Neuroplasia endogenă indusă de opioide a neuronilor dopaminergici din zona tegmentală ventrală influențează recompensa naturală și opioidă (2014)

Sesiuni zilnice de împerechere.

Pentru a studia evoluția în timp a modificărilor dimensiunii somatelor neuronilor dopaminergici în atriul ventricular superior (VTA), animalele cu experiență sexuală și cele neexperimentate au fost sacrificate la 1, 7 sau 31 de zile ( n = 5-8 per grup) după ultima zi de împerechere (experimentate) sau manipulare (neexperimentate). Grupurile cu experiență sexuală au fost asociate în funcție de comportamentul sexual în timpul sesiunii finale de împerechere, precum și de numărul total de ejaculări pe parcursul celor cinci sesiuni (o medie de 5 pentru fiecare grup) și nu au diferit în ceea ce privește niciun parametru al comportamentului sexual.

Sesiuni de împerechere.

Masculii fără experiență sexuală au fost repartizați la oricare dintre cele două condiții experimentale: fără experiență sexuală sau cu experiență sexuală. Animalele cu experiență sexuală au fost lăsate să se împerecheze de cinci ori în zile consecutive cu femele receptive în cuști de testare dreptunghiulare (60 × 45 × 50 cm) până la manifestarea ejaculării sau până la 1 oră (oricare a survenit prima). Cuștile au fost curățate temeinic cu o soluție de etanol 70% și s-a adăugat așternut proaspăt între sesiunile de împerechere. Comportamentul sexual a fost efectuat în timpul fazei de întuneric (2-6 ore după intrarea întunericului). Doar animalele care au ejaculat în timpul a cel puțin patru din cele cinci sesiuni de împerechere au fost considerate cu experiență sexuală și incluse în experimente. Toate sesiunile de împerechere au fost observate și comportamentul sexual a fost înregistrat. Au fost înregistrate numărul de intromisii (IM) la montare (M), latența la montare (ML; timpul de la introducerea femelei la prima montare), latența intromisiei (IL; timpul de la introducerea femelei la prima intromisie) și latența ejaculării (EL; timpul de la prima intromisie la ejaculare) ( Agmo, 1997 ). Animalele neexperimentate au fost plasate într-o cușcă de testare curată timp de 1 oră concomitent cu masculi cu experiență sexuală care se împerecheau în aceeași cameră, astfel încât să fie expuse la mirosuri îndepărtate de femele și la niveluri similare de perturbare și noutate de mediu ca și masculii experimentați.

Etichetarea cu imunofluorescență.

Animalele au fost anesteziate profund folosind pentobarbital sodic (270 mg/kg, ip) și perfuzate intracardiac cu 50 ml de soluție salină 0.9%, urmată de 500 ml de paraformaldehidă 4% în tampon fosfat de sodiu (PB) 0.1 m. Creierele au fost prelevate și postfixate timp de 1 oră la temperatura camerei (RT) în același fixativ, apoi imersate în zaharoză 20% și azidă de sodiu 0.01% în PB 0.1 m pentru depozitare la 4°C. Secțiunile coronale au fost tăiate la 35 μm pe un microtom de congelare (H400R, Microm) și au fost colectate în patru serii paralele în soluție crioprotectoare (zaharoză 30%, etilen glicol 30% în PB 0.1 m), apoi depozitate la 20°C. Toate incubările au fost efectuate la RT cu agitare ușoară și clătiri abundente cu PBS 0.1 m, pH 7.35, între incubări. Secțiunile au fost expuse la 1% _{H₂O₂ timp de 10 minute pentru a distruge peroxidazele endogene, apoi blocate timp} de 1 oră în soluție de incubare (PBS+: PBS conținând 0.4% Triton X-100; Sigma-Aldrich) și 0.1% albumină serică bovină (Jackson Immuno Research Laboratories). Apoi, secțiunile au fost incubate peste noapte la temperatura camerei într-un anticorp tirozin hidroxilază (TH) de șoarece (1:20 000; Millipore ). După incubarea cu anticorp primar, secțiunile au fost incubate în anticorp de capră anti-șoarece conjugat cu AlexaFluor 555 (1:100; Invitrogen, Eugene, OR) timp de 30 de minute. În final, secțiunile au fost spălate cu 0.1 m PB, montate pe lame de sticlă Superfrost Plus, uscate și acoperite cu gelvatol conținând agentul anti-decolorare 1,4-diazabiciclo(2,2)octan (DABCO; 50 mg/ml, Sigma-Aldrich; Lennette, 1978 ).

