Przejściowe hamowanie neuronalne ujawnia przeciwstawne role pośrednich i bezpośrednich szlaków w uczuleniu (2011)

Nat Neurosci. 2011 styczeń; 14 (1): 22 – 24.

Opublikowane online 2010 Grudzień 5. doi:  10.1038 / nn.2703

PMCID: PMC3058296
NIHMSID: NIHMS245934
Ostateczna, zredagowana wersja tego artykułu jest dostępna pod adresem Nat Neurosci
Zobacz inne artykuły w PMC, że cytować opublikowany artykuł.

Abstrakcyjny

Prążkowie grzbietowe odgrywa ważną rolę w rozwoju narkomanii; jednak dokładne zrozumienie ról striatopallidal (pośredni) i striatonigral (bezpośrednia) ścieżka neurony w regulacji zachowań pozostają nieuchwytne.

Wykorzystanie nowatorskiego podejścia, które opiera się na wirusowej ekspresji skonstruowanego GPCR (hM4D), wykazaliśmy aktywację hM4Receptory D z klozapinąN-tlenek (CNO) silnie zmniejszał pobudliwość neuronów prążkowia. Kiedy hM4Receptory D były selektywnie wyrażane w neuronach szlaku bezpośredniego lub pośredniego u szczurów, CNO nie zmieniało ostrych odpowiedzi lokomotorycznych na amfetaminę, ale zmieniało plastyczność behawioralną związaną z powtarzanym leczeniem lekami. Konkretnie, przejściowe zakłócenie aktywności neuronalnej striatopalidów ułatwiło uwrażliwienie behawioralne, podczas gdy zmniejszenie pobudliwości neuronów prążkowiczych osłabiło jego trwałość. Odkrycia te sugerują, że ostre efekty leku można analizować z adaptacji behawioralnych związanych z powtarzaną ekspozycją na lek i podkreślają użyteczność tego podejścia do dekonstrukcji wkładu szlaków neuronalnych w zachowania, takie jak uczulenie.

Pomimo przytłaczających negatywnych konsekwencji uzależnienia od narkotyków, stosowanie i nadużywanie psychostymulantów pozostaje powszechne. Postęp od początkowej ekspozycji na lek do regularnego stosowania, a ostatecznie do kompulsywnego, nawykowego zachowania i utraty kontroli hamującej, obejmuje szereg adaptacji molekularnych w dyskretnych obwodach nerwowych1,2,3. Striatum zostało zidentyfikowane jako kluczowe miejsce wielu adaptacji behawioralnych i neurobiologicznych, które, jak się uważa, tworzą podstawowe procesy pośredniczące w uzależnieniu1,2,3. Większość neuronów w prążkowiu (~ 95%) to neurony kolczastej projekcji średniej GABAergicznej (MSN) tkapelusz różnią się ekspresją neuropeptydu i tworzą dwie główne ścieżki odprowadzające4.

  • Striatopallidal MSNs zawierają enkefalinę (ENK) i tworzą pośrednią ścieżkę
  • mając na uwadze, że MSN striatonigry zawierają dynorfinę (DYN) i substancję P i tworzą bezpośredni szlak.

Wiele modeli pojęciowych zakłada, że ​​te populacje MSN przeciwstawiają się sobie zarówno mechanicznie, jak i funkcjonalnie5,6. Istnieje jednak niewiele dowodów empirycznych na poparcie ich zróżnicowanej roli w kontroli zachowania, ponieważ te populacje komórek są fizycznie wymieszane i morfologicznie nieodróżnialne, co sprawia, że ​​selektywna manipulacja jest technicznie nieuchwytna.

Aby zbadać rolę tych populacji komórek prążkowia w rozwoju zachowań, które występują po wielokrotnym narażeniu na narkotyki, połączyliśmy dwie nowe strategie: wektory wirusowe, które wykorzystują promotory genu ENK lub DYN do kierowania ekspresji transgenu do neuronów striatopallidalnych lub striatonigralnych , odpowiednio, i skonstruowane GPCR (Gi / omuskularny ludzki M4 DREADD; Receptor projektanta wyłącznie aktywowany przez designerski lek; hM4D)7 który jest aktywowany przez farmakologicznie obojętny ligand, klozapinęN-tlenek8,9 (CNO; Rys. 1a, h). Po ekspresji w hodowanych neuronach podawanie CNO stymuluje Gi / osprzężony hM4Receptory D w ten sposób aktywują kanały 3 (Kir3) prostujące wewnętrznie potas, powodując hiperpolaryzację błony i przejściowe wyciszenie neuronów9.

