PLoS One. 2012;7(4):e34700. doi: 10.1371/journal.pone.0034700. Publicat în format electronic, 18 aprilie 2012.
Pitchers KK , Schmid S , Di Sebastiano AR , Wang X , Laviolette SR , Lehman MN , Coolen LM.
Sursa
Departamentele de Anatomie și Biologie Celulară, Scoala de Medicină și Stomatologie Schulich, Universitatea din Western Ontario, Londra, Ontario, Canada.
Abstract
Recompensa naturală și abuzul de droguri converg asupra sistemului mezolimbic, care mediază motivația și comportamentele de recompensă. Drogurile induc adaptări neuronale în acest sistem, inclusiv modificări transcripționale, morfologice și sinaptice, care contribuie la dezvoltarea și exprimarea amintirilor legate de droguri și a dependenței. Anterior, s-a raportat că experiența sexuală la șobolanii masculi, un comportament natural de recompensă, induce o neuroplasticitate similară în sistemul mezolimbic și afectează recompensa naturală și comportamentul legat de droguri.
Studiul actual a stabilit dacă experiența sexuală provoacă schimbări de lungă durată în împerechere sau traficul sau funcția receptorilor ionotropi de glutamat în nucleul accumbens (NAc), în urma a 3 perioade diferite de abstinența de la recompensă: 1 zi, 1 săptămână sau 1 lună după ultima sesiune de împerechere.
Șobolanii masculi Sprague Dawley s-au împerecheat timp de 5 zile consecutive (experiență sexuală) sau au rămas neexperimentați sexual pentru a servi drept grup de control. Masculii cu experiență sexuală au demonstrat facilitarea inițierii și efectuării împerecherii la fiecare moment. În continuare, expresia intracelulară și la suprafața membranei a receptorilor N-metil-D-aspartat ( NMDA: subunitatea NR1 ) și α-amino-3-hidroxi-5-metilizoxazol-4-propionat (AMPA: subunități GluA1, GluA2) din NAc a fost determinată utilizând un test de reticulare a proteinei bis(sulfosuccinimidil)suberat (BS(3)), urmat de analiza Western Blot.
Expresia NR1 a crescut la 1 zi de abstinență atât la suprafață, cât și intracelular, dar a scăzut la suprafață la 1 săptămână de abstinență. GluA2 a crescut intracelular la 1 săptămână și a crescut la suprafață după 1 lună de abstinență. În cele din urmă, înregistrările electrofiziologice cu clemă de patch-clamp pe celule întregi au determinat un raport AMPA/NMDA redus al curenților sinaptici în neuronii din învelișul NAc în urma stimulării aferențelor corticale la bărbații cu experiență sexuală, după toate perioadele de abstinență prin recompensă.
Împreună, aceste date arată că experiența sexuală determină modificări pe termen lung în expresia și funcția receptorului de glutamat în NAc. Deși nu este identică, această neuroplasticitate indusă de experiența sexuală are asemănări cu cele cauzate de psihostimulanți, sugerând mecanisme comune de întărire a recompensei naturale și a drogurilor.
Introducere
Sistemul mezolimbic este format din zone cerebrale interconectate, inclusiv aria tegmentală ventrală, cortexul prefrontal medial (mPFC) și nucleul accumbens (NAc). [1]. Împreună, aceste zone ale creierului mediază comportamente naturale de recompensare, inclusiv hrănirea. [2], [3], [4], [5], băutură [6], comportamentul matern [7], legături sociale [8], [9] și comportamentul sexualr [10], [11], [12], [13], [14]Studiile comportamentale au demonstrat că comportamentul sexual al șobolanilor masculi este recompensator și întăritor, deoarece șobolanii masculi formează o preferință condiționată de loc pentru copulație. [15], [16], [17], dezvoltă viteze de alergare mai mari în labirinturile în formă de T [18]pistă cu braț drept [19] sau alpinism cu obstacole [20]și îndeplinesc sarcini operante pentru a obține acces la femele receptive sexual [21], [22]. În plus, experiența sexuală facilitează comportamentul sexual ulterior, inclusiv creșterea motivației și performanței sexuale [23] și influențează exprimarea preferinței de loc condiționate pentru împerechere [15]. Aceste schimbări comportamentale sugerează apariția învățării și memoriei naturale legate de recompensă, despre care se presupune că este mediată de modificări ale sistemului mezolimbic induse de experiența comportamentului de împerechere. [11].
În sprijinul acestei ipoteze, am demonstrat anterior că experiența sexuală a cauzat o creștere a nivelului de deltafosB în NAc, care, la rândul său, a fost esențială pentru facilitarea inițierii și desfășurării comportamentului sexual după experiența sexuală [23].
În plus, experiența sexuală a cauzat o creștere a arborizării dendritice și a numărului de spini în NAc. [11]. Modificări similare în transcripție și morfologie sunt induse de psihostimulante [24], [25], [26]. S-a demonstrat că experiența sexuală modifică reacția la drogurile de abuz, inclusiv sensibilizarea la activitatea locomotorie indusă de psihostimulante (sensibilizare încrucișată) și recompensa psihostimulantă sporită. [10], [11], [27]. S-a demonstrat că o perioadă de sevraj sau abstinență după expunerea la drog este esențială pentru creșterea poftei pentru drog, denumită incubație a poftei. [28]. De asemenea, o perioadă de abstinență la împerechere după experiența sexuală este esențială pentru creșterea recompensei psihostimulante indusă de experiența sexuală și creșterea ramificării dendritice și a spinilor în NAc. [11]. Prin urmare, experiența sexuală și abstinența ulterioară de la această recompensă naturală provoacă modificări pe termen lung ale sistemului mezolimbic, similare cu cele induse de psihostimulante și afectează răspunsurile comportamentale atât la recompensa naturală, cât și la cea medicamentoasă.
