Cocaina indusă de formarea coloanei vertebrale dendritice în D1 și D2 receptorul dopaminergic conținând neuroni spini medii în nucleul accumbens (2006)

Proc Natl Acad Sci SUA A. Feb 28, 2006; 103 (9): 3399-3404.
Publicat online Feb 21, 2006. doi:  10.1073 / pnas.0511244103
PMCID: PMC1413917
Neuroştiinţe
Acest articol a fost citat de alte articole din PMC.

Abstract

Modificarea indusă de psiștimulant a coloanei dendritice pe neuronii dopaminoceptivi din nucleus accumbens (NAcc) a fost ipotetizată ca un răspuns neuronal adaptiv care este legat de comportamentele dependente de lungă durată. NAcc este în mare parte compus din două subpopulații distincte ale neuronilor spinoși de mărime medie care exprimă niveluri ridicate de receptori ai dopaminei D1 sau D2. În studiul de față, am analizat densitatea dendritică a coloanei vertebrale după tratamentul cronic cu cronică în neuronii spinoși cu conținut mediu de dimensiune D1 sau D2 în NAcc. Aceste studii au făcut uz de șoareci transgenici care au exprimat EGFP sub controlul promotorului receptorului D1 sau D2 (Drd1-EGFP sau Drd2-EGFP). După zilele 28 de tratament cu cocaină și zilele de retragere 2, densitatea coloanei vertebrale a crescut atât în ​​cazul neuronilor Drd1-EGFP-și Drd2-EGFP-pozitivi. Cu toate acestea, creșterea densității coloanei vertebrale a fost menținută doar în cazul neuronilor Drd1-EGFP-pozitivi 30 zile după retragerea medicamentului. În mod special, exprimarea crescută a ΔFosB a fost observată, de asemenea, în neuronii Drd1-EGFP- și Drd2-EGFP-pozitiv după zilele 2 de retragere a medicamentului, dar numai în neuronii Drd1-EGFP-pozitivi după zilele 30 de retragere a medicamentului. Aceste rezultate sugerează că densitatea crescută a coloanei vertebrale observată după tratamentul cu cocaină cronică este stabilă numai în neuronii care conțin receptorul D1 și că expresia ΔFosB este asociată cu formarea și / sau întreținerea coloanei dendritice în D1, precum și cu neuronii care conțin receptorul D2 în NAcc.

Calea dopaminergică mezolimbică este compusă din neuroni din zona tegmentală ventrală care inerva nucleul accumbens (NAcc), tuberculul olfactiv, cortexul prefrontal și amigdala (1), în timp ce neuronii dopaminergici nigrostriatali în substantia nigra (pars compacta) asigură o proeminență ascendentă a striatului dorsal (2). Psihostimulantele ridică concentrațiile sinaptice de dopamină în NAcc: cocaina, prin blocarea absorbției dopaminei din cleștele sinaptice și amfetamină, prin promovarea eliberării dopaminei de la terminalele nervoase (3-5). Administrarea repetată, intermitentă a psihostimulanților are ca rezultat răspunsuri comportamentale (sensibilizare) augmentate la efectele stimulative acute ale acestor medicamente (6-8). Cele mai multe linii de dovezi sugerează că modificările adaptive în zona tegmentală ventrală - sistemul dopaminergic NAcc sunt esențiale pentru modificarea plasticității dependente de experiență care stă la baza comportamentului indus de medicamente.

În plus față de dopamină, glutamatul este necesar pentru dezvoltarea sensibilizării comportamentale ca răspuns la psihostimulante (9, 10). Neuronii spinoși medii (MSN) în striatum ventral primesc proiecții excitatorii glutamatergice din cortexul prefrontal care se sinapsează pe capetele tibiilor dendritice. MSN-urile sunt, de asemenea, ținta majoră pentru axonii dopaminergici care se sinapsează pe gâtul coloanei vertebrale (1, 11, 12). Prin urmare, coloanei dendritice în MSNs reprezintă compartimentul celular în care transmisia dopaminergică și glutamatergică sunt inițial integrate.

Dopamina acționează asupra a două subfamilii principale de receptor, subfamilia D1 (subtipurile D1 și D5) și subfamilia D2 (subtipuri D2, D3 și D4) (13). În studiul striatar dorsal, studiile anatomice au arătat că MSN striatonigral conțin niveluri ridicate de receptori D1 (împreună cu substanța P și dynorfin), în timp ce MSN striatopalidice exprimă predominant receptorii D2 (împreună cu enkefalina) (14-17). Proiecțiile de la NAcc sunt mai complexe decât în ​​striatum dorsal, cu cochilii și părțile de bază ale NAcc care se proiectează în subregiuni distincte ale palidului ventral și zonei tegmentale ventral și substantia nigra18). În timp ce receptorii D2 și enkefalina sunt foarte exprimați în proiecții la pallidum ventral, receptorii D1 și substanța P se găsesc în mod egal distribuit în proiecții pallidum ventral și zona tegmentală ventrală (19). Studiile de agoniști și antagoniști selectivi pentru receptorii D1 sau D2 au arătat că ambii receptori D1 și D2 sunt necesari pentru modificările comportamentale dependente de psihostimulant (20-25). Cu toate acestea, rolurile acestor receptori par a fi diferite. De exemplu, stimularea receptorilor D1 atenuează căutarea de cocaină indusă de injecțiile de primă de cocaină și de indicatorii de mediu legați de cocaină, în timp ce stimularea receptorilor D2 facilitează reintroducerea indusă de cocaină (26-28).