Analiza datelor: dimensiunea neuronului soma.

Imaginile neuronilor TH-imunorreactivi (IR) din VTA au fost realizate la o mărire de 40× la trei niveluri rostrale și caudale ( Balfour et al., 2004 ). Nu s-au detectat diferențe între celulele de la diferitele niveluri. Dimensiunea somei neuronilor TH-IR a fost analizată folosind ImageJ (National Institutes of Health). Aria medie, perimetrul și circularitatea au fost măsurate așa cum este descris de Sklair-Tavron et al. (1996) . A fost analizată o medie de 25 de celule per animal (combinate toate cele 3 niveluri VTA) și au fost incluse doar celulele cu un nucleu clar vizibil. Pentru fiecare animal, au fost calculate aria medie, perimetrul și circularitatea. Pentru analiza statistică s-a utilizat un ANOVA bidirecțional [factori: experiență sexuală (cu experiență sexuală sau fără experiență sexuală) și timp (1, 7 sau 31 de zile)], urmate de comparații post-hoc folosind metoda Holm-Sidak cu un nivel de semnificație de 0.05.

Sesiuni de împerechere pe două săptămâni.

Pentru a testa dacă experiența sexuală în timpul sesiunilor de împerechere zilnică este necesară pentru scăderea mărimii neuronului soma TH-IR, s-au analizat neuronii dopaminei VTA de animale care s-au împerecheat pe parcursul a cinci sesiuni de împerechere biweekly. Ședințele de împerechere au fost descrise mai sus, dar într-o perioadă de săptămâni 2.5. Creierele au fost colectate 7 d după ultima împerechere sau manipulare.

Imunoperoxidaza etichetare.

În plus, s-a testat dacă utilizarea tehnicilor sensibile de colorare cu imunoperoxidază și detectare a cromogenului ar permite, de asemenea, vizualizarea modificărilor dimensiunii somei în TH-IR. Perfuzia și procesarea țesuturilor au fost efectuate așa cum s-a descris mai sus. După tratamentul cu 1% H₂O₂ _și PBS ₊ , secțiunile au fost incubate peste noapte la temperatura camerei într-un anticorp policlonal de șoarece anti-tirozin hidroxilază (TH) (1:20 000; Millipore ). După incubarea cu anticorpi primari, secțiunile au fost incubate cu IgG de capră anti-iepure conjugat cu biotină (1 oră, 1:500 în PBS+; Vector Laboratories), peroxidază de avidină-biotină-hrean (1 oră, ABC elite; 1:1 000 în PBS; Vector Laboratories) și tetrahidroclorură de 3,3′-diaminobenzidină (10 min, 0.02%, DAB; Sigma-Aldrich) amplificată cu sulfat de nichel (0.02% în 0.1 m PB) cu peroxid de hidrogen (0.015%). Secțiunile au fost spălate bine în 0.1 m PB pentru a termina reacția și montate pe lame de sticlă Superfrost plus codificate (Fisher) cu 0.3% gelatină în ddH2O. _După deshidratare, toate lamele au fost acoperite cu agent de montare DPX (xilen cu ftalat de dibutil; Sigma-Aldrich).

Analiza datelor: dimensiunea neuronului soma.

Celulele TH-IR au fost analizate pentru arie, perimetru și circularitate așa cum s-a descris mai sus. În plus, au fost analizate celulele TH-IR din substantia nigra (SN), în aceleași secțiuni utilizate pentru analiza celulelor TH-IR VTA. În final, după analiza celulelor TH-IR VTA și SN, secțiunile au fost contracolorate folosind violet de crezil, iar celulele non-TH-IR au fost analizate folosind aceleași metode descrise mai sus. Diferențele dintre grupurile naive și cele experimentate au fost comparate folosind teste t Student bilaterale cu un nivel de semnificație de 0.05.

Proiectare experimentală.

Anterior, Russo și colab. (2007) au arătat că administrarea cronică a morfinei induce toleranță la recompensa administrată de morfină. Întrucât experiența sexuală și administrarea cronică a morfinei provoacă scăderi similare ale dimensiunii somatice a neuronilor dopaminergici din atriul ventral (VTA), relevanța funcțională a modificărilor morfologice induse de sex a fost testată pentru recompensa administrată de morfină. Animalele cu experiență sexuală și cele neexperimentate au fost împărțite în șase grupuri experimentale diferite ( n = 9-13 per grup) pe baza comportamentului sexual (neexperimentate sau experimentate) și a dozei de morfină (0.5, 5.0 sau 10.0 mg/kg, ip) și au fost testate pentru preferința de loc condiționată (CPP) indusă de morfină.