S-a raportat că psihostimulantele induc numeroase modificări suplimentare ale NAc, dintre care multe depind de o perioadă de abstinență. Aceste modificări includ modificări ale traficului și funcției receptorilor de glutamat [29] , [30] . Consumul repetat de cocaină, urmat de o perioadă lungă de abstinență (3-7 săptămâni), provoacă o creștere a expresiei la suprafață a subunităților receptorilor α-amino-3-hidroxi-5-metilizoxazol-4-propionat (AMPA) și a subunităților receptorilor N-metil-D-aspartat ( NMDA ), în timp ce nu s-au observat modificări după o perioadă scurtă de abstinență (1 zi).
Mai mult, diferite subunități ale receptorilor AMPA și NMDA sunt afectate diferențiat de expunerea la medicament și de perioadele ulterioare de abstinență, deoarece expresia la suprafață a AMPAR-urilor lipsite de GluA2 este reglată pozitiv după perioade prelungite de abstinență (5-7 săptămâni). [31], [32]PFC oferă un input glutamatergic major către NAc. [33] și studiile electrofiziologice au arătat că administrarea repetată de cocaină provoacă modificări ale raportului AMPA/NMDA în neuronii NAc care răspund la PFC și modificări ale excitabilității intrinseci a neuronilor NAc, care pot fi dependente de o perioadă de abstinența la droguri și de subregiunea NAc. [34], [35], [36], [37], [38], [39], [40], [41]O astfel de plasticitate neuronală indusă de medicamente contribuie la modificări ale sensibilizării comportamentale la psihostimulante. [42], [43], [44], [45] și căutarea de droguri [31], [46], [47].
În prezent, nu se știe dacă adaptări similare ale traficului și funcției receptorilor de glutamat apar în urma experienței de recompensă naturală și a abstinenței ulterioare de la recompensa naturală. Prin urmare, scopul prezentului studiu a fost de a testa ipoteza că experiența sexuală provoacă modificări în traficul receptorilor AMPA sau NMDA în NAc și modificări ale forței sinaptice a neuronilor din învelișul NAc care răspund la PFC. În plus, aceste măsurători au fost determinate la 3 momente diferite după sesiunea finală de împerechere pentru a investiga efectele unei perioade de abstinență de la recompensa naturală (1 săptămână sau 1 lună după împerecherea finală) asupra plasticității în NAc, comparativ cu o perioadă fără abstinență (1 zi după împerecherea finală).
REZULTATE
Experimentul 1: Facilitarea sexului
Obiectivul experimentului 1 a fost de a determina o evoluție temporală a facilitării comportamentului sexual după experiența sexuală. Anterior, facilitarea comportamentului sexual a fost detectată până la 1 săptămână după ultima sesiune de împerechere. [23], dar nu a fost investigat anterior dacă facilitarea comportamentului sexual indusă de experiența sexuală este menținută după o perioadă prelungită de abstinență. Aici, două grupuri de șobolani masculi au fost testate pentru exprimarea pe termen lung a facilitării comportamentului sexual, fie la 1 săptămână, fie la 1 lună după ultima sesiune de împerechere. În primul rând, ambele grupuri au demonstrat facilitarea comportamentului sexual în timpul a cinci sesiuni zilnice de împerechere, demonstrată de latențele semnificativ mai scurte până la montare. (Figura 1A; 1 săptămână, p
=0.028; 1 lună, p=0.019), intromisie (Figura 1B; 1 lună, p=0.016; tendință la 1 săptămână, p=0.078) și ejaculare (Figura 1C; 1 săptămână, p=0.016; 1 lună, p=0.008) în ziua 5 comparativ cu ziua 1 a experienței sexuale. În plus, facilitarea comportamentului sexual a fost menținută atât la 1 săptămână, cât și la 1 lună după ultima sesiune de împerechere, deoarece latențele parametrilor de împerechere au fost mai scurte în ziua testului (1 săptămână sau 1 lună după ziua 5 a experienței sexuale) comparativ cu ziua 1 de împerechere (Figura 1Alatență de montare, 1 lună, p=0.016; Figura 1B: latență de intromisie, 1 lună, p=0.046; Figura 1C: latență a ejaculării, 1 săptămână, p=0.016; 1 lună, p=0.008) și nu au existat diferențe semnificative între ziua 5 de împerechere și ziua de testare pentru niciun parametru comportamental în niciun moment (cu excepția latenței de montare la 1 lună; p=0.016). Prin urmare, facilitarea comportamentului sexual indusă de experiență a fost menținută pe parcursul unei perioade de abstinența la împerechere de 1 lună.
Experimentul 2: Redistribuirea/exprimarea subunității receptorului ionotrop de glutamat
Obiectivul experimentului 2 a fost de a determina expresia subunităților receptorilor ionotropi ai glutamatului la masculi cu experiență sexuală și neexperimentați, după diferite perioade de abstinența la împerechere. Seturile de suprafață și intracelulare ale subunităților AMPAR și NMDAR au fost cuantificate folosind un reactiv de reticulare impermeabil la membrană (BS3 ) , care a modificat selectiv proteina exprimată la suprafață, permițând distincția de proteinele intracelulare nemodificate folosind analiza SDS-PAGE și Western Blot. Bloturi reprezentative care ilustrează benzile de suprafață (MW ridicat, >250 kDa) și intracelulare sunt prezentate în Figura 2M.
La o zi după actul sexual, expresia subunității NR1 la suprafață (S), intracelulară (I) și totală (S+I) a fost semnificativ crescută (S, Figura 2A, p=0.025; I, Figura 2D, p=0.035; S+I, Figura 2J, p=0.023) la animalele cu experiență sexuală comparativ cu grupul de control neexperimentat sexual (Figura 2NLa o săptămână după ultima împerechere, s-a observat o scădere semnificativă a expresiei NR1 la suprafață și la nivel intracelular (raportul S/I; Figura 2G; p=0.024) fără modificări semnificative ale expresiei de suprafață sau intracelulară, comparativ cu animalele neinfectate sexual. Expresia GluA2 a crescut semnificativ la o săptămână după ultima împerechere, în expresia intracelulară și totală, fără modificări ale expresiei de suprafață (I, Figura 2E, p=0.026; S+I, Figura 2K, p=0.014) la animalele cu experiență sexuală comparativ cu cele neexperimentate (Figura 2O). Întrucât, la o lună după ultima împerechere, raportul S/I al GluA2 a crescut semnificativ (Figura 2H; p=0.046) însoțită de o tendință statistică spre o creștere a expresiei la suprafață (Figura 2B; p=0.055) la animalele cu experiență sexuală comparativ cu grupul de control neexperimentat. Modificări ale GluA1 nu au fost detectate la 1 zi sau 1 săptămână după ultima împerechere. După 1 lună, expresia GluA1 la suprafață și a raportului S/I a părut a fi crescută la animalele cu experiență sexuală comparativ cu grupul de control neexperimentat, deși au fost detectate doar tendințe statistice (S, Figura 2C, p=0.098; S/I, Figura 2I, p=0.083). Prin urmare, în concluzie, inițial la 1 zi de abstinență, s-a detectat o creștere totală a expresiei NR1, urmată de o creștere a expresiei intracelulare a GluA2 după 1 săptămână de abstinență și o creștere a expresiei la suprafață a GluA2 și GluA1 după 1 lună de abstinență (aceasta din urmă doar ca o tendință statistică).
