Front Psychiatry. 2018; 9: 81.
Opublikowano online 2018 Mar 12. doi: 10.3389 / fpsyt.2018.00081
PMCID: PMC5858605
PMID: 29593587
Minho Lee,1,† Hyeyoung Cho,2,3,† Seung Hyun Jung,2,4 Seon-Hee Yim,2 Sung-Min Cho,2,3 Ji-Won Chun,5 Soo-Hyun Paik,5 Yae Eun Park,6,7 Dong Huey Cheon,7,8 Ji Eun Lee,7 Jung-Seok Choi,9 Dai-Jin Kim,5,* i Yeun-Jun Chung1,2,3,*
Abstrakcyjny
Tło
Uzależniające korzystanie z Internetu i gier online jest potencjalnym zaburzeniem psychicznym określanym jako internetowe zaburzenie gry (IGD). Zmieniono profil ekspresji mikroRNA (miRNA) we krwi i tkance mózgowej pacjentów z pewnymi zaburzeniami psychicznymi i zasugerowano jako biomarkery. Jednakże nie było żadnych raportów dotyczących profili miRNA we krwi w IGD.
Metody
Aby odkryć miRNA związane z IGD, przeanalizowaliśmy profile ekspresji miRNA próbek 51 (kontrolki 25 IGD i 26) przy użyciu matrycy miRNA TaqMan Low Density. W celu walidacji przeprowadziliśmy ilościową PCR z odwrotną transkrypcją z niezależnymi próbkami 36 (kontrolki 20 IGD i 16).
Efekt
Poprzez odkrycie i niezależną walidację, zidentyfikowaliśmy trzy miRNA (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-652-3p), które były znacznie obniżone w grupie IGD. Osoby z wszystkimi trzema zmianami miRNA wykazywały o wiele większe ryzyko wystąpienia IGD niż osoby bez zmian [iloraz szans (OR) 22, 95% CI 2.29-211.11], a ORs zwiększały dawkę w zależności od liczby zmienionych miRNA. Przewidywane geny docelowe trzech miRNA były związane ze szlakami nerwowymi. Zbadaliśmy ekspresję białka trzech docelowych genów metodą western blot i potwierdziliśmy, że ekspresja GABRB2 i DPYSL2 była znacznie wyższa w grupie IGD.
Wnioski
Zaobserwowaliśmy, że ekspresja hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p i hsa-miR-652-3p była obniżona u pacjentów z IGD. Nasze wyniki pomogą zrozumieć patofizjologię IGD.
Wprowadzenie
Uzależniające korzystanie z Internetu i gier internetowych nie jest tylko zjawiskiem społecznym w krajach o rozbudowanej infrastrukturze dostępu do Internetu, ale potencjalnym zaburzeniem psychiatrycznym określanym jako internetowe zaburzenie gry (IGD) (1-3). Według raportów epidemiologicznych częstość występowania IGD u nastolatków jest różna w różnych krajach, od 0.8 do 26.7% (4). W szczególności badania wykazują wskaźniki rozpowszechnienia powyżej 10% u nastolatków w wielu krajach azjatyckich, takich jak Korea Południowa, Chiny, Tajwan, Hongkong i Singapur (4). IGD wiąże się z zaburzeniami w poznaniu, relacjach psychospołecznych i życiu codziennym; na przykład pogarszające się wyniki akademickie lub zawodowe (4-7). IGD jest teraz włączony do Sekcji III (Warunki dalszego studium) piątej rewizji Podręcznika diagnostyczno-statystycznego zaburzeń psychicznych (DSM-V) (8). Jednak, pomimo swojego kliniczno-społecznego znaczenia, niewiele wiadomo na temat molekularnego mechanizmu genetycznego odpowiedzialnego za IGD.
Ostatnie bliźniacze badania na dużą skalę sugerują genetyczne podstawy dla IGD (9, 10). Vink i in. zbadali indywidualne różnice w kompulsywnym korzystaniu z Internetu za pomocą jednojajowych bliźniąt jednojajowych 5,247 i dizygotycznych w rejestrze bliźniaczych Niderlandów i podali, że 48% różnic wyjaśniono czynnikami genetycznymi (9). Li i in. zaobserwował pary 825 chińskich bliźniąt dorastających i poinformował, że czynniki genetyczne wyjaśniają 58-66% różnic (10). Odpowiednio, polimorfizmy genów zaangażowanych w neurotransmisję, funkcje poznawcze i uwagę, takie jak gen D2 receptora dopaminy (DRD2), genu O-metylotransferazy katecholaminowej (COMT), gen transportera serotoniny (5HTTLPR) i genu nikotynowego alfa 4 receptora cholinergicznego (CHRNA4) zostały zgłoszone jako znacząco powiązane z uzależnieniem od Internetu (11-13). Ostatnio Kim et al. skrywane warianty więcej niż genów kandydujących 100 związanych z produkcją, działaniem i metabolizmem neuroprzekaźników za pomocą analizy sekwencjonowania następnej generacji i donoszą, że rs2229910 NTRK3 gen jest związany z IGD (14).