Morfina-CPP.

Condiționarea a avut loc la 1 zi după ultima sesiune de împerechere, iar grupurile au fost asociate în funcție de performanța sexuală în timpul ultimei sesiuni de împerechere. Paradigma CPP utilizată a constat dintr-un pretest, zile de condiționare și un post-test, iar aparatul s-a bazat pe Tenk și colab. (2009) . Pe scurt, aparatul CPP (MED Associates) a constat din trei camere distincte. Între fiecare sesiune, aparatul a fost curățat temeinic cu o soluție de etanol 70% pentru a minimiza indiciile olfactive persistente. Pentru a determina preferințele individuale, a fost efectuat un pretest în timpul căruia animalelor li s-a oferit acces liber la întregul aparat timp de 15 minute. Ca grup, animalele nu au arătat o preferință semnificativă pentru o anumită cameră, dar fiecare animal individual a avut o ușoară preferință inițială. Șobolanii care au arătat o preferință substanțială pentru una dintre camere (o diferență >200 s între timpul petrecut în fiecare dintre camere; <5% dintre animale) în timpul pretestului au fost excluși din studiu. În timpul condiționării, medicamentul a fost asociat fie cu camera inițial preferată, fie cu cea nepreferată, utilizând o paradigmă imparțială ( Tzschentke, 2007 ), iar animalele au fost izolate în camere timp de 30 de minute. Animalele au fost injectate cu soluție salină (ip) dimineața (9:00 - 12:00) și izolate în camera cu soluție salină (control). După-amiaza (1:00 - 4:00), animalele au fost injectate cu morfină (ip, 0.5 mg/kg, 5.0 mg/kg sau 10.0 mg/kg; sulfat de morfină dizolvat în soluție salină 0.9%, Johnson Matthey) și izolate în camera cu morfină. Animalele au fost supuse la două zile de condiționare. A doua zi (la 3 zile după ultima zi de împerechere), a fost efectuat un post-test, identic din punct de vedere procedural cu pre-testul. Pentru analiza statistică, timpul petrecut în camera cu morfină pereche în timpul post-testului a fost comparat cu timpul petrecut în camera cu soluție salină pereche în timpul post-testului pentru masculii neperfecți sau experimentați sexual, în cadrul fiecărei doze, utilizând un test t pereche. O valoare de p < 0.05 a fost considerată semnificativă statistic. Grupuri de control suplimentare, formate din animale neperfecte și experimentate sexual, au primit soluție salină atât în ​​camere pereche, cât și în camere neperfecte, pentru a servi drept controale negative. Nu s-au detectat diferențe în timpul petrecut între camere pentru niciunul dintre grupuri.

Proiectare experimentală.

Experiența sexuală are ca rezultat facilitarea comportamentului sexual care se menține timp de cel puțin 1 lună ( Pitchers și colab., 2012 ). Pentru a analiza efectul blocării MOR asupra facilitării comportamentului sexual indusă de experiență, animalele cu experiență sexuală au primit fie naloxonă, fie soluție salină înainte de cele cinci sesiuni consecutive de împerechere ( n = 12 fiecare), așa cum este descris mai sus. La o săptămână după ultima sesiune de împerechere, a fost efectuat un test final de împerechere, în timpul căruia toate animalele au fost lăsate să se împerecheze până la o ejaculare sau până la 1 oră. Nu a fost administrat tratament cu naloxonă sau soluție salină înainte de împerechere în ultima zi de test. Parametrii împerecherii au fost comparați pentru a determina dacă naloxona a afectat fie facilitarea împerecherii indusă de experiența sexuală (ziua 1 vs ziua 5), ​​fie menținerea acestei facilitări (ziua 5 vs test) utilizând o ANOVA bidirecțională [factori: tratament (soluție salină versus naloxonă) și zi (ziua 1, ziua 5 sau test)] și metoda Holm-Sidak pentru comparații post-hoc . Pentru toate testele statistice, p < 0.05 a fost considerat a fi semnificativ statistic.

Sistemul naloxonă în ziua testului.