Experimentul 3: Electrofiziologie
Obiectivul experimentului 3 a fost de a determina dacă experiența sexuală modifică forța sinaptică în neuronii din învelișul NAc care răspund la PFC. Curenții sinaptici au fost înregistrați în neuronii spinoși medii din învelișul NAc la masculi cu experiență sexuală și neexperimentați, în urma stimulării fibrelor presupuse a proveni din PFC. Raportul AMPA/NMDA a fost redus semnificativ la animalele cu experiență sexuală la 1 zi (p=0.005), 1 săptămână (p=0.016) și 1 lună (p=0.005) după ultima sesiune de împerechere, comparativ cu grupul de control fără experiență sexuală (Figura 3A, B, C). Pentru a determina dacă a existat o modificare a probabilității de eliberare a transmițătorului presinaptic, au fost investigate raporturile pulsurilor pereche. Magnitudinea facilitării eliberării transmițătorului care a apărut ca răspuns la stimularea cu pulsuri pereche nu a diferit între animalele cu experiență sexuală și cele neexperimentate la niciun interval de timp (Figura 3D).
Discuție
Studiul actual a demonstrat că experiența sexuală provoacă modificări în distribuția și funcția receptorilor ionotropici de glutamat în NAc la șobolanii masculi și că unele dintre aceste modificări au variat în funcție de durata perioadei de abstinență de la comportamentul sexual. Comparativ cu masculii neexperimentați sexual, masculii cu experiență sexuală au prezentat o creștere pe termen scurt a expresiei totale a subunităților NR1 datorită creșterii atât a rezervelor de receptori de suprafață, cât și a celor intracelulari. Expresia GluA2 a fost crescută intracelular și la suprafață după 1 săptămână și, respectiv, 1 lună de abstinență de la recompensă. În cele din urmă, expresia GluA1 nu a fost modificată semnificativ în niciun moment. În plus, animalele cu experiență sexuală au avut un raport AMPA/NMDA scăzut imediat și de lungă durată, înregistrat la neuronii din învelișul NAc care răspund la PFC, comparativ cu grupul de control neexperimentat. Rezultatele noastre indică faptul că traficul receptorilor de glutamat depinde de durata unei perioade de abstinență de la comportamentul sexual, în timp ce modificările forței sinaptice la sinapsele formate de aferențele corticale prefrontale la învelișul NAc nu. Aceste constatări principale sunt similare cu cele raportate în urma consumului repetat de cocaină în ceea ce privește creșterea expresiei la suprafață a subunităților AMPAR după o abstinența lungă de droguri și o scădere imediată a raportului AMPA/NMDA, dar diferă în ceea ce privește expresia pe termen scurt a subunităților NMDAR și o scădere persistentă a raportului AMPA/NMDA.
Comportamentul sexual este extrem de recompensator și de întăritor. Astfel, pe măsură ce un șobolan mascul câștigă experiență sexuală, acesta prezintă o motivație și o performanță sexuală crescute, demonstrate prin latențe mai scurte pentru inițierea împerecherii și manifestarea ejaculării, precum și o eficiență crescută a copulației [10] , [23] . Aici, s-a confirmat că această facilitare a comportamentului sexual a fost prezentă la 1 săptămână după împerechere și s-a stabilit că comportamentul sexual facilitat a fost menținut până la 1 lună de abstinență la împerechere. Profilul temporal al facilitării comportamentului sexual indus de experiența sexuală corespunde cu studiul nostru anterior, care arată sensibilizare încrucișată la efectele de inducere locomotorie ale amfetaminei atunci când a fost testat în aceleași perioade de abstinență la împerechere [11] . Studiile anterioare au implicat NAc ca mediator al menținerii comportamentului sexual facilitat. Atât neuronii din miezul NAc, cât și cei din coajă sunt activați prin împerechere sau prin indicii asociate cu împerecherea [48] , iar experiența sexuală are ca rezultat o creștere a ramificării dendritice și a spinilor în miezul și coaja NAc la o săptămână după împerechere [11] . În plus, scăderea activității factorului de transcripție deltaFosB în NAc prin transfer genetic mediat de vector viral atenuează facilitarea comportamentului sexual indusă de experiență [23] , [49] . Aceste descoperiri sugerează că NAc este asociat în mod specific cu întărirea comportamentului sexual și este potențial critic pentru efectele medicamentului sensibilizate încrucișat ale experienței sexuale [23].
