DeltaFosB reglementează indirect activitatea promotorului Cck (2010)

Brain Res. 2010 Mai 6; 1329: 10-20.

Publicat online 2010 martie 11. doi: 10.1016 / j.brainres.2010.02.081

PMCID: PMC2876727

John F. Enwright, III,¹ Megan Wald,¹ Madison Paddock,¹ Elizabeth Hoffman,¹ Rachel Arey,² Scott Edwards,² Sade Spencer,² Eric J. Nestler,³ și Colleen A. McClung^{2, *}

Informații de autor ► Informații despre licență și licență

Versiunea editată finală a acestui articol este disponibilă la Brain Res

Vezi alte articole din PMC că citează articolul publicat.

Abstract

Unele dintre modificările biochimice, structurale și comportamentale importante induse de expunerea cronică la medicamente de abuz par să fie mediate de factorul de transcripție foarte stabil ΔFosB. Lucrarea anterioară a arătat că supraexprimarea ΔFosB la șoareci pentru săptămâni 2 conduce la o creștere a expresiei numeroaselor gene în striatum, cele mai multe dintre acestea fiind reglate mai târziu după săptămânile 8 de exprimare ΔFosB. Interesant, un numar mare din aceste gene au fost, de asemenea, crescute in sus in soareci supraexprimand factorul de transcriptie CREB. Nu a fost clar din acest studiu, totuși, dacă DFosB pe termen scurt reglementează aceste gene prin intermediul CREB. Aici găsim că săptămânile 2 de supraexprimare a ΔFosB măresc expresia CREB în striatum, un efect care se risipește după săptămâni 8. Inducerea timpurie este asociată cu creșterea legării CREB la anumiți promotori ai genei țintă din această regiune a creierului. Surprinzator, o gena care a fost o tinta CREB suspectata pe baza rapoartelor anterioare, cholecystokinin (Cck), nu a fost controlată de CREB în striatum. Pentru a investiga în continuare reglementarea CCK în urma supraexprimării ΔFosB, am confirmat că supraexpresia ΔFosB pe termen scurt crește atât CCK activitatea promotorului și expresia genică. De asemenea, crește activitatea de legare la un situs de legare CREB presupus în CRE CCK promotor. Cu toate acestea, în timp ce site-ul CRE este necesar pentru exprimarea bazală normală a CCK, nu este necesar pentru inducerea ΔFosB a CCK. Luate împreună, aceste rezultate sugerează că, în timp ce inducția pe termen scurt a ΔFosB crește expresia și activitatea CREB la anumiți promotori genetici, acesta nu este singurul mecanism prin care genele sunt reglate în sus în aceste condiții.

Cuvinte cheie: nucleul accumbens, transcripția, dependența

INTRODUCERE

Expunerea cronică la medicamente de abuz determină modificări biochimice și structurale în mai multe regiuni ale creierului. Aceste modificări se presupune că implică alterarea profilurilor de exprimare a genelor în sistemul mezolimbic. Acest sistem este compus din neuroni dopaminergici care se propagă din zona tegmentală ventrală (VTA) din miezul mucozei la neuronii medii spinoși din nucleul accumbens (NAc) (striatum ventral), precum și din alte regiuni ale creierului. Modificările în activitatea a doi factori de transcripție, proteina de legare a elementului de răspuns cAMP (CREB) și ΔFosB (o proteină familială Fos), au fost propuse pentru a media multe dintre modificările biochimice, structurale și comportamentale observate cu expunerea cronică la medicamente de abuz revizuite de Nestler, 2005).

CREB este un factor de transcripție exprimat omniprezent, care este membru al familiei CREB / ATF. Homodimerii CREB se leagă de variațiile unei secvențe CRE (consens: TGACGTCA) găsită în promotorii multor gene. Fosforilarea CREB (predominant la serina 133, deși au fost identificate alte situsuri) poate fi stimulată prin câteva cascade de semnalizare, inclusiv cele din aval de receptorii dopaminergici (Cole și colab., 1995). După fosforilare la serina 133, CREB recrutează proteina de legare CREB (CBP) co-activator sau proteine conexe care conduc la o expresie genetică crescută (revizuită prin Johannessen și colab., 2004). Expunerea cronică la medicamente de abuz de opiacee sau psihostimulante determină creșteri tranzitorii ale activității CREB în nucleul accumbens (Barrot și colab., 2002; Shaw-Lutchman și colab., 2002, 2003), o adaptare gândită pentru a diminua proprietățile recompensatoare ale acestor medicamente și pentru a contribui la starea emoțională negativă a retragerii de droguri (Nestler, 2005).

Lmodificările pe termen lung ale medicamentelor de abuz sunt considerate a fi mediate în parte de ΔFosB, o variantă de legare extrem de stabilă a FosB (Nestler și colab., 1999; McClung și colab., 2004; Nestler, 2008). Membrii familiei Fos se dimerizează cu membrii familiei Jun pentru a forma un complex protector activator 1 (AP-1). Complexele de transcripție AP-1 se leagă de variațiile elementului de răspuns AP-1 (consens: TGACTCA) pentru a regla transcripția (revizuită prin Chinenov și Kerppola, 2001). Deși expunerea acută la medicamente de abuz duce la inducerea (orelor) de viață a membrilor familiei Fos (precum și la creșterea activității CREB), expunerea repetată la medicament conduce la acumularea de DFosB foarte stabil (Hope și colab., 1994; Perrotti și colab., 2008), a cărui expresie persistă de câteva săptămâni.

Șoarecii bi-transgenici care supraexprimă indusă excesiv fie ΔFosB, fie CREB în striatumul adult, prezintă multe dintre fenotipurile biochimice și comportamentale observate la animale expuse în mod repetat la psihostimulante sau alte medicamente de abuz. Aanaliza modificărilor exprimării genelor la aceste animale transgenice a identificat numeroase gene suprapuse prin supradozarea pe termen scurt (2 saptamani) a supraexprimării ΔFosB, modificări asociate cu o scădere concomitentă a recompensei medicamentului. Modificările expresiei genice și răspunsul comportamental cu ΔFosB pe termen scurt au fost remarcabil de similare cu cele observate la animalele care supraexprimă CREB pentru săptămâni 2 sau 8 (McClung și Nestler, 2003). În contrast izbitor, suprapresiunea pe termen lung (săptămâni 8) a ΔFosB a redus expresia multor aceleași gene și a condus la o creștere a recompensei de droguri (Kelz și colab., 1999; McClung și Nestler, 2003).

O gena identificată în aceste studii este colecistochinina (CCK), o neuropeptidă produsă în câteva regiuni ale creierului, incluzând striatum (Hokfelt și colab., 1980). CCK poate modula transmisia dopaminergică (Vaccarino, 1992), este implicat în recompensarea și armarea medicamentului (Josselyn și colab., 1996; Josselyn și colab., 1997; Hamilton și colab., 2000; Beinfeld și colab., 2002; Rotzinger și colab., 2002) și este indusă în striat cu cocaină cronică (Ding și Mocchetti, 1992). În plus, CCK promotorul a fost dovedit a fi receptiv la ambele complexe CREB și AP-1 (Haun și Dixon, 1990; Deavall și colab., 2000; Hansen, 2001). Deoarece multe dintre gene (inclusiv CCK) care au prezentat o expresie crescută după ce atât CREB, cât și expresia ΔFosB pe termen scurt au fost cunoscute sau suspectate genele țintă CREB (McClung și Nestler, 2003), am vrut să determinăm dacă expresia pe termen scurt ΔFosB conduce la reglarea acestor gene (cu accent pe CCK) prin reglementarea CREB sau prin mecanisme mai complexe de reglare a genei.