Pentru a demonstra că alterarea comportamentului sexual din ultima zi a testului de împerechere nu s-a datorat absenței naloxonei, am administrat fie naloxonă, fie soluție salină în ultima zi a testului de împerechere animalelor care au primit împerechere cu naloxonă în timp ce dobândeau experiență sexuală. Mai exact, toate animalele au primit injecție cu naloxonă (10 mg/kg, subcutanat) cu 30 de minute înainte de împerechere, până la o singură ejaculare timp de 5 zile consecutive. În ziua testului, a 7-a zi mai târziu, aproximativ jumătate dintre animale au primit o injecție cu naloxonă (10 mg/kg, n = 7) sau soluție salină ( n = 6) cu 30 de minute înainte de introducerea unei femele receptive. Comportamentul sexual a fost observat și înregistrat. Parametrii împerecherii au fost comparați pentru a determina dacă naloxona a afectat fie facilitarea împerecherii indusă de experiența sexuală (ziua 1 vs ziua 5), ​​fie menținerea acestei facilitări (ziua 5 vs test) utilizând o ANOVA bidirecțională [factori: tratament (soluție salină versus naloxonă) și zi (ziua 1, ziua 5 sau test)] și metoda Holm-Sidak pentru comparații post-hoc . Pentru toate testele statistice, o valoare p < 5% a fost considerată semnificativă statistic.

Efectele naloxonei asupra expresiei pe termen scurt a comportamentului sexual facilitat.

Efectele tratamentului cu naloxonă (10 mg/kg, sc) în timpul împerecherii au fost testate asupra comportamentului sexual ulterior în timpul unei zile finale de test de împerechere, care a fost efectuată la doar 1 zi după ultima împerechere (soluție salină, n = 5; naloxonă, n = 4).

Pre-tratamentul sistemic cu naloxonă.

Pentru a determina dacă tratamentul repetat cu naloxonă singură provoacă afectarea comportamentului sexual la 7 zile după ultimul tratament, animalele netratate sexual au primit cinci injecții zilnice cu naloxonă (10 mg/kg, sc) sau soluție salină, în zile consecutive, înainte de un test de împerechere, la 7 zile după injecția finală cu naloxonă sau soluție salină. În această ultimă zi de test, animalele nu au primit nicio injecție. Comportamentul sexual a fost observat și înregistrat așa cum este descris mai sus. Parametrii de împerechere au fost comparați între grupuri utilizând teste t nepereche . Pentru toate testele statistice, o valoare de p < 5% a fost considerată semnificativă statistic.

Sistemul naloxonă și recompensa sexuală.

O posibilitate pentru efectele atenuante ale naloxonei pe afișarea menținerii comportamentului sexual facilitat este aceea că naloxona blochează efectele satisfăcătoare ale comportamentului sexual. Pentru a testa această posibilitate, paradigma CPP a fost realizată pentru un comportament sexual imediat după naloxonă sau injecție salină la bărbați fără experiență sexuală anterioară. Procedura CPP a fost similară cu cea descrisă mai sus pentru CPP morfină, inclusiv pretest, zile de condiționare și post-test.

Comportamentul sexual a fost asociat cu camera inițial nepreferată. Într-o manieră contrabalansată, fiecare animal a primit o injecție cu naloxonă ( n = 12) sau soluție salină ( n = 11) cu 30 de minute înainte de a primi acces la o femelă receptivă. Durata medie a sesiunii de împerechere a fost de aproximativ 13 minute. La un minut după ejaculare, animalul a fost plasat în camera pereche timp de 30 de minute. În cealaltă zi de condiționare, animalele au primit o injecție fie cu naloxonă, fie cu soluție salină (oricare au primit înainte de împerechere) și au fost plasate în camera nepereche timp de 30 de minute. Apoi, a fost efectuat un post-test, identic cu pre-testul. Pentru a determina preferința pentru cameră, a fost comparat timpul petrecut în camera pereche în timpul pre-testului și post-testului. Pentru analiza statistică, s-au utilizat teste t pereche pentru a compara scorurile de preferință și diferență și timpul petrecut în camera pereche în timpul pre-testului și post-testului pentru a determina dacă s-a format un CPP semnificativ pentru comportamentul sexual. O valoare p < 0.05 a fost considerată semnificativă.

Proiectare experimentală.