Anomaliile comportamentale asociate dependenței psihostimulante sunt extrem de lungi. De aceea, a existat un interes considerabil pentru identificarea modificărilor induse de medicamente de lungă durată la nivel molecular și structural în circuitele neuronale reglementate de dopamină și glutamat (29-32). În special, sa constatat că expunerea pe termen lung la cocaină sau amfetamină duce la creșterea numărului de puncte de ramificație dendritice și a spinoaselor de MSN în NAcc (33-35). Aceste modificări structurale s-au dovedit a persista până la ≈1-3.5 luni după ultima expunere la medicament (30, 35) și s-a sugerat că acestea stau la baza modificărilor de lungă durată ale plasticității sinaptice asociate expunerii psihostimulante.

Scopul studiului a fost de a examina modificările structurale induse de cocaină ale coloanei dendritice în subpopulațiile de MSN populare care exprimă fie receptorii D1, fie D2. În aceste studii am utilizat șoareci transgenici cromozomi artificiali bacterieni (BAC) care exprimă EGFP sub controlul promotorului receptorului de dopamină D1 (Drd1-EGFP) sau D2 (Drd2-EGFP)36). Rezultatele indică faptul că, deși densitatea crescută a coloanei vertebrale apare inițial în MSNs care conțin receptori D1 și MSNs care conțin receptorul D2, densitatea modificată a coloanei vertebrale este stabilă numai în neuronii care conțin receptorul D1. Mai mult decât atât, găsim modificări similare în exprimarea factorului de transcripție ΔFosB, sugerând că ΔFosB poate fi implicat în formarea și / sau întreținerea coloanei dendritice în D1, precum și neuronii care conțin receptorul D2 în NAcc.

REZULTATE

Analiza MSNs în șoarecii transgenici DAC1-EGFP și Drd2-EGFP BAC transgenic.

Modelul de proiecție al MSNs de la striatul dorsal și ventral la șoarecii transgenici Drd1-EGFP sau Drd2-EGFP BAC a fost caracterizat prin analiza expresiei GFP36). Expresia diferențială a GFP în MSNs de striat dorsal corespunde, în general, cu cea a receptorilor endogeni D1 sau D2 (36). Am analizat suplimentar expresia diferențială a GFP în NAcc la șoareci Drd1-EGFP sau Drd2-EGFP (Fig. 1a și b). Deși ≈58% din neuroni în NAcc au exprimat GFP la șoarecii Drd1-EGFP (Fig. 1a), ≈48% din neuroni în NAcc exprimat GFP la șoareci Drd-2-EGFP (Fig. 1b). MSN reprezintă 90-95% din toți neuronii în NAcc (12, 37). Receptorii D1 sunt exprimați numai în MSNs, iar receptorii D2 sunt exprimați în MSNs și în interneuronii colinergici, care reprezintă 1-3% din neuronii striatali (37). Ținând cont de acești factori, rezultatele sugerează că, în mod minim, ≈10-15% din MSNs în NAcc sunt susceptibile de a exprima atât receptorii D1, cât și D2.

Fig. 1. 

Analiza MSN în șoarecii Drd1-EGFP și Drd2-EGFP. (a și b) Secțiuni fixate de creier de la NAcc din Drd1-EGFP (a) sau Drd2-EGFP (b) Șoarecii transgenici BAC au fost imunocolorați pentru GFP și NeuN (ca marker neuronal general). Imaginile îmbinate arată, în galben, colocalizarea ...

Analiza coloanei dendritice la șoarecii Drd1-EGFP și Drd2-EGFP.

Expresia GFP la șoarecii Drd1-EGFP și Drd2-EGFP a fost utilă pentru a pata corpurile celulare neuronale. Cu toate acestea, semnalul GFP în dendrite și coloane dendritice a fost prea slab pentru a permite analiza lor după imunizare cu anticorpi anti-GFP. Difuzarea balistică mediată de particule a coloranților fluorescenți a fost recent utilizată pentru a eticheta populațiile neuronale într-un mod rapid și eficient (38). Toți neuronii pot fi etichetați folosind această tehnică, iar metoda pare a fi comparabilă cu colorarea cu Golgi-Cox. Pentru a analiza morfologia dendritică a neuronilor în NAcc, s-au marcat feliile fixe fixe cu colorantul de fluorescență lipofilă 1,1'-diotadecil-3,3,3 ', perclorat de tetrametilindocarbocanină (DI) 3' folosind un pistol genetic. Un exemplu de MSN colorat cu DiI este prezentat în Fig. 1c. În condițiile utilizate, am observat, în general, neuroni marcați fără dendritele suprapuse de la alți neuroni marcați. La o mărire superioară, ar putea fi observată o morfologie dendritică detaliată, inclusiv coloane dendritice (Fig. 1d).

Apoi am folosit o combinație de marcare DiI și imunohistochimie pentru GFP la șoareci transgenici Drd1-EGFP sau Drd2-EGFP, ceea ce a fost posibil prin utilizarea unei concentrații scăzute de detergent pentru permeabilizarea țesuturilor (a se vedea Metode). Prin compararea atentă a colorării DiI și a expresiei GFP în corpurile celulare ale MSNs, am putut identifica neuronii DiI- și GFP-pozitivi sau DI-pozitivi și GFP-negativi în Drd1-EGFPFig. 2a) sau Drd2-EGFP (Fig. 2b) șoareci. Pentru următoarele studii, am analizat morfologia dendritică numai la neuronii DiI și GFP-pozitivi de la șoareci Drd1-EGFP sau Drd2-EGFP.