Oprócz czynników genetycznych dobrze wiadomo, że fenotypy neurobehawioralne są kontrolowane epigenetycznie przez niekodujące RNA, w tym mikroRNA (miRNA) (15, 16). miRNA to małe niekodujące jednoniciowe cząsteczki RNA (w przybliżeniu długości nukleotydów 20-23), które negatywnie regulują ekspresję genów kodujących białka poprzez degradację mRNA i odgrywają kluczową rolę w patofizjologicznym procesie różnych chorób (17). Linie dowodów wykazały, że miRNA są obfite w ludzkim ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) i działają w celu dostrojenia poziomów ekspresji ich docelowych genów, które biorą udział w rozwoju i dojrzewaniu układu CNS (15). Rzeczywiście, ostatnie badania wykazały, że profile ekspresji miRNA są zmienione w tkance mózgowej pacjentów z zaburzeniami psychicznymi, co sugeruje, że ich profile ekspresji mogą być biomarkerami dla zaburzeń psychicznych (15, 16, 18). Na przykład w analizie pośmiertnej Lopez i in. donieśli, że ekspresja miR-1202, która reguluje ekspresję genu metabolitu metabotropowego genu 4 i przewiduje reakcję na lek przeciwdepresyjny, była obniżona w tkankach kory przedczołowej pacjentów z ciężką depresją (19). Pod względem badania biomarkerów podejście to jest wyraźnie ograniczone, ponieważ wykonanie biopsji tkanki CNS w celu skriningu jest niemożliwe. Ponieważ miRNA można wykryć we krwi (osocze lub surowica), krążące miRNA mają wyraźną przewagę jako nieinwazyjne biomarkery w zaburzeniach neuropsychiatrycznych. Jednak do tej pory nie przeprowadzono badań dotyczących krążenia profili miRNA w IGD. Lepsze zrozumienie krążących profili ekspresji miRNA może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmu rozwoju IGD i ułatwić przekład kliniczny.
W tym badaniu staraliśmy się zidentyfikować markery miRNA związane z IGD, obserwując różnicowo wyrażane miRNA w plazmie między IGD i kontrolnymi grupami oraz zbadać ich biologiczne implikacje.
Materiały i Metody
Osoby badane
Przeanalizowaliśmy nastolatków 3,166 (w wieku 12-18) korzystając z punktacji DSM-V IGD. Wśród nich 251 (samce 168 i samice 83) zostały zdiagnozowane jako IGD zgodnie z kryteriami DSM-V (8). Łączna liczba osób 91 (49 IGD i kontrola 42) dostarczyła świadomą zgodę na to badanie. Wśród nich cztery osoby zostały wykluczone zgodnie z kryteriami wykluczenia. Ostatecznie do tego badania włączono osobników 87 (osobników 45 IGD i zdrowych osób kontrolnych 42). Wśród nich uczestnicy 51 (pacjenci 25 IGD i kontrole 26) zostali zwerbowani jako zestaw od 2014 do 2016. Pozostali uczestnicy 36 (pacjenci 20 IGD i kontrole 16) zostali zwerbowani jako niezależny zestaw walidacyjny z 2016. Wszyscy uczestnicy byli Koreańczykami, zarejestrowanymi w Seoul St. Mary's Hospital (Seul, Korea Południowa) i Seoul National University Boramae Hospital (Seul, Korea Południowa). Wszyscy uczestnicy przeszli ustrukturyzowaną rozmowę kwalifikacyjną przeprowadzoną przez psychiatrę na podstawie koreańskiego wykazu zaburzeń afektywnych i schizofrenii (K-SADS-PL) (20). Wszyscy uczestnicy wypełnili podtesty Blokowe projektowanie i słownictwo Koreańsko-Wechslerowskiej Skali Inteligencji dla Dzieci, wydanie 4th (K-WISC-IV) (21). Impulsywność została oceniona za pomocą Skali Impulsywności Barratt (BIS) (22). Systemy BFS (Behavioral Inhibition System) i Behavioral Activation System (BAS) zostały zmierzone w celu oceny wymiaru osobowości (23). Kryteria wykluczenia obejmowały przeszłe lub obecne poważne zaburzenia medyczne (np. Cukrzyca), zaburzenia neurologiczne (np. Zaburzenia drgawkowe, uraz głowy), zaburzenia psychiczne (np. Ciężkie zaburzenia depresyjne, zaburzenia lękowe), upośledzenie umysłowe lub jakiekolwiek nadużywanie substancji (np. tytoniu, marihuany, alkoholu). Ogólna charakterystyka badanych osób została podsumowana w tabeli Table1.1. Badanie to zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board z University College of Catholic University (MC16SISI0120). Wszyscy uczestnicy i ich rodzice wyrazili pisemną, świadomą zgodę.