Pentru a determina dacă acțiunea EOP, specifică în VTA, a fost responsabilă pentru efectele modificărilor induse de experiența sexuală asupra comportamentului sexual, animalele au fost supuse unei perfuzii locale de naloxonă sau soluție salină în VTA înainte de cinci sesiuni zilnice de împerechere. Paradigma comportamentală a fost similară cu experimentul sistemic cu naloxonă. Animalele cu experiență sexuală au fost lăsate să se împerecheze timp de 5 zile consecutive până la o ejaculare sau până la 1 oră. Cu cincisprezece minute înainte de introducerea femelei receptive, șobolanii masculi au primit perfuzii bilaterale fie de naloxonă (10 μg/μl per emisferă; volum de 0.5 μl; dizolvată în soluție salină 0.9%), fie de soluție salină (0.5 μl per emisferă). Microinjecțiile bilaterale au fost administrate la un debit de 0.5 μl/min pe un interval de 1 minut, urmate de încă 1 minut, cu canula de injecție lăsată la locul ei pentru difuzie. Canula de injecție a fost apoi înlocuită cu canula fictivă și capacul de praf. La o săptămână după ultima zi de împerechere (ziua testului), toate animalele s-au împerecheat încă o dată până la ejaculare fără o perfuzie de naloxonă sau soluție salină. Figura 3 A prezintă structura experimentală. Analiza datelor a fost efectuată așa cum este descris în experimentul cu naloxonă sistemică.

Chirurgie cannulară.

Șobolanii masculi au fost anesteziați cu o injecție intraperitoneală (0.1 ml/kg) de ketamină (0.87 mg/ml) și xilazină (0.13 mg/ml) și plasați într-un aparat stereotaxic (Kopf Instruments). Canule de ghidare bilaterale de calibru 21 (Plastics One) au fost coborâte prin mici găuri în craniu în creier către VTA la -4.8 mm AP, ± 0.75 mm ML de la bregma și -7.8 mm DV de la partea superioară a craniului, conform Paxinos și Watson (2013) . Canulele au fost fixate cu acril dentar care a aderat la trei șuruburi fixate în craniu. Animalele au avut o perioadă de recuperare de 2 săptămâni și au fost manipulate zilnic pentru acomodarea cu procedurile de manipulare și injectare utilizate în timpul testării comportamentale.

Verificarea plasării canulei.

Plasarea canulelor a fost examinată utilizând imunomarcarea TH pentru a confirma că VTA a fost direcționată corect. Doar animalele cu plasările corecte au fost incluse în analize (mărimile finale ale grupurilor: soluție salină experimentată n = 8; naloxonă experimentată n = 6). Trei animale suplimentare care au primit injecții intra-VTA cu naloxonă în afara VTA au fost grupate într-un grup de „injecții ratate”. Grupul ratat a fost analizat separat pentru a servi drept control anatomic, iar testul Mann-Whitney U a fost utilizat pentru a compara comportamentul din ziua finală a testului cu masculii experimentați tratați cu naloxonă și cu soluție salină.

Proiectare experimentală.

Expunerea la cușca în care masculii au dobândit experiența de împerechere s-a dovedit a provoca activarea MOR în VTA și activitate neuronală în VTA și NAc ( Balfour și colab., 2004 ). Prin urmare, mediul de împerechere servește ca un indiciu condiționat predictiv al recompensei sexuale. Studiul actual a testat dacă activarea MOR în timpul experienței sexuale este necesară pentru activarea neuronală ulterioară indusă de indicii condiționate. Naloxona sau soluția salină au fost administrate sistemic (ip) cu 30 de minute înainte de plasarea în arena de împerechere și introducerea unei femele receptive pentru împerechere (experimentată) sau înainte de manipularea de control, care a constat în plasarea în cușca de manipulare fără prezentarea femelei (mediu neutru; naiv). Astfel, au fost create patru grupuri experimentale: Sal naiv, NLX naiv, Sal exp și NLX exp. La o săptămână după sesiunea finală de împerechere, jumătate din animalele din fiecare grup au fost expuse în cușca de împerechere (masculi Exp: indicii condiționate asociate sexului) sau în cușca de manipulare (masculi naivi: indicii non-saliente/neutre), în timp ce cealaltă jumătate nu a fost expusă la niciun indiciu și a rămas în cuștile lor (pentru a determina expresia inițială a pERK). Această paradigmă experimentală a produs 8 grupuri: Sal naiv - Fără indiciu, Sal+naiv, NLX naiv - Fără indiciu, NLX+naiv, Sal exp - Fără indiciu, Sal exp + indiciu, NLX exp - Fără indiciu, NLX exp + indiciu ( n = 4 fiecare, cu excepția NLX naiv - Fără indiciu, n = 3). Animalele au fost perfuzate la 10-15 minute după expunerea la indiciu. Animalele de control au fost scoase din cuștile lor și perfuzate concomitent.