Fig. 2. 

Analiza coloanei dendritice la șoarecii Drd1-EGFP și Drd2-EGFP. Neuronii din NAcc fie de șoareci Drd1-EGFP (a) sau șoareci Drd2-EGFP (b) au fost mai întâi etichetați cu DiI (roșu) și apoi supuși imunohistochimiei folosind un anticorp anti-GFP (EGFP, verde). Numai ...

Rezultatele cronice de tratament cu cocaină au creat o densitate crescută a coloanei vertebrale în MSNs acumbal care exprimă fie Drd1-EGFP, fie Drd2-EGFP.

Șoarecii Drd1-EGFP sau Drd2-EGFP au fost injectați în mod repetat cu cocaină (30 mg / kg) sau cu soluție salină timp de patru săptămâni consecutive (a se vedea Metode). Două zile (2WD) sau 30 zile (30WD) după ultimul tratament medicamentos, creierele au fost procesate pentru etichetarea DiI și imunohistochimie așa cum s-a descris mai sus. Un studiu anterior a arătat că tratamentul cronologic cu amfetamină a crescut densitatea coloanei vertebrale pe dendritele distal, dar nu proximale, ale MSN în NAcc (35). Prin urmare, am limitat analiza noastră la dendritele distal (adică cele cu ramuri de ordinul doi sau trei), inclusiv regiunile terminale. Când a fost analizat la 2WD, densitatea coloanei vertebrale sa dovedit a crește în MSNs Drd1-EGFP-pozitiv (128% din grupul salin) (Fig. 3a și c) și într-o măsură mai mică în neuronii Drd2-EGFP-pozitivi (115% din grupul salin) (Fig. 3 b și d). După 30WD, densitatea crescută a coloanei vertebrale a fost menținută în neuronii Drd1-EGFP-pozitivi (118% din controlul salinei) (Fig. 3 a și c) dar nu în neuronii Drd2-EGFP-pozitivi (Fig. 3 b și d).

Fig. 3. 

Creșterea indusă de cocaină cronică a densității coloanei vertebrale în MSNs Drd1-EGFP- sau Drd2-EGFP-pozitiv în NAcc. (a și b) Drd1-EGFP (a) sau Drd2-EGFP (b) au fost tratați cu sare (Sal) sau cocaină (Coc, 30 mg / kg) pentru săptămâni 4. Creierul mouse-ului 2WD sau 30WD au fost procesate ...

Morfologia coloanei dendritice este variabilă în ceea ce privește lungimea și lățimea capului coloanei vertebrale. Prin urmare, am clasificat proeminențele dendritice în patru clase de coloană (stubby, ciuperci, subțiri și filopodii) la 2WD de la cocaină (datele nu sunt prezentate). Densitatea ciupercii (119.7 ± 4.0%, P <0.01) și spini subțiri (120.0 ± 3.4%, P <0.01) a fost crescută prin tratamentul cu cocaină în MSN-uri pozitive pentru Drd1-EGFP, în timp ce densitatea de butuc (182.4 ± 21.6%, P <0.05) și spini de ciuperci (122.5 ± 5.0%, P <0.01) a fost crescut în MSN-uri pozitive la Drd2-EGFP. Nu a existat o creștere semnificativă a coloanei vertebrale stubby în neuronii Drd1-EGFP-pozitivi sau a coloanelor vertebrale subțiri în neuronii Drd2-EGFP-pozitivi.

Cocaina cronică induce expresia ΔFosB în MSNs Drd1-EGFP- sau Drd2-EGFP-pozitiv în NAcc.

ΔFosB este membru al familiei Fos de factori de transcripție. Întrucât administrarea acută de cocaină induce o inducere rapidă și tranzitorie a mai multor izoforme Fos în NAcc, expunerea repetată la cocaină mărește nivelul ΔFosB. Mai mult, creșterea expresiei ΔFosB persistă în NAcc timp de săptămâni până la luni de la întreruperea expunerii la medicament și sa sugerat că este implicată în reglarea pe termen lung a expresiei genei, chiar și după ce consumarea de droguri încetează (29, 39, 40).

Pentru a examina inducerea ΔFosB în NAcc de la șoareci Drd1-EGFP sau Drd2-EGFP după tratamentul cu cocaină, am analizat expresia FosB și GFP prin etichetare dublă (Fig. 4 și Tabelul 1) Anticorpul anti-FosB recunoaște toate formele de FosB, dar presupunem că imunostainul crescut reprezintă ΔFosB (vezi Metode pentru discuții ulterioare). La șoarecii tratați cu soluție salină, 16% din neuronii Drd1-EGFP-pozitivi și 15% din neuronii Drd2-EGFP-pozitivi au exprimat imunoreactivitatea FosB cu intensitate relativ scăzută (Fig. 4 a și b și Tabelul 1). Tratamentul repetat cu cocaină urmat de 2WD a dus la o creștere semnificativă a numărului de neuroni Drd1-EGFP-pozitivi care coexprimă ΔFosB (55% din neuronii GFP-pozitivi) (Fig. 4c și Tabelul 1). O creștere mai mică, dar încă semnificativă, a exprimării ΔFosB s-a găsit în neuronii Drd2-EGFP-pozitivi (25% din neuronii GFP-pozitivi) (Fig. 4d și Tabelul 1). Ca și în cazul modificărilor în densitatea coloanei, creșterea expresiei ΔFosB a fost menținută în neuronii Drd1-EGFP-pozitivi (46% din neuronii GFP-pozitivi), dar nu și în neuronii Drd2-EGFP-pozitivi (15% din neuronii GFP-pozitivi) 30WD (Fig. 4 e și f și Tabelul 1). Rețineți că expresia ΔFosB crescută observată în Fig. 4f este prezent în neuronii Drd2-EGFP-negativi.