REZULTATE

Supraexpresia ΔFosB crește treptat nivelul CREB

Am folosit Western blotting pentru a investiga dacă supraexprimarea ΔFosB crește nivelul de proteine CREB în striatumul șoarecilor. Pentru acest studiu am utilizat șoareci bi-transgenici (linia 11A) care transporta atât o transgenă NSE-tTA, cât și o transgenă TetOp-ΔFosB. În absența doxiciclinei, acești șoareci prezintă o creștere robustă a expresiei ΔFosB în neuronii dynorfin pozitivi în striatum (Kelz și colab., 1999). Această metodă de supraexprimare a ΔFosB a fost documentată pe larg și permite o supraexprimare specifică regiunii, care paralel cu inducția ΔFosB observată la animale expuse cocainei cronice (Hope și colab., 1994; Kelz și colab., 1999). Am constatat că la șoarecii 11A care supraexprimă ΔFosB, nivelurile de proteină CREB au fost semnificativ reglate după săptămânile de exprimare 2 și aceste niveluri s-au revenit la linia de bază după săptămânile de exprimare 8 (Figura 1A, n = 8). Pentru a determina dacă modificările nivelurilor CREB cu supraexpresia ΔFosB pe termen scurt ar putea fi reproduse într-un alt sistem, am supraexprimat tranzitoriu ΔFosB în celulele PC12 și am constatat că nivelurile CREB au crescut semnificativ (p <0.05) în comparație cu martorii (Figura 1B, n = 4). Aceste rezultate demonstrează că expresia ΔFosB pe termen scurt mărește nivelurile de proteine CREB.

Nivelurile CREB cresc cu supraexpresia ΔFosB. Analiza Western blot a lizatelor de la (A) mouse striata de la 11A șoareci off dox pentru 2 sau 8 săptămâni sau (B) Celulele PC12 care supraexprimă ΔFosB. Datele din A sunt afișate ca variație procentuală în dox off, comparativ ...

Atât ΔFosB, cât și CREB se leagă la promotorii genelor țintă specifice în striatum după o suprapresiune de scurtă durată ΔFosB

Am folosit testele ChIP (imunoprecipitare cu cromatină) ale țesutului striatal pentru a determina dacă legarea ΔFosB sau CREB a apărut la anumiți promotori ai genei țintă și dacă această legare a fost crescută după o suprapresiune de lungă durată cu ΔFosB. Am analizat obligativitatea la BDNF și CCK promotori, deoarece ambele gene sunt extrem de reglate în urma unei supraexprimări pe termen scurt a ΔFosB, a supraexprimării CREB sau a unui tratament cronic cu cronică (McClung și Nestler, 2003). Am analizat, de asemenea, obligatorii la CDK5 promotor, deoarece este o țintă directă cunoscută de ΔFosB (Chen și colab., 2000; Bibb și colab., 2001; Kumar și colab., 2005). În cele din urmă, am măsurat legarea la prodynorphin deoarece studiile anterioare au constatat că poate fi legat atât de ΔFosB cât și de CREB în condiții diferite (Andersson și colab., 2001; Zachariou și colab., 2006).

Analiza CHIP a fost efectuată pe striate de la șoareci 11A care supraexprimă ΔFosB pentru săptămâni 2 folosind anticorpi care recunosc CREB sau ΔFosB. În condiții normale, am constatat că ΔFosB se leagă de CDK5 și prodynorphin promotori, în timp ce nu există nici o obligativitate detectabilă la BDNF or CCK promotorii (Tabelul 1). Mai mult, supraexprimarea ΔFosB a crescut legarea ΔFosB la CDK5 promotor, dar nu la prodynorphin promotor. Am urmat măsurarea legării CREB la acești promotori și am constatat că CREB se leagă de CDK5, BDNF și prodynorphin promotori, dar nu la CCK promotor, în striatum normal, și că supraexprimarea ΔFosB pentru săptămâni 2 crește legarea CREB la BDNF și prodynorphin promotori, dar nu CDK5 promotor. Luate împreună, aceste rezultate arată că ΔFosB și CREB se pot lega la ambii promotori genetici, cum ar fi prodynorphin și CDK5, totuși, legarea CREB este specifică altor promotori, cum ar fi BDNF. Mai mult, supraexprimarea ΔFosB conduce la creșterea legării ΔFosB la anumiți promotori, așa cum ar fi de așteptat, dar și la legarea CREB la promotori specifici, în concordanță cu inducția CREB mediată de DFosB observată în acest moment.

Legarea proteinelor de reglementare putative la diferiți promotori la șoareci care supraexprimă ΔFosB timp de două săptămâni.

Lucrările anterioare au arătat că modificările expresiei genice induse de supraexprimarea ΔFosB pe termen lung sunt asociate cu modificările cromatinei, în particular, acetilarea histonei H3, la promotorii genelor specifice (Kumar și colab., 2005). Pentru a determina dacă acest lucru ar putea explica modificările expresiei genei la o suprapresiune mai scurtă a ΔFosB, am măsurat legarea histonei acetilate H3 (o modificare a histonei asociată cu cromatina activă transcripțional) sau o histonă metilată H3 (Lys9, o modificare a histonei asociată transcripțional cromatină inactivă). Am constatat că supraexprimarea ΔFosB pentru săptămâni 2 nu a determinat modificări în legarea H3 acetilat la oricare dintre promotorii genei studiați (Tabelul 1). Am constatat o scădere semnificativă a legării histonului metilat H3 la prodynorphin promotor, dar nu obligatoriu la CCK promotorul și nici o modificare a legării la CDK5 și BDNF promotori, sugerând că acest lucru nu este un mecanism general prin care ΔFosB, pe termen scurt, reglează expresia genelor. Am fost surprinși și interesați de faptul că nu am găsit diferențe în analizele ChIP care ar putea explica creșterea CCK expresia mRNA la șoarecii 11A după săptămâni 2 de exprimare ΔFosB și a decis să investigheze acest mecanism în continuare.

DFosB pe termen scurt crește CCK expresie în mai multe sisteme

Caracterizarea microarray a șoarecilor bi-transgenici 11A care supraexprimă ΔFosB în striatum a constatat că CCK nivelurile de expresie cresc după săptămânile 2 de supraexprimare și apoi scad treptat cu perioade mai lungi de expresie ΔFosB (Figura 2A, n = 3). Am validat acest efect pentru CCK utilizând PCR în timp real pe un grup separat de animale la săptămâni 2 și 8 și a găsit rezultate la cele două momente de timp ca fiind similare cu analiza microarray (datele nu sunt prezentate).

Supraexpresia pe termen scurt a ΔFosB crește CCK expresia genelor. (A) CCK expresia mRNA în striatum urmând supraexprimarea ΔFosB la șoarecii 11A pentru săptămâni 1, 2, 4 sau 8. Analiza microarray a fost efectuată pe eșantioane striatale și CCK nivelurile de ...

Pentru a investiga în continuare capacitatea ΔFosB de a reglementa CCK expresie, am folosit celule PC12 transfectate tranzitoriu cu o CCKplasmidă reporter-luciferază și fie o plasmidă de expresie ΔFosB, fie o cantitate egală de pCDNA. Ambele două zile (n = 5-9) și trei (n = 11-13) zile de supraexprimare a ΔFosB au dus la o creștere semnificativă CCK-luciferaza. În plus, trei zile de supraexprimare a ΔFosB a avut ca rezultat mult mai mult CCK-luciferazei în comparație cu două zile de supraexprimare (Figura 2B). Supraexpresia ΔFosB nu a induce expresia unui construct de luciferază fără promotor (datele nu sunt prezentate). În condițiile de tratament nu a fost o reducere în CCK-luciferază aparentă. Aceste rezultate arată că expresia ΔFosB pe termen scurt mărește activitatea CCK promotor, și lasă fără răspuns mecanismul prin care suprima suprapresiunea ΔFosB pe termen lung CCK expresie.

