły operację zmian chorobowych, jak opisano powyżej, i pozwolono im wyzdrowieć przez tydzień przed badaniem behawioralnym. Wszystkie testy behawioralne rozpoczęły się 4 godziny po rozpoczęciu ciemnego okresu. Kondycjonowane urządzenie preferencji miejsca podzielono na trzy komory z neutralną komorą środkową. Jedna strona komory miała białe ściany i siatkową podłogę, natomiast druga strona była czarna z prętami ze stali nierdzewnej jako podłoga, środkowa komora była szara z podłogą z pleksiglasu (Med Associates, St. Albans, VT). Najpierw przeprowadzono test wstępny, aby ustalić naturalną preferencję dla każdej osoby przed rozpoczęciem kondycjonowania, wszystkie zwierzęta umieszczono w centralnej komorze z swobodnym dostępem do wszystkich komór na piętnaście minut i rejestrowano całkowity czas spędzony w każdej komorze. Następnego dnia, tj. W dniu kondycjonowania 1, samce krzyżowały się z jedną ejakulacją w klatce domowej, na której natychmiast umieszczano je w początkowo nie preferowanej komorze na trzydzieści minut bez dostępu do innych komór lub umieszczano w ich początkowo preferowanej komorze na trzydzieści minut bez uprzedniego zachowania seksualnego. W drugim dniu kondycjonowania mężczyźni otrzymywali przeciwne leczenie. Ten paradygmat warunkowania powtórzono jeszcze raz. Następnego dnia przeprowadzono test, który był proceduralnie identyczny z testem wstępnym. Dwie oddzielne wartości wykorzystano do określenia, czy uszkodzone zwierzęta mPFC tworzą warunkową preferencję miejsca dla płci. Pierwszy wynik to wynik różnicy, zdefiniowany jako różnica między czasem spędzonym w początkowo preferowanej komorze a czasem spędzonym w początkowo nie preferowanej komorze. Wynik preferencji zdefiniowano jako czas spędzony w początkowo niepreferowanej komorze podzielony przez czas spędzony w początkowo niepreferowanej komorze plus czas spędzony w początkowo preferowanej komorze. Wyniki preferencji i różnic porównano dla każdego zwierzęcia między testem wstępnym i testem końcowym, stosując sparowane testy t-Studenta z poziomami istotności 5%. Wcześniejsze badania wykazały, że łączenie się w pary prowadzi do silnej warunkowej preferencji miejsca przy użyciu tego paradygmatu i że zabiegi kontrolne nie powodują zmian preferencji (27-29).
Uwarunkowana awersja do miejsca
Zwierzęta, które nie były wcześniej seksualnie, poddano uszkodzeniu lub pozorowanej operacji, jak opisano powyżej, i pozwolono im wyzdrowieć przez tydzień przed badaniem behawioralnym. Wszystkie testy behawioralne rozpoczęły się 4 godziny po rozpoczęciu okresu światła. Stosując opisane powyżej urządzenie CPP, zastrzyki LiCl lub solanki sparowano odpowiednio z początkowo preferowaną lub niepreferowaną komorą odpowiednio podczas dwóch prób kondycjonowania w sposób zrównoważony przeciwnie. Przeprowadzono testy przed i po, a dane analizowano jak opisano powyżej, stosując sparowane testy t-Studenta z poziomami istotności 5%.
Weryfikacja uszkodzenia
W celu weryfikacji uszkodzeń zwierzęta poddawano perfuzji przezsercowo za pomocą 4% paraformaldehydu i wycięto mózgi (koronalnie). Skrawki poddano immunoprocesorowi dla markera neuronowego NeuN przy użyciu pierwotnej surowicy odpornościowej w roztworze inkubacyjnym rozpoznającym NeuN (antysurowica monoklonalna anty-NeuN; 1: 10,000; Chemicon) i standardowe metody immunoperoksydazy (19). Lokalizację i wielkość zmian ibotenicznych określano analizując obszar w sąsiednich odcinkach mPFC pozbawiony barwienia neuronów NeuN. Uszkodzenia mPFC zwykle rozciągały się na odległość od AP + 4.85 do + 1.70 względem bregmy (Rysunek 1A-C). Uszkodzenia uznano za zakończone, jeśli 100%% IL i 80% PL został zniszczony i tylko zwierzęta z pełnymi zmianami zostały włączone do analiz statystycznych (eksperyment zachowania seksualnego, zmiana n = 11, fikcja n = 12; eksperyment EPM, uszkodzenie n = 5, fikcja n = 4; eksperyment warunkowanej awersji seksualnej, sham-solanka n = 4, fikcja-LiCl n = 9, sól fizjologiczna n = 5, uszkodzenie-LiCl n = 12; eksperyment preferencji miejsca warunkowego, uszkodzenie n = 5 ; warunkowy eksperyment awersji do miejsca, fikcja n = 12, zmiana n = 9).