Tabela 1
Ogólna charakterystyka badanych osób.
odkrycie | Walidacja | Mieszany | |||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Control | IGD | P-wartość | Control | IGD | P-wartość | Control | IGD | P-wartość | |
N | 26 | 25 | 16 | 20 | 42 | 45 | |||
Wiek (lata) | |||||||||
Mediana (min-max) | 13 (12 - 17) | 13 (12 - 15) | 0.759 | 15 (13 - 18) | 14.5 (12 - 18) | 0.628 | 14 (12 - 18) | 14 (12 - 18) | 0.509 |
Tygodniowe godziny gier internetowych (h) | |||||||||
Mediana (min-max) | 5.25 (2 - 17) | 18 (6 - 46) | 1.27E-6a | 5.5 (2 - 23) | 8 (1 - 112) | 0.374 | 5.5 (2 - 23) | 14 (1 - 112) | 1.63E-5a |
Miesięczny dochód gospodarstwa domowego (milion KRW) | |||||||||
Mediana (min-max) | 5 (1 - 9) | 3 (1 - 9) | 0.588 | 4 (4 - 4) | 2 (2 - 2) | 1.000 | 5 (1 - 9) | 3 (1 - 9) | 0.460 |
Edukacja (lata) | |||||||||
Mediana (min-max) | 8 (7 - 9) | 8 (7 - 9) | 0.584 | 12 (12 - 12) | 6 (6 - 13) | 0.305 | 8 (7 - 12) | 8 (6 - 13) | 0.269 |
K-WISC: projekt bloku | |||||||||
Mediana (min-max) | 10.5 (4 - 17) | 10 (4 - 16) | 0.544 | 10 (3 - 16) | 12.5 (4 - 15) | 0.125 | 10 (3 - 17) | 11 (4 - 16) | 0.598 |
K-WISC: słownictwo | |||||||||
Mediana (min-max) | 9 (5 - 17) | 7 (5 - 13) | 0.174 | 9.5 (8 - 15) | 11.5 (5 - 15) | 0.595 | 9 (5 - 17) | 9 (5 - 15) | 0.527 |
KS | |||||||||
Mediana (min-max) | 24 (17 - 36) | 37 (22 - 51) | 3.81E-6a | 29 (17 - 34) | 59 (22 - 108) | 1.2E-5a | 25 (17 - 36) | 40 (22 - 108) | 2.05E-10a |
BIS | |||||||||
Mediana (min-max) | 63 (35 - 75) | 67.5 (45 - 81) | 0.080 | 61 (45 - 79) | 63 (32 - 82) | 0.835 | 62 (35 - 79) | 65 (32 - 82) | 0.240 |
BAS | |||||||||
Mediana (min-max) | 31 (15 - 40) | 31 (13 - 51) | 0.558 | 36.5 (22 - 48) | 34 (27 - 52) | 1.000 | 32 (15 - 48) | 34 (13 - 52) | 0.637 |
BINKI | |||||||||
Mediana (min-max) | 18 (10 - 26) | 17.5 (13 - 27) | 0.642 | 18.5 (12 - 25) | 20 (13 - 21) | 0.138 | 18 (10 - 26) | 19 (13 - 27) | 0.302 |
IGD, pacjenci z hazardem internetowym; KS, koreańska skala opłat za uzależnienie od Internetu; BIS, Barratt Impulsivity Scale; BAS, behawioralny system aktywacji; BINI, system hamowania behawioralnego; KRW, Korean Won.
aP <0.05 (test Manna – Whitneya – Wilcoxona).
Eksperymenty miRNA (TLDA) TaqMan o niskiej gęstości
Od każdego uczestnika pobrano krew obwodową i przeniesiono do laboratorium w ciągu 4 godz., Aby zminimalizować lizę komórek krwi. Próbkę odwirowano przy prędkości obrotowej 3,000 przez min 10 w temperaturze pokojowej. Następnie supernatant (warstwa osocza) zebrano bez zanieczyszczania komórek krwi. Krążące miRNA ekstrahowano przy użyciu TaqMan miRNA ABC Purification Kit (ludzki panel A, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) zgodnie z instrukcjami producenta. W skrócie, zmieszano 50 μL próbki osocza i 100 μl buforu ABC. Po hybrydyzacji z specyficznymi dla celu perełkami magnetycznymi anty-miRNA, ograniczone krążące miRNA eluowano z kulek za pomocą 100? L buforu do elucji. W fazie wykrywania, miRNA 381 badano z próbek osocza 51 (25 IGD i kontroli 26) przy użyciu TaqMan miRNA ABC Purification Kit (ludzki panel A, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) zgodnie z instrukcjami producenta. Reakcje odwrotnej transkrypcji i wstępnej amplifikacji Megaplex przeprowadzono w celu zwiększenia ilości cDNA do analizy ekspresji miRNA przy użyciu MegaplexPreAmp Primers Human Pool A i TaqManPreAmp Master Mix (Thermo Fisher Scientific). Panel TLDA A v2.0 (Thermo Fisher Scientific) pracował w systemie PCR w czasie rzeczywistym ViiA7 (Thermo Fisher Scientific) w celu oceny ekspresji miRNA. Surowe dane przetwarzano przy użyciu oprogramowania ExpressionSuite v1.0.4 (Thermo Fisher Scientific) w celu określenia wartości Ct dla każdego miRNA.