Supraexpresia ΔFosB crește legarea la un situs de legare CREB presupus în CCK promotor

Analizele noastre au constatat asta CCK expresia este crescută după expresia ΔFosB pe termen scurt, totuși, testele ChIP au constatat că nici CREB, nici ΔFosB nu se leagă de CCK promotor. Pentru a determina dacă există modificări ale legării la proteine la CCK promotorul urmând supraexprimarea ΔFosB, am folosit testele de deplasare a mobilității electroforetice (EMSA) cu o probă care conține situsul presupus CRE prezent în cadrul CCK promotor. Utilizând extractele nucleare din striata de șoareci 11A care supraexprimă ΔFosB pentru săptămâni 2, am constatat o creștere a legării la situl CRE presupus în CCK promotor (Figura 3 A, C, n = 4). Interesant, șoarecii 11A care supraexprimă ΔFosB pentru săptămâni 8, care arată o scădere în CCK expresie, a arătat, de asemenea, o legare crescută la acest loc (Figura 3B, C, n = 4). Ca o comparație, am examinat legarea la un situs CRE consensual la șoarecii care supraexprimă ΔFosB pentru săptămâni 2 și am găsit legarea CRE robustă în extracte striatale, dar nu a crescut legarea după inducerea ΔFosB (Figura 3F, n = 4). Astfel, în ciuda unei creșteri induse de ΔFosB în nivelurile totale CREB observate în acest punct de timp, aceste rezultate sunt în concordanță cu analizele ChIP care constată că legarea CREB crescută la promotori după supraexpresia ΔFosB este specifică doar anumitor gene și nu este un fenomen global . Pentru a determina dacă CREB este legat de CCK promotor în analiza noastră EMSA, am efectuat teste supershift cu un anticorp specific CREB. În concordanță cu testele ChIP, nu am găsit nici o obligație a CREB la a CCK probă care conține situsul CRE presupus în analizele EMSA, în timp ce CREB a legat semnificativ și suprashift un sit consens CRE (Figura 3D, E, n = 4). Activitatea de legare a ADN - ului la CCK promotorul nu a fost, de asemenea, afectat de un anticorp la ΔFosB (date nereprezentate), în condițiile prezentate în mai multe studii anterioare pentru a bloca legarea ΔFosB la situsurile AP-1 bona fide (Hope și colab., 1994a, 1994b; Chen și colab., 1995, Hiroi și colab., 1998). De asemenea, am efectuat teste ChIP pe striata animalelor 11A dupa saptamani 8 de exprimare ΔFosB si inca nu gasim nici o legare a CREB sau ΔFosB la CCK promotor (datele nu sunt prezentate). Astfel, expresia ΔFosB conduce la o creștere a legării la proteine la CCK promotor după ambele săptămâni de exprimare 2 și 8; cu toate acestea, identitatea acestor factori rămâne necunoscută.

Legarea de proteine la CCK promotor. (A, B) Testarea schimbării mobilității electroforetice utilizând metoda CCK Site-ul CRE similar cu țesutul striatal de la animale care supraexprimă ΔFosB pentru săptămâni 2 (A) sau săptămâni 8 (B). În (A), concurența cu excesul de competitor neetichetat ...

Putativul site CRE din CCK promotorul nu este responsabil pentru creșterea activității promotorului

Deoarece am găsit o creștere a legării la proteine folosind un fragment din CCK promotor, care conține site-ul CRE presupus, în urma supraexprimării ΔFosB, am vrut să determinăm dacă acest site este necesar pentru a crește CCK expresie după supraexprimarea ΔFosB. Pentru a testa această posibilitate, am transfectat celulele PC12 cu o CCKplasmidă de luciferază conținând situsul său intact CRE sau unul care conține o mutație în situs care ar elimina orice interacțiune cu CREB. Interesant, mutația situsului similar CRE a scăzut bazal CCK activitate promotor cu 32% (Figura 4A, n = 9), dar nu a afectat CCK inducerea promotorului prin supraexprimarea ΔFosB (Figura 4B, n = 11-13). Acest lucru sugerează că, deși CCK promotorul necesită un situs intact CRE pentru o activitate bazală completă, activitatea crescută a promotorului indusă de supraexprimarea ΔFosB nu necesită secvența asemănătoare CRE.

CCK- cum ar fi site-ul CRE nu este necesar pentru CCK inducție de către ΔFosB. (A) CCKactivitatea activității luciferazei a fost măsurată 2 zile după transfecția fie cu normală CCK-luciferază sau una în care site-ul asemănător CRE a fost mutat. * p <0.05 (B) CCK-luciferase ...

cFos se leagă de CCK promotor

Studiile anterioare au constatat acest lucru cFos mARN crește cu expresia ΔFosB pe termen scurt, totuși, după o expresie prelungită ΔFosB, capacitatea tratamentului cu cocaină de a induce cFos în striatum este redusă (McClung și Nestler, 2003; Renthal și colab., 2008). Prin urmare, ar putea fi posibil ca cFos să contribuie la creșterea în CCK expresie după expresia ΔFosB pe termen scurt. Am efectuat testele ChIP cu un anticorp specific pentru cFos și măsurarea legării cFos la CCK promotor cu și fără expresie ΔFosB pe termen scurt. În timp ce am constatat că cFos se leagă de CCK promotor, această legare nu a crescut semnificativ după supraexprimarea ΔFosB (Figura 5, n = 5). Acest lucru sugerează că, deoarece cFos leagă CCK promotor, acesta poate contribui la reglementarea generală a CCK dar probabil că nu este implicată în reglementarea CCK promotor de către ΔFosB.

cFos se leagă de CCK promotor. Analizele de imunoprecipitare cromatină s-au efectuat cu un anticorp specific pentru cFos utilizând țesut striatal din șoareci care au supraexprimat ΔFosB fie la dox, fie după 2 săptămâni de îndepărtare a dox-ului. Analiza PCR în timp real a fost ...

DISCUŢIE

Acest studiu confirmă și se extinde asupra rezultatelor anterioare care arată că ΔFosB reglează expresia genelor în striatum și constatăm că aceasta se face prin mecanisme multiple după exprimarea pe termen scurt. Aratăm că, după 2 săptămâni de supraexprimare, ΔFosB se leagă direct la promotori în anumite gene care duc la modificări ale expresiei (adică CDK5). Mai mult, crește nivelul de proteine CREB, un efect observat în celulele de cultură, precum și în striatum, ceea ce duce la creșterea legării CREB la alți promotori genetici (adică dinorfina și BDNF). Într-un studiu anterior, am constatat că suprapresiunea pe termen scurt a ΔFosB în striatum conduce la multe dintre aceleași modificări ale expresiei genice care se găsesc atunci când CREB este supraexprimat și conduce la răspunsuri comportamentale similare în măsurile de preferință de cocainăMcClung și Nestler, 2003). Astfel, descoperirea prezentă că ΔFosB conduce la o inducție a CREB, precum și legarea CREB la anumiți promotori genetici, ajută la a explica de ce atât de multe modificări ale expresiei genei au fost împărtășite de acești doi factori de transcripție.

Inducerea CREB de către ΔFosB este interesantă, deoarece sa demonstrat că medicamentele de abuz induc modificări ale nivelelor serice 133-fosforilate CREB (Mattson și colab., 2005) și să crească transcripția mediată de CRE (Barrot și colab., 2002; Shaw-Lutchman și colab., 2002, 2003), fără a modifica nivelurile globale ale CREB. Este posibil ca modificările în nivelurile CREB să fie tranzitorii și, prin urmare, să fie ușor de pierdut în alte studii. În mâinile noastre, am observat creșteri induse de cocaină în ARNm CREB în anumite experimente, cu toate acestea, acest efect este foarte variabil (observație nepublicată). Deoarece atât șoarecii transgenici 11A, cât și celulele PC-12 prezintă inducția CREB ca urmare a supraexprimării ΔFosB pe termen scurt, acest lucru sugerează că CREB este indus de ΔFosB (sau o țintă a ΔFosB), furnizând încă un alt mecanism pentru a explica modificările induse de medicament în gene expresie.