Rysunek 1
WYNIKI
Zachowanie seksualne
Uszkodzenia PL / IL nie wpływały na żaden testowany parametr płciowy u mężczyzn, którzy nie byli seksualnie naiwni przed operacją (Rysunek 1D – F). W zgodzie z tym, nie zaobserwowano wpływu zmian PL / IL na zachowanie seksualne u doświadczonych seksualnie mężczyzn włączonych do eksperymentu z uwarunkowaną niechęcią seksualną podczas pierwszej próby, a więc przed parowaniem LiCl z zachowaniem seksualnym (Tabela 1). Stąd zmiany PL / IL nie wpływały na zachowania seksualne niezależnie od doświadczeń seksualnych.
Tabela 1
Podwyższony labirynt plus
W zgodzie z wcześniejszymi raportami (27-29) samce szczurów ze zmianami mPFC wykazywały więcej wejść do otwartych ramion EPM w porównaniu do kontroli (Rysunek 1G), sugerując, że funkcja mPFC ma kluczowe znaczenie w sytuacjach wymagających oceny ryzyka.
Uwarunkowana niechęć do seksu
Wpływ uwarunkowania LiCl na zachowania seksualne
Kondycjonowanie LiCl spowodowało znaczące zmniejszenie odsetka pozorowanych mężczyzn, którzy wykazywali wierzchowce, wady lub wytrysk w porównaniu z pozorowanymi kontrolami soli fizjologicznej (Rysunek 2A – B). Jednak zmiany mPFC całkowicie zablokowały hamowanie spowodowane uwarunkowaniem LiCl. Analiza chi-kwadrat wykazała istotne różnice między grupami wykryte w procentach zwierząt, które pokazały wierzchowce (Rysunek 2A), intromissions (nie pokazane; dane identyczne z Rysunek 2A) lub wytrysków (Rysunek 2B). W szczególności, odsetki mężczyzn, którzy wykazywali wierzchowce, intromisje lub ejakulację były istotnie niższe w grupie Sham-LiCl w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi traktowanymi solanką (Sham i Lesion), co wskazuje na destrukcyjny wpływ warunkowania LiCl podczas kopulacji u zwierząt Sham. W przeciwieństwie do tego nie zaobserwowano wpływu kondycjonowania LiCl u samców Lesion-LiCl (Rysunki 2A – B). Zatem funkcja mPFC ma kluczowe znaczenie dla uzyskania warunkowego zahamowania zachowań seksualnych. Jednakże możliwe jest, że zmiany PL / IL osłabiają uczenie się asocjacyjne związane z nagrodą seksualną, zatem w oddzielnym badaniu badano wpływ zmian PL / IL na uzyskanie warunkowej preferencji miejsca dla nagrody seksualnej.
Rysunek 2
Uwarunkowana preferencja miejsca i awersja
Szczury z uszkodzeniami mPFC wykazywały normalne uczenie asocjacyjne wskazówek kontekstowych w połączeniu z nagrodą seksualną, na co wskazuje zwiększony wynik różnicy i wynik preferencji podczas testu końcowego (Rysunek 3A – B). Ponadto zmiany nie wpłynęły na uczenie się asocjacyjne wskazówek kontekstowych z powodu złego samopoczucia wywołanego przez LiCl, na co wskazuje znaczne zmniejszenie różnic i wyników preferencji podczas testu końcowego (Rysunek 3C – D).
Rysunek 3
DYSKUSJA
W tym badaniu stwierdzamy, że zmiany w obszarach IL i PL mPFC nie wpływają na ekspresję zachowań seksualnych ani na uzyskanie warunkowej preferencji miejsca w stosunku do nagrody seksualnej. Zamiast tego zmiany zapobiegają nabywaniu uwarunkowanej seksualnej niechęci. Wyniki te dostarczają funkcjonalnych dowodów na hipotezę, że zdolność do adaptacyjnych zmian behawioralnych jest regulowana przez podregiony IL i PL mPFC.