Analiza danych dla TLDA
Najpierw zmierzyliśmy cykle progowe (wartość Ct) każdego miRNA. miRNA o wartości Ct> 35 uznano za niewykrywalne i wykluczono z dalszej analizy. Wszystkie wartości Ct zostały znormalizowane do wartości Ct miR-374b (wartość ΔCt), jednego z miRNA o najbardziej stabilnej ekspresji krążącego w ludzkim osoczu (24). Współczynnik fałdowania log2 (wartość ΔΔCt) wyrażono, stosując średnie wartości próbek kontrolnych jako kalibratora w pakiecie HTqPCR w Biowrzewodniku (25). Względna kwantyfikacja (RQ) każdego celu miRNA została zdefiniowana jako 2-ΔΔCt. W celu hipotetycznego przetestowania różnicy w ekspresji między dwiema grupami zastosowaliśmy zmienną analizę zastępczą (SVA) w celu wychwycenia niejednorodności, takich jak efekty wsadowe w eksperymentach z użyciem Sva pakiet w Bioconductor (26). miRNA z P-wartość <0.05 uznano za istotnie różną między dwiema grupami.
Analiza wzbogacania zestawu genów
Do analizy wzbogacania zestawu genów użyliśmy ToppFun w ToppGene Suite (27), aby wnioskować o znacznie wzbogaconej Gene Ontology (GO) (28) terminy, szlaki i terminy chorobowe. Jako dane wejściowe dla tego podejścia wykorzystaliśmy przewidywane geny docelowe kandydujących miRNA 1,230. Analiza szlaku została wykorzystana do znalezienia istotnych szlaków przewidywanych genów docelowych zgodnie z ścieżkami KEGG, BioCarta, Reactome, GeneMAPP i MSigDBin ToppGene. Znaczenie terminów wzbogacania funkcjonalnego określono na podstawie skorygowanego Bonferroniego P-wartość.
Ilościowa odwrotna transkrypcja PCR (qRT-PCR) Walidacja i replikacja
W celu walidacji miRNA 10, które ulegały ekspresji różnicowej na etapie odkrycia, qRT-PCR przeprowadzono przy użyciu testu TaqMan MicroRNA (miR-15b-5p, # 000390; miR-26b-5p, # 000407; miR-29b-3p, # 000413; miR-125b-5p, # 000449; miR-200c-3p, # 002300; miR-337-5p, # 002156; miR-411-5p, # 001610; miR-423-5p, # 002340; miR-483 -5p, #002338; i miR-652-3p, #002352) oraz system ViiA7 (Life Technologies) zgodnie z protokołem producenta. Dziesięć nanogramów całkowitego RNA przekształcono w cDNA pierwszej nici za pomocą starterów specyficznych dla miRNA przy użyciu zestawu do odwrotnej transkrypcji TaąMan MicroRNA (#4366596, Life Technologies), a następnie w czasie rzeczywistym PCR z użyciem TaqMan Probes. RQ każdego miRNA zdefiniowano jako 2-ΔCt, gdzie ΔCt to różnica w cyklach progowych dla danej próbki, znormalizowana względem endogennego miRNA (miR-374b-5p, #001319). Wszystkie reakcje PCR przeprowadzono trzykrotnie, a ich wartości Ct uśredniono. Obliczyliśmy stosunek fałdowania log2 (ΔΔCt) każdego miRNA w taki sam sposób, jak w analizie tablicowej. Przeprowadzono nieparametryczny test Manna-Whitneya-Wilcoxona w celu przetestowania różnic w poziomach ekspresji miRNA w dwóch grupach z progiem P- wartość 0.05.
Analiza Western Blot
Każda próbka surowicy została po raz pierwszy pozbawiona najwyższych białek 14 (albuminy, immunoglobuliny G, immunoglobuliny A, serotransferryny, haptoglobiny, antytrypsyny alfa-1, fibrynogenu, alfa-2 makroglobuliny, glikoproteiny kwasowej alfa-1, immunoglobuliny M, apolipoproteiny AI apolipoproteiny A-II, stanowiącej dopełniacz C3 i transtyretynę) przy użyciu kolumny MARS-14 (4.6 x 50 mm, Agilent Technology, Santa Clara, CA, USA) przed analizą Western błot. Niezwiązaną frakcję uzyskaną z kolumny MARS-14 zatężono przy użyciu filtra odśrodkowego Amicon Ultracel-3 (granica 3 kDa), a następnie stężenie białka oznaczono stosując metodę z kwasem bicynchoninowym. Te same ilości (od 10 do 30 μg) próbek kontrolnych i próbek surowicy IGD rozdzielono na żelu 4-20% Mini-PROTEAN TGX (Bio-Rad, CA, USA) i przeniesiono na membranę z difluorku poliwinylidenu. Następnie membranę zablokowano w TBS-T (190 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl, pH 7.5 i 0.05% Tween 20) z odtłuszczonym mlekiem 5% w temperaturze pokojowej przez min. 30. Następnie membrany inkubowano z pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko DPYSL2 (1: 500, Novus Biologicals, Littleton, CO, USA), GABRB2 (1: 1000, Abcam, Cambridge, MA, USA) i CNR1 (1: 100, Santa Cruz Biotechnology , Inc., Santa Cruz, Kalifornia, USA), DUSP4 (1: 500, MybioSource, San Diego, CA, USA) i PI15 (1: 500, MybioSource, San Diego, CA, USA) w TBS-T z 5 % odtłuszczonego mleka w proszku w 4 ° C przez noc, a następnie z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi bydlęcymi przeciwciałami przeciwko mysim (1: 1,000, Santa Cruz Biotechnology) lub kozim anty-króliczym (1: 1,000, Cell Signaling, Beverly, MA, USA ) sprzężone z peroksydazą chrzanu w temperaturze pokojowej przez 1 godz. Wykrywanie sygnału przeprowadzono stosując chemiluminescencję z odczynnikiem ECL (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). Określiliśmy ilościowo wyniki Western blot przy użyciu oprogramowania do analizy TotalLab 1D (Non-linear Dynamics, Newcastle upon Tyne, UK). Następnie wartość stosunku densytometrii obliczono dzieląc wartość densytometryczną każdej próbki, jak opisano w innym miejscu (29). Jako kontrolę normalizacji, do każdego eksperymentu użyto próbki surowicy zebranej z 46 IGD i próbek kontrolnych. Istotność statystyczną określono przy użyciu nieparametrycznego testu Manna-Whitneya-Wilcoxona z progiem P- wartość 0.05.