În mod surprinzător, am constatat că nici CREB, nici ΔFosB nu se leagă de CCK promotor chiar dacă CCK exprimarea este în mod evident upregulată după expresia ΔFosB pe termen scurt. Cck este o neuropeptidă abundentă exprimată atât în VTA cât și în NAc (Hokfelt și colab., 1980) și este probabil implicat în răspunsurile comportamentale la medicamentele de abuz (Josselyn și colab., 1996; Josselyn și colab., 1997; Hamilton și colab., 2000; Beinfeld și colab., 2002; Rotzinger și colab., 2002). În testele de cultură celulară, CCK promotorul a fost caracterizat pe larg și sa dovedit a fi receptiv la membrii familiei CREB și AP-1 (revizuit de Hansen, 2001). Haun și Dixon (1990) a arătat că complexele AP-1 se pot lega de CCK Site-ul CRE in vitro, și s-a arătat ulterior, utilizând celule de neuroblastom SK-N-MC, că mutația situsului asemănător CRE reduce răspunsul promotorului la cFos / cJun supraexprimat (Rourke și colab., 1999). Într-adevăr, găsim, de asemenea, o creștere CCK activitatea de promotor (Figura 2) și legarea la sau în jurul elementului CRE (Figura 3) la supraexprimarea ΔFosB, un alt membru al familiei AP-1, dar nu găsim nici o legătură directă a ΔFosB cu CCK promotor in vivo or in vitro, chiar și după supraexprimarea sa.

O mare parte a activității a demonstrat un rol pentru CREB în reglementarea CCK activitatea promotorului. CCK Site-ul CRE este conservat pe vertebrate (Hansen, 2001) și, în unele teste de cultură celulară, ambele complexe CREB și AP-1 se leagă la acest sit și sunt necesare pentru CCK activitatea de promotor (Haun și Dixon, 1990; Deavall și colab., 2000; Hansen, 2001). În plus, mai mulți activatori cunoscuți din CCK (de exemplu, bFGF, PACAP, peptoni și depolarizare) s-au dovedit a acționa prin CREB (Hansen și colab., 1999; Deavall și colab., 2000; Bernard și colab., 2001; Gevrey și colab., 2002; Hansen și colab., 2004). Al nostru CCK- datele privind gena reporterului de luciferază susțin un rol esențial pentru site-ul similar CRE în reglementarea CCK activitatea promotorului, deoarece mutația acestui sit reduce bazalul CCK activitatea de promotor și CCK-expresia de luciferază indusă de VP16-CREB, o formă constitutiv activă a CREB, este pierdută atunci când acest sit este mutat (observație nepublicată). Astfel, am fost surprinși să constatăm că CREB nu pare să se lege de CCK promotor în extracte striatale fie la momentul inițial, fie la supraexpresia ΔFosB pe termen scurt atunci când nivelurile CREB sunt crescute. Acest lucru susține că nivelurile de CREB în sine nu sunt singurul factor care determină valoarea obligatorie a acestui site, iar acest lucru este susținut de munca altora (Cha-Molstad și colab., 2004). Deoarece promotorii altor genuri țintă CREB identificate anterior, cum ar fi BDNF și prodynorphin, a obligat CREB, suntem încrezători în constatarea noastră că CREB nu este obligatoriu pentru CCK promotor în extracte nucleare striatale. Mai mult, inducerea lui CCK-luciferaza de către ΔFosB nu a fost dependentă de situsul intact CRE, sugerând că ΔFosB nu reglează CCK expresie prin reglementarea legării directe a CREB la CCK promotor.

Incapacitatea noastră de a detecta interacțiunea CREB cu CCK promotorul este susținut de Renthal și colab. (2009), care a folosit o abordare Chip-chip pentru a analiza modificările globale în legarea CREB (pCREB) fosforilată și ΔFosB în striatum după expunerea cocaină cronică. În aceste experimente, complexele ADN-proteină au fost imunoprecipitate cu anticorpi ΔFosB sau pCREB și ADN-ul precipitat, după etichetare, a fost hibridizat cu o microarray de promotor. În timp ce multe gene caracterizate anterior CREB au fost identificate cu această abordare (de exemplu, BDNF, prodynorfin), CCK nu a fost identificat. În plus, s-a demonstrat că legarea CREB la un sit consens CRE variază foarte mult între liniile celulare cultivate (Cha-Molstad și colab., 2004). Toate studiile anterioare care au găsit interacțiuni CREB cu CCK promotor au fost realizate în cultura celulară (nu creierul din care au fost derivate eșantioanele noastre EMSA și ChIP) și au utilizat teste de schimbare a gelului pentru a investiga interacțiunile proteină-ADN. În timp ce un EMSA poate evalua potențialul unui factor de legare la o secvență ADN, analizele ChIP oferă o privire nouă asupra acestor interacțiuni in vivo. În plus, o mare parte a datelor care demonstrează fie inducerea CCK activitatea promotor sau legarea CREB la CCK promotor au fost obținute din celule care au fost stimulate de factori cum ar fi peptone (Bernard și colab., 2001), depolarizarea (Hansen și colab., 2004) sau o varietate de activatori ai cascadelor de semnalizare intracelulare incluzând cAMP și ERK (Hansen și colab., 1999). În experimentele noastre, singurul "stimul" folosit a fost supraexprimarea ΔFosB, care este suficientă pentru a induce CCK expresie. Luate împreună, acest lucru sugerează faptul că capacitatea CREB de a se lega (și ar putea reglementa) CCK promotorul este în mare măsură dependent de tipul celular și de activarea căilor de semnalizare particulare. În plus, CCK Elementul promotor asemănător CRE (cel puțin în celule PC12 neinduși și în striatum de șoarece) nu este o țintă directă a fie CREB, fie ΔFosB. Interesant, regulamentul FosB exprimarea de către CREB este, de asemenea, specifică tipului de celule și tipului de stimulare. Un studiu realizat de Andersson et al. a constatat că injectarea de oligonucleotide antisens CREB în striatum de șoarece a inhibat parțial inducerea FosB după administrarea de cocaină (Andersson și colab., 2001). Cu toate acestea, au constatat, de asemenea, că capacitatea L-Dopa de a induce FosB expresia în striatum leziat cu 6-OHDA nu a fost influențată de prezența oligonucleotidelor antisens CREB.

Din moment ce CREB și ΔFosB par să reglementeze indirect CCK promotorul și modificările în structura cromatinei au fost documentate ca răspuns la o varietate de stimuli care induc ΔFosB (Tsankova și colab., 2004; Kumar și colab., 2005; Renthal și colab., 2008), am argumentat că ΔFosB ar putea modula indirect activitatea promotorului prin modificarea structurii cromatinei. Cu toate acestea, la șoarecii care au supraexprimat ΔFosB pentru săptămâni 2, nu a existat nicio modificare în acetilarea histonei H3 la CCK promotor (Tabelul 1). Acest lucru este susținut de datele Chip-chip din Renthal și colab. (2009), care nu au raportat nicio modificare a legării H3 acetilate la CCK promotor la șoareci expuși cocainei cronice. Din moment ce CCK promotorul este activ în striatum, nu a fost așteptată sau observată legarea H3 a histonului metilat represiv. Interesant, nu am văzut nici o schimbare din cauza supraexprimării ΔFosB în legarea H3 acetilată la BDNF promotor (care a prezentat legare CREB crescută) sau la CDK5 și prodynorphin promotori (care au prezentat o creștere a legării ΔFosB). Deoarece există o multitudine de modificări ale histonei asociate cu modificări în activitatea promotorului (revizuite de Rando și Chang, 2009), există probabil alte modificări ale cromatinei care se asociază cu inducerea acestor gene. Orice modificare a cromatinei, deși adesea predictivă a nivelului activității promotorului, nu se poate modifica în timpul activării unei gene particulare. În viitor, ar fi interesant să analizăm alte modificări potențiale ale structurii cromatinei din jurul CCK promotor în urma supraexprimării ΔFosB. Interesant este că cocina cronică (probabil de Inducția ΔFosB) a demonstrat că induce exprimarea sirtuin 1 și 2, deacetilazele histonei de clasa a III-a care par a modifica fiziologia neuronală, semnalizarea ERK și răspunsurile comportamentale la cocaină (Renthal și colab., 2009). Inducerea unei histone deacetilaze ar avea capacitatea de a regla simultan expresia unui număr mare de gene de schimbări globale în structura cromatinei.