Rysunek 1  

Przejściowe i ukierunkowane tłumienie sygnalizacji komórek prążkowia. (a, h) Mapy Amplicon pENK-hM4D/pENK-GFP (a) i pDYN-hM4D/pDYN-GFP (h) celowanie wektorów. (b, i) Mikroskopia konfokalna wykazała, że ​​pENK-hM4D receptory były selektywnie wyrażane w striatopalidach ...

Aby przetestować swoistość fenotypową wektorów wirusowych w komórkach, zastosowaliśmy mikroskopię immunofluorescencyjną z dwoma etykietami po wlewie wirusów do prążkowia grzbietowego (Uzupełnienie Rys. 1), które wyrażają hM znakowane hemaglutyniną4Receptory D pod kontrolą promotora ENK (strENK-hM4D) lub promotora DYN (strDYN-hM4D). Odkryliśmy, że pENK-hM4D ekspresja była pierwotnie w MSN zawierających ENK (90% komórek hemaglutyniny to ENK +, 85 z 94; 6% komórek hemaglutyniny były substancjami P +, 4 z komórek 70; Rys. 1b), podczas gdy pDYN-hM4D ekspresja występowała głównie w MSN zawierających substancję P (95% komórek hemaglutyniny stanowiła substancja P +, 109 z komórek 115; 5% komórek hemaglutyninowych to ENK +, 5 z komórek 97; Rys. 1i). Podobne wyniki uzyskano po infuzji wirusów specyficznych dla promotora, które eksprymują białko zielonej fluorescencji (strENK-GFP i pDYN-GFP; Dodatkowe suplementy. 2a i 3a).

Biorąc pod uwagę, że MSN striatopallidalne są pierwotnie projektowane na gałęzie gałki bladej zewnętrzne (GPe) i MSNs prążkowia pierwotnego projektowane głównie na istotę czarną pars reticulata (SNpr), użyliśmy wstrzyknięć znacznika wstecznego Fluoro-Gold do tych obszarów mózgu, a następnie immunohistochemii fluorescencyjnej z podwójną etykietą potwierdzić, że pENK i pDYN wirusy wywołały infekcję specyficzną dla szlaku. Zaobserwowaliśmy, że pENK-GFP komórki zlokalizowane z prążkowią ekspresją Fluoro-Gold po naparach do GPe, ale nie SNpr (Uzupełnienie Rys. 2b), podczas gdy pDYN-GFP komórki zlokalizowane z prążkowią ekspresją Fluoro-Gold po wlewach do SNpr, ale nie GPe (Uzupełnienie Rys. 3b). Ekspresja wektorów wirusowych nie zmieniła liczby neuronów ENK + lub substancji P + w regionie zakażenia wirusowego, co sugeruje, że zastosowanie tych promotorów do transferu genów za pośrednictwem wirusa nie zakłóca poziomu endogennego neuropeptydu. Wszystkie te wyniki pokazują, że pENK i pDYN wektory wirusowe eksprymują geny w ich odpowiednio oddzielonych populacjach komórek prążkowia.