Studiul actual a demonstrat că experiența sexuală a cauzat modificări în sinteza și/sau traficul AMPAR, modificări care au fost dependente de durata perioadei de abstinență sexuală. În primul rând, o creștere a expresiei intracelulare a expresiei GluA2 a fost evidentă la 1 săptămână, indicând potențial o sinteză crescută a receptorilor GluA2 și/sau endocitoză. Apoi, la 2 lună după ultima împerechere a fost detectat un raport crescut suprafață/intracelular GluA1 (în mare parte datorat creșterii la suprafață), sugerând redistribuirea receptorilor la suprafața celulei. Modificările traficului de AMPAR în urma expunerii la cocaină au fost dependente și de durata perioadei de abstinență la droguri. [50]În general, nivelurile de GluA1 și GluA2/3 la suprafața celulară și la nivelul sinaptozomilor cresc după o săptămână de abstinență de la cocaină și se mențin la niveluri ridicate timp de până la 3 săptămâni după ultima injecție cu cocaină. [51], [52], [53], [54], [55]După o perioadă mai prelungită de abstinența de la medicamente (5 săptămâni), expresia GluA1 la suprafață a rămas crescută și a existat o mică scădere a raportului suprafață/intracelular GluA2 și, prin urmare, AMPAR-urile lipsite de GluA2 au fost suprareglate. [31], [56]Această expresie crescută a receptorilor lipsiți de GluA2 la suprafață a fost detectată după o retragere prelungită (5-7 săptămâni) de la autoadministrarea cocainei cu acces extins, dar nu și după o retragere prelungită de la administrarea necontingentă de cocaină. [32]Mai mult, blocarea AMPAR-ului lipsit de GluA2 a împiedicat căutarea de medicamente. [31], [57]. Modificările traficului receptorilor AMPA în urma experienței sexuale și a abstinenței variază ușor de cele induse de cocaină. În ceea ce privește creșterea expresiei GluA1 la suprafața membranei, datele actuale indică o creștere modestă a receptorilor GluA1 de la suprafața membranei, care nu a atins semnificație statistică la 1 lună după experiența sexuală, sugerând astfel că expresia GluA1 la suprafața acesteia ar putea necesita perioade de abstinență mai lungi pentru o reglare suplimentară, similar cu modificările induse de cocaină după 5 săptămâni de abstinență. [31]În plus, datele actuale diferă în ceea ce privește GluA2, care a suferit o ușoară scădere după 5 sau mai multe săptămâni fără cocaină, în timp ce experiența sexuală și 1 lună de abstinență au dus la o creștere a expresiei GluA2 la suprafață. Ipoteza noastră este că suprareglarea receptorilor AMPA în NAc poate fi esențială pentru efectele pe termen lung ale experienței sexuale asupra comportamentului de recompensă ulterior și asupra creșterii recompensei de amfetamină. [11] în urma perioadelor prelungite de abstinență testate în studiul actual. În schimb, modificările expresiei sau traficului receptorilor AMPA nu sunt esențiale pentru efectele pe termen scurt ale experienței sexuale asupra comportamentului de recompensă. În sprijinul acestora, numeroase rapoarte au demonstrat că transmiterea modificată a AMPAR nu este necesară pentru sensibilizarea comportamentală indusă de medicamente la psihostimulante (pentru revizuire) [30]). Sensibilizarea și sensibilizarea încrucișată au fost observate după 1 zi de abținere de la recompensă fără modificări ale suprareglării AMPAR. [11], [53]Mai mult, sensibilizarea comportamentală a fost demonstrată prin expunerea repetată la amfetamină, substanță psihostimulantă, care nu a fost asociată cu nicio modificare a transmiterii AMPAR. [50], [53], [58].
Rolul NMDAR-urilor a fost mult mai puțin studiat decât cel al AMPAR-urilor în ceea ce privește sensibilizarea comportamentală și traficul de receptori. Un antagonist NMDAR neselectiv (MK-801) a prevenit dezvoltarea sensibilizării locomotorii cu cocaină sau amfetamină, dar nu a reușit să blocheze exprimarea acestei sensibilizări [59] , [60] . Rolul NMDAR în comportamentul sexual a fost examinat minimal prin administrarea sistemică sau intramedială în zona preoptică a MK-801, care a afectat comportamentul sexual la șobolanii masculi naivi și experimentați [61] , [62] , [63] . NMDAR mediază, de asemenea, alte recompense naturale, deoarece antagoniștii NMDAR au redus aportul alimentar la babuini [64] și au crescut pofta de mâncare la șobolani [65] . Expresia NMDAR în NAc este modificată de expunerea la cocaină, iar perioadele de abstinență mai lungi (3 săptămâni), dar nu scurte (1 zi), de la consumul repetat de cocaină, au crescut expresia subunităților NMDAR (NR1, NR2A, NR2B) [55] , [60] . Rezultatele actuale demonstrează că experiența sexuală a cauzat o creștere a expresiei totale a NR1 la 1 zi datorită nivelurilor crescute atât în rezervele de receptori de suprafață, cât și în cele intracelulare, pe lângă scăderea raportului suprafață/intracelular după o perioadă de abstinență de 1 săptămână. Prin urmare, emitem ipoteza că o creștere inițială a transmiterii NMDAR poate fi critică pentru efectele pe termen scurt ale experienței sexuale asupra comportamentului ulterior de recompensă.
Mai mult, creșterea pe termen scurt a subunității NR1 în urma experienței sexuale poate fi un indicator al formării sinapselor silențioase induse de experiența sexuală. Huang și colab. [66] au demonstrat că administrarea repetată de cocaină a generat sinapse silențioase în stratul NAc, în care recrutarea post-sinaptică de noi receptori NMDAR a fost esențială. Sinapsele glutamatergice silențioase exprimă curenți mediați de NMDAR funcționali în absența curenților mediați de AMPAR [67] , [68] , [69] . S-a demonstrat că expunerea anterioară la cocaină poate genera sinapse silențioase în tot creierul și că aceste sinapse nou generate oferă un substrat pentru experiențele ulterioare [66] , [70] . Receptorii NMDAR sunt compuși din cel puțin o subunitate NR1 în combinație cu una sau mai multe subunități NR2 (A-D). NR1 este necesar pentru formarea canalelor funcționale; prin urmare, modificările expresiei NR1 pot oferi un indice pentru modificările numărului de receptori NMDA funcționali. Consumul repetat de cocaină determină inserția de NMDAR-uri care conțin NR1 și NR2B și generează sinapse silențioase în stratul NAc. Aceste sinapse silențioase care conțin NR2B au fost inhibate în timpul administrării de cocaină, ceea ce a atenuat sensibilizarea locomotorie ulterioară cu cocaină [71] . Numărul de sinapse silențioase a scăzut după câteva zile de abstinență de la cocaină, în timp ce sensibilizarea locomotorie a persistat, sugerând că sinapsele premature se pot angaja în formarea de noi circuite plastice care pot fi modificate (potențial prin abstinența de la recompensă) pentru a media aceste comportamente persistente. Astfel, emitem ipoteza că suprareglarea expresiei totale a NR1 la scurt timp după experiența sexuală se poate datora creșterii numărului de NMDAR în sinapsele silențioase nou formate. În plus, experiența sexuală urmată de abstinența prelungită poate duce la scăderea sinapselor silențioase, explicând atât raportul scăzut suprafață/intracelular NR1, cât și creșterea subunităților AMPAR cu perioade de abstinență prelungite, deoarece sinapsele nu sunt silențioase.