Efekt
Charakterystyka uczestników badania
Demograficzne i kliniczne cechy badanych osób przedstawiono w tabeli Table1.1. Kiedy porównaliśmy IGD i grupy kontrolne zgodnie z koreańską skalą podatności Uzależnienie od Internetu (K-Scale) jak opisano w innym miejscu (20, 30), grupa IGD wykazała istotnie wyższą średnią wartość K-skali niż grupa kontrolna (37 vs. 24, P = 3.81 × 10-6) (Stół (Table1) .1). Średni tygodniowy czas spędzany na grach internetowych w grupie IGD był znacznie dłuższy niż w przypadku kontrolnych (18 vs. 5.25 h, P = 1.27 × 10-6). Podczas gdy nie było istotnej różnicy między dwiema grupami wiekowymi, miesięcznym dochodem gospodarstwa domowego, czasem trwania edukacji, projektem blokowym i podtestem słownictwa K-WISC, BIS, BInS i BAS.
Różnie wyrażane miRNA między IGD i kontrolami
Aby odkryć miRNA związane z IGD, przyjęliśmy dwuetapowe podejście (odkrywanie i niezależna walidacja). Projekt badania i ogólną strategię przedstawiono na rysunku S1 w materiale uzupełniającym. Na etapie odkrywania przeanalizowaliśmy profile ekspresji miRNA próbek 51 (25 IGD i kontrolki 26) przy użyciu tablicy miRNA zawierającej miRNA 384. Stwierdzono, że poziomy ekspresji miRNA 10 znacząco różnią się między IGD i grupami kontrolnymi (tab (Table2) .2). Względne poziomy ekspresji tych miRNA 10 pokazano na rysunku Figure1.1. Wśród nich dwa (hsa-miR-423-5p i hsa-miR-483-5p) uległy zwiększeniu i osiem (hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-337c-5p, hsa-miR-411-5p i hsa-miR-652-3p) były obniżone w grupie IGD.
Tabela 2
MiRNA różnicowane ekspresyjnie (miRNA) i fałd zmiany.
miRNA | odkrycie | Walidacja | Mieszany | |||
---|---|---|---|---|---|---|
P-wartość | Zwiń zmiany | P-wartość | Zwiń zmiany | P-wartość | Zwiń zmiany | |
hsa-miR-15b-5p | 0.033 | 0.829 | 0.694 | 1.119 | 0.381 | 0.947 |
hsa-miR-26b-5pa | 0.008 | 0.871 | 0.049 | 0.841 | 0.013 | 0.857 |
hsa-miR-29b-3p | 0.005 | 0.400 | 0.560 | 1.187 | 0.089 | 0.647 |
hsa-miR-125b-5p | 0.021 | 0.582 | 0.290 | 0.950 | 0.069 | 0.723 |
hsa-miR-200c-3pa | 0.011 | 0.336 | 0.003 | 0.542 | 2.93 × 10-5 | 0.415 |
hsa-miR-337c-5p | 0.009 | 0.385 | 0.582 | 0.872 | 0.020 | 0.553 |
hsa-miR-411-5p | 0.004 | 0.322 | 0.336 | 1.282 | 0.158 | 0.595 |
hsa-miR-423-5p | 0.026 | 1.387 | 0.189 | 0.955 | 0.518 | 1.175 |
hsa-miR-483-5p | 0.018 | 1.861 | 0.765 | 1.413 | 0.211 | 1.647 |
hsa-miR-652-3pa | 0.019 | 0.715 | 0.049 | 0.877 | 0.011 | 0.782 |
amiRNA znacząco zmieniły się zarówno w zestawach wykrywania, jak i walidacji w spójny sposób.