Imunohistochimie.

Secționarea și imunohistochimia au fost efectuate așa cum s-a descris mai sus. Aici, am utilizat un anticorp policlonal de iepure împotriva kinazelor MAP p42 și p44 ERK1 și ERK2 (pERK; 1:4 000; Cell Signaling Technology). Anticorpul primar a fost caracterizat pe larg în literatura de specialitate ( Roux și Blenis, 2004 ; Murphy și Blenis, 2006 ; Frohmader et al., 2010b ). Mai mult, omiterea anticorpului primar a împiedicat orice imunoreactivitate, iar analiza Western blot a țesutului cerebral de șobolan a relevat două benzi la greutățile moleculare corespunzătoare.

Analiza datelor.

Celulele pERK-imunoreactive (-IR) au fost numărate într-un număr de regiuni ale creierului utilizând un tub de desen camera lucida atașat la un microscop Leica DMRD: NAc [nucleu (C) și coajă (S); 400 × 600 μm; cortex prefrontal medial; mPFC; aria cingulară anterioară (ACA); cortex prelimbic (PL); cortex infralimbic (IL); 600 × 800 μm fiecare], putamen caudat (CP; 800 × 800 μm) și amigdală bazolaterală (BLA; 900 × 1200 μm; Balfour și colab., 2004 ; Frohmader și colab., 2010b ; Pitchers și colab., 2010b ). Două secțiuni au fost numărate per regiune a creierului, iar numărul de celule din zonele standard de analiză a fost apoi calculat ca număr de celule pe mm2 ^. Cele două numărări au fost mediate per animal pentru calcularea mediilor de grup. Mediile grupurilor din cadrul grupurilor cu sau fără experiență sexuală au fost comparate utilizând ANOVA bidirecțională [factori: tratament medicamentos (NLX sau Sal) și indiciu (indiciu sau fără indiciu)], urmate de comparații post-hoc utilizând testele de sumă Holm-Sidak sau Mann-Whitney, acolo unde a fost cazul, cu un nivel de semnificație de p < 0.05. În stratul NAc al animalelor cu experiență sexuală, a existat o tendință puternică spre semnificația factorilor și, prin urmare, s-au efectuat comparații perechi pentru a compara doar grupurile saline (Sal-Fără indiciu) și indiciul salin (Sal + Indiciu).

Imagini.

Imaginile digitale au fost capturate folosind o cameră CCD (Macrofire, Optronics) atașată la un microscop Leica (DM5000B) cu setări fixe ale camerei. Imaginile au fost importate în software-ul Adobe Photoshop 9.0. Imaginile nu au fost modificate în niciun fel, cu excepția ajustării luminozității și contrastului.

Schimbările dimensiunii soma induse de opioide endogene ale neuronilor dopaminei VTA. AImagini reprezentative ale neuronilor dopaminergici VTA de la animale naivă și experimentate sexual, care arată reducerea dimensiunii soma 7 d după sesiunea de împerechere finală. Scala barei, 5 μm. Date cantitative care arată că experiența sexuală (Exp, bare negre) a cauzat o reducere semnificativă a ariei (B; în μm²) și perimetrul (C; în μm) de celule de dopamină VTA, 1 d (Naive, Exp; n = 6) și 7 d (Naive, n = 5; Exp, n = 6), dar nu 31 d (Naive, n = 6; Exp, n = 8) după împerecherea finală, comparativ cu controalele naive sexual (barele naive, alb). Zona a fost redusă la 84% la bărbații cu experiență comparativ cu controalele naive la 1 sau 7 d. Perimetrul a fost redus la 91.6 și 90% în grupurile experimentate comparativ cu controlul la 1 și 7 d resp. Nu a existat niciun efect asupra circularității (D). Această plasticitate a celulelor dopamină în zonă (E) și perimetrul (F) a fost prevenită de naloxonă (NLX, n = 8), dar nu și soluție salină (Sal, n = 7) în cursul împerecherii, 7 d după încheierea ședinței finale în comparație cu controlul naiv sexual (Sal, n = 5; NLX, n = 6). Datele reprezintă media ± SEM; * indică o diferență semnificativă în comparație cu controalele naive sexual din aceeași zi (B, C) sau în comparație cu martorii naivi tratați cu soluție salină și bărbații experimentați sexual cu naloxonă (E, F).