Constatările actuale conform cărora experiența sexuală și perioadele de abstinență după recompensă au cauzat modificări ale traficului și expresiei receptorilor de glutamat au sugerat modificări ale forței sinaptice la sinapsele excitatorii din NAc. Prin urmare, o procedură de electrofiziologie bazată pe un studiu anterior realizat de Thomas și colegii [72] a fost utilizată pentru a studia funcția receptorilor de glutamat în neuronii din învelișul NAc după aceleași perioade de abstinență care au dus la sensibilizarea comportamentului sexual și al drogurilor și la redistribuirea receptorilor de glutamat. Similar studiilor anterioare efectuate după expunerea la cocaină, plasticitatea a fost determinată în sinapsele din învelișul NAc care au răspuns la inputul PFC. Se știe că PFC joacă un rol cheie în comportamentul compulsiv și abuzul de droguri [73] , [74] . De asemenea, PFC este esențial pentru dezvoltarea sau exprimarea comportamentului sexual compulsiv, deoarece leziunile PFC provoacă o căutare maladaptivă a comportamentului sexual la șobolanii masculi [75] . Datele actuale au arătat că experiența sexuală a cauzat o scădere imediată și de lungă durată a raportului AMPA/NMDA în neuronii din învelișul NAc care răspund la PFC.
Anterior, s-a emis ipoteza că principala diferență dintre recompensa naturală și cea indusă de droguri este că modificările raportului AMPA/NMDA după recompensa naturală sunt temporare și se vor disipa în timp, în timp ce modificările induse de droguri vor persista [76] . Această ipoteză s-a bazat pe constatările că cocaina, dar nu alimentele sau zaharoza, a indus o creștere de lungă durată a raportului AMPA/NMDA în VT A [76] . În schimb, studiul actual demonstrează că experiența sexuală a provocat într-adevăr o modificare de lungă durată a raportului AMPA/NMDA în NAc.
Cu toate acestea, plasticitatea învelișului NAc indusă de sex diferă de cea care urmează expunerii la cocaină, care s-a dovedit a fi asociată cu o modificare bidirecțională a excitabilității mediate de AMPAR . În urma expunerii la cocaină și a unei zile de abstinență la droguri, s-a constatat o reducere a raporturilor AMPA/NMDA [72] și o depresie a capacității de descărcare [34] , similară cu rezultatele obținute pentru efectele pe termen scurt ale experienței sexuale. Cu toate acestea, după o perioadă de abstinență de 14 zile la cocaină, neuronii din învelișul NAc au raporturi AMPA/NMDA crescute, sugerând că abstinența de la cocaină a sporit forța sinaptică în NAc [54] . Prin urmare, expunerea la cocaină are ca rezultat o modificare bidirecțională a plasticității sinaptice, cu răspunsuri mediate de AMPA reduse la scurt timp după expunerea la droguri, dar o excitabilitate mediată de AMPAR crescută odată cu abstinența prelungită la droguri. În schimb, abstinența prelungită de la experiența sexuală a dus la o scădere a excitabilității mediate de AMPAR în învelișul NAc, chiar dacă sensibilizarea activității locomotorii și recompensa asociate cu amfetamina sunt observate în timpul acelor perioade de abstinență [11] . Cu toate acestea, alte rapoarte au arătat o scădere a excitabilității intrinseci a membranei, atât în miez, cât și în înveliș, în perioade de abstinență scurte și lungi după expunerea la cocaină [35] , [36] , [ 37 ] , [38 ] , [39] , [40] , [41] , demonstrând o lipsă a schimbării bidirecționale, similară cu efectele experienței sexuale . Mai mult, rezultatele actuale arată că experiența sexuală nu provoacă modificări ale probabilității de eliberare a glutamatului presinaptic, pe baza lipsei de diferențe între grupuri pentru raportul pulsurilor pereche. Kalivas și colegii săi au demonstrat că administrarea repetată de cocaină induce modificări ale mediatorilor rezervelor extracelulare non-sinaptice de glutamat din NAc, rămânând de stabilit dacă astfel de modificări apar odată cu experiența sexuală (pentru revizuire [77] ).
Este probabil ca inputurile glutamatergice către acronimul nazolic (NAc) din alte zone ale creierului decât cortexul prefrontal (PFC) să joace un rol funcțional în efectele experienței sexuale asupra comportamentului ulterior de recompensă . NAc primește input glutamatergic de la amigdala bazolaterală (BLA) și de la subiculul ventral al hipocampului [78] . BLA joacă un rol în comportamentul natural de căutare a recompensei [79] , [80] , fiind esențial pentru asocierea stimulilor de mediu cu recompensa sexuală [81] și pentru comportamentul instrumental de inițiere a împerecherii [82] . Prin urmare, este tentant să speculăm că experiența sexuală produce modificări ale forței sinaptice și la nivelul sinapselor care răspund la BLA.
Raportul AMPA/NMDA scăzut la sinapsele PFC din învelișul NAc este în concordanță cu creșterea expresiei NR1 la scurt timp după experiența sexuală, dar este în contradicție cu creșterea GluA2 și GluA1 după perioade prelungite de abstinența. O explicație este că traficul de receptori a avut loc la sinapsele care primesc input glutamatergic provenit din alte zone ale creierului în afară de PFC. De asemenea, includerea nucleului NAc, pe lângă învelișul NAc, în probele de proteine exclude posibilitatea de a face corelații precise între expresia proteinelor și datele privind puterea sinaptică. Cu toate acestea, descoperirile actuale demonstrează clar că comportamentul natural de recompensă și abstinența ulterioară de la recompensă provoacă plasticitate sinaptică în NAc, cu asemănări și diferențe față de cele induse de psihostimulante.