qRT-PCR Validation of Candidate miRNAs
W celu walidacji miRNA kandydujących do 10, przeprowadziliśmy qRT-PCR z niezależnym zestawem walidacyjnym (kontrolery 20 IGD i 16) (tabela S1 w materiale uzupełniającym). Trzy z tych miRNA (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p i hsa-miR-652-3p) były znacznie obniżone w grupie IGD zestawu do walidacji (tabela (Table2) .2). Trzy inne miRNA (hsa-miR-337c-5p, hsa-miR-125b i hsa-miR-423-5p) również uległy obniżeniu w grupie IGD, ale nie znacząco. Pozostałe cztery miRNA (hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-411-5p i hsa-miR-423-5p) wyrażono przeciwnie w zestawie walidacyjnym. Po połączeniu zestawów wykrywania i sprawdzania poprawności (łącznie z obiektami 45 IGD i kontrolkami 42) trzy zatwierdzone miRNA były konsekwentnie znaczące (tabela (Table2) .2). Szczegółowe informacje, lokalizacje chromosomów, dojrzałe sekwencje i poziomy ekspresji w OUN tych trzech miRNA są dostępne w tabeli S2 w materiale uzupełniającym.
Synergistyczny efekt równoczesnej zmiany trzech miRNA na ryzyko IGD
Aby ocenić łączny wpływ trzech miRNA, obserwowaliśmy iloraz szans (OR) czterech podgrup (z modyfikacjami miRNA 0, 1, 2 lub 3). Zmiana miRNA została zdefiniowana przez wartość RQ, jak opisano w rozdziale "Materiały i Metody"Ponieważ wszystkie trzy markery miRNA uległy obniżeniu w grupie IGD, to miRNA, którego wartość RQ była poniżej jednej, zostało zignorowane jako zmienione. Szczegółowe informacje o wartości RQ każdego badanego osobnika dla trzech miRNA są dostępne w tabeli S3 w materiale uzupełniającym. Dla każdej podgrupy kursy obliczano jako stosunek liczby kontroli do liczby IGD, następnie obliczano każde OR dzieląc szanse dla każdej podgrupy przez kurs podgrupy bez żadnych zmian miRNA. Osoby z trzema zmianami miRNA wykazywały ryzyko 22 razy wyższe niż te bez jakiejkolwiek zmiany miRNA (OR 22, 95% CI 2.29-211.11). OR wykazały wzrost tendencji z liczbą zmienionych miRNA od 0 do 3 (r2 = 0.996) (rys (Figure22).
Analiza GO i Pathway docelowych genów miRNA kandydatów
Aby uzyskać wgląd w funkcje trzech markerów miRNA znacznie obniżonych w grupie IGD, ich geny docelowe były przewidywane przy użyciu bazy danych miRWalk 2.0 (31). Całkowita liczba genów 1,230 była konsekwentnie przewidywana jako docelowe miejsce docelowe przez cztery algorytmy (miRWalk, miRanda, RNA22 i Targetscan) przy użyciu bazy danych miRWalk (32-34) (Tabela S4 w materiale uzupełniającym). Analiza wzbogacania zestawu genów przy użyciu ToppFun w ToppGene Suite wykazała, że docelowe geny tych miRNA były znacząco związane ze ścieżkami rozwoju nerwowego, takimi jak "prowadzenie Axona" i terminy GO, takie jak "neurogeneza" (tabela S5 w materiale uzupełniającym).
Ekspresja przewidywanych genów docelowych
Wśród docelowych docelowych genów trzech miRNA, 140 przewidywano jednocześnie dla dwóch lub więcej miRNA (Tabela S4 w materiale uzupełniającym). Aby zbadać, czy ich poziomy ekspresji białek docelowych genów są różne między IGD i grupami kontrolnymi, wybraliśmy geny 2 (DUSP4 i PI15), które są przewidywane jako docelowe miejsca docelowe wszystkich miRNA 3 i dodatkowych genów 3 (GABRB2, DPYSL2, CNR1) od tych przewidzianych dla miRNA 2 i wykonano analizę Western blot z próbkami osocza z 28 IGD i kontroli 28 dostępnych do eksperymentu. Porównaliśmy wyrażenia pięciu celów między IGD i grupami kontrolnymi, mierząc intensywność pasma i obszar, jak opisano w innym miejscu (29). Wśród nich poziomy ekspresji DPYSL2 (28 IGD i 28 control, P = 0.0037) i GABBR2 (27 IGD i 28 kontroli, P = 0.0052) były istotnie wyższe w grupie IGD (ryc (Figure3) .3). Jednak nie mogliśmy zaobserwować różnicowych wyrażeń CNR1 (P = 0.0853), DUSP4 (P = 0.5443) i PI15 (P = 0.6346).