Un posibil candidat implicat în CCK regularea după supraexprimarea ΔFosB a fost membrul de familie cFos al familiei AP-1. Expresia cFos este reglementată de CREB (Sheng și colab., 1990; Impey și colab., 2004), și supraexpresia cFos (în concordanță cu supraexprimarea partenerului său de legare cJun) crește CCK activitatea de promotor (Rourke și colab., 1999). Prin urmare, creșterea nivelului CREB din cauza supraexprimării pe termen scurt a ΔFosB ar putea crește nivelurile de cFos și ar determina o legare crescută la CCK Site-ul CRE. CFOs ARNm este indus la șoareci după două săptămâni de supraexprimare a ΔFosB (McClung și Nestler, 2003) și a scăzut la șoareci expuși cocainei cronice sau supraexprimării ΔFosB pe termen lung (Renthal și colab., 2008). Aici găsim că cFos se leagă direct la CCK promotor în țesutul striatal, totuși, supraexprimarea ΔFosB nu crește în mod semnificativ legarea. Acest lucru sugerează că, în timp ce cFos ar putea fi implicat în reglementarea CCK expresia în general, o modificare a legării cFos în monoterapie nu este probabil mecanismul prin care reglează ΔFosB CCK expresie. Cu toate acestea, este posibil ca ΔFosB să poată induce fie modificări post-translaționale în cFos (de exemplu, fosforilarea modificată), fie să inducă expresia unui partener de legare (cum ar fi cJun) sau a proteinei coactivator. Cu toate acestea, deoarece situsul intact CRE (care sa dovedit anterior a fi un situs de legare pentru complexele AP-1, vezi Haun și Dixon, 1990) nu este necesară pentru creșterea CCK activitatea promotor observată cu supraexprimarea ΔFosB (așa cum este evaluată în experimentele noastre de gena reporter), este înteles că alți factori trans-acționari sunt, de asemenea, reglementați de ΔFosB.

CCK fragmentul promotor utilizat în experimentele cu gena reporter luciferază conține un situs de legare Sp1 conservat și o cutie E (revizuită de Hansen, 2002). În particular, s-a arătat că secvențele E-box leagă numeroși factori de transcripție (revizuit de Forrest și McNamara, 2004). Folosind celulele PC12, am văzut că mutația e-boxului scade CCK activitate promotor, dar nu modifică răspunsul promotorului la ΔFosB (datele nu sunt prezentate). Interesant, a CCK- reporterul cu luciferază care conține mutații atât în CRE, cât și în E-box, nu are activitate bazală detectabilă și nu răspunde la supraexprimarea ΔFosB (observație nepublicată). Un alt potențial mediator al acțiunii ΔFosB pe CCK promotor sunt ATF-uri, anumite forme despre care se știe că sunt induse în striatum prin expunere psihică cronică (Green și colab., 2008). Cu toate acestea, nu am găsit nicio dovadă pentru inducerea ΔFosB a acestor ATF-uri (datele nu sunt prezentate), iar ATF-urile nu ar fi de așteptat să se lege la situsul similar cu CRE mutant pe CCK promotor.

O precizare a acestui studiu constă în faptul că folosim un sistem bi-transgenic pentru a supraexprimă ΔFosB și, prin urmare, trebuie să fim conservativi în desenarea paralelelor între această paradigmă și administrarea cocainei cronice. Cu toate acestea, șoarecii transgenici 11A oferă posibilitatea unică de a privi efectele specifice ale ΔFosB în striatum, deoarece supraexprimarea este limitată la această regiune a creierului (Chen și colab., 1998), în timp ce administrarea de cocaină induce modificări într-o mare varietate de alte regiuni ale creierului care pot afecta indirect striatumul. În plus, mai multe studii au documentat fenotipuri comportamentale și moleculare similare la șoarecii 11A în comparație cu animalele netransgenice tratate cu cocaină cronică (Kelz și colab., 1999; McClung și Nestler, 2003; Renthal și colab., 2009). În plus, Bibb și colab. (2001) au raportat niveluri similare de striatal Cdk5 mRNA și inducția proteinelor în aceeași tulpină 11A în comparație cu loturile de carne netransgene tratate cu cocaină, precum și schimbări similare în țintele CDK5, p35 și DARPP-32.

În concluzie, constatăm că expresia ΔFosB pe termen scurt duce la inducerea genelor în striatum prin mecanisme multiple. Acestea includ legarea directă a promotorului, inducerea proteinei și activității CREB, modificarea cromatinei, în plus față de căile care urmează să fie determinate.

PROCEDURI EXPERIMENTALE

animale

Au fost utilizate animale bi-transgenice 11A (NSE-tTA x TetOP-ΔFosB) în acest studiu și sunt caracterizate prin Kelz și colab., 1999. Pentru a supraexprima ΔFosB, șoarecii au fost îndepărtați din doxiciclină între săptămânile 3 și 6, în timp ce șoarecii de control s-au menținut pe doxiciclină. Toți șoarecii au fost adăpostiți în grup și au fost menținute pe un ciclu 12: 12 lumină / întuneric, luminează la 7 am și luminează la ora 7 pm, cu ad lib accesul la hrană și apă. Toate experimentele cu șoarece au fost în conformitate cu protocoalele aprobate de comitetul de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea din Texas Southwestern Medical Center din Dallas.

Reporter și plasmide de expresie

Tipul sălbatic (WT) CCK reporter-reporter luciferază promotor a fost preparat prin inserarea unui fragment de aproximativ 200 bp PCR în vectorul pGL3-luc (Promega). Acest fragment a fost obținut din ADN genomic de șoarece (primeri: 5 'TATCCTCATTCACTGGGACGC 3' în amonte și 5 'TACCTTTGGATGGGGAAATCG 3' în aval) și inițial inserat în vectorul pGEM-T Easy (Promega, # A1360). Fragmentul promotor a fost apoi clonat în situsurile de restricție Kpn1 / Xho1 ale pGL3-luc.

Pentru a crea mutația punctului CRE în CCK promotor, un primer mutagen îndreptat împotriva unui site asemănător CRE raportat anterior (primer senzor: 5'CGTGTCCTGCTGGACTGAGCTCGCACTGGGTAAACA 3 ', primer antisens: 5'CTGTTTACCCAGTGCGCGCTGAGTCCAGCAGGACACG 3') a fost utilizat în combinație cu instrucțiunea de schimbare a produsului cu Stratag . Aceasta convertește site-ul asemănător CRE raportat (ACTGCGTCAGC) în ACTGAGCTCC. Toate plasmidele reporter au fost confirmate prin secvențierea ADN-ului. Plasmida de expresie ΔFosB conține o secvență ΔFosB de lungime completă inserată în situl de clonare multiplă al pCDNA 3.1 și a fost descrisă anterior (Ulery și Nestler, 2007).