În concluzie, s-a demonstrat că experiența sexuală și abstinența ulterioară de la recompensă la șobolanii masculi provoacă o facilitare imediată și de lungă durată a comportamentului sexual, similar cu efectele experienței sexuale asupra sensibilizării la efectele inductoare locomotorii ale amfetaminei [ 11] și a fost asociată cu o scădere imediată și de lungă durată a raporturilor AMPA/NMDA în sinapsele din stratul NAc. Mai mult, experiența sexuală a cauzat o creștere rapidă a NMDAR și o redistribuire lentă a AMPAR la suprafața neuronilor NAc. Prin urmare, similar efectelor psihostimulantelor, comportamentul natural de recompensă poate provoca modificări de lungă durată ale expresiei, traficului și excitabilității receptorilor de glutamat. Cu toate acestea , abstinența prelungită de la experiența sexuală, spre deosebire de cea care a urmat consumului de cocaină, a dus la o scădere persistentă a raportului AMPA/NMDA în stratul NAc. Au fost propuse o serie de ipoteze testabile pentru potențialii factori care stau la baza acestei discrepanțe, inclusiv modificări ale sinapselor care răspund la BLA, în urma experienței naturale de recompensă. Aceste date arată încă o dată atât asemănări, cât și diferențe între consecințele pe termen lung ale expunerii la recompensă naturală și cele ale recompensei medicamentoase și pot contribui la o mai bună înțelegere a modului în care medicamentele pot acționa asupra acestei căi naturale de recompensă.
Aplicate
Declarație de etică
Toate procedurile au fost aprobate de Comitetul pentru Îngrijirea și Utilizarea Animalelor al Universității din Western Ontario și s-au conformat ghidurilor Consiliului Canadian pentru Îngrijirea Animalelor care implică animale vertebrate în cercetare.
animale
Șobolanii Sprague Dawley masculi adulți (experimentele 1 și 2: 10–12 săptămâni; experimentele 3, 8–10 săptămâni la momentul începerii experimentelor) au fost obținuți de la Charles River Laboratories (Senneville, QC, Canada). Animalele de același sex au fost adăpostite în perechi în cuști din plexiglas cu un tub tunel, într-o cameră cu temperatură reglată, menținută într-un ciclu de lumină-întuneric de 12/12 ore, cu hrană și apă disponibile ad libitum, cu excepția perioadei de testare comportamentală. Femelele stimul (210–220 grame) pentru sesiunile de împerechere au primit un implant subcutanat conținând 5% benzoat de estradiol și 95% colesterol, după ovariectomie bilaterală. Receptivitatea sexuală a fost indusă prin administrarea a 500 µg progesteron în 0.1 ml ulei de susan cu aproximativ 4 ore înainte de testare.
Experiența sexuală
Toți șobolanii masculi erau neexperimentați sexual înainte de începerea experimentelor. Sesiunile de împerechere au avut loc în faza incipientă de întuneric (între 2-6 ore după debutul perioadei de întuneric) sub iluminare roșie slabă. În timpul fiecărei sesiuni de împerechere, șobolanii masculi au fost lăsați să copuleze până la ejaculare sau până la 1 oră, iar parametrii comportamentului sexual au fost înregistrați, inclusiv: latența la montare (ML; timpul de la introducerea femelei până la prima montare), latența intromisiei (IL; timpul de la introducerea femelei până la prima montare cu penetrare vaginală) și latența ejaculării (EL; timpul de la prima intromisie până la ejaculare) [83] . Subiecții de control neexperimentați sexual au fost manipulați, adăpostiți în aceleași camere ca și animalele de împerechere și, prin urmare, expuși acelorași niveluri de zgomot, tulburări generale și mirosuri îndepărtate ale femelelor în estr, dar nu li s-a permis să interacționeze sau să se împerecheze cu femele receptive.
Experimentul 1: Facilitarea sexului
Șobolanii masculi Sprague Dawley s-au împerecheat în cuștile lor timp de 5 sesiuni de împerechere consecutive, zilnice. Animalele au fost împărțite în 2 grupuri experimentale și au fost testate pentru comportament sexual fie la 1 săptămână, fie la 1 lună după ultima sesiune de împerechere (Ziua Testării; n=7 per grup). Grupurile au fost corelate în funcție de parametrii comportamentului sexual și nu s-au detectat diferențe semnificative între grupuri pentru nicio măsură a comportamentului sexual în timpul niciunei sesiuni de împerechere în timp ce dobândeau experiență sexuală.
Analiza datelor
În cadrul grupurilor s-au făcut comparații evaluând Ziua 1 și Ziua 5 a experienței sexuale pentru a determina facilitarea comportamentului sexual odată cu experiența sexuală, între Ziua 1 și Ziua Testului și între Ziua 5 și Ziua Testului (fie la 1 săptămână, fie la 1 lună după Ziua 5) pentru latențele de montare, intromisie și ejaculare, utilizând testul Wilcoxin Signed Rank cu un nivel de semnificație de 5%.
Experimentul 2: Redistribuirea/exprimarea subunității receptorului ionotrop de glutamat
Pentru a examina redistribuirea receptorilor ionotropi, a fost utilizată o paradigmă similară cu experimentul 1. Șobolanii Sprague Dawley masculi neexperimentați sexual au fost împărțiți în grupuri cu experiență sexuală și neexperimentați. Pentru grupurile cu experiență sexuală, experiența sexuală a fost dobândită prin 5 sesiuni de împerechere zilnice consecutive (așa cum este descris mai sus). Masculii cu experiență sexuală au fost apoi împărțiți în 3 grupuri experimentale (potrivite pentru parametrii comportamentului sexual) pentru colectarea țesuturilor, fie la 1 zi, 1 săptămână, fie la 1 lună după ultima sesiune de împerechere. Creierele de la subiecții de control neexperimentați sexual (manipulați așa cum este descris mai sus) au fost colectate la momente identice după manipularea finală. Grupurile au inclus: experimentați sexual (AMPAR: 1D, n=9; 1V, n=12; 1M, n=12; NMDAR: 1D, n=9, 1W sau 1M, n=6) sau neavizate sexual (AMPAR: 1D, n=9; 1V, n=12; 1M, n=12; NMDAR: 1D, n=9, 1W sau 1M, n=6).