Chociaż hM4Wykazano, że techniki oparte na receptorze D modulują aktywność innych typów neuronów9, ich zdolność do wpływania na neurony prążkowia nie została zbadana. W związku z tym zainfekowaliśmy hM średnie neurony kolczaste prążkowia4Receptory D pod kontrolą promotora wirusa opryszczki (HSV), dwa dni później przygotowano plastry koronalne prążkowia grzbietowego i zbadano, jak hM4Średnio kolczaste neurony prążkowia wyrażające D reagują na CNO. Zaobserwowaliśmy, że miejscowe stosowanie CNO (10 μM) indukowało hiperpolaryzację potencjału błonowego (~ 7 mV, wyjściowy potencjał błonowy dostosowano do -80 mV; Rys. 1c) i zmniejszono rezystancję wejściową neuronów po zastosowaniu CNO (Rys. 1d, e), sugerując, że przewodnictwo potasu (tj. prąd mediowany Kir3) jest aktywowane przez CNO w hM4Neurony wyrażające receptor D. Ponadto perfuzja CNO znacznie zmniejszyła liczbę wywołanych potencjałów działania w hM4Neurony wyrażające D, ale nie w komórkach kontrolnych, skutecznie hamując funkcjonalne wyjście neuronów zakażonych wirusami Ekspresja hM4Same receptory D nie zmieniły rezystancji wejściowej (P = 0.84) lub odpalanie potencjału czynnościowego (P = 0.64). (Rys. 1f, g). Podsumowując, dane te sugerują, że podobnie do neuronów hipokampa9, hM4Metoda oparta na D / CNO może skutecznie zmniejszyć pobudliwość neuronów prążkowia szczura.

Jako dodatkowy dowód koncepcji przetestowaliśmy, czy hM4Receptory D blokowałyby neurotransmisję w dobrze ugruntowanym obwodzie, w którym aktywność neuronalna jest wywoływana przez bodźce istotne dla zachowania. W związku z tym zainfekowaliśmy neurony brzuszne obszaru nakrywkowego (VTA) za pomocą hM4Receptory D pod kontrolą promotora HSV, który silnie wyraża się w neuronach dopaminowych10i zastosował szybką woltamperometrię cykliczną do pomiaru zmian w uwalnianiu dopaminy w jądrze półleżącym po nieoczekiwanym dostarczeniu nagrody żywnościowej11. Podawanie CNO znacząco osłabiło uwalnianie dopaminy wywołane przez granulki pokarmowe w jądrze półleżącym w porównaniu z nośnikiem (Uzupełnienie Rys. 4). Na koniec przetestowaliśmy, czy malejąca aktywność określonych typów komórek nerwowych w prążkowiu in vivo może zmienić zdolność amfetaminy do stymulowania ekspresji Fos. Psychostymulanty, takie jak amfetamina, są silnymi aktywatorami c-fos w prążkowiu12 i zwiększy c-fos zarówno w neuronach striatonigralnych, jak i striatopallidalnych w naszych warunkach doświadczalnych13. Oprócz zastosowania jako markera aktywności neuronalnej, indukcja psychostymulatora c-fos uważa się, że odgrywa ważną rolę w inicjowaniu i utrzymywaniu adaptacji nerwowych związanych z uczuleniem psychomotorycznym1,14. Odkryliśmy, że aktywacja p za pośrednictwem CNOENK-hM4D receptory znacznie zmniejszały całkowitą liczbę indukowanych amfetaminą komórek c-Fos w prążkowiu (Rys. 1k i Uzupełnienie Rys. 5a). Ta redukcja wystąpiła w obu neuronach dodatnich pod względem hemaglutyniny (tj. Tych wyrażających hM4Receptory D) i neurony ujemne hemaglutyniny (tj. Te, które nie wyrażają hM4Receptory D; Rys. 1l), sugerując neuronowy efekt przenikania między hM4Neurony wyrażające D i niezainfekowane neurony. Znaczne zmniejszenie całkowitej liczby komórek c-Fos wywołanych amfetaminą i liczby komórek c-Fos dodatnich pod względem hemaglutyniny było również widoczne, gdy hM4Receptory D były aktywowane w neuronach bezpośredniego szlaku (Rys. 1n, o i Uzupełnienie Rys. 5b). Co ważne, te efekty nie są po prostu powodowane przez wirusową ekspresję nowego receptora od czasu ekspresji któregokolwiek z nichENK-hM4D lub pDYN-hM4D receptory pod nieobecność leczenia CNO nie miały wpływu na liczbę komórek Fos wywołanych amfetaminą (Dodatkowe rysunki. 6 i 7). Zatem wyniki te pokazują, że aktywacja hM za pośrednictwem CNO4Receptory D mogą również prowadzić do zmniejszenia aktywności neuronów przez zmniejszenie uwalniania neuroprzekaźników i osłabienie sygnalizacji wewnątrzkomórkowej.