Culturile de celule și transfecțiile ADN

Celulele feocromocitomului de șobolan (PC12) au fost menținute în mediul Eagle modificat Dulbecco F-12, suplimentat cu 10% ser de cal, 5% ser fetal bovin și 1% penicilină / streptomicină la 37 ° C și 5% CO₂. Celulele au fost transfectate prin electroporare utilizând un electroporator BTX 360 (350V, 0 ohmi și 850 μF) în 800 μL soluție salină tamponată cu fosfat Dulbecco în cuve de spațiu de 4 mm cu 10 μg de reporter și 5 μg de constructie de expresie. Plasmida vectorică goală (pCDNA) a fost utilizată pentru a normaliza cantitățile totale de ADN. După transfecție, celulele au fost crescute pe vase acoperite cu colagen de 35 mm pentru perioadele de timp indicate.

Teste de luciferază

La două sau trei zile după transfecție, celulele au fost spălate de 3 ori în soluție salină tamponată cu fosfat a lui Dulbecco, lizate (folosind glicilglicină 25 mM, MgSO 15 mM₄, 4 mM EGTA, 1% Triton X-100, pH 7.8, 1 mM DTT), colectate și eliminate prin centrifugare. 30 μL de lizat s-a combinat cu tampon de analiză 140 uL de luciferază (25 mM glicilglicină, 15 mM MgS04₄, 4 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 1 mM fosfat de potasiu, 1 mM coenzima A, pH 7.8). Activitatea de luminescență a fost măsurată utilizând un cititor de fluorescență microplaci FLx-800 după o injecție automată de 40 μL 1 mM luciferină per godeu. Activitatea luciferazei a fost normalizată la conținutul total de proteine așa cum s-a determinat printr-un test de proteină BioRad.

Testarea schimbării mobilității electroforetice

Extractele nucleare din felii bilaterale de striatum de la șoareci bi-transgenici 11A (aceia care au fost menținute pe sau în afara doxiciclinei timp de săptămâni 2 sau 8) (McClung și Nestler, 2003) au fost preparate conform Huang și Walters (1996). ³²Sondele oligonucleotidice dublu catenate marcate cu P s-au preparat utilizând protocolul de sistem Promega Gel Shift Assay (#E3300) și probele s-au purificat utilizând Coloane de rotație rapidă Roche. Secvențele de consens CRE și AP-1 au fost de la Promega (#E328A și E320B, respectiv) și CCK Secvențele CRE au fost (Cck-CRE sens: CTAGCGAGCTCTGGACTGCGTCAGCACTGGGTGCA; antisens Cck-CRE: CCCAGTGCTGACGCAGTCCAGAGCTCGCTAGCTTT).

Reacțiile de legare și electroforeza s-au efectuat utilizând modificări ale procedurii de testare a schimbării gelului Promega (#E3300). 50,000 CPM al probei marcate a fost combinată cu extractul nuclear striatal 10 μg. ADN-ul competitorului rece sau anticorpii au fost adăugați înainte de introducerea probelor radiomarcate. Pentru experimente supershift, s-a utilizat 2 pg de anticorp CREB (Upstate Biotechnology # 06-083). Reacțiile s-au făcut prin electroforeză pe geluri de poliacrilamidă 4%, s-au uscat și s-au expus filmului (folosind ecrane de intensificare pentru 1 oră până la 2 zile).

imunoblotare

Pentru celulele PC12, plăci de 35 mm de celule transfectate au fost spălate cu soluție salină tamponată cu fosfat de Dulbecco rece și lizatele au fost preparate în tampon de liză RIPA rece ca gheața (50 mM Tris pH 7.4, 5 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% deoxicolat, 1 % Triton X-100, 0.1% dodecil sulfat de sodiu) conținând inhibitori de protează. După sonicare, curățare și testul proteinei Bradford, lizatele au fost complet denaturate și 50 μg din fiecare probă au fost electroforizate pe geluri de poliacrilamidă SDS 10%. Proteinele au fost transferate la membrana PVDF, blocate timp de 1 oră în lapte uscat fără grăsimi 3% în soluție salină tamponată cu Tris conținând 0.1% Tween-20 (lapte TBS-T) și sondate peste noapte la 4 ° C cu anticorpi primari (CREB- Upstate Biotechnology # 06-083, utilizat la 1: 1,000; GAPDH- Sigma # G8795, utilizat la 1: 80,000) diluat în lapte TBS-T. După mai multe spălări în TBS-T, pete au fost sondate timp de o oră la temperatura camerei folosind anticorpi secundari conjugați cu fosfatază alcalină (Sigma) diluați 1: 5,000 în lapte TBS-T. După mai multe spălări în soluție salină tamponată cu Tris, reacția de culoare a fost efectuată conform instrucțiunilor BioRad (# 170-6432). Membranele au fost uscate peste noapte, scanate pe un scaner plat și densitometria efectuată folosind ImageJ (vezi mai jos).

Pentru extractele striatale, testele Western blot au fost efectuate așa cum au fost publicate anterior (Hope și colab., 1994). Țesutul a fost îndepărtat de la șoareci decapitați, plasat pe gheață și secționat pe o matrice de creier la o grosime de 1 mm. S-au luat apoi dungi de țesut și s-au congelat la -80 ° C până când s-au folosit. Țesutul a fost sonicat pe gheață într-un tampon bazat pe detergent, conținând atât inhibitori de fosfatază, cât și inhibitori de protează (Roche, Sigma). După sonicare, probele au fost denaturate în apă clocotită și centrifugate la 15,000xg timp de 15 minute; supernatantul a fost ulterior colectat și procesat; cantitățile de concentrație de proteină au fost apoi cuantificate folosind un test Bradford (Bio-Rad). Probele au fost conduse pe un gel 10% acrilamid / bisacrilamidă, transferate pe o membrană PVDF, blocate în lapte 5% și incubate cu anticorpi primari (Anti-CREB, Upstate, Lake Placid, NY). Bloturile au fost ulterior vizualizate utilizând un sistem de chemiluminescență (Pierce). Toate probele au fost normalizate la GAPDH (Fitzgerald, Concord, MA). Au fost executate curbe standard pentru a se asigura că suntem în intervalul liniar al analizei.

Analiza densitometrică

Pentru imunobloturile PC12, a fost efectuată analiza densitometrică folosind ImageJ cu calibrare rodbard. Semnalul mediu de fundal a fost scăzut din fiecare măsurătoare, iar raportul dintre semnalul CREB și GAPDH a fost calculat pentru fiecare probă. Pentru imunobloturi striate și analiză EMSA, Scion Image 1.62c a fost utilizat cu scăderea fundalului.

Imunoprecipitarea cromatinei (ChIP)

Analizele CHIP s-au efectuat conform metodelor Tsankova și colab. (2004) și Kumar și colab. (2005). Pe scurt, probele bilaterale striatale de la șoareci 11A menținuți pe sau în afara doxiciclinei au fost reticulate cu 1% formaldehidă și reticularea a fost stinsă cu glicină (concentrație finală de 0.125 M). Aceste probe provin din felii întregi de creier luate la nivelul nucleului accumbens cu cortexul îndepărtat. Cromatina a fost tunsă la aproximativ 0.2 până la 1 kb fragmente prin sonicare, eliminată cu margele de proteină G (Thermo Scientific # 22852) și probe de intrare congelate la -80 ° C. Pentru fiecare precipitație s-au utilizat între 60 și 100 μg de cromatină. S-au folosit 5-10 μg din fiecare anticorp primar (CREB: Upstate Biotechnology # 06-863, osFosB: Santa Cruz Biotechnology # SC-48x, acetilat H3: Upstate Biotechnology # 06-599, metilat H3 (LYS9): Cell Signaling Technology, cFos: Santa Cruz Biotechnology # SC-7202x). Complexele anticorp-cromatină au fost imunoprecipitate cu proteine G plus margele conform instrucțiunilor fabricării (Thermo Scientific # 22852). După reticularea inversă a probelor de intrare și precipitate, fiecare probă a fost supusă PCR cantitativă (qPCR). Utilizarea tuturor acestor anticorpi pentru ChIP a fost validată pe larg (Tsankova și colab., 2004; Kumar și colab., 2005; Renthal și colab., 2009).