Experiența sexuală nu a redus dimensiunea soma în neuronii dopaminei substantia nigra sau neuronii VTA nondopamine. VTA zona TH-IR neuron soma (A; în μm²) și perimetrul (B; în μm) la animalele naiv (alb) și experimentate (negre) care au câștigat experiență prin împerechere de două ori pe săptămână decât în ​​zile consecutive. Substanța nigră TH-IR zona soma (C) și VTA non-TH-IR zona soma (D) la animalele naiv (alb) și cu experiență (negru) sexual. Datele reprezintă media ± SEM; * indică o diferență semnificativă în comparație cu controalele naive sexual. Imagini reprezentative care prezintă neuronii TH-IR (maro) în VTA de naivi sexuali (E) și cu experiență (F) masculi. G, H, O imagine de mărire mai mare a neuronului indicată de săgeată din E și F respectiv. Neuronii colorați de Nissl sunt afișați în albastru în aceste imagini. Imagini reprezentative care prezintă neuroni TH-IR în SN de naivi sexuali (I) și cu experiență (J) masculi. Scări de bare: E-J, 20 μm.

Efectele experienței sexuale asupra recompensei cauzate de morfină. Timpii petrecuți în camere cu soluție salină (Sal) sau morfină (Mor; 0.5, 5 sau 10 mg/kg greutate corporală) în timpul post-testului la masculi neexperimentați sexual (naivi, n = 10-13) sau experimentați (Exp, n = 9-13). Datele sunt prezentate ca medie ± SEM; * indică o diferență semnificativă în comparație cu camera cu soluție salină (Sal) în cadrul acelorași animale. NS, Nesemnificativ.

Opioidele endogene joacă un rol esențial în facilitarea comportamentului sexual indusă de experiență. A , Design experimental. B - D , Parametrii comportamentului sexual pentru masculii tratați cu soluție salină (Sal, bare albe, n = 11) sau naloxonă (NLX; bare negre, n = 12) cu administrare sistemică. Datele prezentate sunt latența până la montare ( B ; secunde), intromisia ( C ; secunde) și ejacularea ( D ; secunde) în zilele 1 și 5 din cinci zile consecutive de împerechere. În plus, sunt prezentate date pentru testul final de împerechere, la 7 zile după a cincea sesiune de împerechere. Datele sunt prezentate ca medie ± SEM; + indică o diferență semnificativă între zilele 1 și 5 în cadrul tratamentului; * indică o diferență semnificativă între ziua testului și ziua 5 în cadrul tratamentului; # indică o diferență semnificativă între grupurile cu naloxonă și soluție salină în aceeași zi.

Administrarea de naloxonă înainte de împerechere a crescut latențele la montare și intromisie numai în prima zi de împerechere

Opioidele endogene sunt importante în exprimarea pe termen lung a facilitării comportamentului sexual indusă de experiență. A , Design experimental pentru experimentul privind efectul tratamentului cu NLX în ziua testului. B , Latența crescută în zilele 1 și 5 din cinci zile consecutive de împerechere și în ziua finală a testului de împerechere (Test) după injectarea cu soluție salină (gri) sau naloxonă (negru). Datele reprezintă media ± SEM. * indică o diferență semnificativă între ziua 1 și ziua 5 în cadrul tratamentului. # indică o diferență semnificativă între ziua testului și ziua 5 în cadrul tratamentului. C , Design experimental pentru experimentul care să testeze efectul pretratamentului cu naloxonă, fără experiență sexuală, asupra comportamentului de împerechere. D , Latența crescută în ziua finală a testului de împerechere, la 7 zile după 5 zile de injectare cu soluție salină sau naloxonă, în absența împerecherii. Datele reprezintă media ± SEM. E , Design experimental pentru experimentul care să testeze dacă tratamentul cu naloxonă a afectat manifestarea pe termen scurt a comportamentului sexual facilitat la animalele cu experiență sexuală. F , Latența creșterii în ziua 1 și ziua 5 din cinci zile consecutive de împerechere și în ziua finală a testului de împerechere, la 1 zi după ziua 5 în prezența injecției de soluție salină (gri) sau naloxonă (negru). Datele reprezintă media ± SEM. * indică o diferență semnificativă între ziua 1 și ziua 5 în cadrul tratamentului. G , Design experimental pentru experimentul care vizează testarea dacă tratamentul cu naloxonă a blocat efectele recompensatoare ale comportamentului sexual. H , Timpul petrecut în camera pereche de împerechere (în secunde) în timpul pre-testului (alb) și post-testului (negru) pentru animalele care au primit fie naloxonă, fie soluție salină înainte de împerechere. Datele reprezintă media ± SEM; * indică o diferență semnificativă în comparație cu pre-testul.