Dyskusja
Doniesiono, że miRNA są zaangażowane w rozwój neuronów (35, 36), a zróżnicowana ekspresja miRNA w mózgu obserwuje się w chorobach psychiatrycznych, takich jak schizofrenia (37). Dlatego jest prawdopodobne, że krążące profile miRNA mogą być użytecznymi biomarkerami dla IGD. Krążące miRNA zostały zasugerowane jako biomarkery różnych zaburzeń neuropsychiatrycznych (38-40); Jednak molekularne mechanizmy stojące za rozwojem IGD są nadal w dużej mierze nieznane, pomimo ich znaczenia klinicznego i społecznego. W szczególności nie przeprowadzono badań dotyczących miRNA związanych z IGD. Cel tego badania był dwojaki. Najpierw próbowaliśmy odkryć miRNA plazmy związane z IGD. Po drugie, oceniliśmy biologiczną implikację kandydatów na miRNA, badając ekspresję białka i GO docelowych genów w dół. Dzięki przeszukiwaniu całego genomu profili ekspresji miRNA i dalszej walidacji kandydatów odkryliśmy, że ekspresja trzech miRNA (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p i hsa-miR-652-3p) została znacznie niższe u pacjentów z IGD niż w grupie kontrolnej. Chociaż wzorce ekspresji innych siedmiu kandydatów miRNA nie były replikowane w walidacji, mogą być fałszywie ujemne ze względu na małą wielkość próby w tym badaniu. Zgodnie z naszą wiedzą, jest to pierwszy raport na temat możliwości, że profile ekspresji miRNA we krwi mogą być użytecznymi biomarkerami dla IGD. Kombinacja trzech markerów miRNA może służyć jako minimalnie inwazyjne narzędzie do wczesnej identyfikacji osób zagrożonych IGD.
Odkryto, że miRNA zidentyfikowane w tym badaniu są zaangażowane w różnorodne zaburzenia neuropsychiatryczne. W wielu zaburzeniach psychiatrycznych, takich jak schizofrenia, zaobserwowano, że ekspresja hsa-miR-200c we krwi ulega obniżeniu (41) i główne epizody depresyjne (42). Zgłaszano, że miR-200c jest silniej wyrażany w frakcjach synaptycznych niż w całkowitym przodomierzu (43), a także być związane ze śmiercią komórek neuronalnych (44). Na podstawie tych wcześniejszych doniesień, miR-200c bierze udział w neurorozwoju i może być związany z zaburzeniami neuropsychiatrycznymi, jeśli jego ekspresja jest zaburzona. W kilku badaniach zasugerowano związek między miR-652 a ryzykiem wystąpienia zaburzeń neuropsychiatrycznych. Podobnie jak w naszym podejściu, aby zidentyfikować biomarkery krwi dla schizofrenii, Lai i in. przeprowadzili analizę TLDA u pacjentów ze schizofrenią i u zdrowych osób i stwierdzili, że siedem miRNA, w tym hsa-miR-652, ulegało zróżnicowanej ekspresji u pacjentów ze schizofrenią (45). W kolejnym badaniu opracowali model predykcyjny z wykorzystaniem danych dotyczących ekspresji miRNA i z powodzeniem odróżnili schizofrenię od normalnej kontroli (46). Zmienioną ekspresję hsa-miR-652 obserwowano również u alkoholików (47). Stwierdzono, że Hsa-miR-26b był aktywowany podczas różnicowania komórek nerwowych (48). Perkins i in. donoszą, że hsa-miR-26b był obniżony w korze przedczołowej pacjentów ze schizofrenią (49).
Chociaż nie ma bezpośrednich dowodów na poparcie związku między zaburzoną ekspresją tych miRNA a patofizjologią IGD, możemy wywnioskować, że rozregulowanie tych miRNA może być związane z patofizjologią IGD na podstawie różnych wcześniejszych doniesień na temat przewidywanych genów, które przewidywaliśmy. . Niektóre z dalszych genów trzech miRNA, takich jak GABRB2, CNR1, NRXN1, DPYSL2 są zgłaszane jako związane z zaburzeniami neuropsychiatrycznymi. Kwas gamma-aminomasłowy (GABA) jest głównym neurotransmiterem hamującym w OUN. Dysregulacja receptora GABA jest związana z zaburzeniami neuropsychiatrycznymi, w tym uzależnieniem, lękiem i depresją (50), które są również głównymi cechami IGD (8). Doniesiono, że genetyczne polimorfizmy w genach receptora GABA wiążą się z uzależnieniem od alkoholu i schizofrenią (51, 52). Dihydropirymidynazopodobny 2 (DPYSL2) jest członkiem rodziny białek mediatora reakcji collapsin, która odgrywa rolę w tworzeniu mikrotubuli, sygnalizacji synaptycznej i regulacji wzrostu aksonów. W związku z tym ta cząsteczka została zasugerowana jako biomarker zaburzeń psychicznych (53, 54). Polimorfizm w DPYSL2 zanotowano również związek genów z zaburzeniem używania alkoholu (55). Poprzednie raporty i nasze dane sugerują, że nadekspresja GABRB2 i DPYSL2, dolne poziomy docelowe obniżonych miRNA, ma wpływ na patogenezę zaburzeń neuropsychiatrycznych, w tym IGD. Receptor kannabinoidowy 1 (CNR1) jest presynaptycznym heteroreceptorem, który moduluje uwalnianie neuroprzekaźnika, a zaburzenia w sygnalizacji kannabinoidowej są związane z różnymi zaburzeniami neuropsychiatrycznymi (56). Genetyczny polimorfizm CNR1 wiadomo, że gen jest powiązany z uzależnieniem od substancji u rasy kaukaskiej (57). W modelu szczurzym aktywacja hipokampu brzusznego CNR1 zakłóca normalne zachowania społeczne i funkcje poznawcze (58). Wiadomo, że zmiany genetyczne w rodzinie NRXN są zaangażowane w różnorodne zaburzenia neuropsychiatryczne, w tym uzależnienie (59).