Reticularea receptorilor de suprafață
Animalele au fost eutanasiate cu pentobarbital sodic (270 mg/kg; ip) urmat de decapitare. După decapitare, fiecare creier a fost îndepărtat rapid și plasat imediat într-o soluție salină rece ca gheața. NAc bilateral a fost disecat folosind o matrice de creier de șobolan (ASI Instruments, Warren, MI, SUA) și o lamă de bisturiu, conform limitelor NAc definite de Paxinos & Watson (1998). Apoi, țesutul NAc a fost tăiat în cuburi de 400×400 µm folosind un tocător de țesuturi McIlwain (Vibratome, St. Louis, MO, SUA). Metodologia pentru reticularea subunităților receptorilor AMPA și NMDA s-a bazat pe Boudreau & Wolf [53] . Imediat după tocare, țesutul cerebral a fost transferat rapid într-un tub Eppendorf conținând 1 mL de aCSF rece ca gheața, îmbogățit cu reactivul de reticulare a proteinelor bis(sulfosuccinimidil)suberat (BS3 , 2 mM; Pierce Biotechnology, Rockford, IL, SUA) și incubat timp de 30 de minute pe un balansier la 4°C. BS3 nu traversează membranele celulare, ceea ce îi permite să reticuleze selectiv proteinele exprimate la suprafață cu legături sulfurice, formând astfel agregate cu greutate moleculară mare, în timp ce proteinele intracelulare rămân nemodificate. Această reacție permite distingerea grupurilor de proteine de la suprafață și intracelulare pe baza greutății moleculare (MW) utilizând electroforeza pe gel de dodecil sulfat de sodiu-poliacrilamidă (SDS-PAGE) și analiza Western Blot. Reacția de reticulare a fost stinsă prin adăugarea a 100 µL de glicină 1 M timp de 10 minute la 4°C. Țesutul a fost peletizat prin centrifugare la 14.000 rpm timp de 2 minute la 4°C, iar supernatantul a fost aruncat. Peletele au fost resuspendate în 400 µL de tampon de liză răcit cu gheață [25 mM Hepes (pH 7.4), 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 20 mM NaF, 0.1% Nonidet P-40 (0.1%), cocktail inhibitor de protează (Ministop, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germania) și 1× cocktail inhibitor de fosfatază (Phosstop, Roche Diagnostics GmbH)]. Probele au fost sonicate timp de 5 secunde pentru a distruge țesutul, apoi centrifugate la 14.000 rpm timp de 2 minute la 4°C și imediat plasate înapoi în blocul de gheață. Supernatantul a fost transferat într-un nou tub Eppendorf, din care 30 µL de probă au fost puși pe gheață, iar supernatantul rămas a fost depozitat la −80°C pentru analiza Western Blot. Pentru fiecare probă, concentrația de proteine a lizatelor reticulate a fost determinată utilizând un test BCA (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA) și un spectrofotometru NanoDrop ND-1000 (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA).
Analiza Western Blot
Probele de proteine (20 µg) au fost încărcate și electroforezate pe geluri Tris-HCl cu gradient de 4–15% (Bio-Rad Laboratories Ltd., Mississauga, Ontario, Canada) utilizând un sistem Mini Trans-Blot Cell (Bio-Rad Laboratories Ltd.) și tampon de curgere Tris-Glycine-SDS [25 mM Tris, 192 mM Glicine, 0.1% SDS (pH 8.3)]. Standardele Precision Plus protein All Blue (Bio-Rad Laboratories Ltd.) au fost utilizate ca markeri de greutate moleculară. După separare, proteinele au fost transferate pe membrane de difluorură de poliviniliden Millipore Immobilon-FL (PVDF; Millipore, Billerica, MA, SUA) utilizând sistemul Trans-Blot Cell wet Blotting (Bio-Rad Laboratories Ltd.) pentru imunoblotting. Transferul proteinelor a fost efectuat în tampon de transfer (20% metanol și 0.037% SDS în Tris-glicină [25 mM Tris, 192 mM glicină (pH 8.3)] la 82 V timp de 1 oră la temperatura camerei (RT). Toate probele au fost efectuate cel puțin în duplicat, echilibrate între grupuri și pe geluri individuale.
Apoi, membranele au fost incubate într-un mediu de 2![[raport]](http://www.ncbi.nlm.nih.gov/corehtml/pmc/pmcents/x2236.gif)
Membranele au fost apoi incubate individual timp de 3 ore pe un agitator la 50°C fie cu soluție policlonală de iepure anti-GluA150 (∼8.0 kDa; 11K; Millipore, Cat # AB1504) și GluA2 (∼100 kDa; 14K; Millipore, Cat # AB1768), sau anti-NR1 monoclonal de șoarece (~130 kDa; 12K; Upstate (Millipore), Cat # 05-432). Acești anticorpi primari au fost utilizați și validați anterior. [84], [85]și a produs o singură bandă la greutatea moleculară corespunzătoare, care a fost prevenită prin preabsorbția anticorpului cu peptidă atunci când a fost utilizat pe țesut nereticulat. Toți anticorpii au fost diluați într-un mediu de 2Amestec de tampon de blocare Odyssey cu TBS-T (TBS + 3% Tween-0.05 (pH 20). După trei spălări de 8.0 minute în TBS-T, membranele au fost incubate în anticorpi secundari diluați într-un amestec de 10Amestec de 3% de tampon de blocare Odyssey și TBS-T timp de 1 oră la temperatura camerei. Anticorpii secundari au inclus anticorpi de capră anti-iepure conjugați cu Alexa-680 (1%5K; Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA) sau anticorp de capră anti-șoarece conjugat cu IR Dye800 CW (110K; LI-COR Biosciences). Imunoreactivitatea fluorescentă a fost vizualizată, iar imaginile au fost capturate folosind un scaner Odyssey 2.1 (LI-COR Biosciences).