Fig. 4. 

Cocaina cronică induce expresia ΔFosB în MSNs Drd1-EGFP- sau Drd2-EGFP-pozitiv în NAcc. Drd1-EGFP (a, c, și e) sau Drd2-EGFP (b, d, și f) au fost tratați cu soluție salină sau cocaină cronică așa cum este descris în Fig. 3. 2WD (c și d) sau 30WD (e și ...
Tabelul 1. 

Cuantificarea neuronilor EGFP-pozitivi care exprimă ΔFosB

Discuție

Adapțiile de lungă durată în neurotransmisia dopaminergică se crede că stau la baza comportamentelor dependente asociate cu medicamente psihostimulante. În particular, creșterile induse de psihostimulant în densitatea dendritică a coloanei vertebrale a MSNs în NAcc au fost presupuse a fi legate de reorganizarea conectivității sinaptice (30). NAcc este în mare parte compus din două subpopulații distincte ale MSN care exprimă niveluri ridicate de receptori de dopamină D1 sau D2. În studiul de față, am analizat densitatea coloanei vertebrale în D1 sau D2 distincte care conțin receptori conținând MSNs în NAcc după tratamentul cronic cu cronică. Rezultatele obținute arată că, deși densitatea crescută a coloanei vertebrale apare inițial în MSNs care conțin receptori D1 și MSNs care conțin receptorul D2, densitatea modificată a coloanei vertebrale este stabilă numai în neuronii care conțin receptorul D1. Mai mult decât atât, găsim un model similar de modificări în exprimarea factorului de transcripție ΔFosB în D1 și în receptorii care conțin D2 MSNs.

Aceste studii au făcut uz de șoareci transgenici BAC care exprimă GFP în subpopulații specifice de MSN sub controlul promotorului receptorului D1 sau D2. Mai mult, am dezvoltat o metodă de etichetare dublă care combina imunohistochimia pentru GFP cu etichetarea balistică a neuronilor folosind DiI. Studiile anterioare au folosit metoda Golgi-Cox pentru a analiza efectul psihostimulantelor asupra densității coloanei vertebrale (34), iar metoda DiI folosită aici a dat rezultate care au fost comparabile cantitativ. Am dezvoltat metoda de etichetare dublă, deoarece colorarea Golgi nu este compatibilă cu imunohistochimia. Imunofarbirea necesită, de obicei, permeabilizarea țesuturilor cu detergenți, un procedeu care de obicei conduce la solubilizarea coloranților lipofili din membrană (38). Cu toate acestea, în studiile noastre actuale, imunofarbirea GFP nu a necesitat o concentrație mare de detergent pentru permeabilizarea țesuturilor și astfel ar putea fi utilizată împreună cu etichetarea lipofilă a colorantului. Metoda noastră de etichetare dublă ar trebui să fie în general utilă pentru studiile privind modificările structurale ale coloanei dendritice, de exemplu atunci când este utilizată pentru analiza liniilor de șoareci transgenici BAC unde GFP este exprimată în populații specifice de neuroni din cortex36).

Deși încă controversate, se crede că receptorii D1 și D2 sunt în mare parte segregați anatomic față de neuronii de proiecție striatală directă (striatonigrală) și indirectă (striatopallidal), respectiv (17, 41). Caracterizarea inițială a localizării GFP la șoarecii Drd1-EGFP și Drd2-EGFP a fost în concordanță cu această concluzie36). Mai mult, analiza noastră a numărului de neuroni GFP-pozitivi în NAcc de la șoareci Drd1-EGFP și Drd2-EGFP este în concordanță cu concluzia că ≈50% din MSNs exprimă numai receptorii D1, că 35-40% exprimă numai receptorii D2, și că ≈10-15% coexpresează atât receptorii D1, cât și cei D2. Această valoare a coexpression este similară cu cea implicată în studiile de striatum dorsal care au combinat analiza patch-clamp a neuronilor striatali unici cu tehnici RT-PCR pentru a izola și amplifica mRNAs (coexpresia 17% a enkefalinei și a substanței P) (42). Trebuie remarcat faptul că studiile noastre actuale nu abordează problema expresiei receptorilor D3, D4 și D5 și nici nu abordează problema nivelurilor scăzute de exprimare a receptorilor D1 în MSN care exprimă niveluri ridicate de receptori D2 sau invers.

Mai multe studii anterioare au examinat localizarea neuronală a expresiei Fos induse de psihostimulant și rolul receptorilor D1 și D2 (43-45). Aceste studii au susținut concluzia că inducerea Fos și ΔFosB este mediată de activarea receptorilor D1. Cu toate acestea, localizarea celulară a expresiei Fos este influențată de contextul de mediu în care sunt administrate medicamente psihostimulante (46, 47). De exemplu, amfetamina sau cocaina administrate in colivia de origine induce genele imediate imediate (inclusiv Fos), preferential in celulele P substante de substanta care coexprimate receptorii D1. În contrast, aceste medicamente pot induce expresia Fos atât în ​​MSN-urile care conțin D1, cât și în receptorii D2 atunci când sunt administrate într-un mediu nou. Protocolul utilizat în studiile noastre actuale nu a inclus injectarea de combinație de droguri cu expunerea la un mediu nou. Cu toate acestea, nu putem exclude un fel de stres dependent de context, care este responsabil de exprimarea ΔFosB în MSN-urile care conțin receptori D2.