Aby zbadać biologiczną implikację trzech kandydatów na miRNA w bardziej bezpośredni sposób, badaliśmy ekspresję białka ich docelowych genów. Ze względu na ograniczoną dostępność próbek osocza, z powszechnych kandydatów 140 (przewidywane jako następne od 2 lub więcej miRNA), zbadaliśmy cele 5 (GABRB2, DPYSL2, CNR1, DUSP4 i PI15) metodą western blot i potwierdziliśmy, że ekspresja GABRB2 a DPYSL2 był znacznie wyższy w grupie IGD. Poprzednie raporty i nasze dane sugerują, że nadekspresja GABRB2 i DPYSL2, dolne poziomy docelowe obniżonych miRNA, może mieć wpływ na patogenezę zaburzeń neuropsychiatrycznych, w tym IGD. Wyniki analizy GO i szlaku szlaków rozwoju nerwowego również potwierdzają neurobiologiczną implikację markerów miRNA. Innym interesującym odkryciem był synergistyczny efekt jednoczesnej zmiany miRNA. Osoby z regulacją w dół wszystkich miRNA 3 wykazywały 22 razy większe ryzyko niż osoby bez regulacji w dół, a OR wzrastały w sposób zależny od dawki. Chociaż CI dla tych trzech zmian było szerokie z powodu ograniczonej wielkości próby, wyraźna dodatnia korelacja (r2 = 0.996) wspiera synergistyczne działanie trzech miRNA.
Chociaż odkryliśmy, że miRNA związane z IGD i osoby z wszystkimi trzema zmianami miRNA miały ryzyko 22 razy wyższe niż te bez jakichkolwiek zmian miRNA, istnieje kilka ograniczeń w tym badaniu. Po pierwsze, niewielki rozmiar próbki zwiększył prawdopodobieństwo braku innych znaczących markerów miRNA. Po drugie, ponieważ nasze dane nie były wystarczające do wyjaśnienia, czy profile miRNA w plazmie są przyczyną lub skutkiem, nie możemy potwierdzić biologicznych ról tych nieinwazyjnych markerów w warunkach klinicznych. Dalsze profilowanie miRNA i ich dalsza analiza genów za pomocą ludzkiej tkanki mózgowej z banku tkanek mózgu może dać bardziej bezpośrednią odpowiedź. Pomocna byłaby również analiza tkanki mózgowej z modelem zwierzęcym zaburzeń gry. Po trzecie, ze względu na ograniczoną dostępność próbek osocza zbadaliśmy tylko pięć potencjalnych cząsteczek kandydujących. Zbadanie większej liczby celów w dół za pomocą większego zestawu próbek będzie pomocne w dalszym zrozumieniu mechanizmu molekularnego IGD.
Podsumowując, dzięki przeszukiwaniu całego genomu profili ekspresji miRNA i niezależnej walidacji, odkryliśmy trzy miRNA związane z IGD (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p i hsa-miR-652-3p). Uważa się, że wiele z ich dalszych genów bierze udział w różnorodnych zaburzeniach neuropsychiatrycznych, a eksperymentalna walidacja zmienionej ekspresji tych dalszych genów wspiera implikację miRNA zidentyfikowanych w tym badaniu. Stwierdziliśmy, że osoby z obniżoną regulacją wszystkich trzech miRNA są narażone na wysokie ryzyko wystąpienia IGD. Wraz ze znanymi klinicznymi lub środowiskowymi czynnikami ryzyka i kryteriami diagnostycznymi, nasze odkrycia mogą ułatwić wczesną interwencję, aby pomóc ludziom o podwyższonym ryzyku wystąpienia IGD.
Oświadczenie o etykiecie
Badanie to zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board z University College of Catholic University (MC16SISI0120). Wszyscy uczestnicy i ich rodzice wyrazili pisemną, świadomą zgodę.
Autorskie Wkłady
ML i HC w równym stopniu przyczyniły się do tego artykułu. ML, D-JK i Y-JC zaprojektowali badanie. SJ, S-MC, YP, DC i JL przeprowadzali eksperymenty i generowanie danych. J-WC, S-HP, J-SC i D-JK pobrali próbki krwi i informacje kliniczne. ML, HC, S-HY i Y-JC analizowały dane. ML, HC, S-HY i Y-JC opisali manuskrypt. Y-JC nadzorował projekt.
Oświadczenie o konflikcie interesów
Autorzy oświadczają, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.
Przypisy
Finansowanie. Prace te zostały wsparte grantem z Programu Badań Mózgu za pośrednictwem Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF), finansowanej przez Ministerstwo Nauki oraz ICT i Planowanie na przyszłość (NRF-2015M3C7A1064778).
Materiał uzupełniający
Dodatkowe materiały do tego artykułu można znaleźć na stronie http://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpsyt.2018.00081/full#supplementary-material.
Referencje