Cuantificare și analize statistice
Pentru fiecare probă de proteină, nivelurile de intensitate a fluorescenței pentru fiecare bandă (MW ridicat, >250 kDa pentru expresia la suprafață și benzi la MW-ul specific enumerat mai sus pentru expresia intracelulară) au fost determinate folosind software-ul Odyssey și au fost calculate mediile pentru fiecare animal. Valorile densității benzilor la suprafață (S), intracelulară (I), raport (S/I, măsura distribuției subunităților receptorului) și totală (S+I, măsura expresiei totale a subunităților receptorului) au fost normalizate la valorile medii ale grupurilor de control corespunzătoare, neexperimentate sexual. Nu a existat nicio diferență în intensitatea fluorescenței între replicatele fiecărei probe (încărcate în geluri diferite), confirmând lipsa de variabilitate în încărcarea probelor de proteine. Toate datele Western Blot au fost analizate între controalele cu experiență sexuală și cele neexperimentate sexual, în același moment, folosind teste t nepereche cu un nivel de semnificație de 0.05.
Experimentul 3: Electrofiziologie
Același design experimental a fost utilizat ca cel descris mai sus pentru experimentele 1 și 2. Masculii cu experiență sexuală au fost împărțiți în 3 grupuri experimentale, potrivite în funcție de performanța comportamentului sexual și pe baza momentului colectării țesuturilor - 1 zi, 1 săptămână sau 1 lună după ultima sesiune de împerechere (1 zi, n=7; 1 săptămână, n=9; 1 lună, n=10). Comportamentul sexual la acești șobolani masculi mai tineri nu a diferit de comportamentul sexual al șobolanilor masculi mai în vârstă din experimentele 1 și 2. Șobolanii au fost anesteziați cu pentobarbital sodic (270 mg/kg; ip) urmat de perfuzie transcardiacă cu oxigen rece ca gheața (95% OXNUMX)2, 5% CO2) soluție de preparare conținând [250 mM Zaharoză, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 4 mM MgCl2, 0.1 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3, 10 mM glucoză, 3 mM mioinozitol, 2 mM piruvat de sodiu și 0.5 mM ascorbat]. Creierul a fost excizat și plasat într-o soluție de preparare oxigenată rece ca gheața. Secțiuni sagitale de creier, cu grosimea de 400 µm, au fost obținute de la fiecare animal folosind un vibratom (Microm, Walldorf, Germania). Un total de 4 secțiuni per creier au fost transferate într-o cameră de așteptare cu lichid cefalorahidian artificial (aCSF) [125 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 1.3 mM MgCl2, 2.5 mM CaCl2, 26.2 mM NaHCO3 și glucoză 10 mM], încălzită la 32°C timp de 30 de minute și apoi lăsată să revină la temperatura camerei timp de cel puțin 1 oră înainte ca o singură felie să fie plasată într-o cameră de înregistrare. Această cameră a fost superfuzată cu aCSF oxigenat la 22°C. Nu au existat diferențe între grupuri în ceea ce privește parametrii comportamentali sexuali. Creierele au fost colectate de la controale neavande sexual la fiecare dintre cele 3 momente după manipularea finală (n=3–4 fiecare).
Neuronii din stratul superior al celulelor naproxene (NAc) au fost examinați în secțiuni mediale de NAc care nu conțineau striatum dorsal [72] . Microelectrozi bipolari din oțel inoxidabil au fost plasați la granița cortexului prelimbic - NAc, rostral față de electrodul de înregistrare, pentru stimularea presinaptică a fibrelor aferente corticale. Neuronii spinoși medii vitali au fost identificați vizual după dimensiunea somei lor (în jur de 30-35 µM diametru) și un potențial de membrană de repaus relativ negativ de -75 până la -85 mV. Înregistrările au fost efectuate folosind un amplificator Axopatch 200A și o rată de eșantionare de 20 kHz (Digidata 1340), cu un filtru trece-jos de 10 kHz. PClamp 9.0 a fost utilizat pentru protocoalele experimentale și analiză. Aferenții au fost stimulați cu impulsuri pereche (50 ms ISI) la 0.1 Hz, iar neuronii folosind un electrod concentric bipolar din tungsten. Celulele au fost fixate cu voltaj fix la −80 mV și depolarizate la +40 mV timp de 500 ms înainte de stimularea sinaptică, pentru a elibera blocul de magneziu al curenților NMDA. Raporturile AMPA/NMDA au fost determinate prin calcularea mediei EPSC-urilor la +40 mV în absența sau prezența antagonistului NMDAR AP5 (50 µM; curenți pentru întreaga celulă 30× control și 30× în prezența AP5). Răspunsul NMDA a fost calculat prin scăderea înregistrărilor AP5 din control. Vârful EPSC AMPAR a fost împărțit la vârful EPSC NMDAR pentru a obține un raport AMPA/NMDA. Pentru a determina raporturile de impulsuri pereche, măsurătorile au fost efectuate la −80 mV cu stimulare presinaptică (30×).
Analiza datelor
Datele provenite de la grupul de control neexperimentat sexual au fost combinate pentru a forma un singur grup de control (n=10 neuroni la 10 animale), deoarece nu au fost detectate diferențe statistice între momentele de timp din cadrul grupului de control. Grupurile cu experiență sexuală (1 zi, n=7; 1 săptămână, n=9; 1 lună, n=10 neuroni; de obicei un neuron per animal) au fost comparați cu grupul de control neexperimentat sexual folosind o ANOVA unidirecțională (factori: interval de timp) urmată de un test Fisher LSD pentru post hoc comparații cu un nivel de semnificație de 5%.
recunoasteri
Le mulțumim Dr. Marina E. Wolf și Mike Milovanovic de la Universitatea de Medicină și Științe Rosalind Franklin pentru sfaturile lor tehnice.
Note de subsol
Conflicte de interese: Autorii declară că nu există conflicte de interese.
Finanțare: Institutele Canadiene de Cercetare în Sănătate pentru LMC și ARD și Consiliul de Cercetare în Științe Naturale și Inginerie pentru LMC și KKP. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.
Referinte