O caracteristică notabilă a rezultatelor prezente a fost modelul paralel al densității crescute a coloanei vertebrale și a expresiei ΔFosB. Densitatea crescută a coloanei vertebrale și expresia ΔFosB au apărut inițial în MSN care exprimă Drd1-EGFP și Drd2-EGFP. Cu toate acestea, aceste modificări au fost stabile numai în neuronii care conțin receptorul D1. O explicație posibilă pentru observația că densitatea crescută a coloanei vertebrale și expresia ΔFosB s-a găsit tranzitoriu în neuronii care conțin receptorul D2 este că aceasta a apărut în fracțiunea mică de MSN care coexpresează atât receptorii dopaminergici D1 cât și D2. Astfel, natura tranzitorie a acestor creșteri poate fi asociată cu efectele antagoniste ale activării receptorului D2 pe căile de semnalizare dependente de D1 (48). Este de interes faptul că modificările densității coloanei vertebrale și expresiei ΔFosB au fost reversibile, ceea ce poate reflecta capacitatea căilor de semnalizare dependente de receptorul D2 de a influența stabilitatea ΔFosB.

Observația că există schimbări paralele în exprimarea ΔFosB și a densității coloanei vertebrale este în concordanță cu ideea că ΔFosB este implicat în formarea inițială și menținerea ulterioară a coloanei dendritice în neuronii care conțin receptori D1 în NAcc. Exprimarea ΔFosB este controlată de calea de semnalizare dependentă de D1 / DARPP-32 / PP1 în MSNs (49). Mai multe studii au arătat că ΔFosB joacă un rol important în acțiunile de stimulare și acționare locomotorie ale psihostimulantelor (39), probabil prin influențarea expresiei mai multor gene care includ receptorii neurotransmițători, proteinele de semnalizare și proteinele implicate în reglarea morfologiei neuronale (50). Cu toate acestea, mecanismele moleculare specifice implicate în formarea coloanei cronice induse de cocaină nu sunt cunoscute în prezent. Studiile noastre anterioare au arătat că perfuzia intraaccumbală a inhibitorului Cdk5 roscovitină a atenuat creșterea indusă de cocaină a densității coloanei vertebrale (51). Mai mult decât atât, Cdk5 este o genă țintă în aval pentru ΔFosB și a fost implicată în modificări adaptive compensatorii asociate cu tratamentul cocainei cronice (52). Prin urmare, modificarea fosforilării dependente de Cdk5 este un mecanism plauzibil care stă la baza formării coloanei induse de cocaină și / sau a stabilității coloanei vertebrale. PAK (53), β-catenin (54), PSD-95 (55) și spinofilină (56) sunt substraturi pentru Cdk5 și sunt toate implicate în reglarea morfogenezei coloanei vertebrale (57-60). Caracterizarea suplimentară a acestor și a altor substraturi Cdk5 în coloane va spera, sperăm, la mecanismele implicate în reglarea formării coloanei vertebrale de către psiștimulanți.

Metode

Animale.

Șoarecii care transportau o transgenă EGFP sub controlul receptorilor de dopamină D1 sau D2 au fost generați prin proiectul transgenic BAC Gensat (36). Soarecii transgenici utilizați în acest studiu au fost 4-5 săptămâni și au fost pe un fundal elvețian-Webster. Șoarecii au fost menținuți într-un ciclu 12: 12-h lumină / întuneric și au fost găzduiți în grupuri de 2-5 cu alimente și apă disponibile ad libitum. Toate protocoalele de animale au fost în conformitate cu Ghidul național pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator și au fost aprobate de Comitetul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor instituționale al Universității Rockefeller.

Tratament medicamentos.

Tratamentul cu cocaină cronică (30 mg / kg, zilnic) a prezentat o creștere robustă a densității coloanei vertebrale a MSN atât în ​​miez, cât și în coajă de NAcc de la șobolani, dar o doză mai mică (15 mg / kg) cochilia (61). Prin urmare, am folosit doza mai mare de cocaină pentru a induce modificări structurale în ambele părți ale NAcc. Șoarecii au primit o injecție (ip) de 30 mg / kg de cocaină-HCI (sau soluție salină) în fiecare zi pentru zile consecutive 5, urmate de zile fără injecție 2 și această procedură a fost repetată pentru 4 săptămâni consecutive. Au fost efectuate injecții în cușcă. 2WD sau 30WD, creierul mouse-ului a fost procesat pentru etichetarea DiI și / sau imunohistochimie.

Etichetare balistică cu diodă de colorare fluorescentă.