Powtarzające się narażenie na uzależniające leki może prowadzić do postępującego i uporczywego wzrostu reakcji behawioralnej, często określanego jako uczulenie behawioralne. Co ważne, uczulenie obejmuje niektóre z tych samych obwodów nerwowych zaangażowanych w rozwój narkomanii u ludzi3. Wykorzystujemy tutaj nasze nowe narzędzia do badania wpływu specyficznego dla obwodu tłumienia aktywności neuronów prążkowia na rozwój uczulenia na amfetaminę. Postawiliśmy hipotezę, że neurony szlaku bezpośredniego i pośredniego pełnią przeciwstawne role, w których neurony prążkowicze promują uczulenie, a neurony prążkowokomórkowe tłumią uczulenie, zgodnie z ich koncepcyjnie proponowanymi rolami odpowiednio w aktywacji behawioralnej i hamowaniu5,6. W związku z tym zbadaliśmy, czy biochemicznie zmniejszająca się pobudliwość neuronalna neuronów prążkowia będzie indukować uczulenie na schemat dawkowania amfetaminy, który wywołuje progowy poziom uczulenia i czy zmniejszenie pobudliwości neuronalnej neuronów prążkowatych uniemożliwiłoby uczulenie w protokole, który normalnie powoduje silne uczulenie.

W pierwszym badaniu zastosowaliśmy schemat leczenia, który wywołuje progowy poziom uczulenia narządu ruchu w kontrolach GFP (cztery ekspozycje na lek). Po okresie karencji podawano umiarkowaną dawkę amfetaminy prowokującej (2 mg / kg) przy braku osłabienia aktywności neuronalnej indukowanego przez CNO w celu określenia, czy uczulenie było trwałe. Aktywacja p za pośrednictwem CNOENK-hM4D receptory podczas leczenia amfetaminą nie zmieniły ostrej odpowiedzi ruchowej na amfetaminę (Rys. 2a). Jednak zakłócenie aktywności neuronalnej za pośrednictwem CNO w neuronach o pośrednim szlaku ułatwiło rozwój znacznie silniejszego uczulenia w porównaniu z kontrolami GFP (Rys. 2b). To zwiększenie uczulenia utrzymało się w przypadku prowokacji amfetaminą, która została przeprowadzona tydzień później przy braku leczenia CNO (Rys. 2c, d). Efekty te można przypisać zależnemu od CNO zmniejszeniu aktywności neuronów prążkowatych przez hM4Receptory D, ponieważ hM4Ekspresja receptora D bez leczenia CNO nie powoduje uczulenia lokomotorycznego na ten łagodny schemat dawkowania amfetaminy (Uzupełnienie Rys. 6).

Rysunek 2  

Przejściowe zmniejszenie pobudliwości neuronów striatopallidalnych lub striatonigralnych miało przeciwne działanie na uczulenie na amfetaminę. (a, e) Ostre reakcje lokomotoryczne na amfetaminę po aktywacji p wywołanej CNOENK-hM4D (a) i pDYN-hM4D (e) receptory. ...