Nivelurile de legare a proteinei la fiecare promotor de gene de interes au fost determinate prin măsurarea cantității de ADN asociat prin qPCR (Applied Biosystems (ABI) Prism 7700, Foster City, CA). Intrarea sau ADN-ul total (neimunoprecipitat) și ADN imunoprecipitat s-au amplificat în triplicat în prezența SYBR Green (Applied Biosystems, CA). Valorile Ct din fiecare probă au fost obținute utilizând software-ul Detector de secvență 1.1. Cuantificarea relativă a ADN-ului șablon a fost efectuată utilizând metoda ΔΔCt (Tsankova și colab., 2004). Primerii utilizați: promotorul BDNF 4: CTTCTGTGTGCGTGAATTTGCT; Promotorul AGTCCACGAGAGGGCTCCA CDK5: GCTGAAGCTGTCAGGAGGTC; GTGCCCCGCTCTTGTTATTA promotor Cck: CTTGGGCTAGCCTCATTCACTG; Promotorul promotorinei TTAAATAGCTCCTCCCGGTTCG: GGCTTCCTTGTGCTTCAGAC; GCGCTGTTTGTCACTTTCAA.

analize statistice

Toate datele sunt prezentate ca medii ± eroare standard a mediei. Diferența statistică a fost determinată de testul t cu două cozi al lui Student (p <0.05). Când s-au făcut mai multe comparații, valorile p au fost ajustate folosind corecția Bonferroni.

Mulţumiri

Dorim să-i mulțumim lui Will Renthal și lui Arvind Kumar pentru discuții utile. De asemenea, le mulțumim NIDA pentru finanțarea acestor experimente.

Note de subsol

Declinarea responsabilității editorului: Acesta este un fișier PDF al unui manuscris needitat care a fost acceptat pentru publicare. Ca serviciu pentru clienții noștri oferim această versiune timpurie a manuscrisului. Manuscrisul va fi supus copierii, tipăririi și revizuirii probelor rezultate înainte de a fi publicat în forma sa finală. Rețineți că în timpul procesului de producție pot fi descoperite erori care ar putea afecta conținutul și toate denunțările legale care se referă la jurnal.

Termeni de clasificare:

Secțiunea: #1 Biologie celulară și moleculară a sistemelor nervoase

Referinte

Andersson M, Konradi C, Cenci MA. proteina de legare a elementului de răspuns al proteinei cAMP este necesară pentru exprimarea genei dependente de dopamină în striatul intact dar nu în dopamina denatată. J Neurosci. 2001; 21: 9930-43. [PubMed]
Barrot M, Olivier JD, Perrotti LI, DiLeone RJ, Berton O, Eisch AJ, Impey S, Storm DR, Neve RL, Yin JC, Zachariou V, Nestler EJ. Activitatea CREB în shell-ul nucleului accumbens controlează răspunsurile comportamentale la stimulii emoționali. Proc Natl Acad Sci SUA A. 2002; 99: 11435-40. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
Beinfeld MC, Connolly KJ, Pierce RC. Tratamentul cu cocaină crește colecistochinina extracelulară (CCK) în carcasa nucleului accumbens a șobolanilor treji, în mișcare liberă, un efect care este intensificat la șobolani sensibili la comportamentul cocainei. J Neurochem. 2002; 81: 1021-7. [PubMed]
Bernard C, Sutter A, Vinson C, Ratineau C, Chayvialle J, Cordier-Bussat M. Peptonele stimulează transcripția genei colecistocininei intestinale prin intermediul factorilor de legare a elementului de răspuns al adenozin monofosfatului ciclic. Endocrinologie. 2001; 142: 721-9. [PubMed]
Bibb JA, Chen J, Taylor JR, Svenningsson P, Nishi A, Snyder GL, Yan Z, Sagawa ZK, Ouimet CC, Nairn AC, Nestler EJ, Greengard P. Efectele expunerii cronice la cocaină sunt reglementate de proteina neuronală Cdk5. Natură. 2001; 410: 376-80. [PubMed]
Cha-Molstad H, Keller DM, Yochum GS, Impey S, Goodman RH. Legarea specifică de tip a celulei a factorului de transcripție CREB la elementul de răspuns cAMP. Proc Natl Acad Sci SUA A. 2004; 101: 13572-7. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, Hope BT, Nestler EJ. Reglarea proteinelor delta FosB și FosB prin tratamente de convulsii electroconvulsive și tratamente cu cocaină. Mol Pharmacol. 1995; 48: 880-9. [PubMed]
Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Animale transgenice cu expresie genică inductibilă, țintită în creier. Mol Pharmacol. 1998; 54: 495-503. [PubMed]
Chen J, Zhang Y, Kelz MB, Steffen C, Ang ES, Zeng L, Nestler EJ. Inducerea kinazei dependente de ciclină 5 în hipocampus prin convulsii cronice electroconvulsive: rolul ΔFosB. J Neurosci. 2000; 20: 8965-71. [PubMed]
Chinenov Y, Kerppola TK. Închiderea întâlnirilor de mai multe tipuri: interacțiunile Fos-Jun care mediază specificitatea de reglare a transcripției. Oncogene. 2001; 20: 2438-52. [PubMed]
Cole RL, Konradi C, Douglass J, Hyman SE. Adaptarea neuronală la amfetamină și dopamină: mecanisme moleculare ale reglării genei prodynorfinei în striatum de șobolan. Neuron. 1995; 14: 813-23. [PubMed]
Deavall DG, Raychowdhury R, Dockray GJ, Dimaline R. Controlul transcripției genei CCK de către PACAP în celulele STC-1. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2000; 279: G605-12. [PubMed]
Ding XZ, Mocchetti I. Reglarea dopaminergică a conținutului de mRNA de colecistocinină în striatum de șobolan. Brain Res Mol Brain Res. 1992; 12: 77-83. [PubMed]
Forrest S, McNamara C. Familia de identificare a factorilor de transcripție și formarea leziunilor vasculare. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004; 24: 2014-20. [PubMed]
Gevrey JC, Cordier-Bussat M, Némoz-Gaillard E, Chayvialle JA, Abello J. Co-cerință a proteinelor kinazelor AMP- și calciului dependent de calciu pentru activarea transcripțională a genei de colecistokinină de către hidrolizatele de proteină. J Biol Chem. 2002; 277: 22407-13. [PubMed]
Green TA, Alibhai IN, Unterberg S, Neve RL, Ghose S, Tamminga CA, Nestler EJ. Inducerea factorilor de transcripție activă (ATF) ATF2, ATF3 și ATF4 în nucleul accumbens și reglarea comportamentului lor emoțional. J Neurosci. 2008; 28: 2025-32. [PubMed]
Hamilton ME, Redondo JL, Freeman AS. Transferul de dopamină și colecistokinină în nucleul accumbens de șobolan ca răspuns la administrarea acută de medicament. Synapse. 2000; 38: 238-42. [PubMed]
Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC. Căile de semnalizare proteină kinază activate cu mitogen și protein kinază A stimulează transcrierea colecistokininei prin activarea proteinei de legare a elementului de răspuns al adenozinei 3 ', 5'-monofosfat ciclic. Mol Endocrinol. 1999; 13: 466-75. [PubMed]
Hansen TV, Nielsen FC. Reglarea transcripției genei de colecistocinină neuronală. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 2001; 234: 61-7. [PubMed]
Hansen TV. Cholecystokinin transcripția genei: elemente promotor, factori de transcripție și căi de semnalizare. Peptidele. 2001; 22: 1201-11. [PubMed]
Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC. KCl și forskolin reglează sinergie expresia genei colecistocininei prin activarea coordonată a CREB și CBP coactivator. J Neurochem. 2004; 89: 15-23. [PubMed]
Haun RS, Dixon JE. Un amplificator transcripțional esențial pentru exprimarea genei de colecistocinină de șobolan conține o secvență identică cu elementul -296 al genei c-fos umane. J Biol Chem. 1990; 265: 15455-63. [PubMed]
Hiroi N, Marek GJ, Brown JR, Ye H, Saudou F, Vaidya VA, Duman RS, Greenberg ME, Nestler EJ. Rolul esențial al genei fosB în acțiunile moleculare, celulare și comportamentale ale convulsiilor cronice electroconvulsive. J Neurosci 1998. 1998; 18: 6952-62. [PubMed]
Hokfelt T, Rehfeld JF, Skirboll L, Ivemark B, Goldstein M, Markey K. Dovezi pentru coexistența dopaminei și CCK în neuronii mezo-limbici. Natură. 1980; 285: 476-8. [PubMed]
Hope BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ. Tratamentul cu convulsii electroconvulsive cronice (ECS) are ca rezultat exprimarea unui complex AP-1 de lungă durată în creier, cu compoziție și caracteristici modificate. J Neurosci. 1994; 14: 4318-28. [PubMed]
Hope BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ. Inducerea unui complex AP-1 de lungă durată compus din proteine modificate Fos în creier prin cocaină cronică și alte tratamente cronice. Neuron. 1994; 13: 1235-44. [PubMed]
Huang KX, Walters JR. Reglarea dopaminergică a activității de legare a ADN-ului factorului de transcripție AP-1 în striatum de șobolan. Neuroscience. 1996; 75: 757-75. [PubMed]
Impey S, McCorkle SR, Cha-Molstad H, Dwyer JM, Yochum GS, Boss JM, McWeeney S, Dunn JJ, Mandel G, Goodman RH. Definirea regulatorului CREB: o analiză la nivelul genomului a regiunilor de reglare a factorului de transcripție. Cell. 2004; 119: 1041-54. [PubMed]
Johannessen M, deputatul Delghandi, Moens U. Ce se întâmplă cu CREB? Semnalul celular. 2004; 16: 1211-27. [PubMed]
Josselyn SA, Vaccarino FJ. Efecte opuse ale antagoniștilor CCK (A) și CCK (B) asupra dezvoltării activității condiționate la șobolani. Behav Pharmacol. 1996; 7: 505-512. [PubMed]
Josselyn SA, De Cristofaro A, Vaccarino FJ. Dovezi pentru implicarea receptorului CCK (A) în obținerea activității condiționate produse de cocaină la șobolani. Brain Res. 1997; 763: 93-102. [PubMed]
Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr., Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR , Nestler EJ. Exprimarea factorului de transcripție deltaFosB în creier controlează sensibilitatea la cocaină. Natură. 1999; 401: 272-6. [PubMed]
Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DE, Truong HT, Russo SJ, Laplant Q, Sasaki TS, Whistler KN, Neve RL, Self DW, Nestler EJ. Remodelarea cromatinei este un mecanism cheie care stă la baza plasticității induse de cocaină în striatum. Neuron. 2005; 48: 303-14. [PubMed]
Mattson BJ, Bossert JM, Simmons DE, Nozaki N, Nagarkar D, Kreuter JD, Hope BT. Coborârea CREB indusă de cocaină în nucleul accumbens de șobolani sensibili la cocaină este posibilă prin activarea sporită a kinazei extracelulare a semnalului, dar nu și a protein kinazei A. J Neurochem. 2005; 95: 1481-94. [PubMed]
McClung CA, Nestler EJ. Reglementarea expresiei genelor și a recompensei cocainei de către CREB și DeltaFosB. Nat Neurosci. 2003; 6: 1208-15. [PubMed]
McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ. DeltaFosB: un comutator molecular pentru adaptarea pe termen lung în creier. Brain Res Mol Brain Res. 2004; 132: 146-54. [PubMed]
Nestler EJ, Kelz MB, Chen JS. ΔFosB: un mediator molecular al plasticității neuronale și comportamentale pe termen lung. Brain Res. 1999; 835: 10-17. [PubMed]
Nestler EJ. Există o cale moleculară comună pentru dependență? Nat Neurosci. 2005; 8: 1445-9. [PubMed]
Nestler EJ. Mecanisme transcripționale ale dependenței: rolul DeltaFosB. Philos Trans R. Soc Lond. B Biol Sci. 2008; 363: 3245-55. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. Modele distincte ale inducției DeltaFosB în creier prin medicamente de abuz. Synapse. 2008; 62: 358-69. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
Rando JO, Chang HY. Opiniile generale despre structura cromatinei. Annu Rev Biochem. 2009; 78: 245-71. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
Renthal W, Carle TL, Maze I, Covington HE, 3rd., Truong HT, Alibhai I, Kumar A, Montgomery RL, Olson EN, Nestler EJ. Delta FosB mediază desensibilizarea epigenetică a genei c-fos după expunerea cronică la amfetamină. J Neurosci. 2008; 28: 7344-9. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
Rentalul W, Kumar A, Xiao G, Wilkinson M, Covington HE, 3rd, Maze I, Sikder D, Robison AJ, LaPlant Q, Dietz DM, Russo SJ, Vialou V, Chakravarty S, Kodadek TJ, Nestler EJ. Analiza genomului asupra reglajului cromatinei de cocaină relevă un rol pentru sirtuine. Neuron. 2009; 62: 335-48. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
Rotzinger S, Bush DE, Vaccarino FJ. Modularea cu cholecystokinină a funcției mezolimbice de dopamină: reglementarea comportamentului motivat. Pharmacol Toxicol. 2002; 91: 404-13. [PubMed]
Rourke IJ, Hansen TV, Nerlov C, Rehfeld JF, Nielsen FC. Cooperativitatea negativă între elementele de e-box juxtapuse și elementele sensibile la cAMP / TPA în promotorul genei de colecistokinină. FEBS Lett. 1999; 448: 15-8. [PubMed]
Shaw-Lutchman TZ, Barrot M, Wallace T, Gilden L, Zachariou V, Impey S, Duman RS, Storm D, Nestler EJ. Cartografierea regională și celulară a transcripției mediate de CRE în timpul retragerii morfinei precipitate de naltrexonă. J Neurosci. 2002; 22: 3663-3672. [PubMed]
Shaw-Lutchman TZ, Impey S, Storm D, Nestler EJ. Reglarea transcripției mediate de CRE în creierul de șoarece de către amfetamină. Synapse. 2003; 48: 10-7. [PubMed]
Sheng M, McFadden G, Greenberg ME. Membrana depolarizată și calciu induc transcripția c-fos prin fosforilarea factorului de transcripție CREB. Neuron. 1990; 4: 571-82. [PubMed]
Tsankova NM, Kumar A, Nestler EJ. Modificări histone la regiunile promotor gene în hipocampus de șobolan după crize electroconvulsive acute și cronice. J Neurosci. 2004; 24: 5603-10. [PubMed]
Ulery PG, Nestler EJ. Reglarea activității de transcripție DeltaFosB prin fosforilare Ser27. Eur J Neurosci. 2007; 25: 224-30. [PubMed]
Vaccarino FJ. Nucleus accumbens dopamina-CCK interactiuni in recompensa psihostimulant si comportamente conexe. Neurosci Biobehav Rev. 1992; 18: 207-14. [PubMed]
Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton O, Sim-Selley LJ, DiLeone RJ, Kumar A, Nestler EJ. ΔFosB: Un rol esențial pentru ΔFosB în nucleul accumbens în acțiunea morfinei. Nature Neurosci. 2006; 9: 205-11. [PubMed]