Șoarecii au fost anesteziați cu 80 mg / kg de pentobarbital de sodiu și perfuzate transcardial cu 5 ml de PBS, urmată de perfuzia rapidă cu 40 ml de paraformaldehidă 4% în PBS (20 ml / min). Creierul a fost îndepărtat rapid din craniu și postfixat în paraformaldehidă 4% pentru 10 min. Modelele de creier (100 μm) au fost marcate prin livrarea balistică a colorantului fluorescent DiI (Molecular Probes) așa cum este descris în ref. 38. Sa elaborat o metodă de etichetare combinată DiI-imunohistochimie cu o concentrație scăzută de detergent. Secțiunile marcate cu diol au fost permeabilizate cu 0.01% Triton X-100 în PBS pentru 15 min și apoi incubate în 0.01% Triton X-100 și 10% ser de capră normală în PBS pentru 1 h pentru a minimiza etichetarea nespecifică. Secțiunile de țesut au fost apoi incubate cu 1% ser normal de capră / 0.01% Triton X-100 și anticorp anti-GFP (Abcam, Cambridge, MA) pentru 2 h la temperatura camerei, spălate și incubate într-o diluție 1: 1,000 a FITC- anticorp secundar conjugat (Molecular Probes). Secțiunile au fost plasate pe diapozitive cu microscop și acoperite cu un mediu de montare. Metoda de etichetare balistică a permis o analiză detaliată a structurii coloanei dendritice, iar rezultatele obținute au fost comparate calitativ și cantitativ cu studiile anterioare, utilizând metoda de impregnare Golgi-Cox în felii de creier de șobolan34). Cu toate acestea, spre deosebire de studiile anterioare, am observat rar vârfuri cu două capete în neuronii colorați de DiI. Această diferență poate fi cauzată de sensibilitatea metodelor de colorare sau a variabilității șoarecelui (acest studiu) față de țesutul de șobolan (34).

Imunohistochimie.

Animalele au fost anesteziate și perfuzate așa cum s-a descris mai sus. Creierele au fost îndepărtate și depozitate peste noapte în paraformaldehidă 4% la 4 ° C. Creierele au fost transferate în 30% zaharoză în soluție PBS pentru crioprotecție. Secțiunile coronale (12 μm) au fost tăiate pe un microtome de îngheț (Leica) și apoi au fost prelucrate pentru imunohistochimie. Secțiunile creierului au fost apoi permeabilizate în 0.3% Triton X-100 în PBS pentru min. 15 și spălate de două ori în PBS. Secțiunile au fost preincubate în ser 10% de capră normală în PBS pentru 1 h la 37 ° C, expuse la anticorpi primari (diluați în ser 1% ser de capră normală în PBS) peste noapte la 4 ° C și apoi clătite în PBS și incubate cu secundar anticorpi pentru 1 h la 37 ° C. Au fost utilizați următorii anticorpi: iepure anti-pan-FosB de iepure (SC-48, 1: 500, Santa Cruz Biotechnology), anti-NeuN (Chemicon) mouse, anti-GFP de iepure, IgG anti-iepure conjugat FITC, IgG anti-șoarece conjugat (Molecular Probes). Pentru etichetarea triplă (ΔFosB, NeuN și GFP), secțiunile creierului au fost imunografiate mai întâi cu anticorp anti-pan FosB și anticorp anti-NeuN și apoi incubate cu anticorpi secundari (IgG anti-iepure conjugat cu rodamină și IgG anti-șoarece conjugat cu cyan ). Secțiunile creierului dublu-colorate au fost prelucrate în continuare pentru imunofarbire cu GFP utilizând tehnologia de etichetare Zenon (Zenon Alexa Fluor 488, Molecular Probes). Anticorpul anti-pan-FosB a fost crescut la N terminal al FosB și recunoaște ΔFosB și FosB cu lungime întreagă (62). Pe baza studiilor anterioare care au arătat că ΔFosB, dar nu FosB sau alte antigene legate de Fos, este exprimat stabil după tratamentul cocainei cronice, presupunem că creșterile de lungă durată ale imunoreactivității reprezintă expresia stabilă a ΔFosB. Totuși, identitatea semnalului FosB imunoreactiv observat la șoarecii tratați cu soluție salină nu este cunoscută. Analiza statistică în Tabelul 1 a folosit Studentul t Test.

Analiza coloanei vertebrale dendritice.

Numerele MSN individuale din NAcc au fost alese pentru analiza coloanei vertebrale pe baza mai multor criterii. (i) Nu a existat o suprapunere minimă sau deloc cu alte celule marcate pentru a se asigura că procesele din celule diferite nu ar fi confundate. (ii) Cel puțin trei dendrite primare trebuie să fie vizibile pentru a fi folosite pentru analiză. (III) Au fost examinate dendrite distale (dendrite terminale sau apropiate de dendrita terminală). Au fost analizate dendrite de la ambele MSN din nucleul și carcasa NAcc. Deși am observat MSN-uri slab spinate (tip II spinoase), am analizat doar MSN-uri spinate (tip I spinoase). Pentru a calcula densitatea coloanei vertebrale, s-a trasat o lungime de dendrit (> 20 μm lungime) utilizând un microscop confocal (Zeiss LSM 510) cu o lentilă de imersie în ulei (× 40). Toate imaginile cu dendrite au fost realizate la diferite z niveluri (intervale de adâncime 0.5-1 μm) pentru a examina morfologia coloanei dendritice. Toate măsurătorile au fost făcute cu software de analiză a imaginii metamorfă (Universal Imaging, Downingtown, PA). Analiza statistică a utilizat testul Kolmogorov-Smirnov.