W celu ustalenia, czy neurony prążkowicze mogą regulować reakcję na lek w sposób przeciwny, zbadaliśmy następnie wpływ biochemicznie zmniejszającej się pobudliwości neuronów prążkowiczych w prążkowiu grzbietowo-przyśrodkowym podczas schematu leczenia amfetaminą, który powoduje silne uczulenie w kontrolach GFP (sześć ekspozycji na lek ) jak również podczas niskiej dawki prowokującej amfetaminy (0.5 mg / kg) przy braku zaburzeń aktywności neuronalnej za pośrednictwem receptora. Podobnie jak w przypadku tłumienia pośredniego szlaku, zależne od CNO spadki pobudliwości neuronów bezpośredniej ścieżki podczas leczenia amfetaminą nie zmieniły ostrej odpowiedzi lokomotorycznej na amfetaminę (Rys. 2e). Chociaż rozwój uczulenia był podobny do kontroli GFP po aktywacji p wywołanej CNODYN-hM4D receptory w fazie leczenia (Rys. 2f), uczulenie nie utrzymywało się w pDYN-hM4D grupa, ale nadal była dobrze utrzymana w formantach GFP (Rys. 2g, h). Efekty te można również przypisać zależnemu od CNO zmniejszeniu aktywności neuronów prążkowiczych przez hM4Receptory D, ponieważ hM4Ekspresja receptora D pod nieobecność leczenia CNO nie blokowała rozwoju uczulenia narządu ruchu, ponieważ uczulenie obserwowano podczas fazy leczenia i prowokacji lekiem (Uzupełnienie Rys. 7). Dane te sugerują, że neurony prążkowicze mogą być szczególnie ważne dla regulowania długoterminowych adaptacji behawioralnych, które są konsekwencją powtarzanego zażywania narkotyków.

Podsumowując, dane te stanowią pierwszy dowód na krytyczne i przeciwstawne role neuronów striatopallidalnych i striatonigralnych w regulacji plastyczności zachowania zależnego od doznania lekowego. Ponadto brak wpływu hamowania neuronów na ostrą odpowiedź lokomotoryczną na amfetaminę dostarcza dalszych dowodów na to, że mechanizmy regulujące ostre reakcje na leki różnią się od tych, które modulują trwałe adaptacje, które występują przy powtarzanej ekspozycji na lek. Wreszcie, parowanie specyficznych dla fenotypu wektorów wirusowych z projektowanymi receptorami zdolnymi do zmiany aktywności neuronalnej bez trwałego zakłócania funkcji komórki stanowi nowe i potężne podejście do dekonstrukcji molekularnych podstaw uzależnienia.

Materiał uzupełniający

Podziękowanie

Praca ta była wspierana przez granty NIH K99 DA024762 (SMF), T32 GM07266 i T32 GM07108 (DE), T32 AA009455 i F32 DA026273 (MJW), R21 DA021793 (PEMP), R01 DA023206 (YD), U19MH82441 i NIMH-PDSP (YD), U21MH021273 i NIMH-PDSP (BLR ), oraz RXNUMX DAXNUMX (JFN), nagrody za osiągnięcia dla naukowców z uczelni (DE) oraz nagrodę NARSAD Distinguished Investigator Award (BLR)

Przypisy

Konkurencyjne oświadczenie o zainteresowaniach

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Referencje

1. Berke JD, Hyman SE. Neuron. 2000; 25: 515 – 532. [PubMed]
2. Neslter EJ. Nat Rev Neurosci. 2001; 2: 119 – 128. [PubMed]
3. Robinson TE, Berridge KC. Uzależnienie. 2001; 96: 103 – 114. [PubMed]
4. Smith Y, Bevan MD, Shink E, Bolam JP. Neuroscience. 1998; 86: 353 – 387. [PubMed]
5. Shen W, Flajolet M, Greengard P, Surmeier DJ. Nauka. 2008; 321: 848 – 851. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
6. Durieux PF, et al. Nat Neurosci. 2009; 12: 393 – 395. [PubMed]
7. Conklin BR, et al. Metody Nat. 2008; 5: 673 – 678. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
8. Alexander GM, et al. Neuron. 2009; 63: 27 – 39. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
9. Armbruster BN, Li X, Pausch MJ, Herlitze S, Roth BL. Proc Natl Acad Sci USA. 2007; 104: 5163 – 5168. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
10. Choi KH, et al. Ann NY Acad Sci. 2003; 1003: 372 – 374. [PubMed]
11. Clark JJ, et al. Metody Nat. 2010; 7: 126 – 129. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
12. Harlan RE, Garcia MM. Mol Neurobiol. 1998; 16: 221 – 267. [PubMed]
13. Badiani A, Oates MM, Dzień HE, Watson SJ, Akil H, Robinson TE. Behav Brain Res. 1999; 103: 203 – 209. [PubMed]
14. Hyman SE, Malenka RC. Nat Rev Neurosci. 2001; 2: 695 – 703. [PubMed]