Poprzednie dane z naszego laboratorium wykazały, że neurony mPFC są aktywowane podczas zachowań seksualnych u samców szczurów (20). Jednakże szczury uszkodzone przez mPFC w tym badaniu są nie do odróżnienia od pozorowanych szczurów kontrolnych w każdym z analizowanych parametrów zachowań seksualnych. W zgodzie z wcześniejszymi raportami (30, 32) Zmiany mPFC wywołały efekty przeciwlękowe, co oceniono na podstawie wyników na podwyższonym labiryncie plus, wskazując, że nasz protokół uszkodzenia był skuteczny. Dlatego obecne wyniki sugerują, że aktywacja podjednostek IL i PL w mPFC podczas zachowań seksualnych nie jest konieczna do normalnego wyrażania zachowań seksualnych. W przeciwieństwie do tego, poprzednie badanie Agmo i współpracowników wykazało, że uszkodzenia przedniego obszaru zakrętu obręczy (ACA) zwiększały opóźnienia w montażu i intromisji oraz zmniejszały odsetek mężczyzn kopulujących (25). Dlatego możliwe jest, że ACA odgrywa rolę w zachowaniu seksualnym, podczas gdy regiony IL i PL pośredniczą w hamowaniu zachowań związanych z niepożądanymi wynikami.
Chociaż doniesienia o uszkodzeniach mPFC zakłócają różne formy konsolidacji pamięci (33, 34), skutków uszkodzeń mPFC na hamowanie behawioralne zgłaszane tutaj nie można przypisać deficytom uczenia się. W oddzielnym zestawie doświadczeń samce uszkodzone przez mPFC zostały przetestowane pod kątem zdolności do ustalenia warunkowej preferencji miejsca w stosunku do zachowań seksualnych. Uczenie się asocjacyjne związane z nagrodą pozostało nienaruszone u zwierząt uszkodzonych przez mPFC, ponieważ te samce były w stanie stworzyć warunkową preferencję miejsca w stosunku do pary sparowanych nagród seksualnych. Odkrycie to jest zgodne z wcześniejszymi badaniami badającymi rolę PL lub kompletnego mPFC w nabywaniu CPP wywołanego psychostymulantem (35, 36), Co więcej, uczenie asocjacyjne dla bodźca awersyjnego LiCl nie było zmienione przez zmiany mPFC, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami, że zmiany PFC nie zapobiegły nabyciu uwarunkowanej awersji smakowej (34). Łącznie dane te sugerują, że wcześniej obserwowana aktywacja podpodziałów PL / IL w mPFC (20) nie są konieczne do uzyskania powiązanego z nagrodami uczenia się asocjacyjnego, jednak są niezbędne do właściwego wykorzystania tych informacji, ponieważ odnosi się to do wykonywania kontroli behawioralnej. Pojęcie to jest zgodne z obecnym twierdzeniem, że nienaruszona funkcja IL jest niezbędna do badania i działania na podstawie czynników hamujących i pobudzających, które przekazują informacje o ewentualnych awersjach do nagrody (37). Ponadto zwierzęta z PL (35) lub IL (8, 37, 38) zmiany wykazują normalne uczenie się wymierania pomimo niemożności wykorzystania tych informacji do podejmowania decyzji ukierunkowanych na cel.
Podsumowując, obecne badanie wskazuje, że zwierzęta ze zmianami mPFC są prawdopodobnie zdolne do tworzenia skojarzeń z awersyjnymi wynikami swojego zachowania, ale brak im zdolności do tłumienia poszukiwania nagród seksualnych w obliczu awersyjnych konsekwencji. U ludzi podniecenie seksualne jest złożonym doświadczeniem, w którym przetwarzanie informacji poznawczo-emocjonalnych służy do określenia, czy hedoniczne właściwości danego bodźca są wystarczające, aby działać jako zachęta seksualna (39). Aktualne dane sugerują, że dysfunkcja mPFC może przyczyniać się do podejmowania ryzyka seksualnego lub kompulsywnego poszukiwania zachowań seksualnych. Ponadto dysfunkcja mPFC jest związana z kilkoma zaburzeniami psychicznymi (13, 40) sugerując, że dysfunkcja mPFC może być podstawową patologią, która jest wspólna z innymi zaburzeniami i że kompulsywne zachowania seksualne mogą być związane z innymi zaburzeniami. Rzeczywiście, u ludzi stwierdzono, że hiperseksualność lub kompulsywne zachowania seksualne mają wysoką częstość współwystępowania z chorobami psychicznymi (w tym nadużywanie substancji, lęk i zaburzenia nastroju) (41) i około10% rozpowszechnienia choroby Parkinsona wraz z kompulsywnym kupowaniem, hazardem i jedzeniem (42-44).
Przypisy
Zastrzeżenie wydawcy: Jest to plik PDF z nieedytowanym manuskryptem, który został zaakceptowany do publikacji. Jako usługa dla naszych klientów dostarczamy tę wczesną wersję manuskryptu. Rękopis zostanie poddany kopiowaniu, składowi i przeglądowi wynikowego dowodu, zanim zostanie opublikowany w ostatecznej formie cytowania. Należy pamiętać, że podczas procesu produkcyjnego mogą zostać wykryte błędy, które mogą wpłynąć na treść, a wszystkie zastrzeżenia prawne, które odnoszą się do czasopisma, dotyczą.
;