Protruziile de la dendrite au fost clasificate în patru tipuri pe baza lungimii lor, așa cum este descris în fig. 63 și 64. Proeminențele din clasa 1, numite și protuberanțe stubby, aveau o lungime <0.5 μm, nu aveau un cap mare al coloanei vertebrale și nu păreau să aibă gâtul; clasa 2, sau spini în formă de ciupercă, aveau o lungime cuprinsă între 0.5 și 1.25 μm și se caracterizau printr-un gât scurt și un cap mare al coloanei vertebrale; clasa 3 sau spini subțiri, au variat între 1.25 și 3.0 μm și aveau gâtul coloanei vertebrale alungite cu capete mici; clasa 4, sau extensii filopodiale, erau proeminențe filamentoase lungi, cărora le lipsea un cap de coloană discernabilă.

recunoasteri

Această lucrare a fost susținută de Grantul DA10044 din partea Statelor Unite pentru Sănătate Publică (către PG și ACN) și de Fundația Simons, Fundația Peter J. Sharp, Fundația Picower și Fundația FM Kirby.

Abrevieri

  • NACC
  • nucleul accumbens
  • MSN
  • neuron spinal mijlociu
  • BAC
  • bacteriene cromozomul artificial
  • Drd1
  • receptorul dopaminic D1 promotor-condus
  • Drd2
  • receptorul dopaminic D2 promotor-condus
  • Dil
  • 1,1'-diotadecil-3,3,3 ', 3'-tetrametilindocarbocanin perclorat
  • 2WD
  • 2 de zile după ultimul tratament medicamentos
  • 30WD
  • 30 de zile după ultimul tratament medicamentos.

Note de subsol

 

Declarația privind conflictul de interese: Nu au fost declarate conflicte.