Datele prezentate sunt latențe la intromisiune și ejaculare (secunde) din experimentele de control efectuate pentru a determina că efectele blocării MOR asupra pierderii armării pe termen lung a comportamentului sexual au apărut independent de lipsa administrării naloxonei în ziua testului de împerechere finală

Opioidele endogene din VTA mediază facilitarea comportamentului sexual indusă de experiență și menținerea acestuia pe termen lung. Parametrii comportamentului sexual pentru masculii tratați cu soluție salină (Sal, bare albe, n = 8) sau NLX (bare negre, n = 6) cu administrare intra-VTA. Datele prezentate sunt latența până la montare ( A ), intromisiunea ( B ) și ejacularea ( C ) în zilele 1 și 5 din cinci zile consecutive de împerechere. În plus, sunt prezentate date pentru ziua finală a testului de împerechere, la 7 zile după ziua 5 în absența injecției de soluție salină sau naloxonă. Datele reprezintă media ± SEM; + indică o diferență semnificativă între zilele 1 și 5 în cadrul tratamentului; * indică o diferență semnificativă între ziua testului și ziua 5 în cadrul tratamentului; # indică o diferență semnificativă între grupurile cu naloxonă și Sal în aceeași zi. Desene schematice ale secțiunilor coronale VTA (H, −4.60; I, −5.00; J, −5.25 din bregma) indicând locurile de injectare intra-VTA pentru toate animalele din Experimentul 5 (soluție salină; alb; naloxonă, negru; Missed, gri), folosind desene șablon din Swanson Brain Maps ( Swanson, 2004 ). Canulele au fost bilaterale, dar locurile de injectare sunt reprezentate unilateral pentru ușurința prezentării. fr, Fasciculus retroflexus; ML, Lemniscus medial; SN, substantia nigra.

Acțiunea opioidă endogenă este necesară pentru activarea neuronală în NAc indusă de indicii condiționate asociate sexului. Numărul de celule pERK-IR pe mm2 ^în nucleul accumbens ( A ) și învelișul ( B ) la animale naive sexual (albe) și experimentate (Exp; negre) care au fost pretratate cu NLX sistemic sau soluție salină (Sal) în timpul sesiunilor de împerechere (masculi Exp) sau sesiunilor de manipulare (masculi naivi). Grupurile au fost fie expuse la indicii contextuale (Cue), care au fost indicii asociate împerecherii la masculii Exp și indicii neutre la animalele naive, fie prelevate din cuștile de animale (Fără indiciu; indicat prin lipsa etichetei Cue). Datele sunt prezentate ca medie ± SEM; * indică o diferență semnificativă în comparație cu grupul de control expus fără indiciu, pretratat cu soluție salină (Sal naiv - Fără indiciu și Sal exp - Fără indiciu); # indică o diferență semnificativă în comparație cu grupul Exp tratat cu Sal și expus la indiciu (Sal exp + Indiciu). Imagini reprezentative ale celulelor pERK-IR per mm2 ^în nucleul NAc al masculilor cu experiență sexuală cu Sal ( C , D ) sau NLX ( E , F ), care au fost fie prelevate din cușca adăpostită (Fără indiciu, C, E), fie expuse indiciilor contextuale asociate împerecherii (Indiciu; D , F ). N = 4 în fiecare grup, cu excepția NLX naiv (Fără indiciu), n = 3. ac, Comisura anterioară. Bara de scală, 100 μm.

Efectele naloxonei asupra expresiei pERK induse de indicii de împerechere în alte regiuni țintă VTA. Numărul de celule pERK-IR pe mm2 ^la animale neexperimentate sexual (albe) și experimentate (Exp; negre) care au fost pretratate cu NLX sistemic sau soluție salină (Sal) în timpul sesiunilor de împerechere și au fost expuse indiciilor contextuale (Cue) sau cuștii de domiciliu (fără indicii) în ACA ( A ), PL ( B ), IL ( C ) și BLA ( D ). Datele reprezintă media ± SEM; * indică o diferență semnificativă în comparație cu controalele fără indicii, pretratate cu soluție salină (Sal naiv - fără indiciu și Sal exp - fără indiciu); # indică o diferență semnificativă în comparație cu controalele neexperimentate sexual, expuse la indicii și tratate cu Sal (Sal naiv + indiciu).