Referinte

1. Totterdell S., Smith ADJ Chem. Neuroanat. 1989; 2: 285-298. [PubMed]
2. Smith Y., Bevan MD, Shink E., Bolam JP Neuroscience. 1998; 86: 353-387. [PubMed]
3. Heikkila RE, Orlansky H., Cohen G. Biochem. Pharmacol. 1975; 24: 847-852. [PubMed]
4. Ritz MC, Lamb RJ, Goldberg SR, Kuhar MJ Science. 1987; 237: 1219-1223. [PubMed]
5. Nestler EJ Trends Pharmacol. Sci. 2004; 25: 210-218. [PubMed]
6. Kalivas PW, Stewart J. Brain Res. Rev. 1991; 16: 223-244. [PubMed]
7. Pierce RC, Kalivas PW Brain Res. Rev. 1997; 25: 192-216. [PubMed]
8. Robinson TE, Berridge KC Annu. Rev. Psychol. 2003; 54: 25-53. [PubMed]
9. Wolf ME, Khansa MR Brain Res. 1991; 562: 164-168. [PubMed]
10. Vanderschuren LJ, Kalivas PW Psihofarmacologie. 2000; 151: 99-120. [PubMed]
11. Sesack SR, Pickel VMJ Comp. Neural. 1992; 320: 145-160. [PubMed]
12. Smith AD, Bolam JP Trends Neurosci. 1990; 13: 259-265. [PubMed]
13. Sibley DR, Monsma FJ, Jr. Trends Pharmacol. Sci. 1992; 13: 61-69. [PubMed]
14. Beckstead RM, Cruz CJ Neuroscience. 1986; 19: 147-158. [PubMed]
16. Gerfen CR, Young WS, III Brain Res. 1988; 460: 161-167. [PubMed]
16. Gerfen CR Tendințe Neurosci. 2000; 23: S64-S70. [PubMed]
17. Gerfen CR, Engber TM, Mahan LC, Susel Z., Chase TN, Monsma FJ, Jr., Sibley DR Știință. 1990; 250: 1429-1432. [PubMed]
18. Zahm DS Neurosci. Biobehav. Rev. 2000; 24: 85-105. [PubMed]
19. Lu X.-Y., Ghasemzadeh MB, Kalivas PW Neuroscience. 1998; 82: 767-780. [PubMed]
20. Koob GF, Le HT, Creese I. Neurosci. Lett. 1987; 79: 315-320. [PubMed]
21. Woolverton WL, Virus RM Pharmacol. Biochem. Behav. 1989; 32: 691-697. [PubMed]
22. Bergman J., Kamien JB, Spealman RD Behav. Pharmacol. 1990; 1: 355-363. [PubMed]
23. Epping-Jordan MP, Markou A., Koob GF Brain Res. 1998; 784: 105-115. [PubMed]
24. Caine SB, Negus SS, Mello NK, Bergman JJ Pharmacol. Exp. Ther. 1999; 291: 353-360. [PubMed]
25. De Vries TJ, AR Cools, Shippenberg TS NeuroReport. 1998; 9: 1763-1768. [PubMed]
26. Self DW, Barnhart WJ, Lehman DA, Nestler EJ Science. 1996; 271: 1586-1589. [PubMed]
27. Khroyan TV, Barrett-Larimore RL, Rowlett JK, Spealman RDJ Pharmacol. Exp. Ther. 2000; 294: 680-687. [PubMed]
28. Alleweireldt AT, Weber SM, Kirschner KF, Bullock BL, Neisewander JL Psychopharmacology. 2002; 159: 284-293. [PubMed]
29. Nestler EJ Nat. Rev. Neurosci. 2001; 2: 119-128. [PubMed]
30. Robinson TE, Kolb B. Neuropharmacology. 2004; 47: 33-46. [PubMed]
31. Kalivas PW Curr. Opin. Pharmacol. 2004; 4: 23-29. [PubMed]
32. Hyman SE, Malenka RC Nat. Rev. Neurosci. 2001; 2: 695-703. [PubMed]
33. Robinson TE, Kolb BJ Neurosci. 1997; 17: 8491-8497. [PubMed]
34. Robinson TE, Kolb B. Eur. J. Neurosci. 1999; 11: 1598-1604. [PubMed]
35. Li Y., Kolb B., Robinson TE Neuropsychopharmacology. 2003; 28: 1082-1085. [PubMed]
36. Gong S., Zheng C., Doughty ML, Losos K., Didkovsky N., Schambra UB, Nowak NJ, Joyner A., ​​Leblanc G., Hatten ME, și colab. Natură. 2003; 425: 917-925. [PubMed]
37. Zhou FM, Wilson CJ, Dani JAJ Neurobiol. 2002; 53: 590-605. [PubMed]
38. Grutzendler J., Tsai J., Gan WB Methods. 2003; 30: 79-85. [PubMed]
39. Kelz MB, Chen J., Carlezon WA, Jr., Whisler K., Gilden L., Beckmann AM, Steffen C., Zhang YJ, Marotti L., Self DW și colab. Natură. 1999; 401: 272-276. [PubMed]
40. Nestler EJ Neuropharmacology. 2004; 47: 24-32. [PubMed]
41. Le Moine C., Bloch BJ Comp. Neural. 1995; 355: 418-426. [PubMed]
42. Surmeier DJ, Song WJ, Yan ZJ Neurosci. 1996; 16: 6579-6591. [PubMed]
43. Nye HE, Hope BT, Kelz MB, Iadarola M., Nestler EJJ Pharmacol. Exp. Ther. 1995; 275: 1671-1680. [PubMed]
44. Gerfen CR, Keefe KA, Gauda EBJ Neurosci. 1995; 15: 8167-8176. [PubMed]
45. Moratalla R., Elibol B., Vallejo M., Graybiel AM Neuron. 1996; 17: 147-156. [PubMed]
46. Badiani A., Oates MM, Ziua HE, Watson SJ, Akil H., Robinson TE Behav. Creier. Res. 1999; 103: 203-209. [PubMed]
47. Uslaner J., Badiani A., Norton CS, Ziua HE, Watson SJ, Akil H., Robinson TE Eur. J. Neurosci. 2001; 13: 1977-1983. [PubMed]
48. Huff RM, Chio CL, Lajiness ME, Goodman LV Adv. Pharmacol. 1998; 42: 454-457. [PubMed]
49. Zachariou V., Sgambato-Faure V., Sasaki T., Svenningsson P., Berton O., Fienberg AA, Nairn AC, Greengard P., Nestler EJ Neuropsychopharmacology. 2005 Aug 3; 10.1038 / sj.npp.1300832.
50. McClung CA, Nestler EJ Nat. Neurosci. 2003; 6: 1208-1215. [PubMed]
51. Norrholm SD, Bibb JA, Nestler EJ, Ouimet CC, Taylor JR, Greengard P. Neuroscience. 2003; 116: 19-22. [PubMed]
52. Bibb JA, Chen J., Taylor JR, Svenningsson P., Nishi A., Snyder GL, Yan Z., Sagawa ZK, Ouimet CC, Nairn AC, și colab. Natură. 2001; 410: 376-380. [PubMed]
53. Nikolic M., Chou MM, Lu W., Mayer BJ, Tsai LH Nature. 1998; 395: 194-198. [PubMed]
54. Kesavapany S., Lau KF, McLoughlin DM, Brownlees J., Ackerley S., Leigh PN, Shaw CE, Miller CC Eur. J. Neurosci. 2001; 13: 241-247. [PubMed]
55. Morabito MA, Sheng M., Tsai LHJ Neurosci. 2004; 24: 865-876. [PubMed]
56. Futter M., Uematsu K., Bullock SA, Kim Y., Hemmings HC, Jr., Nishi A., Greengard P., Nairn AC Proc. Natl. Acad. Sci. STATELE UNITE ALE AMERICII. 2005; 102: 3489-3494. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
57. Hayashi ML, Choi SY, Rao BS, Jung HY, Lee HK, Zhang D., Chattarji S., Kirkwood A., Tonegawa S. Neuron. 2004; 42: 773-787. [PubMed]
58. Murase S., Mosser E., Schuman EM Neuron. 2002; 35: 91-105. [PubMed]
59. Prange O., Murphy THJ Neurosci. 2001; 21: 9325-9333. [PubMed]
60. Feng J., Yan Z., Ferreira A., Tomizawa K., Liauw JA, Zhuo M., Allen PB, Ouimet CC, Greengard P. Proc. Natl. Acad. Sci. STATELE UNITE ALE AMERICII. 2000; 97: 9287-9292. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
61. Li Y., Acerbo MJ, Robinson TE Eur. J. Neurosci. 2004; 20: 1647-1654. [PubMed]
62. Perrotti LI, Bolanos CA, Choi KH, Russo SJ, Edwards S., Ulery PG, Wallace DL, Self DW, Nestler EJ, Barrot M. Eur. J. Neurosci. 2005; 21: 2817-2824. [PubMed]
63. Harris KM, Jensen FE, Tsao BJ Neurosci. 1992; 12: 2685-2705. [PubMed]
64. Vanderklish PW, Edelman GM Proc. Natl. Acad. Sci. STATELE UNITE ALE AMERICII. 2002; 99: 1639-1644. [Articol gratuit PMC] [PubMed]